Summary
نحن نقدم بروتوكولا مفصلا لتدخل الحمض النووي الريبي بوساطة كهربائية في حشرات النظام Odonata (اليعسوب وdamselflies) باستخدام السد الأزرق الذيل(Ischnura senegalensis: Coenagironidae: Zygoptera) واليعسوب المقشود pied(Pseudothemis zonata: التشهير: Anisoptera).
Abstract
اليعسوب وdamelflies (النظام Odonata) تمثل واحدة من أكثر الحشرات الأجداد مع التحول ، والتي تغير بيئتها ، مورفولوجيا ، والسلوك بشكل كبير من اليرقات المائية إلى البالغين الأرضيين / الجويين دون مرحلة الجراء. يتمتع البالغون في أودوناتا برؤية لونية متطورة ويظهرون تنوعًا ملحوظًا في ألوان الجسم وأنماطه عبر الجنسين والمراحل والأنواع. في حين أجريت العديد من الدراسات الإيكولوجية والسلوكية على أودوناتا، كانت الدراسات الوراثية الجزيئية نادرة أساسا بسبب صعوبة في تطبيق التحليل الوظيفي الجيني على أودوناتا. على سبيل المثال، تدخل الحمض النووي الريبي (RNAi) أقل فعالية في أودوناتا، كما ورد في Lepidoptera. للتغلب على هذه المشكلة، أنشأنا بنجاح طريقة RNAi جنبا إلى جنب مع في الكهربائية في الجسم الحي. هنا نقدم بروتوكول مفصل بما في ذلك شريط فيديو لطريقة RNAi بوساطة كهربائية على النحو التالي: إعداد اليرقات ، وتحديد الأنواع ، وإعداد محلول dsRNA / siRNA وإبر الحقن ، والتخدير البارد لليرقات ، وحقن dsRNA / siRNA ، في electroporation الجسم الحي ، والتربية الفردية حتى ظهور البالغين. طريقة RNAi بوساطة كهربائية قابلة للتطبيق على كل من damselflies (Zygoptera) واليعسوب (أدنى أمر Anisoptera). في هذا البروتوكول، نقدم أساليب سد أزرق الذيل Ischnura senegalensis (Coenagrionidae) كمثال على الأنواع damselfly واليعسوب المكاشطة الزائفة Pseudothemis zonata (قذفة) كمثال آخر من أنواع اليعسوب. كأمثلة تمثيلية، نعرض نتائج RNAi التي تستهدف تخليق الميلانين جين multicopper أوكسيديز 2. هذه الطريقة RNAi سوف تسهل فهم مختلف وظائف الجينات المشاركة في التحول، morphogenesis، تشكيل نمط اللون، وغيرها من السمات البيولوجية من أودوناتا. وعلاوة على ذلك، قد يكون هذا البروتوكول قابلاً للتطبيق عموماً على الكائنات غير النموذجية التي تكون فيها RNAi أقل فعالية في قمع الجينات بسبب عدم الكفاءة وانخفاض البينة.
Introduction
اليعسوب وdamelflies (النظام Odonata) هي من بين أكثر المجموعات الأجداد من الحشرات التي تظهر "التحول"1،2. بواسطة التحول، فإنها تغير بيئتها، مورفولوجيا، والسلوك بشكل كبير من اليرقات المائية إلى الأرض / الجوية البالغين3. إن البالغين في أودوناتا يتمتعون برؤية لونية متطورة ويمثلون تنوعًا ملحوظًا في ألوان الجسم وأنماطه عبر الجنسين والمراحل والأنواع3و4و5. في حين أن العديد من الدراسات الإيكولوجية والسلوكية على أودوناتا قد أجريت6,7, وقد أعاقت الدراسات الوراثية الجزيئية أساسا من صعوبة في تطبيق التحليل الوظيفي الجيني إلى أودوناتا.
تدخل الحمض النووي الريبي التقليدية (RNAi) طريقة, التي مزدوجة تقطعت بهم السبل RNA (dsRNA) يتم حقن لقمع وظيفة الجين من مصلحة8, تبين أن تكون غير فعالة في الحشرات أودوناتا9, كما ذكرت في الحشرات Lepidopteran10. من ناحية أخرى ، وقد اقترحت تقارير سابقة أن RNAi بوساطة كهربائية فعالة في أنواع Lepidopteran ، وخاصة في أنسجة البشرة11،12،13. وجدنا مؤخرا أن RNAi بوساطة الكهربائية يعمل بشكل فعال في اليعسوب نانوفيا الأقزام صغيرة (تقذف: Anisoptera)9، ولكن N. pygmaea هو نوع نادر نسبيا ، وبالتالي ليست مناسبة للدراسات الجينية الجزيئية.
تصنف معظم أنواع أودوناتا إلى أي من الجيرات اثنين، Zygoptera (damselflies) أو Anisoptera (اليعسوب الحقيقي)3. هنا ركزنا على السد الأزرق الذيل Ischnura senegalensis (Coenagrionidae; الشكل 1أ) باعتبارها من الأنواع Zygopteran ممثل وpied اليعسوب المكشط Pseudothemis zonata (قذفة ؛ الشكل 1B) باعتبارها تمثل الأنواع Anisopteran. النوعان من الأنواع هي من بين الأنواع الأكثر شيوعا أودوناتا في البرك الطبيعية والحضرية في اليابان، بما في ذلك تلك الموجودة في مدينة تسوكوبا، ويمكننا جمع العديد من يرقات النوعين في هذا المجال. في الآونة الأخيرة أنشأنا نظام تربية المختبرات لليرقات الفردية من I. senegalensis، والتي مكنت من الرصد المستمر للتنمية وmorphogenesis من يرقات أودوناتا في التفاصيل14.
في هذا التقرير، ونحن نقدم طريقة المكرر وبروتوكول الفيديو لرنابي بوساطة الكهربائية في I. senegalensis وP. zonata. في اليابان، I. السنغال وآسياتيكا Ischnura، والتي هي قريبة وراثيا ، وغالبا ما توجد sympatrically15، وأنها من الصعب التمييز في اليرقات16. كما أننا نصف كيف يمكن تمييز نوعين من الاشنورا من خلال تعدد الأشكال في طول جزء القيد (RFLP).
