Summary
Wij bieden een gedetailleerd protocol voor elektroporatie-gemedieerde RNA interferentie in insecten van de orde Odonata (libellen en jonkvliegen) met behulp van de blauwstaartdamselfly (Ischnura senegalensis: Coenagironidae: Zygoptera) en de pied skimmer libelle (Pseudothemis zonata: Libellulidae: Anisoptera).
Abstract
Libellen en jonkvrouwen (orde Odonata) vertegenwoordigen een van de meest voorouderlijke insecten met metamorfose, waarin ze hun habitat, morfologie en gedrag drastisch veranderen van aquatische larven naar terrestrische / luchtvolwassenen zonder popstadium. Odonata volwassenen hebben een goed ontwikkelde kleur visie en tonen een opmerkelijke diversiteit in lichaamskleuren en patronen over geslachten, stadia en soorten. Terwijl vele ecologische en gedragsstudies op Odonata zijn uitgevoerd, zijn de moleculaire genetische studies schaars hoofdzakelijk toe te schrijven aan de moeilijkheid in het toepassen van gen functionele analyse op Odonata geweest. Bijvoorbeeld, RNA interferentie (RNAi) is minder effectief in de Odonata, zoals gemeld in de Lepidoptera. Om dit probleem op te lossen, hebben we met succes een RNAi-methode opgezet in combinatie met in vivo elektroporatie. Hier bieden we een gedetailleerd protocol met een video van de elektroporatie-gemedieerde RNAi-methode als volgt: voorbereiding van larven, identificatie van soorten, voorbereiding van dsRNA/siRNA-oplossing en injectienaalden, ijskoude anesthesie van larven, dsRNA/siRNA-injectie, in vivo elektroporatie en individueel fokken tot het ontstaan van volwassenen. De elektroporatie-gemedieerde RNAi methode is van toepassing op zowel damselflies (suborder Zygoptera) en libellen (suborder Anisoptera). In dit protocol presenteren we de methoden voor de blauwstaartdamselfly Ischnura senegalensis (Coenagrionidae) als een voorbeeld van damselfly soorten en de pied skimmer libfly Pseudothemis zonata (Libellulidae) als een ander voorbeeld van libelle soorten. Als representatieve voorbeelden tonen we de resultaten van RNAi gericht op de melanine synthese gen multicopper oxidase 2. Deze RNAi-methode zal het begrijpen van verschillende genfuncties die betrokken zijn bij metamorfose, morfogenese, kleurpatroonvorming en andere biologische kenmerken van Odonata vergemakkelijken. Bovendien kan dit protocol in het algemeen van toepassing zijn op niet-modelorganismen waarin RNAi minder effectief is in genonderdrukking als gevolg van de inefficiëntie en lage penetrantie.
Introduction
Libellen en jonkvrouwen (de orde Odonata) behoren tot de meest voorouderlijke groepen insecten die "metamorfose" vertonen1,2. Door metamorfose veranderen ze hun habitat, morfologie en gedrag drastisch van aquatische larven naar terrestrische/antennevolwassenen3. Odonata volwassenen hebben een goed ontwikkelde kleur visie en vertegenwoordigen een opmerkelijke diversiteit in lichaamskleuren en patronen over geslachten, stadia, en soorten3,4,5. Terwijl veel ecologische en gedragsstudies op Odonata zijn uitgevoerd6,7, moleculaire genetische studies zijn vooral belemmerd door de moeilijkheid bij de toepassing van gen functionele analyse op Odonata.
De conventionele RNA interferentie (RNAi) methode, waarbij dubbelstrengs RNA (dsRNA) wordt geïnjecteerd om de functie van het gen van belang8te onderdrukken, bleek niet effectief te zijn bij Odonata insecten9, zoals gemeld in Lepidopteran insecten10. Aan de andere kant, eerdere rapporten hebben gesuggereerd dat elektroporatie-gemedieerde RNAi effectief is in Lepidopteran soorten, vooral in epidermale weefsels11,12,13. We hebben onlangs vastgesteld dat de elektroporatie-gemedieerde RNAi werkt effectief in de kleine libelle Nannophya pygmaea (Libellulidae: Anisoptera)9, maar N. pygmaea is een relatief zeldzame soort en dus niet geschikt voor moleculaire genetische studies.
De meeste Odonata soorten zijn ingedeeld in een van de twee suborders, Zygoptera (damselflies) of Anisoptera (echte libellen)3. Hier richtten we ons op de blauwstaartdamselfly Ischnura senegalensis (Coenagrionidae; Figuur 1A) als representatieve Zygopteran soort en de pied skimmer libelle Pseudothemis zonata (Libellulidae; Figuur 1B) als representatieve Anisopteransoort. De twee soorten behoren tot de meest voorkomende Odonata soorten in natuurlijke en stedelijke vijvers in Japan, met inbegrip van die in Tsukuba City, en we kunnen verzamelen vele larven van de twee soorten in het veld. Onlangs hebben we een laboratoriumhouderijsysteem voor individuele larven van I. senegalensisopgezet, waardoor de ontwikkeling en morfogenese van de Odonata-larven in detail konden worden gecontroleerd14.
In dit rapport bieden we een verfijnde methode en een videoprotocol voor de elektroporatie-gemedieerde RNAi in I. senegalensis en P. zonata. In Japan, I. senegalensis en Ischnura asiatica, die genetisch dicht zijn, worden vaak sympatrisch15gevonden , en ze zijn moeilijk te onderscheiden in larven16. We beschrijven ook hoe twee Ischnura-soorten kunnen worden onderscheiden door beperking fragment lengte polymorfisme (RFLP).
