Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Изучение кавитационной усиленной терапии

Published: April 9, 2021 doi: 10.3791/61989
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1
1Institute of Biomedical Engineering, University of Oxford
* These authors contributed equally

Summary

Представленный экспериментальный протокол может быть использован для выполнения измерений кавитационной активности в реальном времени в устройстве клеточной культуры с целью проведения исследования условий, необходимых для успешной доставки лекарственного средства и/или других биоэффектов.

Abstract

Интерес к терапевтическому применению ультразвука является значительным и растущим, с потенциальными клиническими целями, начиная от рака до болезни Альцгеймера. Кавитация - образование и последующее движение пузырьков в ультразвуковом поле - представляет собой ключевое явление, лежащее в основе многих из этих методов лечения. Однако сохраняется значительная неопределенность в отношении подробных механизмов действия, с помощью которых кавитация способствует терапевтическому воздействию, и существует необходимость в разработке надежных методов мониторинга, которые могут быть реализованы клинически. В частности, существуют значительные различия между исследованиями в параметрах воздействия, которые, как сообщается, успешно обеспечивают терапевтические эффекты, и соответствующими акустическими излучениями. Целью данной статьи является предоставление руководящих принципов проектирования и экспериментального протокола с использованием широко доступных компонентов для проведения исследований биоэффектов, опосредованных кавитацией, и включение акустического мониторинга в режиме реального времени. Следует надеяться, что протокол позволит более широко включить акустический мониторинг в терапевтические ультразвуковые эксперименты и облегчит сравнение между исследованиями состояний воздействия и их корреляции с соответствующими биоэффектами.

Introduction

Ультразвук (США) широко используется в качестве метода диагностической визуализации из-за его безопасного и неинвазивного характера, простоты его реализации у постели пациента и его экономической эффективности1. Наряду со своими диагностическими и мониторинговыми возможностями, США имеет значительный потенциал для терапевтического применения. Ранняя работа исследовала его использование в тромболизе, трансфекции ДНК и доставке лекарств2,3,4 и терапевтических US внастоящее время представляет собой очень активную область исследований, с приложениями, включая лечение опухолей5,6,7,иммунотерапию8,9,нарушение гематоэнцефалического барьера (ГЭБ)10,11,12,тромболизис13,14,15и лечение бактериальных инфекций16,17. Ключевым явлением, лежащим в основе этих применений, является кавитация: зародыш, рост и колебание газообразных полостей из-за изменений давления жидкости18,19.

Существует целый ряд механизмов, с помощью которых кавитация производит биологические эффекты. Например, высоконелинейная природа пузырьковых колебаний под воздействием прикладного поля США может генерировать микропоток в окружающей жидкости, который может как усиливать конвекцию лекарственного средства20, так и оказывать сдвиговые нагрузки на ткани в непосредственной близости от пузырьков. Это особенно распространено, когда пузырьки находятся в непосредственной близости от границы, заставляя пузырьки колебаться несферически, и может потенциально способствовать поглощению лекарственного средства через пермеабилизацию, вызванную сдвигом21,22,23,24. При более высоких давлениях наблюдаются колебания большей амплитуды и быстрый коллапс пузырьков, придающий прямое механическое напряжение25 и часто генерирующий ударные волны, и, как следствие, большие градиенты давления, которые могут нарушать и проникатьв ткани 26,27. Коллапс пузырьков вблизи поверхности также может привести к образованию высокоскоростных жидких микроджетов28,29,30. Эти микроструйные двигатели могут проникать в ткани, потенциально создавая поры или индуцируя вторичные волны напряжения31,32. Пермеабилизация биологических мембран как на тканевом, так и на клеточном уровнях по-разному называется сонофорезом, используемым главным образом в контексте УЗИ-индуцированного повышения проницаемости кожи33,34и сонопорации, используемой в основном для описания обратимой пермеабилизации клеточной мембраны за счет образования мембранных пор35,36.