لتقييم فعالية RNAi بوساطة كهربائية، نختار جين أوكسيديز 2 متعدد الأكوز (MCO2؛ المعروف أيضا باسم laccase2)كمورث هدف تمثيلي، على حساب النمط الظاهري المرئي للون بشرة شحوب عند الضربة القاضية للتعبير الجيني9. ومن المعروف أن MCO2 ضروري لتعتمق البشرة في مجموعة متنوعة من أنواع الحشرات17،18.
Protocol
ملاحظة: يظهر المخطط الكلي للبروتوكولات في الشكل 1.
1. إعداد يرقات اليعسوب أو damselflies.
- جمع اليرقات في الحقل باستخدام شبكة اليد.
ملاحظة: غالبًا ما تتشبث يرقات يرقات السنغال في كثير من الأحيان بالنباتات المائية العائمة على سطح الماء، في حين أن يرقات P. zonata غالبًا ما تبقى بين فضلات الأوراق في الأسفل. في مدينة تسوكوبا، توجد يرقات النجوم النهائية من I. senegalensis أساسا من مارس إلى يونيو، وتلك من P. zonata من مايو إلى يونيو. I. يمكن تربية يرقات السنغال من البيض في المختبر14، ولكن اليرقات التي يتم جمعها في هذا المجال لديها معدل نجاح أعلى وضوحًا لظهور البالغين. - تحديد الأنواع حسب تقييد طول جزء متعدد الأشكال (RFLP) من المنتجات البوليستربلة.
ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية فقط إذا كان من الصعب تحديد الأنواع من مظهر اليرقات ، كما هو الحال في I. senegalensis.- عقد واحدة من الخياشيم السدية من اليرقة باستخدام ملقط. ثم تسقط اليرقة من الخياشيم السداوية نفسها (مما يسبب استئصال الأوتوماتيكية).
ملاحظة: يرقات Zygopteran damselflies عادة ما يكون ثلاثة خياشيم السد (الشكل 1A). عندما يتم مهاجمتهم من قبل المفترس، فإنها يمكن أن تقلع الخياشيم الخاصة بهم السد للهروب. إذا لم يتوفر الخياشيم السدية، يتم تشريح جزء من الساق. - وضع واحد الخياشيم السدال في 100 ميكرولتر من حل PBS [0.8٪ NaCl، 0.02٪ كلول، 0.115٪نا 2HPO4، و 0.02٪ KH2PO4 (ث / الخامس)] وتجانس مع خلاط اليد باستخدام الأوبئة إيداع.
- تدور أسفل الخليط في 5000 × ز لمدة 10 ثوان، وموضوع 0.5 ميكرولتر من تضخيم PCR باستخدام بوليميراز الحمض النووي وابتهج لتضخيم المساحة الداخلية المنسوخة 1 (ITS1) المنطقة من الحمض النووي.
ملاحظة: تنفيذ PCR وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة. مزيج من ITS-F0 (5'- GGA AAG ATG مجلس التعاون الخليجي AAA CTT GA -3') و 5.8S-AS1 (5'- دول مجلس التعاون الخليجي GGC CCT CAG CCA G -3') التمهيديون يمكن تضخيم منطقة ITS1 في جميع أنواع أودوناتا تقريبا19. - احتضان خليط من 1 ميكرولتر من المنتج تضخيم PCR، 0.3 ميكرولتر من 10x M العازلة، 0.1 μL من دري إنزيم تقييد، و 1.6 μL من الماء في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
ملاحظة: حدد أفضل الإنزيمات المقيدة، اعتمادا على مزيج من الأنواع. إذا لم تكن هناك إنزيمات تقييد مناسبة لتحديد الأنواع، تأكد من تسلسل الحمض النووي. - تحميل 2 ميكرولتر من المنتجات مع صبغة التحميل على 2٪ agarose هلام وتشغيل الكهرباء.
ملاحظة: من الصعب تحديد الأنواع عند استخدام 1٪ أو 1.5٪ هلام agarose. - تحقق من نمط الكهرباء لتحديد الأنواع (الشكل 2).
ملاحظة: أنماط RFLP تعتمد على الأنواع والسكان. في السكان تسوكوبا، I. asiatica لديها نطاق كبير من 400-500 BP، في حين أن I. senegalensis لديه نطاق كبير من حوالي 200 BP وشريط إضافي من أقل من 100 BP (رأس السهم في الشكل 2). وتوجد منطقة الساتل "إيتش 1" في نسخ متعددة في الجينوم، وفي أنواع أشنورا، كثيرا ما تكون تعدد أشكال السواتل الصغرية داخل منطقة الساتل 1 موجودا في نفس الفرد، مما يؤثر على نمط الملوثات الفلورية والفلورية.
- عقد واحدة من الخياشيم السدية من اليرقة باستخدام ملقط. ثم تسقط اليرقة من الخياشيم السداوية نفسها (مما يسبب استئصال الأوتوماتيكية).
- قم بتربية اليرقات التي تم جمعها في المختبر حتى يتم استخدامها في RNAi.
- ضع كل يرقة على حدة في كل بئر من 12 بئرا مع ما يقرب من 3 مل من الماء.
ملاحظة: يجب أن تبقى يرقات التحلل السنغالي الأول بشكل فردي لأنها كثيراً ما تُكل بعضها البعض، في حين يمكن الاحتفاظ بيرقات P. zonata في مجموعة لأنها نادراً ما تُكلَل. - الأعلاف I. يرقات السنغال مع الروبيان الملوحة الأرتيميا كل يوم ويرقات P. zonata مع ديدان الدم و / أو الديدان Tubifex على الأقل مرتين في الأسبوع حتى تنمو إلى مرحلة النمو المناسبة لRNAi.
ملاحظة: التغذية المتكررة أمر بالغ الأهمية لزيادة معدل نجاح ظهور الكبار. - تغيير الماء بمجرد أن يصبح القذرة مع البراز أو بقايا الطعام.
ملاحظة: تغيير المياه المتكرر مهم أيضاً لزيادة معدل نجاح ظهور الكبار. - الحكم على المرحلة التنموية المناسبة لRNAi.
