Summary
우리는 청색 꼬리 댐을 사용하여 주문 오도나타 (잠자리와 담석)의 곤충에 전기 포기 매개 RNA 간섭에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다(이쉬누라 세네갈렌시스: 코나그리니대 : 지고피테라) 및 파이드 스키머 드래곤 플라이(Pseudothems zonata: Libelluldaei)
Abstract
잠자리와 저주 (오도나타 순서)는 변태와 가장 조상 곤충 중 하나를 나타냅니다, 그들은 그들의 서식지를 변경하는, 형태학, 그리고 푸팔 단계없이 지상파 / 공중 성인에 수생 애벌레에서 크게 행동. 오도나타 성인은 잘 발달 된 색상 비전을 가지고 있으며 남녀, 단계 및 종에 걸쳐 신체 색상과 패턴의 놀라운 다양성을 보여줍니다. 오도나타에 대한 많은 생태학적 및 행동 연구가 수행되었지만, 분자 유전 연구는 주로 오도나타에 유전자 기능 분석을 적용하는 데 어려움으로 인해 부족했습니다. 예를 들어, RNA 간섭 (RNAi)은 Lepidoptera에서 보고된 바와 같이 오도나타에서 덜 효과적입니다. 이 문제를 극복하기 위해 생체 내 전기 포기와 결합된 RNAi 방법을 성공적으로 확립했습니다. 여기서 우리는 다음과 같이 전기 화 매개 RNAi 방법의 비디오를 포함하는 상세한 프로토콜을 제공합니다 : 애벌레의 준비, 종 식별, dsRNA / siRNA 용액 및 주사 바늘의 준비, 유충의 얼음 감기 마취, dsRNA / siRNA 주입, 생체 내 전기 화, 성인이 출현 할 때까지 개별 양육. 전기화 매개 RNAi 방법은 댐셀프(자고피테라 하위 오더)와 잠자리(하위 오더 아니스옵테라)에 적용가능하다. 이 프로토콜에서는, 우리는 잠자리 종의 또 다른 예로, 우리는 청꼬리 이쉬누라 세네갈렌시스 (코에나그로니다)에 대한 방법을 저주 종과 파이드 스키머 잠자리 의사 세포염 조나타 (리벨룰리대)의 예로 제시한다. 대표적인 예로, 멜라닌 합성 유전자 멀티구리 산화제 2를표적으로 하는 RNAi의 결과를 보여준다. 이 RNAi 방법은 오도나타의 변형, 형태 발생, 색상 패턴 형성 및 기타 생물학적 특징에 관여하는 다양한 유전자 기능에 대한 이해를 용이하게 할 것입니다. 더욱이, 이 프로토콜은 RNAi가 비효율성 과 낮은 침투로 인한 유전자 억제에 덜 효과적인 비모델 유기체에 일반적으로 적용될 수 있다.
Introduction
잠자리와 담석 (오도나타 질서)은 "변태"1,2를나타내는 곤충의 가장 조상 그룹 중 하나입니다. 변태에 의해, 그들은 그들의 서식지를 변경, 형태, 그리고 행동 수생 애벌레에서 지상파/공중 성인3. 오도나타 성인은 잘 발달 된 색상 비전을 가지고 있으며 남녀, 단계 및 종3,4,5에걸쳐 신체 색상과 패턴의 놀라운 다양성을 나타냅니다. 오도나타에 대한 많은 생태 및 행동 연구가 실시된반면,6,7,분자 유전 연구는 주로 오도나타에 유전자 기능 분석을 적용하는 데 어려움에 의해 방해되고 있다.
상기 종래의 RNA 간섭(RNAi) 방법은, 이중 좌초 RNA(dsRNA)가 관심 있는 유전자의 기능을 억제하기 위해 주입되는8,오도나타 곤충9에서효과가 없는 것으로 밝혀졌으며, 레피도프테라곤충(10)에보고된 바와 같이. 한편, 이전 보고서는 전기포기 매개 RNAi가 레피도프테란 종, 특히 표피 조직11,12,13에서효과적이라고 제안했다. 우리는 최근에 전기 포기 매개 RNAi가 작은 잠자리 난노피라 피그마에아 (리벨룰리대: 아니스옵테라)9에서효과적으로 작동한다는 것을 것을을 발견했습니다 9, 그러나 N. pygmaea는 상대적으로 희소한 종이고 따라서 분자 유전 연구 결과에 적합하지 않습니다.
대부분의 오도나타 종은 두 개의 하위 오더중 하나, 자고피테라 (담터리) 또는 아니노테라 (진정한 잠자리)3중하나에 분류된다. 여기서 우리는 청색 꼬리에 초점을 맞추고 이쇠누라 세네갈렌시스 (코에나그로니대; 그림 1A) 대표적인 지고펫 종과 파이드 스키머 드래곤플라이 슈도테마시스 조나타(리벨룰리대; 그림 1B) 대표적인 아니시옵터종. 두 종은 쓰쿠바시를 포함하여 일본의 자연 및 도시 연못에서 가장 흔한 오도나타 종 중 하나이며, 우리는 현장에서 두 종의 많은 애벌레를 수집 할 수 있습니다. 최근에는 오도나타 애벌레의 발달및 형태발생에 대한 지속적인 모니터링을 가능하게 하는 I. 세네갈렌시스의개별 애벌레를 위한 실험실 사육 시스템을 구축하였으며,14.