Voor de evaluatie van de effectiviteit van de elektroporatie-gemedieerde RNAi, selecteren we multicopper oxidase 2 gen (MCO2; ook bekend als laccase2) als een representatief doelgen, vanwege het zichtbare fenotype van bleker cuticula kleur bij knockdown van de genexpressie9. MCO2 staat bekend als essentieel voor het verduisteren van de opperhuid bij een verscheidenheid van insectensoorten17,18.
Protocol
OPMERKING: Het algemene schema van de protocollen wordt weergegeven in figuur 1.
1. Voorbereiding van larven van libellen of damselflies.
- Verzamel larven in het veld met behulp van een handnet.
OPMERKING: I. senegalensis larven klampen zich vaak vast aan waterplanten die op het wateroppervlak drijven, terwijl P. zonata larven vaak tussen bladstrooisel op de bodem blijven. In Tsukuba City zijn de laatste instar larven van I. senegalensis vooral te vinden van maart tot juni, en die van P. zonata van mei tot juni. I. senegalensis larven kunnen worden gekweekt uit eieren in het laboratorium14, maar de larven verzameld in het veld hebben het duidelijk hogere slagingspercentage van volwassen opkomst. - Identificatie van soorten door beperking fragmentlengte polymorfisme (RFLP) van PCR-versterkte producten.
LET OP: Deze stap is alleen nodig als de soort moeilijk te identificeren is aan de verschijning van de larven, zoals in I. senegalensis.- Houd een van de staartkieuwen van een larve met tangen. Vervolgens valt de larve van zijn staartkieuw zelf (waardoor autotomie).
OPMERKING: Larven van Zygopteran jonkvrouwen hebben meestal drie staartkieuwen(figuur 1A). Wanneer ze worden aangevallen door een roofdier, kunnen ze opstijgen hun eigen caudal kieuwen om te ontsnappen. Als de caudale kieuw niet beschikbaar is, wordt een deel van het been ontleed. - Doe één caudale kieuw in 100 μL PBS-oplossing [0,8% NaCl, 0,02% KCl, 0,115% Na2HPO4en 0,02% KH2PO4 (w/v)] en homogeniseren met een mixerhand met behulp van een statiegeldplaag.
- Draai het mengsel gedurende 10 seconden naar beneden bij 5.000 x g en onderdeel 0,5 μL van de supernatant aan PCR-versterking met behulp van DNA polymerase en primers om het interne getranscribeerde spacer 1 (ITS1) gebied van het nucleaire DNA te versterken.
OPMERKING: Voer de PCR uit volgens het protocol van de fabrikant. De combinatie van ITS-F0 (5'- GGA AAG ATG GCC AAA CTT GA -3') en 5.8S-AS1 (5'- GCC GGC CCT CAG CCA G -3') primers kunnen its1-regio versterken in bijna alle Odonata-soorten19. - Incubeer het mengsel van 1 μL PCR-versterkt product, 0,3 μL 10x M Buffer, 0,1 μL DraI beperkingsenzym en 1,6 μL water bij 37 °C gedurende 1 uur.
LET OP: Selecteer de beste beperkingsenzymen, afhankelijk van de combinatie van soorten. Als er geen beperking enzymen geschikt voor de identificatie van soorten, bevestigen door DNA-sequencing. - Laad 2 μL van de producten met ladingskleurstof op 2% agarose gel en voer elektroforese uit.
OPMERKING: Het is moeilijk om soorten te identificeren bij het gebruik van 1% of 1,5% agarose gel. - Controleer het elektroforesepatroon om de soort te identificeren (figuur 2).
OPMERKING: RFLP-patronen zijn van soort en populatieafhankelijk. In Tsukuba bevolking, I. asiatica heeft een belangrijke band van 400-500 bp, terwijl I. senegalensis heeft een belangrijke band van ongeveer 200 bp en een extra band van minder dan 100 bp (een pijlpunt in figuur 2). De ITS1-regio bestaat in meerdere kopieën in het genoom, en in Ischnura soorten, microsatelliet polymorfisme binnen de ITS1 regio is vaak aanwezig in hetzelfde individu, die het patroon van RFLPs.
- Houd een van de staartkieuwen van een larve met tangen. Vervolgens valt de larve van zijn staartkieuw zelf (waardoor autotomie).
- Achter de verzamelde larven in het laboratorium tot gebruik voor RNAi.
- Plaats elke larve afzonderlijk in elke put van een 12-put plaat met ongeveer 3 mL water.
OPMERKING: I. senegalensis larven moeten individueel worden gehouden omdat ze elkaar vaak kannibaliseren, terwijl P. zonata larven in een groep kunnen worden gehouden omdat ze zelden kannibaliseren. - Voer I. senegalensis larven met Artemia pekelgarnalen elke dag en P. zonata larven met bloedwormen en/of Tubifex wormen ten minste twee keer per week totdat ze groeien tot de geschikte ontwikkelingsfase voor RNAi.
OPMERKING: Frequente voeding is van cruciaal belang om het slagingspercentage van volwassen opkomst te verhogen. - Verander het water zodra het vuil wordt met uitwerpselen of restjes.
OPMERKING: Frequente waterverandering is ook belangrijk om het slagingspercentage van volwassen opkomst te verhogen. - Beoordeel de juiste ontwikkelingsfase voor RNAi.
LET OP: De uiteindelijke instar larven van I. senegalensis kan worden ingedeeld in vijf ontwikkelingsstadia14,20. De eerste fase (fase A, voordat de vleugels beginnen uit te breiden) of de tweede fase (fase B) van de uiteindelijke instarlarven is geschikt voor RNAi-experimenten, bij het overwegen van het heldere fenotype van RNAi na volwassen opkomst (zie Discussie). In P. zonatawerden in deze studie de laatste instarlarven voor vleugeluitbreiding (overeenkomend met fase A van I. senegalensis) gebruikt.
- Plaats elke larve afzonderlijk in elke put van een 12-put plaat met ongeveer 3 mL water.