ملاحظة: يمكن تصنيف يرقات إنستار النهائي من I. senegalensis إلى خمس مراحل النمو14,20. المرحلة الأولى (المرحلة أ، قبل أن تبدأ الأجنحة في التوسع) أو المرحلة الثانية (المرحلة باء) من يرقات إنستار النهائية مناسبة لتجارب RNAi، عند النظر في النمط الظاهري الواضح للرنابي بعد ظهور الكبار (انظر المناقشة). في P. zonata، تم استخدام يرقات النجوم النهائية قبل توسيع الجناح (المقابل للمرحلة أ من I. senegalensis)في هذه الدراسة.
- ضع كل يرقة على حدة في كل بئر من 12 بئرا مع ما يقرب من 3 مل من الماء.
2. إعداد محلول dsRNA/siRNA وإبر الحقن لـ RNAi.
ملاحظة: حدد RNA (سيرنا) (الخطوة 2.1) أو RNA تقطعت بهم السبل (dsRNA) (الخطوة 2.2) كحل لـ RNAi.
- إعداد حل الـ(سيرنا)
- تصميم siRNA باستخدام siDirect إصدار البرنامج 2.0 (http://sidirect2.rnai.jp/)21، اتباع المبادئ التوجيهية التي سبق الإبلاغ عنها في حشرات Lepidopteran22.
- الحصول على سيرنا توليفها تجاريا.
ملاحظة: تسلسل من سيرنا استهداف الجين MCO2 من I. senegalensis المستخدمة في هذه الدراسة كانت على النحو التالي: 5'- GCA CUU UCC GUU AUC AAU AUA -3 لخلوا الحس و5'- UAU UGA UAA CGG AAA GUG CUC -3 'لsassense حبلا. كتحكم سلبي، وتسلسل من سيرنا استهداف البروتين الفلوري الخضراء المعززة (EGFP)الجين كانت على النحو التالي: 5'- GCA UCA AGG UGA ACU UCA AGA -3' لحس حبلا و 5'- UUG AAG UUC ACC UUG AUG CCG -3 ' لsadsense حبلا11. - تخفيف الـ siRNA إلى 100 ميكرومتر مع عازل الحقن [100 mM CH3COOK, 2 mM Mg(CH3COO)2, 30 mM HEPES-KOH, pH 7.4]22.
- يُخزن عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- إعداد حل DSRNA.
- حدد منطقة 300-400 BP لdsRNA باستخدام إصدار برنامج primer3 4.1.0 (http://bioinfo.ut.ee/primer3/)23 وتصميم مجموعات التمهيدي.
- الحصول على مجموعات التمهيدي توليفها تجاريا.
ملاحظة: لإنتاج قوالب لتوليف DSRNA، كانت مجموعات التمهيدي المستخدمة في هذه الدراسة على النحو التالي: (5'- دول مجلس التعاون الخليجي TGT CAG CTT TTT CC -3' ل التمهيدي إلى الأمام و 5'- GGT GTC TGG CGG ACA ACT في -3 لنظري عكسي) لمورثات MCO2 من I. senegalensis (ISMCO2، الانضمام NO. LC589180) و (5'- CCG CAC AGC TCA TTA TTC AA -3' للأمام التمهيدي و 5'- GGA GGA TTC CTT CGA CGA CA -3 لـ عكس التمهيدي) للجينات MCO2 P. zonata (PzMCO2, no. LC589179). كتحكم سلبي، تم تعيين التمهيدي لاستهداف dsRNA β-lactamase (bla)الجين على ناقل الاستنساخ (5'- CTA TGT GGC GTG GTA TTA T-3' التمهيدي الأمامي و5'- CAG AAG TAG TCC TGC TAC T-3 لـ التمهيدي العكسي). - استخراج RNA من يرقات أودوناتا باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي المتاحة تجاريا وتنفيذ التوليف cDNA باستخدام النسخ العكسي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
ملاحظة: يمكن أيضاً استخدام مكتبة cDNA المعدة لتحليل تسلسل الحمض النووي الريبي. - تضخيم تسلسل الهدف باستخدام cDNA توليفها ومجموعة التمهيدي مصممة واستنساخها في ناقلات الاستنساخ باستخدام الرباط التجاري وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
- تحويل البلازميد إلى الخلايا الإشريكية القولونية المختصة والتقاط مستعمرة واحدة بعد الحضانة بين عشية وضحاها.
- PCR-تضخيم منطقة إدراج باستخدام التمهيديات على ناقلات.
- تأكيد تسلسل المستنسخة بواسطة تسلسل سانجر.
- PCR-تضخيم إدراج باستخدام ال التمهيديات ناقلات تحتوي على T7 البوليميراز المروج تسلسل24، 25.
ملاحظة: في هذه الدراسة، تم استخدام التمهيديات التالية: T7-F (5' - TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GAC TAG TCA TAT GGA T - 3') و T7-R (5'- TAA TAC GAC TCA TTA TAG GGA GAC GAC GG GG ATC CGA T - 3') 25. - تنقية المنتج PCR باستخدام مجموعة تنقية PCR وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة، وlute الحمض النووي مع 50 ميكرولتر من الماء المقطر، وتركيز حل الحمض النووي مائل إلى ما يقرب من 10 ميكرولتر باستخدام المبخر الطرد المركزي.
- توليف dsRNA من قبل في المختبر النسخ وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. استخدام ما مجموعه 1000 نانوغرام قالب الحمض النووي وlute توليفها dsRNA مع 100 μL من عازلة elution.
- قياس تركيز dsRNA باستخدام مقياس الطيفية وتأكيد جودة dsRNA بواسطة الكهرباء على جل agarose 1.5٪.
ملاحظة: يمكن رؤية نطاق واحد عندما يكون التوليف DSRNA ناجحا. - تخفيف dsRNA إلى 1000 نانوغرام /ميكرولتر مع عازلة elution وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- إعداد حقن الإبر
- سحب شعري زجاجي باستخدام سحب إبرة زجاجية.
- ضع طرف الشعيرية المسحوبة على شريط لاصق مزدوج الوجه واكسر طرف الشعيرية بالملبك.
- تعيين الشعيرية إلى حاقن.
ملاحظة: من الأسهل التعامل مع الشعيرات الدموية إذا كنت ترتدي قفازات نيتريل. - تحميل حل سيرنا / dsRNA إلى الشعرية المعدة.
ملاحظة: لا تستخدم الشعيرات الدموية بشكل متكرر لأن طرف الشعرية المحقّن قد تصبح مسدودة بالأوساخ لأن اليرقات التي تم جمعها في الحقل عاشت في الوحل.