본 보고서에서, 우리는 I. 세네갈렌시스 및 P. 조나타에서전기화 매개 RNAi에 대한 정제 된 방법 및 비디오 프로토콜을 제공합니다. 일본에서는 유전적으로 가까운 I. 세네갈렌시스와 이쉬누라 아시아티카가종종 교활하게15개,애벌레16에서구별하기 어렵다. 우리는 또한 2개의 Ischnura 종제한 단편 길이 다형성 (RFLP)에 의해 구별될 수 있는 방법을 설명합니다.
전기포기 매개 RNAi의 효과를 평가하기 위해, 유전자 발현9의녹다운 시 창백한 자염색의 가시형을 고려하여 다중구리 산화제 2 유전자(MCO2; laccase2라고도함)를 대표적인 표적 유전자로 선별한다. MCO2는 다양한 곤충종(17,18)에서표피의 어둡게 하는 데 필수적인 것으로 알려져 있다.
Protocol
참고: 프로토콜의 전체 구성표는 그림 1에표시됩니다.
1. 잠자리 또는 댐셀프의 애벌레준비.
- 손망을 사용하여 현장에서 애벌레를 수집합니다.
참고 : 나는 종종 수면에 떠있는 물 식물에 집착 하는 세네갈렌시스 애벌레, P. 조나타 애벌레는 종종 바닥에 잎 쓰레기 사이 유지 하는 동안. 쓰쿠바시에서는 3월부터 6월까지 는 주로 100억 개의 스타 애벌레와 5월부터 6월까지 P. 조나타에서 발견됩니다. I. 세네갈렌시스 애벌레는 실험실 에서 계란에서 사육 될 수있다14,하지만 현장에서 수집 된 애벌레는 성인 출현의 명확하게 높은 성공률을 가지고있다. - PCR 증폭 제품의 제한 단편 길이 다형성(RFLP)에 의한 종 식별.
참고: 이 단계는 종들이 애벌레의 출현에서 식별하기 어려운 경우에만 필요합니다.- 집게를 사용하여 애벌레의 소달 아가미 중 하나를 잡습니다. 그런 다음, 애벌레는 그 caudal 아가미 자체에서 떨어진다 (자기 절제술을 일으키는).
참고 : 자고프테라의 애벌레는 일반적으로 세 개의 caudal 아가미(그림 1A)가있습니다. 그들은 포식자에 의해 공격 될 때, 그들은 탈출하기 위해 자신의 caudal 아가미를 벗을 수 있습니다. 코달 아가를 사용할 수없는 경우 다리의 일부가 해부됩니다. - PBS 용액의 100 μL에 1개의 caudal 아가를 넣고 [0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.115% Na2HPO4,및 0.02% KH2PO 4(w/v)] 및 예금 유봉을 사용하여 핸드 믹서로 균질화한다.
- 혼합물을 5,000 x g에서 10초 동안 스핀다운하고, 핵 DNA의 내부 전사 스페이서 1(ITS1) 영역을 증폭시키기 위해 DNA 폴리머라제 및 프라이머를 사용하여 PCR 증폭에 대한 상수체의 0.5 μL을 피한다.
참고: 제조업체의 프로토콜에 따라 PCR을 수행합니다. ITS-F0(5'-GGA AAG ATG GCC AAA CTT GA-3')과 5.8S-AS1(5'-GCC GGC CCT CCT CCT CCA G-3') 프라이머의 조합은 거의 모든 오도나타 종19종에서ITS1 영역을 증폭시킬 수 있다. - PCR 증폭 제품의 1 μL, 10x M 버퍼의 0.3 μL, 드라이 제한 효소의 0.1 μL, 1시간 동안 37°C의 물 1.6μL의 혼합물을 배양한다.
참고: 종의 조합에 따라 최상의 제한 효소를 선택합니다. 종 식별에 적합한 제한 효소가 없는 경우 DNA 염기서열분석으로 확인하십시오. - 2% 아가로즈 젤에 염색을 적재하고 전기전도를 실행하여 제품의 2 μL을 적재합니다.
참고: 1% 또는 1.5% 아가로즈 젤을 사용할 때 종을 식별하기는 어렵습니다. - 전기 전도 패턴을 확인하여 종을 식별합니다(도2).
참고: RFLP 패턴은 종 및 인구에 따라 다릅니다. 츠쿠바 인구에서는 400-500 bp의 주요 대역을 가지고 있는 반면, I. 세네갈렌시스는 약 200bp의 주요 밴드와 100bp 미만의 추가 대역을 가지고 있습니다(그림 2의화살촉). ITS1 영역은 게놈의 여러 사본에 존재하며, 이쉬누라 종에서는 ITS1 영역 내의 마이크로위성 다형성이 종종 동일한 개인에 존재하여 RFLPs의 패턴에 영향을 미칩니다.
- 집게를 사용하여 애벌레의 소달 아가미 중 하나를 잡습니다. 그런 다음, 애벌레는 그 caudal 아가미 자체에서 떨어진다 (자기 절제술을 일으키는).
- RNAi에 사용할 때까지 실험실에서 수집 된 애벌레를 후면하십시오.