2. Bereiding van dsRNA/siRNA-oplossing en injectienaalden voor RNAi.
OPMERKING: Selecteer klein storend RNA (siRNA) (stap 2.1) of dubbelstrengs RNA (dsRNA) (stap 2.2) als oplossing voor RNAi.
- Bereiding van de siRNA-oplossing
- Ontwerp siRNA met siDirect programma versie 2.0 (http://sidirect2.rnai.jp/)21, volgens de richtlijnen eerder gemeld in Lepidopteran insecten22.
- Verkrijgen commercieel gesynthetiseerd siRNA.
OPMERKING: De sequenties van siRNA gericht op MCO2 gen van I. senegalensis gebruikt in deze studie waren als volgt: 5'- GCA CUU UCC GUU AUC AAU AAU -3' voor sense streng en 5'- UAU UGA UAA CAA AAA GUG CUC -3' voor antisense streng. Als een negatieve controle, de sequenties van siRNA gericht op verbeterde groene fluorescerende eiwit (EGFP)gen waren als volgt: 5'- GCA UCA AGG UGA ACU UCA AGA -3' voor zintuiglijke streng en 5'- UUG AAG UUC ACC UUG AUG CCG -3' voor antisense streng11. - Verdun het siRNA tot 100 μM met injectiebuffer [100 mM CH3COOK, 2 mM Mg(CH3COO)2, 30 mM HEPES-KOH, pH 7.4]22.
- Bewaar op -80 °C tot gebruik.
- Voorbereiding van dsRNA-oplossing.
- Selecteer een 300-400 bp regio voor dsRNA met primer3 programma versie 4.1.0 (http://bioinfo.ut.ee/primer3/)23 en ontwerp de primer sets.
- Verkrijg commercieel gesynthetiseerde primersets.
OPMERKING: Voor de productie van sjablonen voor dsRNA-synthese waren de primersets die in deze studie werden gebruikt als volgt: (5'- GCC TGT CAG CTT CTT CTT CC -3' voor voorwaartse primer en 5'- GGT GTC CGG CGG ACA ACT AT -3' voor reverse primer) voor MCO2-genen van I. senegalensis (IsMCO2, toetreding nr. LC589180) en (5'- CCG CAC AGC TCA CTA TTC AA -3' voor forward primer en 5'- GGA GGA TTC CTT CAT CGA CA -3' for reverse primer) voor MCO2 genen van P. zonata (PzMCO2, toetreding nr. LC589179). Als een negatieve controle, de primer set voor dsRNA targeting β-lactamase (bla) gen op het klonen vector waren (5'- CTA TGT GGCG GTA TTA T -3' voor voorwaartse primer en 5'- CAG AAG TGG TGG TGC AGC AAC T -3 ' voor omgekeerde primer). - Haal RNA uit Odonata-larven met behulp van een commercieel verkrijgbaar RNA-extractiekit en voer cDNA-synthese uit met behulp van omgekeerde transcriptase volgens het protocol van de fabrikant.
LET OP: cDNA-bibliotheek die is voorbereid op RNA-sequencing-analyse kan ook worden gebruikt. - Versterk de doelsequenties met behulp van de gesynthetiseerde cDNA en de ontworpen primer set en kloon ze in het klonen vector met behulp van een commerciële ligase volgens het protocol van de fabrikant.
- Zet de plasmide om in E. coli competente cellen en pak een enkele kolonie op na nachtelijke incubatie.
- PCR-versterken van de insert regio met behulp van primers op de vector.
- Bevestig de gekloonde sequentie door Sanger sequencing.
- PCR-amplificeren van de insert met behulp van vector primers met de T7 polymerase promotor sequentie24, 25.
OPMERKING: In deze studie werden de volgende primers gebruikt: T7-F (5' - TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GAC TAG TCA TAT GGA T - 3') en T7-R (5'- TAA TAC GAC CCA CTA TAG GGA GAC CCG GGG ATC CGA T - 3') 25. - Zuiver het PCR-product met behulp van de PCR-zuiveringskit volgens het protocol van de fabrikant, ontwijk het DNA met 50 μL gedestilleerd water en concentreer de eluted DNA-oplossing op ongeveer 10 μL met behulp van een centrifugale verdamper.
- Synthetiseer dsRNA door in vitro transcriptie volgens het protocol van de fabrikant. Gebruik in totaal 1000 ng template DNA en elute synthesized dsRNA met 100 μL elution buffer.
- Meet de concentratie van dsRNA met behulp van een spectrofotometer en bevestig de kwaliteit van dsRNA door elektroforese op een 1,5% agarose gel.
LET OP: Een enkele band kan worden gezien wanneer dsRNA synthese succesvol is. - Verdun dsRNA tot 1000 ng/μL met elutiebuffer en bewaar tot gebruik bij -20 °C.
- Bereiding van injectienaalden
- Trek een glazen capillaire met behulp van een glazen naald trekker.
- Plaats de punt van de getrokken capillaire op een dubbelzijdige plakband en breek de punt van de capillaire met tangen.
- Zet de capillaire op een injector.
LET OP: Het is gemakkelijker om met de capillaire om te gaan als je nitrilhandschoenen draagt. - Laad siRNA/dsRNA-oplossing op de voorbereide capillaire.
OPMERKING: Gebruik de capillaire niet herhaaldelijk, omdat het puntje van de geïnjecteerde capillaire kan verstopt raken met vuil omdat de larven verzameld in het veld leefden in de modder.
3. siRNA/dsRNA-injectie
LET OP: De procedure is iets anders voor damselflies (stap 3.1) en libellen (stap 3.2).
- Injectie aan een Zygopteran (moederzelf) larve (b.v., I. senegalensis).
- Verdoven een larve bedekt met een nat papier op gemalen ijs gedurende 50-70 seconden (Figuur 3A-C).