3. حقن سيرنا/ ديسرنا
ملاحظة: الإجراء يختلف قليلاً عن damselflies (الخطوة 3.1) واليعسوب (الخطوة 3.2).
- حقن لـ Zygopteran (damselfly) (على سبيل المثال، I. senegalensis).
- تخدير يرقة مغطاة بورق مبلل على الثلج المسحوق لمدة 50-70 ثانية (الشكل 3A-C).
ملاحظة: مدة التخدير البارد من الجليد تعتمد على حالة اليرقة. إذا بدأت اليرقة في التحرك بعد 70 ثانية من التخدير البارد الجليدي ، يتم تطبيق 70 ثانية إضافية من التخدير البارد الجليدي. بالنسبة لليرقات التي نادرا ما تتحرك (على سبيل المثال، P. zonata)،وهذا الإجراء ليس ضروريا. - نعلق دبابيس اثنين على جانبي البروثوراك وإصلاح اليرقة إلى موقف ثابت (على سبيل المثال، قطعة من الستايروفوم)(الشكل 3D).
ملاحظة: ضبط موقف وعدد من دبابيس، اعتمادا على مكان الحقن. - تمتد الغشاء بين القطاعية بين الجزء البطني 7 و 8 لRNAi في البطن أو بين prothorax synthorax (دمج الميسوثوراكس وميتثوراكس) لRNAi في الصدر باستخدام اليدين واللباب.
- الحفاظ على الغشاء بين القطاعية امتدت باليد.
- أدخل طرف الشعيرات الدموية المعدة في الغشاء بين الأجزاء المتمددة (الشكل 3D، 3F).
- حقن 1 ميكرولتر من محلول سيرنا/ ديسرنا.
- تخدير يرقة مغطاة بورق مبلل على الثلج المسحوق لمدة 50-70 ثانية (الشكل 3A-C).
- حقن ليرقات أنيسوبتيران (اليعسوب) (على سبيل المثال، P. zonata).
- امسح الماء من سطح اليرقات بمنشفة ورقية.
- إذا لزم الأمر، قم بإرفاق دبابيس اثنين على جانبي البروثوراك، ثم قم بإصلاح اليرقة إلى حامل ثابت (على سبيل المثال، قطعة من الستايروفوم)(الشكل 3H).
ملاحظة: ضبط موقف وعدد من دبابيس، اعتمادا على مكان الحقن. في حالة P. zonata، ليس من الضروري إصلاح اليرقات مع دبابيس في هذه الخطوة. - تمتد الغشاء بين القطاعين بين الجزء الرابع و 5 من البطن باليد.
- جعل ثقب صغير مع إبرة غرامة في الغشاء بين القطاعين بين الجزء الرابع و 5th في الجزء البطني.
ملاحظة: هذا الإجراء ضروري للعديد من أنواع الأنيسوبتيران (اليعسوب) لأن الغشاء بين الأجزاء من الصعب جداً إدخال شعري زجاجي مباشرة. - أدخل طرف الشعيرات الدموية المعدة في الفتحة المعدة (الشكل 3I).
ملاحظة: كما هو مبين في الشكل 3H، جزء من الجانب الظهري من اليرقات يتوافق مع الجانب البطني للبالغين ، لذلك يظهر النمط الظاهري فيبطين عندما يعامل كما هو مبين في الشكل 3H- J. - حقن 1 ميكرولتر من محلول سيرنا/ ديسرنا.
4. في الكهرباء في الجسم الحي
- إذا لزم الأمر ، أضف المزيد من الدبابيس لإصلاح اليرقة إلى حامل ثابت (على سبيل المثال ، قطعة من الستايروفوم).
- بعد حقن محلول سيرنا/ ديسرنا، ضع قطرتين من جل الموجات فوق الصوتية على سطح اليرقات باستخدام ملقط.
- وضع الأقطاب الكهربائية على هلام الموجات فوق الصوتية، مع القطب الموجب على الجانب حقن مع محلول سيرنا / dsRNA و قطب سلبي على الجانب الآخر (الشكل 3E، 3G، 3J).
ملاحظة: لا تلمس البشرة مباشرة من اليرقة لتجنب تأثير حرق الكهربائي. - توليد نبضات كهربائية 10 مرات (280 مللي ثانية لكل من) باستخدام كهربائي.
ملاحظة: ضبط الجهد الكهربائي، اعتمادا على الأنواع، والمراحل والأنسجة. وفي هذه الدراسة، طُبقت 25 V على I. senegalensis و 45 V إلى P. zonata. - امسح الجل المتبقي على السطح بمنشفة ورقية.
- إبقاء اليرقات المعالجة يستريح على منشفة ورقية مبللة لمدة يوم واحد تقريبا للانتعاش ونقلها إلى حالة تربية في اليوم التالي.
5. تحليل فينوتيبيك خاص بالموقع
- الحفاظ على I. senegalensis بشكل فردي في طبق بيتري (5 سم في القطر) تحتوي على ما يقرب من 10 مل من الماء وقطعة منشفة ورقية، والحفاظ على P. zonata في قفص من البلاستيك مع شبكة غير المنسوجة المتاح (قفص eclosion14).
- بالنسبة لـ I. senegalensis، بعد أن تتوقف اليرقات عن الأكل ، انقلها بشكل فردي إلى قفص بلاستيكي مع شبكة غير منسوجة يمكن التخلص منها.
ملاحظة: لا تضع يرقات أو أكثر في نفس القفص. وإلا، سوف يكلون بعضهم البعض مباشرة بعد أن يصبحوا بالغين. - بعد ظهور الكبار، مراقبة وتصوير النمط الظاهري في جميع أنحاء المنطقة حيث تم وضع القطب الموجب الكهربائي الكهربائي.
ملاحظة: يظهر النمط الظاهري فقط في تصحيحات. غالبًا ما يصعب التعرف على الأنماط الظاهرية مباشرة بعد ظهورها بسبب التصبغ غير المكتمل. - من أجل دراسة كفاءة RNAi (على سبيل المثال، كمية RT-PCR)، إذا كان النمط الظاهري مرئيًا، فتشريح المنطقة ومقارنتها بالمنطقة بدون النمط الظاهري.