- 각 유충을 12웰 플레이트의 각 우물에 약 3mL의 물을 별도로 놓습니다.
참고: 나는 세네갈렌시스 애벌레는 자주 서로 식인화하기 때문에 개별적으로 보관되어야 하며, P. 조나타 애벌레는 거의 식인성수때문에 그룹으로 보관할 수 있습니다. - 매일 아르테미아 염수 새우를 곁들인 세네갈렌시스 애벌레와 P. 조나타 애벌레를 먹이고, RNAi에 적합한 발달 단계로 성장할 때까지 적어도 일주일에 두 번 또는 투비펙스 벌레를 가진 P. 조나타 애벌레를 먹이세요.
참고: 빈번한 수유는 성인 출현의 성공률을 높이는 데 중요합니다. - 대변이나 남은 물로 더러워지자마자 물을 바꿉니다.
참고: 빈번한 물 변화는 성인 출현의 성공률을 높이는 데도 중요합니다. - RNAi에 대한 적절한 개발 단계를 판단하십시오.
참고: I. 세네갈렌시스의 최종 인스타 애벌레는14,20의5개의 발달 단계로 분류될 수 있다. 첫 번째 단계(스테이지 A, 날개가 확장되기 전에) 또는 최종 인스타 애벌레의 두 번째 단계(단계 B)는 성인 출현 후 RNAi의 명확한 표현형을 고려할 때 RNAi 실험에 적합합니다(토론 참조). P. zonata에서,날개 확장 전에 최종 인스타 애벌레 (I. 세네갈렌시스의단계 A에 해당) 이 연구에서 사용되었다.
- 각 유충을 12웰 플레이트의 각 우물에 약 3mL의 물을 별도로 놓습니다.
2. RNAi에 대한 dsRNA / siRNA 용액 및 주입 바늘의 준비.
참고: RNAi용 용액으로 작은 간섭 RNA(siRNA) (단계 2.1) 또는 이중 좌초 RNA(dsRNA) (단계 2.2)를 선택한다.
- siRNA 용액의 준비
- 이전에 Lepidopteran 곤충(22)에보고 된 지침에 따라 siDirect 프로그램 버전 2.0 (http://sidirect2.rnai.jp/)21을사용하여 siRNA를 설계합니다.
- 상업적으로 합성된 siRNA를 얻습니다.
참고: 이 연구에서 사용된 I. 세네갈렌시스의 MCO2 유전자를 표적으로 하는 siRNA의 서열은 다음과 같습니다: 5'-GCA CUU UCC GUU UU AAU AU AUAU AUA -3' 센스 가닥에 대 한 및 5'-UAU UGA UAA CGG AA GUG CUC -3' 안티 센스 가닥에 대 한. 음성 대조군으로서, 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP)유전자를 표적으로 하는 siRNA의 서열은 다음과 같이: 5'-GCA UCA AG UGA ACU UCA AGA -3' 센스 가닥및 5'-UUG AAG UUC ACC UUG CCG -3' 안티가닥에 대한11. - 사출 버퍼 [100 mM CH3COOK, 2 mM Mg (CH3COO)2,30 mM HEPES-KOH, pH 7.4]22로siRNA를 100 μM로 희석한다.
- 사용 전까지 -80°C에 보관하십시오.
- dsRNA 용액의 준비.
- 프라이머3 프로그램 버전 4.1.0(http://bioinfo.ut.ee/primer3/)23을 사용하여 dsRNA에 대한 300-400 bp 영역을 선택하고 프라이머 세트를 설계한다.
- 상업적으로 합성된 프라이머 세트를 획득하십시오.
참고 : dsRNA 합성을위한 템플릿을 생산하기 위해,이 연구에 사용되는 프라이머 세트는 다음과 같습니다 : (5'- GCC TGT CAG CTT TGT CTT CC -3' 앞으로 프라이머에 대한 5'- GGT GTC TGG CGG ACA ACT AT -3' 역 프라이머에 대한) I. senegalensis의 MCO2 유전자에 대한(IsMCO2,액세스 없음) LC589180) 및 (5'-CCG CAC AGC TCA CTA TTC AA -3' 포워드 프라이머및 5'-GGA GGA TTC CTT CAT CGA CA -3' P. 조나타 유전자에 대 한(PzMCO2,가입 없음) LC589179). 음의 대조군으로서, 복제 벡터에 β-락타마제(bla) 유전자를 대상으로 하는 dsRNA에 대한 프라이머 세트는 (5'-CTA TGT GGC GCG GTA TA T-3' 포워드 프라이머및 5'-CAG AAG TG TCC TGC TCC TGC TCC TCC TAC T-3' 역프라이머용)이었다. - 오도나타 애벌레로부터 RNA를 추출하여 시판되는 RNA 추출 키트를 사용하고 제조업체의 프로토콜에 따라 역전사를 사용하여 cDNA 합성을 수행한다.
참고: RNA 염기서열 분석용으로 제조된 cDNA 라이브러리도 사용될 수 있다. - 합성된 cDNA 및 설계된 프라이머 세트를 사용하여 대상 서열을 증폭하고 제조업체의 프로토콜에 따라 상업용 리간아제를 사용하여 복제 벡터로 복제한다.