OPMERKING: Duur van ijskoude anesthesie is afhankelijk van de toestand van de larve; als de larve begint te bewegen na 70 seconden ijskoude anesthesie, wordt nog eens 70 seconden ijskoude anesthesie aangebracht. Voor larven die zich zelden bewegen (bijvoorbeeld P. zonata),is deze procedure niet essentieel. - Bevestig twee pinnen aan beide zijden van de prothorax en bevestig de larve op een vaste standaard (bijvoorbeeld een stuk piepschuim) (Figuur 3D).
LET OP: Pas de positie en het aantal pinnen aan, afhankelijk van de plaats van injectie. - Strek het intersegmentale membraan tussen de 7e en 8e buiksegment voor RNAi in de buik of tussen de prothorax en synthorax (gesmolten mesothorax en metathorax) voor RNAi in de thorax met behulp van handen en tangen.
- Houd het intersegmentale membraan met de hand uitgerekt.
- Plaats de punt van de voorbereide capillaire in het uitgerekte intersegmentale membraan(figuur 3D, 3F).
- Injecteer 1 μL siRNA/dsRNA-oplossing.
- Verdoven een larve bedekt met een nat papier op gemalen ijs gedurende 50-70 seconden (Figuur 3A-C).
- Injectie aan een Anisopteran (libelle) larve (bijv. P. zonata).
- Veeg het water van het larveoppervlak met een papieren handdoek.
- Bevestig indien nodig twee pinnen aan beide zijden van de prothorax en bevestig de larve op een vaste standaard (bijvoorbeeld een stuk piepschuim) (Figuur 3H).
LET OP: Pas de positie en het aantal pinnen aan, afhankelijk van de plaats van injectie. In het geval van P. zonatais het niet essentieel om de larven bij deze stap met pinnen te fixeren. - Strek het intersegmentale membraan tussen het 4e en 5e buiksegment met de hand.
- Maak een klein gaatje met een fijne naald in het intersegmentale membraan tussen het 4e en 5e buiksegment.
OPMERKING: Deze procedure is noodzakelijk voor veel Anisopteran (libelle) soorten omdat het intersegmentale membraan te moeilijk is om een glascapillaire direct in te voegen. - Steek de punt van de voorbereide capillaire in het voorbereide gat(figuur 3I).
OPMERKING: Zoals aangegeven in figuur 3Hkomt een deel van de rugzijde van de larven overeen met de ventrale kant van de volwassene, zodat het fenotype ventrally verschijnt wanneer het wordt behandeld zoals weergegeven in figuur 3H-J. - Injecteer 1 μL siRNA/dsRNA-oplossing.
4. in vivo elektroporatie
- Voeg indien nodig meer pinnen toe om de larve aan een vaste standaard te bevestigen (bijvoorbeeld een stuk piepschuim).
- Breng na de injectie van de siRNA/dsRNA-oplossing twee druppels ultrasone gel op het larvenoppervlak aan met tangen.
- Plaats elektroden op de ultrasone gel, met de positieve elektrode aan de zijkant geïnjecteerd met de siRNA / dsRNA oplossing en een negatieve elektrode aan de andere kant(Figuur 3E, 3G, 3J).
OPMERKING: Raak de opperhuid van de larve niet direct aan om het brandende effect van elektroporatie te voorkomen. - Genereer 10-keer elektroporatie pulsen (280 ms/s per stuk) met behulp van een elektroporator.
OPMERKING: Pas de spanning van elektroporatie aan, afhankelijk van de soort, stadia en weefsels. In deze studie werd 25 V toegepast op I. senegalensis en 45 V naar P. zonata. - Veeg de resterende gel op het oppervlak af met een papieren handdoek.
- Houd de behandelde larven ongeveer een dag op een natte papieren handdoek rustend voor herstel en breng ze op de volgende dag over naar een opfoedcase.
5. Site-specifieke fenotypische analyse
- Houd I. senegalensis individueel in een petrischaaltje (5 cm in diameter) met ongeveer 10 mL water en een stuk papieren handdoek, en bewaar P. zonata in een plastic kooi met een wegwerp niet-geweven gaas (eclosion kooi14).
- Voor I. senegalensis, nadat de larven stoppen met eten, verplaats ze individueel in een plastic kooi met een wegwerp niet-geweven gaas.
LET OP: Stop niet twee of meer larven in dezelfde kooi. Anders zullen ze elkaar kunnennibaliseren onmiddellijk nadat ze volwassen zijn geworden. - Na de opkomst van de volwassene, observeren en fotograferen van het fenotype rond het gebied waar de positieve elektrode werd geplaatst voor elektroporatie.
LET OP: Het fenotype verschijnt alleen in patches. Fenotypes zijn vaak moeilijk onmiddellijk na het ontstaan te herkennen als gevolg van onvolledige pigmentatie. - Om de efficiëntie van RNAi (bijvoorbeeld kwantitatieve RT-PCR) te onderzoeken, ontleden als het fenotype zichtbaar is, het gebied en vergelijk het met de regio zonder het fenotype.
OPMERKING: De niveaus van RNAi fenotype, namelijk grootte en locatie van de cuticula ontkleuring, vertonen vaak aanzienlijke variatie tussen individuen (zie figuur 4). - Houd de voorgekomen volwassenen in 100% EtOH voor toekomstige analyses.
OPMERKING: Lichaamskleur van Odonata-soorten vervaagt snel na de dood, dus het is belangrijk om ze op te slaan in ethanol voordat ze sterven. Ethanol verkleurt soms de insecten, in dergelijke gevallen dat de insecten worden ingevroren voordat ze sterven.