Вязкое поглощение в жидкости, непосредственно окружающей колеблющийся пузырь, может производить существенный эффект нагрева37. Более того, высоконелинейные колебания производят акустическое излучение на частотах, превышая движущие поля США. Это приводит к усилению всасывания в окружающих тканях и дальнейшему нагреванию38. Коллапс пузырьков также может сопровождаться химическими эффектами из-за переходных высоких температур и давлений в ядре пузыря, таких как генерация высокореактивных веществ и электромагнитного излучения, известного как сонолюминесценция32. Эти эффекты были исследованы для оценки потенциального повреждения и/или активации соответствующих клеточных путей для доставки39 и использованы в локальной активации светочувствительных препаратов в подходе, известном как сонодинамическаятерапия 40,41,42,43.

Многие опосредованные США биоэффекты могут быть инициированы исключительно путем контроля параметров поля США (амплитуда давления, частота, длина импульса и частота повторения, а также продолжительность воздействия), но надежное создание кавитации в биологической ткани часто требует высоких входных энергий и, следовательно, несет повышенный риск повреждения. Введение экзогенных или искусственных кавитационных ядер может существенно снизить входную энергию, необходимую для получения широкого спектра эффектов, рассмотренных выше, и дополнительно вводит дополнительные эффекты, которые могут быть невозможны только с США. Кавитационные ядра включают пузырьки газа26,44,каплижидкости45,46,47 и твердые частицы48,49,50,причем наноразмерные кавитационные ядра являются эмерджентной областью исследования для их преимуществ с точки зрения длительного времени циркуляции, улучшенной экстравазации и длительной кавитационной активности49,51,52,53.

Наиболее часто используемыми ядрами являются газовые микропузырьки (МБ), первоначально использовавшиеся в качестве контрастных веществ в диагностической визуализации. Они обычно имеют диаметр 1-2 микрометра и содержат ядро высокомолекулярного газа с низкой растворимостью в водной среде. Ядро окружено защитной липидной, белковой или полимерной оболочкой, чаще всего состоящей из фосфолипидов54. При воздействии поля США сжимаемость МБ заставляет их подвергаться объемным колебаниям, что приводит к сильному акустическому рассеянию, которое отвечает за успех МБ в качестве контрастного вещества. Как уже упоминалось, эти колебания также приводят к вышеупомянутым механическим, термическим и химическим эффектам, которые могут быть использованы в терапевтических приложениях. Процесс нанесения покрытия MB также предлагает механизм инкапсуляции лекарственных средств в структуру MB и для присоединения лекарственных средств и/или целевых видов к поверхности MB. Данная методика облегчает триггерное высвобождение лекарственных средств для снижения системной токсичности55. Также недавно было показано, что материал с поверхности МБ может быть перенесен в биологические структуры, усиливая доставку лекарств посредством так называемой «сонопечати»56,57,58.

Мониторинг опосредоороженной США кавитационной активности может дать представление о результирующих биологических эффектах как in vitro, так и in vivo и потенциально позволяет настраивать и оптимизировать эти эффекты. Двумя наиболее широко применяемыми методами мониторинга кавитационной активности являются: i) оптические, которые используют сверхскоростную видеомикроскопию и, как правило, неосуществимы invivo; и ii) акустические, которые записывают повторно излучаемые звуковые поля, создаваемые колебающимися и / или коллапсирующими пузырьками. Как амплитудная, так и частотная составляющие акустического сигнала содержат информацию о поведении пузырьков. Было показано, что низкие концентрации пузырьков при низких амплитудах падающего США производят преимущественно гармонические излучения (целые кратные частоте движения)59. По мере увеличения давления привода спектр излучения пузырьков может также содержать дробные компоненты, известные как субгармоники и ультрагармоники60, которые указывают на более сильное нелинейное поведение, а также широкополосный шум, который указывает на инерционную кавитацию. Целочисленные гармоники являются основным индикатором пузырьковых колебаний, но также могут быть вызваны нелинейностью в любом месте экспериментальной системы, например, из-за нелинейного распространения. Напротив, дробные гармоники и широкополосный шум очень сильно коррелируют с динамикой пузырьков.