- 플라스미드를 대장균 유능한 세포로 변환하고 하룻밤 잠복 후 단일 식민지를 선택합니다.
- 벡터의 프라이머를 사용하여 삽입 영역을 PCR-증폭합니다.
- Sanger 시퀀싱에 의해 복제된 시퀀스를 확인합니다.
- PCR-T7 폴리머라제 프로모터서열(24, 25)을포함하는 벡터 프라이머를 사용하여 인서트를 증폭한다.
참고 : 이 연구에서, 다음과 같은 프라이머가 사용되었다 : T7-F (5'- TAA TAC GAC TCA CTA 태그 GGA GAC 태그 TCA TAT GGA T - 3') 및 T7-R (5'- TAA TAC GAC TCA CTA 태그 GGA GAC TCA CTA 태그 GGA GAC CCG GGG ATC CGA T - 3') 25. - 제조업체의 프로토콜에 따라 PCR 정제 키트를 사용하여 PCR 제품을 정화하고, 증류수 50μL로 DNA를 엘테우하고, 원심 증발기를 사용하여 약 10 μL에 용출된 DNA 용액을 농축한다.
- 제조 업체의 프로토콜에 따라 체외 전사에 의해 dsRNA를 합성. 총 1000ng 템플릿 DNA및 용출 버퍼 100 μL의 합성 dsRNA를 사용합니다.
- 분광계를 사용하여 dsRNA의 농도를 측정하고 1.5% 아가로즈 젤에서 전기전도에 의한 dsRNA의 품질을 확인한다.
참고: dsRNA 합성이 성공할 때 단일 밴드를 볼 수 있습니다. - dsRNA를 용출 버퍼로 1000 ng/μL로 희석하고 사용할 때까지 -20°C에 보관하십시오.
- 주사 바늘의 준비
- 유리 바늘 풀러를 사용하여 유리 모세관을 당깁니다.
- 당겨진 모세관 의 끝을 양면 접착제 테이프에 놓고 모세관 끝을 집게로 부수습니다.
- 모세관을 인젝터로 설정합니다.
참고: 니트릴 장갑을 착용하면 모세관을 취급하는 것이 더 쉽습니다. - 제조된 모세관에 siRNA/dsRNA 용액을 적재합니다.
참고: 주입된 모세관의 끝이 진흙에 살았던 유충이 진흙에 살았기 때문에 흙으로 막힐 수 있으므로 모세관을 반복적으로 사용하지 마십시오.
3. siRNA/dsRNA 주입
참고: 절차는 댐셀프(3.1단계) 및 잠자리(3.2단계)에 대해 약간 다릅니다.
- 자고피란 (담스스로) 애벌레에 주입 (예를 들어, I. 세네갈렌시스).
- 50-70초 동안 분쇄된 얼음에 젖은 종이로 덮인 애벌레를 마취시(그림3A-C).
참고: 얼음감기 마취의 지속 시간은 애벌레의 상태에 달려 있습니다. 유충이 얼음 차가운 마취 70초 후에 움직이기 시작하면 70초의 얼음감기 마취가 추가로 적용됩니다. 거의 움직이지 않는 애벌레의 경우(예: P. 조나타)이이 절차는 필수적이지 않습니다. - 프로토락의 양쪽에 두 개의 핀을 부착하고 유충을 고정 스탠드(예: 스티로폼 조각)에 고정합니다(그림3D).
참고: 주입 장소에 따라 핀의 위치와 수를 조정합니다. - 복부에 있는 RNAi를 위한 7그리고 8 복부 복부 세그먼트 사이 또는 손과 포셉을 사용하여 흉부에서 RNAi에 대한 prothorax 및 신교 (융합 된 중토락 및 메타토락스) 사이 세그먼트 간 막을 스트레칭합니다.
- 세그먼트 간 멤브레인을 손으로 길게 유지합니다.
- 준비된 모세관의 끝을 연늘한 세그먼트 간 멤브레인(도3D, 3F)에삽입한다.
- siRNA/dsRNA 용액의 1 μL을 주입하십시오.
- 50-70초 동안 분쇄된 얼음에 젖은 종이로 덮인 애벌레를 마취시(그림3A-C).
- 아니옵테란 (잠자리) 애벌레에 주입 (예를 들어, P. 조나타).
- 종이 타월로 애벌레 표면에서 물을 닦으부습니다.
- 필요한 경우 프로토락스 양쪽에 두 개의 핀을 부착하고 유충을 고정 스탠드(예: 스티로폼 조각)에고정합니다(그림 3H).
참고: 주입 장소에 따라 핀의 위치와 수를 조정합니다. P. 조나타의경우, 이 단계에서 핀으로 애벌레를 고치는 것은 필수적이지 않습니다. - 4번째와 5차 복부 세그먼트 사이에 세그먼트 간 멤브레인을 손으로 스트레칭합니다.
- 4번째와 5차 복부 세그먼트 사이의 세그먼트 간 막에 미세한 바늘로 작은 구멍을 만드십시오.
참고: 세그먼트 간 멤브레인이 유리 모세관을 직접 삽입하기가 너무 어렵기 때문에 이 절차는 많은 아니옵테란 (잠자리) 종에 필요합니다. - 준비된 모세관의 끝을 준비된 구멍에 삽입한다(도3I).