Representative Results
We pasten het bovenstaande protocol toe op elektroporatie-gemedieerde RNAi gericht op MCO2-gen en negatieve controlegenen(EGFP voor siRNA en bla voor dsRNA) (i) in de buik van I. senegalensis (figuur 4), ii) in de thorax van I. senegalensis (figuur 5), en (iii) in de buik van P. zonata (Figuur 6). De resultaten van de RNAi-experimenten worden samengevat in tabel 1. Omdat negatief geladen siRNA/dsRNA alleen is opgenomen in positief geladen cellen, werden RNAi-fenotypes waargenomen rond het gebied waar de positieve elektrode werd geplaatst voor elektroporatie.
In zowel I. senegalensis als P. zonataverscheen remming van melaninepigmentatie (d.w.z. zwart, bruin en roodbruin) in flarden rond het gebied waar de positieve elektrode werd geplaatst (witte pijlpunten en stippellijnen in figuur 4, figuur 5en figuur 6) toen MCO2 RNAi werd uitgevoerd in combinatie met elektroporatie (Tabel 1), zoals eerder gemeld in N. pygmaea9. Daarentegen werden rond de elektroporatieplaats geen fenotypische effecten waargenomen toen het controlegen werd geïnjecteerd(EGFP siRNA of bla dsRNA) (figuur 4, figuur 5en figuur 6, tabel 1). Bovendien had het injecteren van het MCO2-gen zonder elektroporatie geen effect op de pigmentatie van volwassenen (figuur 4, tabel 1), wat aangeeft dat elektroporatie essentieel is voor RNAi in Odonata. Opgemerkt moet worden dat de blauwe, groene en gele kleurlingen niet worden beïnvloed door de RNAi van het MCO2-gen dat betrokken is bij melaninesynthese in de cuticula, die aannemelijk weerkaatst het feit dat deze lichaamskleuren worden toegeschreven aan pigmentkorrels die aanwezig zijn in de opperhuidcellen die zichtbaar zijn via de transparante cuticula26. Zoals blijkt uit figuur 4werden er geen opmerkelijke fenotypische verschillen erkend tussen de personen die aan een siRNA-behandeling en dsRNA-behandeling werden onderworpen, terwijl aanzienlijke variatie in omvang en locatie van het RNAi-fenotype werd waargenomen bij verschillende personen die aan dezelfde RNAi-behandeling werden onderworpen (bijvoorbeeld twee voorbeelden van IsMCO2 dsRNA in figuur 4vergelijken ).
Om het ontwikkelingsstadium te bepalen dat het meest geschikt is voor de RNAi-behandeling, vergeleken we de fenotypische gevolgen van de RNAi-behandeling in vijf morfologische stadia (stadium A-E) in de laatste larve instar van I. senegalensis (figuur 7A). Remming van melaninepigmentatie veroorzaakt door MCO2 RNAi werd waargenomen bij alle volwassenen die in de stadia A en B(figuur 7C) werden geïnjecteerd. Wanneer geïnjecteerd in de stadia C en D, onderdrukking van melanine pigmentatie werd zeker waargenomen bij sommige volwassenen, maar andere volwassenen vertoonden abnormale kleuring veroorzaakt door wonden (Figuur 7B).
Figuur 1: Elektroporatiegemedieerde RNAi-methoden in Odonata. A. Ischnura senegalensis (Coenagirionidae) als representatieve damselfly soort. B. Pseudothemis zonata (Libellulidae) als representatieve libellensoort. C. Het algemene schema van de protocollen. Blauwe en oranje vakken geven de protocollen voor I. senegalensis en P. zonata, respectievelijk. De paarse vakken geven de gemeenschappelijke protocollen aan die op beide soorten worden toegepast. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Een representatief resultaat van de identificatie van de fragmentlengte van polymorfisme (RFLP)-gebaseerde soorten voor Ischnura-soorten. Pijlpunt geeft de I. senegalensis-specifiekeband aan. 1, 2, 4: I. asiatica, 3: I. senegalensis, M: 100-base pair ladder marker. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Elektroporatiegemedieerde RNAi-methode in Odonata. A-C. IJskoude anesthesie van I. senegalensis. Pijlpunten wijzen op een larve. A. Het zetten van een larve op gemalen ijs met een nat papier. B. Vergroot beeld van een larve op ijs. C. Een larve die met een nat document op ijs wordt behandeld. D-G. RNAi methode voor I. senegalensis. D. Injectie in de thorax. E. Elektroporatie op de thorax. F. Injectie in de buik. G. Elektroporatie op de buik. H-J. RNAi methode voor P. zonata. H. Het maken van een klein gaatje op de buik. Ik. Injectie in de buik. J. Elektroporatie op de buik. Pijlen geven het punt van het maken van een gat of injectie. +, -: Positieve/negatieve zijelektroden. Getallen geven het buiksegment aan. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Dorsale opvattingen van RNAi fenotypes op de buik van I. senegalensis. Witte pijlpunten geven de gebieden van onderdrukte melanisatie aan. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Laterale en dorsale opvattingen van RNAi fenotypes op de thorax van I. senegalensis. Witte pijlpunten en stippellijnen geven de gebieden van onderdrukte pigmentatie aan. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: Ventrale opvattingen van RNAi-fenotypes in de buik van P. zonata. Witte pijlpunten en stippellijnen geven de gebieden van onderdrukte melanisatie aan. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7: Faseafhankelijke IsMCO2 RNAi-effecten tijdens de laatste larve instar van I.senegalensis. A. Morfologische veranderingen in de samengestelde ogen in vijf morfologische stadia (stadium A-E) en het aantal dagen tot volwassen opkomst in deze studie. Getallen tussen haakjes zijn afkomstig uit het vorige rapport14. B. Abnormale pigmentatie als gevolg van wonden. Pijlpunt geeft elektroporatieplaats aan. C. Het effect van RNAi in vijf morfologische stadia op volwassen pigmentatie in I. senegalensis. Het nummer op de balk geeft het aantal personen aan. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Soort(en) | I.senegalensis I.senegalensis | P.zonata | |||||||||
| Geïnjecteerd gebied | Buik | Thorax | Buik | ||||||||
| siRNA/dsRNA | Sirna | dsRNA | dsRNA | dsRNA | |||||||
| Doelgen | IsMCO2 IsMCO2 | EGFP | IsMCO2 IsMCO2 | IsMCO2 IsMCO2 | Bla | IsMCO2 IsMCO2 | Bla | PzMCO2 | PzMCO2 | Bla | |
| Elektroporatie | + | + | + | - | + | + | + | + | - | + | |
| Geïnjecteerde larven | 22 | 25 | 30 | 6 | 53 | 12 | 20 | 17 | 5 | 9 | |
| Voortgekomen volwassenen | 7 | 6 | 13 | 4 | 40 | 11 | 14 | 11 | 2 | 5 | |
| Volwassenen met minder gepigmenteerde gebieden (verhouding) | 7 (100%) |
0 (0%) |
13 (100%) |
0 (0%) |
0 (0%) |
10 (91%) |
0 (0%) |
11 (100%) |
0 (0%) |
0 (0%) |
|
Tabel 1. Het effect van RNAi op volwassen pigmentatie in I. senegalensis en P. zonata. De resultaten in fase A worden getoond in I. senegalensis. IsMCO2: multicopper oxidase 2 gen van I. senegalensis, EGFP: Enhanced green fluorescent protein gen, bla: beta lactamase gen from pGEM-T Easy Vector, PzMCO2: multicopper oxidase 2 gen of P. zonata. De resultaten voor de controlegenen vertegenwoordigen het totale aantal experimenten dat de auteurs tot nu toe hebben uitgevoerd.
