Detta protokoll möjliggör underhåll av quiescent mänskliga hematopoetiska stamceller in vitro genom att efterlikna benmärg mikromiljön med rikliga fettsyror, kolesterol, lägre koncentrationer av cytokiner och hypoxi.
Mänskliga hematooetiska stamceller (HSCs), som andra däggdjur HSCs, upprätthåller livslång hematopoiesis i benmärgen. HSCs förblir quiescent in vivo, till skillnad från mer differentierade stamceller, och går snabbt in i cellcykeln efter kemoterapi eller bestrålning för att behandla benmärg skada eller in vitro kultur. Genom att efterlikna benmärgsmikromiljön i närvaro av rikliga fettsyror, kolesterol, låg koncentration av cytokiner och hypoxi, upprätthåller mänskliga HSCs quiescence in vitro. Här beskrivs ett detaljerat protokoll för att upprätthålla funktionella HSCs i quiescent tillstånd in vitro. Denna metod kommer att möjliggöra studier av beteendet hos mänskliga HSCs under fysiologiska förhållanden.
Hematoopoetiska stamceller (HSCs) och multipotenta stamceller (MPP) bildar koordinat en reservoar för kontinuerlig påfyllning av differentierade celler för att upprätthålla hematopoiesis under hela livet hos människor1. Cellcykel quiescence är en framträdande egenskap hos HSCs, skiljer dem från MPPs2. Konventionellt, HSCs tros bo i toppen av hierarkin i det hematopoetiska systemet, producerar alla differentierade blodkroppar. Denna hierarkiska modell härleddes mestadels från transplantation experiment3. Nyligen genomförda studier visade dock att dynamiken hos HSCs skiljer sig in vivo jämfört med dem i transplantationsexperiment4,5,6,7. Härstamning spårning experiment med flera barcoding system visade att fenotypiska murin HSCs inte är en unik celltyp som bidrar till steady-state hematopoiesis, och MPPs, som visar begränsad självförnyelse verksamhet vid transplantation inställningar, kontinuerligt leverera mogna blodkroppar4,5,8. Däremot förbättras HSCs bidrag till mogna celler efter benmärgsskada4. Detta kan hänföras till drastiska förändringar i mikromiljön efter benmärg ablation, inklusive benmärg transplantation. Även om det är svårt att tillämpa härstamning spårning av murin celler på mänskliga celler, visade fylogenetisk analys som kombinerar encellig koloni isolering och hela genom sekvensering en liknande egenskap hos det hematopoetiska systemet, där både HSCs och MPPs ansvarar för den dagliga produktionen av mogna celler7. Således, även om transplantation är avgörande för att undersöka murin eller mänsklig HSC-aktivitet, behövs andra experimentella modeller för att förstå HSCs beteenden under fysiologiska förhållanden.
Odlingsmetoder för HSCs har studerats i detalj för att förstå deras kliniska tillämpningar och egenskaper. Mänskliga HSCs kan utökas in vitro med hjälp av en kombination av cytokiner, rekonstitution av extracellulära matriser, avlägsnande av självförnyelseantagonister, samkultur med mesenkymala eller endotelceller, tillsats av albumin eller dess ersättning, transduktion av självförnyelse transkriptionsfaktorer och tillägg av småmolekylföreningar9,10. Några av dessa metoder, inklusive tillsats av små föreningar SR111 och UM17112,har testats i kliniska prövningar med lovande resultat9. Med tanke på HSCs quiescent natur in vivo, upprätthålla HSCs med minimal cell cykling är avgörande för att recapitulating HSC beteende in vitro. Quiescent och prolifererande HSCs uppvisar differentialcellcykelinmatning13,metabolisk status14, och tolerans mot flera påfrestningar15 . De metoder som används för att upprätthålla quiescence av mänskliga HSCs in vitro är begränsade.
Genom att efterlikna benmärgens mikromiljö (hypoxisk och rik på lipider) och optimera koncentrationen av cytokiner kan mänskliga HSCs bibehållas odifferentierade och quiescenta under kulturen. Att rekapitla HSCs quiescenta natur in vitro kommer att förbättra förståelsen av HSCs steady state-egenskaper och möjliggöra experimentell manipulering av HSC.