참고: 도 3H에도시된 바와 같이, 애벌레의 등쪽의 일부는 성인의 복부 측에 해당하므로 도 3H-J에도시된 바와 같이 표현형이 통풍구로 나타납니다. - siRNA/dsRNA 용액의 1 μL을 주입하십시오.
4. 생체 내 전기 포기
- 필요한 경우 고정 스탠드(예: 스티로폼 조각)에 애벌레를 고정하기 위해 핀을 더 추가합니다.
- siRNA/dsRNA 용액의 주입에 따라, 집게를 사용하여 애벌레 표면에 초음파 젤의 두 방울을 적용합니다.
- 초음파 젤상에 전극을 배치하고, 양극을 측면에 주사하여 siRNA/dsRNA 용액과 반대쪽에 음극을 주입한다(도3E, 3G, 3J).
참고: 전기포이니화의 연소 효과를 피하기 위해 애벌레의 표피를 직접 만지지 마십시오. - 전기포로이터를 사용하여 10배의 전기포기 펄스(각각 280ms/s)를 생성합니다.
참고: 종, 단계 및 조직에 따라 전기 기공 전압을 조정합니다. 이 연구에서는, 25 V는 I. 세네갈렌시스와 45 V에서 P. 조나타에적용되었다. - 종이 타월로 표면에 남은 젤을 닦아냅니다.
- 처리된 애벌레는 젖은 종이 타월에 약 1일 동안 누워 서 복구를 위해 보관하고 다음 날 사육 케이스로 옮길 수 있습니다.
5. 사이트 별 표면 분석
- 약 10mL의 물과 종이 타월을 포함하는 페트리 접시(직경 5cm)에 개별적으로 세네갈렌시스를 보관하고, 일회용 부직포 메쉬(백로션 케이지14)가있는 플라스틱 케이지에 P. 조나타를 보관하십시오.
- I. 세네갈렌시스의경우, 애벌레가 먹는 것을 중단한 후 일회용 부직포 메쉬가 있는 플라스틱 케이지로 개별적으로 옮춥시다.
참고: 같은 케이지에 두 개 이상의 애벌레를 넣지 마십시오. 그렇지 않으면 성인이 된 직후에 서로 를 식인화합니다. - 성인의 출현 후, 관찰 및 전기 포기포를 위해 양극이 배치 된 영역 주변의 표현형을 촬영.
참고: 표현형은 패치에만 나타납니다. 표현형은 불완전한 착색으로 인해 출현 직후에 인식하기가 어렵습니다. - 표현형이 보이면 RNAi(예를 들어 정량적 RT-PCR)의 효율을 검사하기 위해 영역을 해부하고 표현형없이 영역과 비교한다.
참고: RNAi 표현형의 수준, 즉 표피 탈색의 크기 및 위치는 종종 개인 간에 상당한 변화를 나타낸다(그림 4참조). - 향후 분석을 위해 등장한 성인을 100% EtOH로 유지하십시오.
참고 : 오도나타 종의 신체 색상은 죽음 후 빠르게 퇴색, 그래서 그들이 죽기 전에 에탄올에 저장하는 것이 중요합니다. 에탄올은 때때로 곤충이 죽기 전에 얼어 붙는 경우 곤충을 분리합니다.
Representative Results
상기 프로토콜을 I. 세네갈렌시스(도 4)의복부에서 MCO2 유전자 및 음성 대조유전자(siRNA 및 bla for dsRNA용 EGFP)(i)를 대상으로 전기포기 매개 RNAi에 상기 프로토콜을 적용하였다. RNAi 실험의 결과는 표 1에요약됩니다. 음전하 시RNA/dsRNA는 양전하 세포에만 통합되기 때문에, RNAi 표현형은 전기포레이션을 위해 양극이 배치된 지역 주변에서 관찰되었다.
I. 세네갈렌시스와 P. 조나타모두에서 멜라닌 색소 침착(즉, 검은색, 갈색, 붉은 갈색)의 억제는 양극전극이 배치된 지역 주변의 패치에 나타났으며(그림 4, 도 5,그림 6)에서 MCO2 RNAi가 전기포기와 병행하여 수행되었을 때(표1) 대조적으로, 대조유전자를 주입했을 때 전기포기 부위 주변에서 표현효과가 관찰되지않았다(EGFP siRNA 또는 bla dsRNA) (도 4, 도5, 및 도 6, 표 1). 또한, 전기기화 없이 MCO2 유전자를 주입하는 것은 성인 색소침착(도4, 표 1)에영향을 미치지 않았으며, 이는 오도나타에서 RNAi에 전기포레이션이 필수적임을 나타낸다. 파란색, 녹색 및 노란색 착색은 큐티클에서 멜라닌 합성에 관여하는 MCO2 유전자의 RNAi에 의해 영향을 받지 않으며, 이는 이러한 체색이 투명한큐티클(26)을통해 보이는 표피 세포에 존재하는 안료 과립에 기인한다는 사실을 그럴듯하게 반영한다. 도 4에도시된 바와 같이, SiRNA 치료 및 dsRNA 치료를 실시하는 개인 들 사이에서 현저한 표현성 차이는 인식되지 않았으며, RNAi 표현형의 크기와 위치가 상당한 변화가 동일한 RNAi 치료를 실시하는 다른 개인들 사이에서 관찰되었다(예. 그림 4에서 IsMCO2 dsRNA의 두 가지 예비교).