ملاحظة: مستويات النمط الظاهري RNAi، وهي حجم وموقع إزالة الألوان، وغالبا ما تظهر تباين كبير بين الأفراد (انظر الشكل 4). - الحفاظ على البالغين ظهرت في EtOH 100٪ لتحليل المستقبل.
ملاحظة: لون الجسم من أنواع أودوناتا سرعان ما يتلاشى بعد الموت، لذلك من المهم تخزينها في الإيثانول قبل أن تموت. في بعض الأحيان يُبدل الإيثانول لون الحشرات ، في مثل هذه الحالات التي يتم فيها تجميد الحشرات قبل أن تموت.
Representative Results
طبقنا البروتوكول المذكور أعلاه على RNAi بوساطة كهربائية يستهدف جينات MCO2 ومورثات التحكم السلبية(EGFP لـ siRNA و bla for dsRNA) (i) في بطن I. senegalensis (الشكل 4)، (ii) في صدر I. senegalensis (الشكل 5) ، و (iii) في بطن P. zonata (الشكل 6). ويرد ملخص لنتائج تجارب RNAi في الجدول 1. لأن يتم دمجها سالبا اتهم سيرنا / dsRNA في الخلايا المشحونة إيجابيا، ولوحظ الظاهريات RNAi في جميع أنحاء المنطقة حيث تم وضع القطب الموجب الكهربائي.
في كلا أنا. senegalensis وP. zonata، تثبيط تصبغ الميلانين (أي الأسود والبني والبني المحمر) ظهرت في بقع في جميع أنحاء المنطقة حيث تم وضع القطب الموجب (رؤوس الأسهم البيضاء والخطوط المنقطة في الشكل 4، الشكل 5، والشكل 6)عندما تم تنفيذ MCO2 RNAi في تركيبة مع الكهربائي(الجدول 1) ، كما ذكر سابقا في N. الأقزام9. وعلى النقيض من ذلك، لم تلاحظ أي آثار ظاهرية حول موقع الكهربائي عندما تم حقن جين التحكم(EGFP سيرنا أو بلا ديسرنا)(الشكل 4، الشكل 5، والشكل 6، الجدول 1). بالإضافة إلى ذلك، حقن الجين MCO2 دون الكهربائي لم يكن له أي تأثير على تصبغ الكبار(الشكل 4، الجدول 1)،مما يشير إلى أن الكهربائي ضروري لRNAi في أودوناتا. تجدر الإشارة إلى أن الألوان الزرقاء والأخضر والصفراء لا تتأثر بجين RNAi من MCO2 الذي يشارك في تخليق الميلانين في البشرة ، والتي تعكس بشكل معقول حقيقة أن هذه الألوان الجسدية تُنسب إلى حبيبات الصباغ الموجودة في خلايا البشرة التي تظهر من خلال بشرة شفافة26. كما هو مبين في الشكل 4، لم يتم التعرف على اختلافات ظاهرية ملحوظة بين الأفراد الذين خضعوا للعلاج بالرنا وعلاج DSRNA ، في حين لوحظ اختلاف كبير في حجم وموقع النمط الظاهري RNAi بين الأفراد المختلفين الذين خضعوا لنفس المعاملة RNAi (قارن مثالين من IsMCO2 dsRNA في الشكل 4).
لتحديد المرحلة التنموية الأكثر ملاءمة لعلاج RNAi ، قارنا عواقب علاج RNAi في خمس مراحل مورفولوجية (المرحلة A-E) في اليرقات الأخيرة من I. senegalensis (الشكل 7A). وقد لوحظ تثبيط تصبغ الميلانين الناجم عن MCO2 RNAi في جميع البالغين ظهرت عند حقنها في المرحلتين A وB (الشكل 7C). عندما حقن في مراحل C و D، وقد لوحظ بالتأكيد قمع تصبغ الميلانين في بعض البالغين ظهرت، ولكن غيرهم من البالغين أظهرت تلوين غير طبيعي الناجمة عن الجروح(الشكل 7B).
الشكل 1: الأساليب RNAi بوساطة الكهربائية في أودوناتا. أ. Ischnura السنغال (Coenagirionidae) كنوع من السدود ممثل. ب. pseudothemis zonata (قذفة) كنوع اليعسوب ممثل. ج. المخطط العام للبروتوكولات. المربعات الزرقاء والبرتقالية تشير إلى البروتوكولات الخاصة بـ I. senegalensis و P. zonata، على التوالي. تشير الصناديق الأرجوانية إلى البروتوكولات الشائعة المطبقة على كلا النوعين. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: نتيجة تمثيلية لتعدد أشكال طول جزء القيد (RFLP) القائم على تحديد الأنواع من الأنواع Ischnura. يشير Arrowhead إلى الفرقة الخاصة بـ I. senegalensis. 1، 2، 4: I. asiatica، 3: I. senegalensis، M: 100-قاعدة علامة سلم الزوج. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3:طريقة RNAi بوساطة كهربائية في أودوناتا. أ-سي. التخدير الجليد الباردة من I. السنغال. تشير رؤوس الأسهم إلى يرقة. أ. وضع يرقة على الثلج المسحوق مع ورقة مبللة. ب. منظر مكبر لليرقة على الجليد. ج. يرقة مغطاة بورق مبلل على الجليد. د-جي. RNAi طريقة ل. السنغال. د. حقن في الصدر. إ. الإكتِلبور على الصدر. ف. حقن في البطن. ز. الكهربائي على البطن. H-J. RNAi طريقة لP. zonata. ح. يحدث ثقب صغير في البطن. أنا، أنا حقن في البطن. ج. الكهربائي على البطن. الأسهم تشير إلى نقطة من صنع ثقب أو حقن. +، -: أقطاب جانبية إيجابية/سلبية. الأرقام تشير إلى الجزء البطني. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: وجهات النظر الظهرية من الأنماط الظاهرية RNAi على البطن من I. السنغال. تشير رؤوس الأسهم البيضاء إلى مناطق الميلانة المكبتة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: آراء المناظير الجانبيه والدنائية للرايات الظاهرية RNAi على صدر I. senegalensis. تشير رؤوس الأسهم البيضاء والخطوط المنقطة إلى مناطق التصبغ المُقمع. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: آراء فينترال من الأنماط الظاهرية RNAi في البطن من P. zonata. تشير رؤوس الأسهم البيضاء والخطوط المنقطة إلى مناطق الشفة المُقمعة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: المرحلة التابعة آثار ISMCO2 RNAi خلال اليرقات في آخر من i.senegalensis. أ. التغيرات المورفولوجية في العين المركبة في خمس مراحل مورفولوجية (المرحلة A-E) وعدد الأيام لظهور الكبار في هذه الدراسة. الأرقام الموجودة بين قوسين هي من التقرير السابق14. ب. تصبغ غير طبيعي بسبب الجروح. يشير رأس السهم إلى موقع الإلكتروبوريشن. ج. تأثير RNAi في خمس مراحل مورفولوجية على تصبغ الكبار في I. senegalensis. يشير الرقم على الشريط إلى عدد الأفراد. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| الانواع | I.senegalensis | P.zonata | |||||||||