Взаимосвязь между поведением пузырьков и обнаруженными акустическими излучениями может быть осложнена факторами, включая падающее поле США, среду нуклеации и характеристики пути обнаружения60. Тем не менее, важная информация о поведении пузырьков и их взаимодействиях с клетками может быть получена путем распознавания тенденций частоты и энергии в акустическом спектре. Эти данные также могут предоставить ценную информацию, которая может быть использована для формирования основы для методов клинического мониторинга лечения. Чтобы в полной мере использовать эту информацию, требуется разработка надежных, переводимых и воспроизводимых экспериментальных методов.

В настоящее время существуют значительные различия в протоколах проектирования систем и проведения исследований в поддержку разработки кавитационной терапии. Что касается аппарата, то был предпринят ряд подходов к проектированию. Несколько групп использовали камеры с параллельными пластинами56,61,62,63,либо изготовленные на заказ, либо коммерчески доступные (например, OptiCell, ThermoFisher Scientific). Hu et al. (2013) разработали клеточную камеру в сочетании с модулем ультразвуковой обработки США и конфокальной визуализацией в реальномвремени 64,Carugo et al. (2015) использовали систему, содержащую коммерчески доступную чашку для клеточных культур с изготовленной на заказ крышкой PDMS, чтобы обеспечить погружение в водяную баню во время воздействия65в США, а Pereno et al. (2018) использовали устройство, состоящее из слоистых акустофлюидных резонаторов, которые позволяют одновременно оптическую и акустическую характеристику динамики пузырьков и взаимодействия пузырьковых клеток66. Использование изготовленных на заказ и специфичных для конкретных применений конструкций усложняет характеристику поля США и других условий воздействия окружающей среды, что затрудняет перекрестные сравнения исследований. Например, существуют значительные различия в параметрах США, выявленных для достижения успешной сонопорации, которые включают центральные частоты в диапазоне от 0,02 до 15 МГц, рабочие циклы, варьирующиеся от 1% до непрерывной волны, и разреженные давления в диапазоне от 0,1 до 20МПа 23,64,67,68,69,70 (таблица 1). Существуют также значительные различия в спектральных компонентах (гармониках, субгармониках и т. д.), которые были идентифицированы как связанные с конкретными биоэффектами.

Цель этой работы, таким образом, состоит в том, чтобы обеспечить легко воспроизводимую системную структуру проектирования и реализации для исследования in vitro кавитационных клеточных биоэффектов с конкретным включением возможности кавитационного мониторинга.

Protocol

1. Принципы проектирования системы

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе представлены принципы проектирования, используемые для создания систем мониторинга воздействия и кавитации в США. Эти принципы проиллюстрированы двумя существующими системами акустической трансфекции (SAT) (показаны на рисунке 1). Каждая система состоит из экспозиционного отсека ячейки, источника США и одноэлементного преобразователя, функционирующего как пассивный кавитационный детектор (PCD), все из которых интегрированы в настольной испытательной камере. Эти конструкции основаны на предыдущем развитии системы, описанном в Carugo et al. (2015)65.