RNAi 치료에 가장 적합한 발달 단계를 결정하기 위해, 우리는 I. 세네갈렌시스 (그림 7A)의최종 애벌레 인스타에서 5 가지 형태학적 단계 (단계 A-E)에서 RNAi 치료의 현상적 결과를 비교했습니다. MCO2 RNAi에 의한 멜라닌 색소 침착의 억제는 단계 A와B(도 7C)에서주입될 때 모든 출현성인에서 관찰되었다. 단계 C와 D단계에서 주입했을 때, 멜라닌 색소 침착의 억제는 확실히 일부 출현 성인에서 관찰되었지만, 다른 성인은 상처에 의한 비정상적인 착색을나타냈다(도 7B).
그림 1: 오도나타에서 전기 포기 매개 RNAi 방법. A. 이쉬누라 세네갈렌시스 (코에나기리오니대)는 대표적인 댐셀프 종으로. B. 대표적인 잠자리 종으로 의사테마시스 조나타(리벨룰리대). C. 프로토콜의 전체 구성표입니다. 파란색과 주황색 상자는 각각 I. 세네갈렌시스와 P. 조나타에대한 프로토콜을 나타냅니다. 보라색 상자는 두 종모두에 적용되는 일반적인 프로토콜을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 이쉬누라 종에 대한 제한 단편 길이 다형성(RFLP) 기반 종 식별의 대표적인 결과. 애로우헤드는 I. 세네갈렌시스-특정밴드를 나타낸다. 1, 2, 4: I. asiatica,3: I. 세네갈렌시스,M: 100베이스 페어 래더 마커. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 오도나타에서 전기 포기 매개 RNAi 방법. A-C. I. 세네갈렌시스의얼음 차가운 마취. 화살촉은 애벌레를 나타냅니다. A. 젖은 종이로 분쇄 된 얼음에 애벌레를 넣습니다. B. 얼음 위에 있는 애벌레의 확대된 전망. C. 얼음 위에 젖은 종이로 덮인 애벌레. D-G. I. 세네갈렌시스에대한 RNAi 방법 . D. 흉부에 주입. E. 흉부에 전기 화. F. 복부에 주입. G. 복부에 전기 화. H-J. P. 조나타에대한 RNAi 방법 . H. 복부에 작은 구멍을 만들기. 나. 복부에 주입. J. 복부에 전기 화. 화살표는 구멍이나 주사를 만드는 지점을 나타냅니다. +, -: 양수/음수 측 전극. 숫자는 복부 세그먼트를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: I. 세네갈렌시스의복부에 대한 RNAi 표현형의 등쪽 보기. 백색 화살촉은 억제된 멜라늄의 영역을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: I. 세네갈렌시스의흉부에 있는 RNAi 표현형의 측면 및 등갈전망. 백색 화살촉과 점선은 억제된 색소침착의 영역을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: P. 조나타복부에 있는 RNAi 표현형의 복부 보기 . 흰색 화살촉과 점선은 억제된 멜라늄화 영역을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: I.senegalensis의최종 애벌레 인스타 동안무대 종속 IsMCO2 RNAi 효과. A. 5개의 형태학적 단계 (단계 A-E)에 있는 복합 눈의 형태학적 변화 및 이 연구 결과에 있는 성인 출현일 수. 괄호의 숫자는 이전 보고서14에서입니다. B. 상처로 인한 비정상적인 색소 침착. 애로우헤드는 전기기전지를 나타냅니다. C. I. 세네갈렌시스에서성인 색소 침착에 대한 5가지 형태학적 단계에서 RNAi의 효과. 막대의 숫자는 개인 수를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 종 | I.세네갈렌시스 | P.조나타 | |||||||||
| 주입된 영역 | 복 부 | 흉부 | 복 부 | ||||||||
| siRNA/dsRNA | Sirna | dsRNA | dsRNA | dsRNA | |||||||
| 표적 유전자 | 이스모2 | EGFP | 이스모2 | 이스모2 | 즐 | 이스모2 | 즐 | PzMCO2 | PzMCO2 | 즐 | |
| 전기 기공 | + | + | + | - | + | + | + | + | - | + | |
| 주입된 애벌레 | 22 | 25 | 30 | 6 | 53 | 12 | 20 | 17 | 5 | 9 | |
| 등장 성인 | 7 | 6 | 13 | 4 | 40 | 11 | 14 | 11 | 2 | 5 | |
| 안료가 적은 성인(비율) | 7 (100%) |
0 (0%) |
13 (100%) |
0 (0%) |
0 (0%) |
10 (91%) |
0 (0%) |
11 (100%) |
0 (0%) |
0 (0%) |
|
표 1. I. 세네가렌즈증 및 P. 조나타에서성인 색소 침착에 RNAi의효과. 단계 A의 결과는 I. 세네갈렌시스에표시됩니다. IsMCO2: I. 세네갈렌시스, EGFP: 향상된 녹색 형광 단백질 유전자의 멀티 구리 산화제 2 유전자 : 향상된 녹색 형광 단백질 유전자, 블라: pGEM-T 이지 벡터에서 베타 락타마제 유전자, PzMCO2: P. 조나타의 멀티 구리 산화 제 2 유전자. 대조군 유전자에 대한 결과는 저자가 현재까지 실시한 총 실험 수를 나타냅니다.