| منطقة حقن | البطن | الصدر | البطن | ||||||||
| سيرنا/ديسرنا | سيرنا | dsRNA | dsRNA | dsRNA | |||||||
| الجين المستهدف | IsMCO2 | EGFP | IsMCO2 | IsMCO2 | بلوخ | IsMCO2 | بلوخ | PzMCO2 | PzMCO2 | بلوخ | |
| الكهرباء | + | + | + | - | + | + | + | + | - | + | |
| يرقات حقن | 22 | 25 | 30 | 6 | 53 | 12 | 20 | 17 | 5 | 9 | |
| البالغين ظهرت | 7 | 6 | 13 | 4 | 40 | 11 | 14 | 11 | 2 | 5 | |
| البالغين مع مناطق أقل مصطبغة (نسبة) | 7 (100%) |
0 (0%) |
13 (100%) |
0 (0%) |
0 (0%) |
10 (91%) |
0 (0%) |
11 (100%) |
0 (0%) |
0 (0%) |
|
الجدول 1- الانبعاثات 1000 تأثير RNAi على تصبغ الكبار في I. senegalensis وP. zonata. تظهر النتائج في المرحلة A في I. senegalensis. IsMCO2: multicopper oxidase 2 الجينات من I. senegalensis, EGFP: تعزيز الجينات البروتين الفلورسنت الخضراء, bla: بيتا لاكتاماز الجينات من pGEM-T سهل ناقلات, PzMCO2: multicopper oxidase 2 جين من P. zonata. وتمثل نتائج الجينات التحكمية العدد الإجمالي للتجارب التي أجراها المؤلفون حتى الآن.
Discussion
فتك العلاج RNAi
وجدنا أن فتاك علاج RNAi يعتمد بقوة على تاريخ تربية وحالة يرقات أودوناتا. اليرقات بعد وقت قصير من جمع في هذا المجال هي صحية عموما وتظهر معدلات وفيات منخفضة بعد العلاج RNAi بوساطة الكهربائية. وعلى النقيض من ذلك، تميل اليرقات التي تربى في المختبر لفترة طويلة من الزمن (مثل شهر واحد) إلى المعاناة من انخفاض معدلات نجاح ظهور البالغين. في I. senegalensis، بدلا من اليرقات التي تم جمعها في الحقل ، يمكن استخدام اليرقات التي تربى في المختبر من البيض14، ولكن معدلات نجاح RNAi باستخدام اليرقات التي يتم تربيتها في المختبر تميل إلى أن تكون أقل بكثير (توفي العديد من الأفراد أثناء التحول) من أولئك الذين يستخدمون اليرقات التي تم جمعها في الميدان. وبالإضافة إلى ذلك، فإن تغذية اليرقات المتكررة وتربية المياه النظيفة أمران مهمان لزيادة معدلات نجاح ظهور البالغين والحد من فتك معالجة الرنابي.
كفاءة العلاج RNAi
كما هو موضح أعلاه، فإن مستويات النمط الظاهري RNAi، أي حجم وموقع إزالة الألوان، غالبا ما أظهرت تباينا كبيرا بين الأفراد الذين تعرضوا لنفس المعاملة RNAi (على سبيل المثال، الشكل 4)،ولكن مستويات بينترترانس الظاهري يبدو أن تختلف بشكل ملحوظ بين الأنواع أودوناتا. وكانت مناطق الظاهرة الملحوظة أكبر وأكثر بروزا في I. senegalensis (الأرقام 4-5)مما كانت عليه في P. zonata (الشكل 6) وN. pygmaea9. قد يكون هذا الفرق بسبب سمك بشرة على سطح اليرقات ، مع الأخذ في الاعتبار أن بشرة I. senegalensis أرق من بشرة P. zonata و N. pygmaea). بقدر ما درسنا، لم يتم التعرف على أي فرق واضح بين آثار سيرنا وDSRNA(الشكل 4، الجدول 1).
مرحلة التطوير المناسبة لـ RNAi
تجدر الإشارة إلى أن التدريج المناسب لليرقات مهم لأداء RNAi بكفاءة. وقد تسبب تثبيط تصبغ الكبار من قبل MCO2 RNAi قبل المرحلة D (ما يقرب من 3 أيام قبل ظهور الكبار)، وهو ما يتفق مع التقرير السابق على N. pygmaea9. وكانت الأنماط الظاهرية RNAi التي لوحظت عند حقنها في المرحلتين C و D أقل وضوحا من تلك التي عولجت في المرحلتين A و B، والتي تشير إلى أن المرحلتين C و D قد تكون متأخرة جدا لقمع التعبير الجيني بشكل كاف. التوقيت المناسب لعلاج RNAi يعتمد على توقيت التعبير الجيني، والمورثات MCO2 معارض التعبير العالي عابرة خلال ظهور الكبار9، كما هو الحال في الحشرات الأخرى17،18. في stinkbug Plautia ستالي، لوحظ ضربة قاضية RNAi من الجين MCO2 من اليوم 4 فصاعدا بعد الحقن27، وهو ما يتفق مع النتائج الحالية.
أظهرت دراستنا السابقة حول I. senegalensis أنه بعد المرحلة B ، تظهر أيام لظهور البالغين اختلافًا صغيرًا نسبيًا بين غالبية يرقات instar النهائية ، مما يشير إلى أن المرحلة B قد تتوافق مع بداية العملية نحو ظهور البالغين ، وبعد ذلك تمضي العمليات التنموية للتحول بطريقة مسبوقة ومنسقة14. وكثيراً ما لوحظت تشوهات مورفولوجية ناجمة عن الجروح عندما كانت اليرقات تعالج في المرحلتين C وD(الشكل 7B, 7C). ومن المرجح أن يكون هذا مرتبطا مع تطور دراماتيكي من التحول خلال هذه المراحل, مما يشير إلى أن العلاج RNAi ينبغي تجنبها من المرحلة C وعلى. وباختصار، نوصي بأن تستخدم يرقات إنستار النهائية في المرحلة A أو B (أو في المرحلة قبل أن تتوسع أجنحة اليرقات بشكل كبير) لإجراء تجارب RNAi.