Discussion
Letaliteit van RNAi behandeling
We ontdekten dat de letaliteit van de RNAi-behandeling sterk afhangt van de opfokgeschiedenis en conditie van de Odonata-larven. De larven kort na de inzameling in het veld zijn over het algemeen gezond en vertonen lage sterftecijfers na de elektroporatie-gemedieerde RNAi-behandeling. Daarentegen hebben de larven die gedurende een lange periode in het laboratorium worden gekweekt (bijvoorbeeld een maand) de neiging om lage slagingspercentages van volwassen opkomst te lijden. In I. senegalensis, in plaats van de larven verzameld in het veld, de larven gefokt in het laboratorium van eieren kunnen worden gebruikt14, maar de slagingspercentages van RNAi met behulp van de laboratorium-gekweekte larven hebben de neiging om aanzienlijk lager (veel mensen stierven tijdens metamorfose) dan die met behulp van het veld verzamelde larven. Bovendien zijn frequente larvevoeding en schoon water grootbrengen belangrijk voor het verhogen van de slagingspercentages van volwassen opkomst en het verminderen van de dodelijkheid van de RNAi-behandeling.
Efficiëntie van de RNAi-behandeling
Zoals hierboven beschreven, vertoonden de niveaus van RNAi-fenotype, namelijk grootte en locatie van de cuticulaontkleuring, vaak aanzienlijke variatie tussen personen die aan dezelfde RNAi-behandeling werden onderworpen (bijvoorbeeld figuur 4),maar de niveaus van de fenotypische penetranteinatie lijken opmerkelijk verschillend te zijn tussen de Odonata-soorten. De waargenomen fenotypische regio's waren groter en prominenter in I. senegalensis (Figuren 4-5) dan in P. zonata (Figuur 6) en N. pygmaea9. Dit verschil kan te wijten zijn aan de dikte van de nagelriem op het larveoppervlak, gezien het feit dat de cuticula van I. senegalensis dunner is dan de cuticula van P. zonata en N. pygmaea). Voor zover wij onderzochten, werd geen duidelijk verschil tussen de effecten van siRNA en dsRNA(figuur 4, tabel 1) erkend.
Geschikte ontwikkelingsfase voor RNAi
Opgemerkt moet worden dat een goede larve enscenering belangrijk is voor het efficiënt uitvoeren van RNAi. Remming van volwassen pigmentatie werd veroorzaakt door MCO2 RNAi vóór het stadium D (ongeveer 3 dagen voor de opkomst van volwassenen), wat in overeenstemming is met het vorige rapport over N. pygmaea9. De RNAi-fenotypes die werden waargenomen wanneer ze in de stadia C en D werden geïnjecteerd, waren minder opvallend dan de rnai-fenotypes die in de stadia A en B werden behandeld, wat erop wijst dat de stadia C en D te laat kunnen zijn om de genexpressie voldoende te onderdrukken. De juiste timing voor RNAi-behandeling is afhankelijk van de timing van genexpressie, en het MCO2-gen vertoont tijdelijk hoge expressie tijdens volwassen opkomst9, zoals bij andere insecten17,18. In de stinkbug Plautia stali, RNAi knockdown van MCO2 gen werd waargenomen vanaf dag 4 na injectie27, wat overeenkomt met de huidige resultaten.
Onze vorige studie over I. senegalensis toonde aan dat, na de fase B, dagen tot volwassen opkomst vertonen relatief kleine variatie onder de meerderheid van de laatste instar larven, wat suggereert dat het stadium B kan overeenkomen met het begin van het proces in de richting van volwassen opkomst, waarna de ontwikkelingsprocessen voor metamorfose te werk gaan op een vooraf vastgestelde en gecoördineerde manier14. Morfologische afwijkingen veroorzaakt door wonden werden vaak waargenomen wanneer de larven werden behandeld in de stadia C en D (Figuur 7B, 7C). Dit is waarschijnlijk geassocieerd met een dramatische progressie van metamorfose tijdens deze stadia, wat suggereert dat RNAi behandeling moet worden vermeden vanaf het stadium C en op. Samengevat raden we aan om de uiteindelijke instarlarven in het stadium A of B (of in het stadium voordat de larvevleugels aanzienlijk uit te breiden) moeten worden gebruikt voor RNAi-experimenten.