Discussion
RNAi 치료의 치사성
우리는 RNAi 처리의 치사성이 오도나타 애벌레의 양육 역사 그리고 상태에 강하게 달려 있다는 것을 것을을 발견했습니다. 현장에서 수집 직후 유충은 일반적으로 건강하고 전기 포기 매개 RNAi 치료 후 낮은 사망률을 나타낸다. 대조적으로, 오랜 기간 동안 실험실에서 자란 애벌레 (예를 들어, 한 달) 성인 출현의 낮은 성공률을 겪는 경향이 있습니다. I. 세네갈렌시스에서,현장에서 채취한 애벌레 대신, 계란으로부터 실험실에서 사육된 애벌레는14개,실험실에서 자란 애벌레를 사용하는 RNAi의 성공률은 현장에서 채취한 애벌레를 사용하는 것보다 상당히 낮은 경향이 있다(많은 개인이 변형 시 사망)하는 경향이 있다. 또한, 빈번한 애벌레 먹이주기와 깨끗한 물 사육은 성인 출현의 성공률을 높이고 RNAi 치료의 치사율을 감소시키는 데 중요합니다.
RNAi 처리의 효율성
전술한 바와 같이, RNAi 표현형의 수준, 즉 표피 탈색의 크기 및 위치, 종종 동일한 RNAi 치료를 실시하는 개인 들 간의 상당한 변화를 나타내었다 (예를 들어, 도 4),그러나 표현성 침투의 수준은 오도나타 종 사이에 현저하게 다른 것으로 보인다. 관찰된 페노티픽 영역은 P. 조나타(그림 6)와 N. 피그마야9보다 I. 세네갈렌시스(그림 4-5)에서더 크고 두드러졌다. 이러한 차이는 애벌레 표면에 표기의 두께때문일 수 있으며, I. 세네갈렌시스의 표절이 P. 조나타 및 N. 피그마에아의표피보다 얇다는 점을 고려하면). 우리가 조사한 한, siRNA와 dsRNA의 효과 사이에 명확한 차이가 인식되지않았다(도 4, 표 1).
RNAi에 대한 적절한 개발 단계
RNAi를 효율적으로 수행하는 데 적절한 애벌레 스테이징이 중요하다는 점에 유의해야 합니다. 성인 색소 침착의 억제는 N. pygmaea9에대한 이전 보고서와 일치하는 단계 D (성인 출현 약 3 일 전에) MCO2 RNAi에 의해 발생했다. 단계 C와 D단계에서 주사할 때 관찰된 RNAi 표현형은 A 단계와 B 단계에서 치료된 것보다 눈에 띄지 않았으며, 이는 C와 D 단계가 유전자 발현을 충분히 억제하기에는 너무 늦을 수 있음을 나타낸다. RNAi 처리를 위한 적당한 타이밍은 유전자 발현의 타이밍에 달려 있고, MCO2 유전자는 다른 곤충17,18에서와같이 성인 출현9도중 일시적으로 높은 발현을 전시합니다. 악취부 Plautia stali에서, MCO2 유전자의 RNAi 녹다운은 주사 후 4일부터 관찰되었다27,이는 현재의 결과와 일치한다.
I. 세네갈렌시스에 대한 우리의 이전 연구는, 단계 B 후, 성인 출현에 대한 일 최종 인스타 애벌레의 대다수 중 상대적으로 작은 변화를 나타낸다, 단계 B가 성인 출현을 향한 과정의 발병에 대응할 수 있음을 시사, 그 후 변태에 대한 발달 과정은 고정 및 조정 방식으로 진행14. 상처에 의한 형태학적 이상은 종종 애벌레가 C 단계와 D 단계에서 RNAi 처리되었을 때 관찰되었다(도 7B, 7C). 이것은 이 단계 도중 변태의 극적인 진행과 연관될 확률이 높습니다, RNAi 처리가 단계 C에서 그리고 에 피해야 한다는 것을 건의합니다. 요약하자면, 스테이지 A 또는 B(또는 애벌레 날개가 크게 확장되기 전에 무대에서) RNAi 실험에 최종 인스타 애벌레를 사용하는 것이 좋습니다.
전기포기 매개 RNAi 방법의 유용성과 우수성
종래의 RNAi는 간단하고 강력한 실험 방법이지만, 나비10,진딧물(28) 및 잠자리9와 같은 일부 곤충 계보는 낮은 RNAi 효율을 나타내며, 유전자 기능 분석의 확립이 주요 과제이다. 이 연구에서는, 전기포기 매개 RNAi가 적절한 발달 단계에서 치료하는 경우 적어도 표피에서 거의 100% 효율을 가진 잠자리에서 국소 유전자 억제를 유도할 수 있음을 발견했습니다(표1). 최근에는 CRISPR/Cas9 계 유전자 녹아웃이 다양한 곤충에 성공적으로 적용되어 비모델유기체(29)를위한 강력한 분자 유전 도구를 제공하고 있다. 여기서, 그러나, 우리는 CRISPR / Cas9는 확실히 중대하지만 전기 화 매개 RNAi 방법은 어떤 면에서 CRISPR / Cas9보다 우수 할 수 있음을 지적한다.