فائدة وتفوق أسلوب RNAi بوساطة الكهربة
وRNAi التقليدية هي طريقة تجريبية بسيطة وقوية ، ولكن بعض أنساب الحشرات مثل الفراشات10، المن28 واليعسوب9 معرض منخفضة كفاءة RNAi ، والتي إنشاء تحليل وظيفة الجينات هو تحد كبير. في هذه الدراسة، وجدنا أن RNAi بوساطة كهربائية يمكن أن تحفز على قمع الجينات المحلية في اليعسوب مع كفاءة 100٪ تقريبا، على الأقل في البشرة، إذا عولجت في مراحل النمو المناسبة(الجدول 1). في الآونة الأخيرة ، تم تطبيق خروج المغلوب للجينات المستندة إلى CRISPR / Cas9 بنجاح على مجموعة متنوعة من الحشرات ، مما يوفر أداة جينية جزيئية قوية للكائنات غير النموذجية29. هنا ، ومع ذلك ، فإننا نشير إلى أن CRISPR / Cas9 هو بالتأكيد كبيرة ولكن الأسلوب RNAi بوساطة كهربائية قد تكون متفوقة على CRISPR / Cas9 في بعض النواحي.
أولاً، في طريقة RNAi بوساطة كهربائية، منطقة الجسم حيث تظهر الأنماط الظاهرية RNAi يمكن التحكم فيها بسهولة تجريبياً من قبل موضع القطب الموجب عند electroporation. وبالإضافة إلى ذلك، بما أن المنطقة التي يتم فيها قمع التعبير الجيني محدودة في جميع أنحاء المنطقة التي تم فيها وضع القطب الموجب، يمكن مقارنة الأنماط الظاهرية RNAi بسهولة مع الأنماط الظاهرية للتحكم جنبًا إلى جنب في نفس الفرد. ثانيا ، بالمقارنة مع CRISPR / Cas9 الطريقة التي حقن البيض يجب أن تكون تربى على مرحلة البلوغ لمراقبة ظاهرية خروج المغلوب ، و RNAi بوساطة الكهربائية متفوقة في أن الجينات ضرب الظاهري يمكن عادة أن يلاحظ في وقت أقصر بكثير. على سبيل المثال، يستغرق ثلاثة إلى أربعة أشهر ل. سنغالنسنسيس سنة إلى سنتين لP. zonata من البيض إلى البالغين14،30. ومع ذلك ، من أجل مراقبة الأنماط الظاهرية RNAi داخل البشرة البالغة ، يستغرق الأمر أقل من شهر واحد من حقن DSRNA إلى يرقات instar النهائية في المرحلة B إلى ظهور البالغين لكل من I. senegalensis و P. zonata (الشكل 7). ثالثاً، إن طريقة RNAi التي يتم بوساطة كهربائية تنطوي على حقن DSRNA في يرقات كبيرة، وهو أسهل من الحقن المجهري في البيض الصغير المطلوب لطريقة CRISPR/Cas9. وبالإضافة إلى ذلك، فإن RNAi بوساطة كهربائية ينطبق على أنواع الحشرات التي يصعب جمع بيضها الذي وضع حديثاً. على سبيل المثال، تضع الإناث من P. zonata البيض على النباتات العائمة على سطح الماء أثناء الطيران، وبالتالي فإنه من الصعب جمع بيضهم في كل من الحقل وفي المختبر. وبالتالي، نتوقع أن يكون هذا البروتوكول قابلاً للتطبيق بشكل عام على الكائنات غير النموذجية التي لا تعمل فيها الطريقة التقليدية لـ RNAi بكفاءة.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
نشكر مينورو مورياما على المشورة الفنية والدعم، وبن هيروتا وريوتارو سوزوكي لجمع يرقات أودوناتا، وميسا شينيا للتعليقات المفيدة على المخطوطة. وقد تم دعم هذا العمل من قبل JSPS KAKENHI أرقام منحة JP18J21561 إلى GO وJP18H02491، JP18H04893، JP19H03287، وJ20H04936 إلى RF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plate | Violamo | VTC-P12 | For rearing larvae before injection |
| Brine shrimp eggs | JAPAN PET DESIGN | 4975677012396 | |
| Calibrated micropipette (1-5 µL) | Drummond | 2-000-001-90 | |
| Deposit pestle 1.5 mL | Thermo Fisher Scientific | K749520-0090 | |
| Digital high defenition microscope camera | Leica Microsystems | MC170HD | |
| Disposable non-woven mesh | HAKUGEN EARTH | DSC-105A | |
| DNA Ligation Kit Ver.2.1 | Takara Bio | 6022 | |
| DraI | Takara Bio | 1037A | |
| Electrode (1mmφ) | NEPAGENE | CUY650P1 | |
| Electroporator | CellProduce | Cure-gene | |
| Forceps | KOWA Forceps Industry | K-10 No1 | |
| Glass needle puller | NARISHIGE | PN-3 | |
| Hand mixer | AS ONE | 1-229-02 | |
| Hand net | HOGA | IS33-3B | |
| HEPES | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 346-01373 | For injection buffer |
| Insect pin capitate No. 3 | Shiga Konchu Fukyusha | N230 | For fixing larvae |
| KCl | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 163-03545 | For PBS |
| KH2PO4 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 169-04245 | For PBS |
| KOAc | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 160-03175 | For injection buffer |
| KOH | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 168-21815 | For injection buffer |
| Laboratory Jack (150x150) | AS ONE | 1-4642-11 | For adjusting the position of the manipulator |
| LOGIQLEAN Gel for Ultrasound Hard type | GE Healthcare | 2369385 | |
| Manipulator | Muromachi Kikai Co., Ltd. | SJ-1 | For adjusting the position of the injector and the capillary |
| MEGAscript RNAi kit | Thermo Fisher Scientific | AM1626 | |
| Mg(OAc)2 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 130-00095 | For injection buffer |
| Na2HPO4 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 197-02865 | For PBS |
| NaCl | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 191-01665 | For PBS |
| Petri dish (5 cm diameter) | Iwaki | 1010-060 | For rearing injected larvae |
| Pneumatic Injector | NARISHIGE | IM-12 | |
| pT7Blue T-Vector | Novagen | 69820 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28106 | |
| RNAiso Plus | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 9109 | |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74106 | |
| Shiga micro insect pin with stainless headless | Shiga Konchu Fukyusha | N251 | For making a small hole |
| Stereoscopic microscope | Leica Microsystems | S8APO | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18090010 | |
| TaKaRa Ex Taq | Takara Bio | RR001B | For PCR-amplification from plasmid |
| Tks Gflex DNA Polymerase | Takara Bio | R060B | For PCR-amplification from caudal gill |
References
- Misof, B., et al. Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 346 (6210), 763-767 (2014).