Nut en superioriteit van elektroporatie-gemedieerde RNAi-methode
De conventionele RNAi is een eenvoudige en krachtige experimentele methode, maar sommige insectenlijnen zoals vlinders10, bladluizen28 en libellen9 vertonen een lage RNAi-efficiëntie, waarvoor het opzetten van genfunctieanalyse een grote uitdaging is. In deze studie ontdekten we dat elektroporatie-gemedieerde RNAi lokale genonderdrukking bij libellen kan veroorzaken met bijna 100% efficiëntie, althans bij opperhuid, indien behandeld in passende ontwikkelingsstadia(tabel 1). Onlangs zijn crispr/cas9-gebaseerde gen knock-outs met succes toegepast op een verscheidenheid van insecten, die een krachtig moleculair genetisch hulpmiddel voor niet-model organismen29. Hier wijzen we er echter op dat CRISPR/Cas9 zeker geweldig is, maar de elektroporatie-gemedieerde RNAi-methode kan in sommige opzichten superieur zijn aan CRISPR/Cas9.
Ten eerste kan in de elektroporatie-gemedieerde RNAi-methode het lichaamsgebied waar RNAi-fenotypes verschijnen, gemakkelijk experimenteel worden gecontroleerd door de positie van de positieve elektrode bij elektroporatie. Bovendien, aangezien het gebied waar de genexpressie wordt onderdrukt beperkt is rond het gebied waar de positieve elektrode werd geplaatst, kunnen de RNAi fenotypes gemakkelijk worden vergeleken met de controlefenotypes naast elkaar in dezelfde persoon. Ten tweede, in vergelijking met CRISPR / Cas9 methode waarbij geïnjecteerde eieren moeten worden gefokt tot volwassenheid om de knock-out fenotypes te observeren, de elektroporatie-gemedieerde RNAi is superieur in die zin dat het gen knockdown fenotypes kan meestal worden waargenomen in veel kortere tijd. Zo duurt het drie tot vier maanden voor I. senegalensis en een tot twee jaar voor P. zonata van eieren tot volwassenen14,30. Echter, om RNAi fenotypes te observeren binnen de volwassen opperhuid, duurt het minder dan een maand van dsRNA-injectie in de uiteindelijke instarlarven in het stadium B tot volwassen opkomst voor zowel I. senegalensis als P. zonata (Figuur 7). Ten derde, de elektroporatie-gemedieerde RNAi methode met zich meebrengt dsRNA injectie in grote larven, die gemakkelijker is dan micro-injectie in kleine eieren die nodig zijn voor CRISPR / Cas9 methode. Bovendien is de elektroporatiegemedieerde RNAi van toepassing op insectensoorten waarvan de nieuw gelegde eieren moeilijk te verzamelen zijn. Bijvoorbeeld, vrouwtjes van P. zonata leggen eieren op drijvende planten op het wateroppervlak tijdens de vlucht, en dus is het moeilijk om hun eieren te verzamelen, zowel in het veld en in het lab. Daarom verwachten we dat dit protocol algemeen van toepassing kan zijn op niet-modelorganismen waarin de conventionele RNAi-methode niet efficiënt werkt.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Minoru Moriyama voor technisch advies en ondersteuning, Bin Hirota en Ryutaro Suzuki voor het verzamelen van Odonata larven, en Misa Shinya voor nuttige opmerkingen over het manuscript. Dit werk werd ondersteund door JSPS KAKENHI Grant Numbers JP18J21561 to GO en JP18H02491, JP18H04893, JP19H03287 en JP20H04936 naar RF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plate | Violamo | VTC-P12 | For rearing larvae before injection |
| Brine shrimp eggs | JAPAN PET DESIGN | 4975677012396 | |
| Calibrated micropipette (1-5 µL) | Drummond | 2-000-001-90 | |
| Deposit pestle 1.5 mL | Thermo Fisher Scientific | K749520-0090 | |
| Digital high defenition microscope camera | Leica Microsystems | MC170HD | |
| Disposable non-woven mesh | HAKUGEN EARTH | DSC-105A | |
| DNA Ligation Kit Ver.2.1 | Takara Bio | 6022 | |
| DraI | Takara Bio | 1037A | |
| Electrode (1mmφ) | NEPAGENE | CUY650P1 | |
| Electroporator | CellProduce | Cure-gene | |
| Forceps | KOWA Forceps Industry | K-10 No1 | |
| Glass needle puller | NARISHIGE | PN-3 | |
| Hand mixer | AS ONE | 1-229-02 | |
| Hand net | HOGA | IS33-3B | |
| HEPES | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 346-01373 | For injection buffer |
| Insect pin capitate No. 3 | Shiga Konchu Fukyusha | N230 | For fixing larvae |
| KCl | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 163-03545 | For PBS |
| KH2PO4 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 169-04245 | For PBS |
| KOAc | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 160-03175 | For injection buffer |
| KOH | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 168-21815 | For injection buffer |
| Laboratory Jack (150x150) | AS ONE | 1-4642-11 | For adjusting the position of the manipulator |
| LOGIQLEAN Gel for Ultrasound Hard type | GE Healthcare | 2369385 | |
| Manipulator | Muromachi Kikai Co., Ltd. | SJ-1 | For adjusting the position of the injector and the capillary |
| MEGAscript RNAi kit | Thermo Fisher Scientific | AM1626 | |
| Mg(OAc)2 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 130-00095 | For injection buffer |
| Na2HPO4 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 197-02865 | For PBS |
| NaCl | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 191-01665 | For PBS |
| Petri dish (5 cm diameter) | Iwaki | 1010-060 | For rearing injected larvae |
| Pneumatic Injector | NARISHIGE | IM-12 | |
| pT7Blue T-Vector | Novagen | 69820 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28106 | |
| RNAiso Plus | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 9109 | |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74106 | |
| Shiga micro insect pin with stainless headless | Shiga Konchu Fukyusha | N251 | For making a small hole |
| Stereoscopic microscope | Leica Microsystems | S8APO | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18090010 | |
| TaKaRa Ex Taq | Takara Bio | RR001B | For PCR-amplification from plasmid |
| Tks Gflex DNA Polymerase | Takara Bio | R060B | For PCR-amplification from caudal gill |
References
- Misof, B., et al. Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 346 (6210), 763-767 (2014).