첫째, 전기포기 매개 RNAi 방법에서 RNAi 표현형이 나타나는 신체 부위는 전포화 시 양성 전극의 위치에 의해 실험적으로 쉽게 제어될 수 있다. 또한, 유전자 발현이 억제되는 영역은 양성 전극이 배치된 영역 주위에서 제한되기 때문에 RNAi 표현형은 동일한 개인에서 나란히 대조군 표현형과 쉽게 비교할 수 있다. 둘째, 주입된 계란이 녹아웃 표현형을 관찰하기 위해 성인기에 사육되어야 하는 CRISPR/Cas9 방법에 비해, 전기기 분과 매개 RNAi는 유전자 녹다운 표현형이 일반적으로 훨씬 짧은 시간에 관찰될 수 있다는 점에서 우수하다. 예를 들어, 나는 세네갈렌시스에 대해 3 ~4 개월, 계란에서 성인14,30까지 P. 조나타에 대해 1 ~ 2 년이 걸립니다. 그러나, 성인 표피 내에서 RNAi 표현형을 관찰하기 위해서는, DsRNA 주입에서 최종 인스타 애벌레로 의한 후 1개월 미만이 소요되며, 단계 B에서 성인 출현까지 I. 세네갈렌시스와 P. zonata(그림 7). 셋째, 전기포기 매개 RNAi 방법은 CRISPR/Cas9 방법에 필요한 작은 계란에 미세 주입보다 쉬운 큰 애벌레로 dsRNA 주입을 수반한다. 또한, 전기기 분과 매개 RNAi는 새로 낳은 알을 수집하기 어려운 곤충 종에 적용됩니다. 예를 들어, P. zonata의 암컷은 비행 중 수면에 떠있는 식물에 알을 낳기 때문에 현장과 실험실에서 계란을 수집하기가 어렵습니다. 따라서, 우리는 이 프로토콜이 통상적인 RNAi 방법이 효율적으로 작동하지 않는 비모델 유기체에 일반적으로 적용될 수 있기를 기대합니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
모리야마 미노루에게 기술적인 조언과 지원, 오도나타 애벌레를 수집한 비누로타와 스즈키 류타로, 그리고 원고에 대한 유용한 의견을 주신 미사 신야에게 감사드립니다. 이 작품은 JSPS KAKENHI 보조금 번호 JP18J21561 GO 및 JP18H02491, JP18H04893, JP19H03287 및 JP20H04936에서 RF에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plate | Violamo | VTC-P12 | For rearing larvae before injection |
| Brine shrimp eggs | JAPAN PET DESIGN | 4975677012396 | |
| Calibrated micropipette (1-5 µL) | Drummond | 2-000-001-90 | |
| Deposit pestle 1.5 mL | Thermo Fisher Scientific | K749520-0090 | |
| Digital high defenition microscope camera | Leica Microsystems | MC170HD | |
| Disposable non-woven mesh | HAKUGEN EARTH | DSC-105A | |
| DNA Ligation Kit Ver.2.1 | Takara Bio | 6022 | |
| DraI | Takara Bio | 1037A | |
| Electrode (1mmφ) | NEPAGENE | CUY650P1 | |
| Electroporator | CellProduce | Cure-gene | |
| Forceps | KOWA Forceps Industry | K-10 No1 | |
| Glass needle puller | NARISHIGE | PN-3 | |
| Hand mixer | AS ONE | 1-229-02 | |
| Hand net | HOGA | IS33-3B | |
| HEPES | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 346-01373 | For injection buffer |
| Insect pin capitate No. 3 | Shiga Konchu Fukyusha | N230 | For fixing larvae |
| KCl | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 163-03545 | For PBS |
| KH2PO4 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 169-04245 | For PBS |
| KOAc | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 160-03175 | For injection buffer |
| KOH | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 168-21815 | For injection buffer |
| Laboratory Jack (150x150) | AS ONE | 1-4642-11 | For adjusting the position of the manipulator |
| LOGIQLEAN Gel for Ultrasound Hard type | GE Healthcare | 2369385 | |
| Manipulator | Muromachi Kikai Co., Ltd. | SJ-1 | For adjusting the position of the injector and the capillary |
| MEGAscript RNAi kit | Thermo Fisher Scientific | AM1626 | |
| Mg(OAc)2 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 130-00095 | For injection buffer |
| Na2HPO4 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 197-02865 | For PBS |
| NaCl | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 191-01665 | For PBS |
| Petri dish (5 cm diameter) | Iwaki | 1010-060 | For rearing injected larvae |
| Pneumatic Injector | NARISHIGE | IM-12 | |
| pT7Blue T-Vector | Novagen | 69820 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28106 | |
| RNAiso Plus | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 9109 | |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74106 | |
| Shiga micro insect pin with stainless headless | Shiga Konchu Fukyusha | N251 | For making a small hole |
| Stereoscopic microscope | Leica Microsystems | S8APO | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18090010 | |
| TaKaRa Ex Taq | Takara Bio | RR001B | For PCR-amplification from plasmid |
| Tks Gflex DNA Polymerase | Takara Bio | R060B | For PCR-amplification from caudal gill |
References
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