Nyligen har flera metoder för att expandera HSCs med minimal differentieringrapporterats 18,19,20,21. Även om dessa metoder är utmärkta, tvingas HSCs att aktivera sina cellcykler i närvaro av höga nivåer av cytokiner, som skiljer sig från in vivo-situationen där HSCs visar minimal cykling. Detta protokoll är användbart för att upprätthålla HSCs som quiescent, som observerats in vivo, genom att rekapitla benmärg microenvironment.
Genom att odla mänskliga HSCs under låg cytokin, lipid-rika och hypoxic villkor, HSCs visade minimal cykling samtidigt upprätthålla sin markör fenotyper. Det kritiska steget i detta protokoll är beredning av medium som innehåller en hög koncentration av fettsyror och kolesterol och låga cytokinkoncentrationer och kultur under hypoxi (steg 1, steg 2 och steg 4). Utan kolesterol och/eller fettsyror minskar underhållsgraden för HSC under låga cytokinkoncentrationer22. Odling av celler under hypoxiska förhållanden är också viktigt, som rapporterats tidigare23.
Odlingsförhållandena liknade dem som användes för murin HSCs, med undantag för cytokinkoncentrationerna. Murine HSCs överlever utan TPO, medan mänskliga HSCs kräver minst 2 ng/mL TPO med 3 ng/ml SCF22. Eftersom koncentrationen av TPO är mycket högre än i humant serum (~100 pg/ml) kan de villkor som används i detta protokoll sakna särskilda faktorer för att stödja överlevnaden av mänskliga HSC. FLT3 uttrycks på mänskliga HSC24. Tillägg av sin ligand FLT3LG minskar något kravet på att TPO ska behålla HSCs22.
Mänskliga HSCs kräver högre koncentrationer av kolesterol jämfört med murin HSCs, förmodligen på grund av oförmågan att inducera uttryck av kolesterol-syntetiserande enzymer och mottaglighet för lipotoxicity under höga koncentrationer (>400 μg/mL) avfettsyror 22. Även om endast kombinationen av palmitiska, oljeiska, linoleiska och steariska syror testades, som finns rikligt i det mänskliga serumet, bör andra kombinationer av lipider utvärderas för att minska lipotoxicity och förbättra hastigheten för att upprätthålla funktionella HSCs.
Även om återpopulationsaktiviteten hos odlade mänskliga HSCs hos immunbristmöss efter två veckors kultur harbekräftats 22,rekapitulerar detta kultursystem inte helt HSCs nischfunktioner in vivo. Uttrycket för CD45RA har rapporterats öka och återbefolkningskapaciteten är sämre än för nysorterade HSC22. Koncentrationerna av näringsämnen, såsom glukos, aminosyra, pyruvat och insulin, som tillsätts mediet på suprafysiologiska nivåer, kan dock optimeras. Föroreningar i BSA kan också äventyra underhållet av HSCs18,25. Dessutom genomgår vissa odlade celler celldöd, medan andra genomgår celldelning. Således kan underhållet av det totala cellnumret inte ange varje cells quiescenta status.
Trots dessa begränsningar kommer de kulturförhållanden som beskrivs i protokollet som utvecklats i denna studie att bidra till att främja forskning och teknik för HSCs, särskilt under nästan fysiologiska förhållanden. Odlingsförhållanden som upprätthåller HSCs med minimal differentiering och cykling verksamhet skulle vara lämpliga för att testa biologiska och kemiska föreningar specifikt verkar på HSCs, manipulera HSCs via lentivirus transduktion eller genomredigering utan förlust av stemness och klargöra det första steget av omvandling framkallas av leukemi-associerade gener.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar M. Haraguchi och S. Tamaki för teknisk support och laboratoriehantering och K. Shiroshita för att ha fotograferat. HK stöddes delvis av KAKENHI-bidraget från MEXT/JSPS (bidrag nr 19K17847) och National Center for Global Health and Medicine. KT stöddes delvis av KAKENHI Grants från MEXT/JSPS (bidrag nr 18H02845 och 18K19570), National Center for Global Health and Medicine (bidrag nr 26-001 och 19A2002), AMED (bidragsnr. JP18ck0106444, JP18ae0201014 och JP20bm0704042), Ono Medical Research Foundation, Kanzawa Medical Research Foundation och Takeda Science Foundation.