- Wipfler, B., et al. Evolutionary history of Polyneoptera and its implications for our understanding of early winged insects. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (8), 3024-3029 (2019).
- Corbet, P. S. Dragonflies Behavior and Ecology of Odonata. , Cornell University Press. Ithaca, NY. (1999).
- Futahashi, R. Color vision and color formation in dragonflies. Current Opinion in Insect Science. 17, 32-39 (2016).
- Futahashi, R. Diversity of UV reflection patterns in Odonata. Frontiers in Ecology and Evolution. 8 (201), (2020).
- Córdoba-Aguilar, A. Dragonflies and damselflies. Model organisms for ecological and evolutionary research. , Oxford University Press. Oxford. (2008).
- Bybee, S., et al. Odonata (dragonflies and damselflies) as a bridge between ecology and evolutionary genomics. Frontiers in Zoology. 13 (46), (2016).
- Linz, D. M., Clark-Hachtel, C. M., Borràs-Castelles, F., Tomoyasu, Y. Larval RNA interference the red flour beetle, Tribolium castaneum. Journal of Visualized Experiments. 92, 52059 (2014).
- Okude, G., et al. Electroporation-mediated RNA interference reveals a role of multicopper oxidase 2 gene in dragonfly’s cuticular pigmentation. Applied Entomology and Zoology. 53 (3), 379-387 (2017).
- Terenius, O., et al. RNA interference in Lepidoptera: An overview of successful and unsuccessful studies and implications for experimental design. Journal of Insect Physiology. 57, 231-245 (2011).
- Ando, T., Fujiwara, H. Electroporation-mediated somatic transgenesis for rapid functional analysis in insects. Development. 140, 454-458 (2013).
- Nishikawa, H., et al. A genetic mechanism for female-limited Batesian mimicry in Papilio butterfly. Nature Genetics. 47 (4), 405-409 (2015).
- Osanai-Futahashi, M., et al. Positional cloning of a Bombyx pink-eyed white egg locus reveals the major role of cardinal in ommochrome synthesis. Heredity. 116 (2), 135-145 (2016).
- Okude, G., Futahashi, R., Tanahashi, M., Fukatsu, T. Laboratory rearing system for Ischnura senegalensis (Insecta: Odonata) enables detailed description of dragonfly’s larval development and morphogenesis. Zoological Science. 34 (5), 386-397 (2017).
- Ozono, A., Kawashima, I., Futahashi, R. Dragonflies of Japan (3rd edition). , Bunichi-Sogo Syuppan, Co Ltd. Tokyo. (2017).
- Ozono, A., Kawashima, I., Futahashi, R. The Handbook of Japanese Aquatic Insects. Volume 3: Dragonfly larvae. , Bunichi-Sogo Syuppan, Co Ltd. Tokyo. (2019).
- Arakane, Y., Noh, M. Y., Asano, T., Kramer, K. J. Tyrosine metabolism for insect cuticle pigmentation and sclerotization. Extracellular Composite Matrices in Arthropods. , Springer. 165-220 (2016).
- Asano, T., et al. Mini-review an insect-specific system for terrestrialization: Laccase-mediated cuticle formation. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 108, 61-70 (2019).
- Futahashi, R., Okude, G., Sugimura, M., Ugai, S.
- Okude, G., Fukatsu, T., Futahashi, R. Interspecific crossing between blue-tailed damselflies Ischnura elegans and I. senegalensis in the laboratory. Entomological Science. 23 (2), 165-172 (2020).
- Naito, Y., Yoshimura, J., Morishita, S., Ui-Tei, K. siDirect 2.0: updated software for designing functional siRNA with reduced seed-dependent off-target effect. BMC Bioinformatics. 10, 392 (2009).
- Yamaguchi, J., Mizoguchi, T., Fujiwara, H. siRNAs induce efficient RNAi response in Bombyx mori embryos. PLoS ONE. 6 (9), e25469 (2011).
- Untergasser, A., et al.
- Futahashi, R. Whole-mount in situ hybridization of sectioned tissues of species hybrids to detect cis-regulatory changes in gene expression pattern. Methods in Molecular Biology. 772, 319-328 (2011).
- Matsuura, Y., Kikuchi, Y., Miura, T., Fukatsu, T. Ultrabithorax is essential for bacteriocyte development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (30), 9376-9381 (2015).
- Henze, M. J., Lind, O., Wilts, B. D., Kelber, A. Pterin-pigmented nanospheres create the colours of the polymorphiic damselfly Ischnura elegans. Journal of The Royal Society Interface. 16, 20180785 (2019).
- Nishide, Y., et al. Diversity and function of multicopper oxidase genes in the stinkbug Plautia stali. Scientific Reports. 10 (1), 3464 (2020).
- Christiaens, O., Swevers, L., Smagghe, G. DsRNA degradation in the pea aphid (Acyrthosiphon pisum) associated with lack of response in RNAi feeding and injection assay. Peptides. 53, 307-314 (2014).
- Sun, D., Guo, Z., Liu, Y., Zhang, Y. Progress and prospects of CRISPR/Cas systems in insects and other arthropods. Frontiers in Physiology. 8, 608 (2017).
- Miyakawa, K. A study of the life-history of Pseudothemis zonata (Burm.) (Odonata, Libellulidae) II. Immature stage. Kontyû. 37 (4), 409-422 (1969).