- Wipfler, B., et al. Evolutionary history of Polyneoptera and its implications for our understanding of early winged insects. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (8), 3024-3029 (2019).
- Corbet, P. S. Dragonflies Behavior and Ecology of Odonata. , Cornell University Press. Ithaca, NY. (1999).
- Futahashi, R. Color vision and color formation in dragonflies. Current Opinion in Insect Science. 17, 32-39 (2016).
- Futahashi, R. Diversity of UV reflection patterns in Odonata. Frontiers in Ecology and Evolution. 8 (201), (2020).
- Córdoba-Aguilar, A. Dragonflies and damselflies. Model organisms for ecological and evolutionary research. , Oxford University Press. Oxford. (2008).
- Bybee, S., et al. Odonata (dragonflies and damselflies) as a bridge between ecology and evolutionary genomics. Frontiers in Zoology. 13 (46), (2016).
- Linz, D. M., Clark-Hachtel, C. M., Borràs-Castelles, F., Tomoyasu, Y. Larval RNA interference the red flour beetle, Tribolium castaneum. Journal of Visualized Experiments. 92, 52059 (2014).
- Okude, G., et al. Electroporation-mediated RNA interference reveals a role of multicopper oxidase 2 gene in dragonfly’s cuticular pigmentation. Applied Entomology and Zoology. 53 (3), 379-387 (2017).
- Terenius, O., et al. RNA interference in Lepidoptera: An overview of successful and unsuccessful studies and implications for experimental design. Journal of Insect Physiology. 57, 231-245 (2011).
- Ando, T., Fujiwara, H. Electroporation-mediated somatic transgenesis for rapid functional analysis in insects. Development. 140, 454-458 (2013).
- Nishikawa, H., et al. A genetic mechanism for female-limited Batesian mimicry in Papilio butterfly. Nature Genetics. 47 (4), 405-409 (2015).
- Osanai-Futahashi, M., et al. Positional cloning of a Bombyx pink-eyed white egg locus reveals the major role of cardinal in ommochrome synthesis. Heredity. 116 (2), 135-145 (2016).
- Okude, G., Futahashi, R., Tanahashi, M., Fukatsu, T. Laboratory rearing system for Ischnura senegalensis (Insecta: Odonata) enables detailed description of dragonfly’s larval development and morphogenesis. Zoological Science. 34 (5), 386-397 (2017).
- Ozono, A., Kawashima, I., Futahashi, R. Dragonflies of Japan (3rd edition). , Bunichi-Sogo Syuppan, Co Ltd. Tokyo. (2017).
- Ozono, A., Kawashima, I., Futahashi, R. The Handbook of Japanese Aquatic Insects. Volume 3: Dragonfly larvae. , Bunichi-Sogo Syuppan, Co Ltd. Tokyo. (2019).
- Arakane, Y., Noh, M. Y., Asano, T., Kramer, K. J. Tyrosine metabolism for insect cuticle pigmentation and sclerotization. Extracellular Composite Matrices in Arthropods. , Springer. 165-220 (2016).
- Asano, T., et al. Mini-review an insect-specific system for terrestrialization: Laccase-mediated cuticle formation. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 108, 61-70 (2019).
- Futahashi, R., Okude, G., Sugimura, M., Ugai, S.
- Okude, G., Fukatsu, T., Futahashi, R. Interspecific crossing between blue-tailed damselflies Ischnura elegans and I. senegalensis in the laboratory. Entomological Science. 23 (2), 165-172 (2020).
- Naito, Y., Yoshimura, J., Morishita, S., Ui-Tei, K. siDirect 2.0: updated software for designing functional siRNA with reduced seed-dependent off-target effect. BMC Bioinformatics. 10, 392 (2009).
- Yamaguchi, J., Mizoguchi, T., Fujiwara, H. siRNAs induce efficient RNAi response in Bombyx mori embryos. PLoS ONE. 6 (9), e25469 (2011).
- Untergasser, A., et al.
- Futahashi, R. Whole-mount in situ hybridization of sectioned tissues of species hybrids to detect cis-regulatory changes in gene expression pattern. Methods in Molecular Biology. 772, 319-328 (2011).
- Matsuura, Y., Kikuchi, Y., Miura, T., Fukatsu, T. Ultrabithorax is essential for bacteriocyte development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (30), 9376-9381 (2015).
- Henze, M. J., Lind, O., Wilts, B. D., Kelber, A. Pterin-pigmented nanospheres create the colours of the polymorphiic damselfly Ischnura elegans. Journal of The Royal Society Interface. 16, 20180785 (2019).
- Nishide, Y., et al. Diversity and function of multicopper oxidase genes in the stinkbug Plautia stali. Scientific Reports. 10 (1), 3464 (2020).
- Christiaens, O., Swevers, L., Smagghe, G. DsRNA degradation in the pea aphid (Acyrthosiphon pisum) associated with lack of response in RNAi feeding and injection assay. Peptides. 53, 307-314 (2014).
- Sun, D., Guo, Z., Liu, Y., Zhang, Y. Progress and prospects of CRISPR/Cas systems in insects and other arthropods. Frontiers in Physiology. 8, 608 (2017).
- Miyakawa, K. A study of the life-history of Pseudothemis zonata (Burm.) (Odonata, Libellulidae) II. Immature stage. Kontyû. 37 (4), 409-422 (1969).