Human bone marrow CD34+ progenitor cells | Lonza | 2M-101C | |
NOD/Shi-scid,IL-2RγKO Jic | In-Vivo Science Inc. | https://www.invivoscience.com/en/nog_mouse.html | |
Anti-human CD34-FITC (clone: 581) | BD biosciences | Cat# 560942; RRID: AB_10562559 | |
Anti-human CD38-PerCP-Cy5.5 | BD biosciences | Cat# 551400; RRID: AB_394184 | |
Anti-human CD45RA-PE | BD biosciences | Cat# 555489; RRID: AB_395880 | |
Anti-human CD90-PE-Cy7 (clone: 5E10) | BD biosciences | Cat# 561558; RRID: AB_10714644 | |
Anti-human CD13-PE (clone: WM15) | BioLegend | Cat# 301703; RRID: AB_314179 | |
Anti-human CD33-PE (clone: WM53) | BD biosciences | Cat# 561816; RRID: AB_10896480 | |
Anti-human CD19-APC (clone: SJ259) | BioLegend | Cat# 363005; RRID: AB_2564127 | |
Anti-human CD3-APC-Cy7 (clone: SK7) | BD biosciences | Cat# 561800; RRID: AB_10895381 | |
Anti-human CD45-BV421 (clone: HI30) | BD biosciences | Cat# 563880; RRID:AB_2744402 | |
Anti-mouse CD45-PE-Cy7 (clone: 30-F11) | BioLegend | Cat# 103114; RRID: AB_312979 | |
Anti-mouse Ter-119-PE-Cy7 (clone: TER-119) | BD biosciences | Cat# 557853; RRID: AB_396898 | |
Fc-block (anti-mouse CD16/32) (clone: 2.4-G2) | BD Biosciences | Cat# 553142; RRID: AB_394657 | |
Phosphate buffered saline | Nacalai Tesque | Cat# 14249-24 | |
Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | Cat# 26140079 | |
DMEM/F-12 medium | Thermo Fisher Scientific | Cat# 11320-033 | |
ITS-X | Thermo Fisher Scientific | Cat# 51500056 | |
Penicillin | Meiji Seika | PGLD755 | |
Streptomycin sulfate | Meiji Seika | SSDN1013 | |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | Cat# A4503 | |
Sodium palmitate | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. | Cat# P0007 | |
Sodium oleate | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. | Cat# O0057 | |
Cholesterol | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. | Cat# C0318 | |
Ammonium Chloride | Fujifilm | Cat# 017-2995 | |
Sodium Hydrogen Carbonate | Fujifilm | Cat# 191-01305 | |
EDTA・2Na | Fujifilm | Cat# 345-01865 | |
Heparine Na | MOCHIDA PHARMACEUTICAL CO., LTD. | Cat# 224122557 | |
Sevoflurane | Fujifilm | Cat# 193-17791 | |
Dextran | Nacalai Tesque | Cat# 10927-54 | |
Recombinant Human SCF | PeproTech | Cat# 300-07 | |
Recombinant Human TPO | PeproTech | Cat# 300-18 | |
Recombinant human Flt3 ligand | PeproTech | Cat# 300-19 | |
Propidium iodide | Life Technologies | Cat# P3566 | |
Flow-Check Fluorospheres | Beckman Coulter | Cat# 7547053 | |
FlowJo version 10 | BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
AutoMACS Pro | Miltenyi Biotec | N/A | |
FACS Aria3u | BD Biosciences | N/A | |
VELVO-CLEAR VS-25 (sonicator) | VELVO-CLEAR | N/A | |
Nitrogen gas cylinder | KOIKE SANSHO CO., LTD | N/A | |
Gas regulator | Astec | Cat# IM-055 | |
Multigas incubator | Astec | Cat# SMA-30DR | |
Glass tube, 16 mL | Maruemu corporation | N-16 | |
Glass tube, 50 mL | Maruemu corporation | NX-50 | |
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma sterilized | Merck Millipore | SLGPR33RS |