  1. Максимальная простота использования.
    1. Сделать клеточный экспозиционный отсек совместимым с существующими методами культивирования и системами визуализации, используя существующие коммерческие устройства для посева клеток в качестве субстратов для посева/роста.
      1. Для SAT2 используйте чашку для культивовки (диаметром 35 мм, из которых наблюдается область диаметра 21 мм, см. Таблицу материалов).
      2. Для SAT3 используйте вставку Transwell (диаметр 6,5 мм, см. Таблицу материалов). Трансвеллы имеют проницаемую мембрану и, следовательно, должны быть помещены в клеточные среды, а не в воду.
  2. Обеспечьте быструю загрузку и герметизацию отсека для экспозиции ячеек.
    1. Сформируйте экспозиционный отсек для клеток SAT2, прижав гибкую полимерную крышку над чашкой для культивовки (Carugo et al. 201565). Как видно на рисунке 1С,крышка имеет пару отверстий диаметром 1,2 мм, которые позволяют заполнять отсек тупым игольчатым шприцем 18 Г. После заполнения запечатайте эти заправочные отверстия короткими пластиковыми стержнями(Таблица материалов).
    2. Заполните отсек SAT3 шприцем или пипеткой и запечатайте, прижав резиновый пробку/бунг.
    3. Обеспечьте быструю загрузку герметикого отсека для воздействия ячеек в испытательную камеру. Держатели для ячеек были встроены в крышки камер, где световой прижим достаточно для обеспечения правильного выравнивания. В системах, показанных на рисунке 1,время для изменения образца может составлять всего 20 секунд, если заранее подготовлены несколько камер воздействия клеток.
    4. Минимизируйте внутренний объем камеры, чтобы система была портативной, а количество необходимой воды / среды можно было свести к минимуму. Это также ускоряет восстановление после случайных разливов или утечек кавитационных агентов из камеры воздействия на клетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Внутренний объем SAT2 составляет приблизительно 0,8 л. Внутренний объем SAT3 составляет около 7,6 л и увеличен для удобства загрузки и смены источника преобразователя или его конфигурации. Внутренняя камера объемом 0,3 л была добавлена для минимизации одноразового объема и для того, чтобы можно было использовать биологически значимые жидкости, отличные от резервуара, заполняющего воду (например, клеточную культурную жиму). Внутреннее дно камеры изготовлено из майларового листа толщиной 30 мкм, что позволяет обеспечить максимальную акустическую передачу.
    5. По возможности изготовите камеру и внутренние компоненты из оптически прозрачных материалов, чтобы любые проблемы (например, утечки, застрявные макропузырьки) можно было быстро наблюдать и устранять.
  3. Максимальная акустическая пропускаемость экспозиционного отсека.
    1. Максимальная пропускаемость благодаря выбору материалов и толщины стенок отсека. Исходя из предположения, что жидкости по обе стороны стенки по существу одинаковы (например, вода), величина нормального коэффициента пропускания давленияпадения 71 составляет:
      Equation 1, где λ — длина волны в стенке толщиной L, Equation 2 а z L и zo — характерные импедансы (продукты плотности и скорости звука) для материала стенки и жидкости соответственно. T = 1 указывает на идеальную передачу.
    2. Для мониторинга кавитации широкого спектра (например, 1-8 МГц) большинство лабораторных полимеров (например, PDMS, PTFE, полистирол) изменяют передаваемое давление не более чем на 10%, если толщина материала составляет менее 1/10длины волны в материале. Это условие может быть трудно выполнить со стандартными источниками питания на высоких частотах (например, #1,5 крышки на частоте 8 МГц), поэтому рекомендуется прогнозировать или непосредственно калибровать частотную характеристику передачи.
    3. Для узкополосной передачи исходного сигнала США в экспозиционный отсек ячейки допускайте более толстый слой, если он приблизительно является целым числом, кратным половине длины волны в материале слоя. Например, крышка PDMS в SAT2 используется при толщине 2,0 мм (~2 длины волны на частоте 1 МГц, cPDMS ~ 1000 м/с).
  4. Максимизируйте область воздействия за счет выбора источника и клеточной среды.
    1. Чтобы максимизировать количество открытых клеток, сделайте область прикрепления клеток как можно более широкой, сохраняя при этом совместимость с имеющимся оборудованием для культивирования и визуализации.
    2. Используйте источник США с полем, которое охватывает область прикрепления ячейки с минимальной пространственной изменчивостью, используя предфокусную область большого сфокусированного источника (SAT2) или сфокусированный или линзированный источник с шириной основной доли, которая соответствует диаметру области прикрепления ячейки (SAT3). Конкретные источники см. в Таблице материалов.
    3. Сведите к минимуму сложность поля, создаваемую держателем ячейки, путем механической поддержки ячейки отсека на далеком от самой сильной части падающего поля, сводя к минимуму поперечное сечение рассеивания держателя или помещая поглощающий материал на держатель. Примеры показаны на рисунках 1A и 1D.
  5. Обеспечьте повторяемость условий воздействия.
    1. Завершите акустическое поле в фиксированной границе, чтобы исключить изменчивость, которая может возникнуть из-за границы раздела воздух-вода в частично заполненных камерах. В SAT2 и 3 это достигается путем установки акустического поглотителя (см. Таблицу материалов)на крышку камеры с дополнительным преимуществом снижения сложности поля, которая может возникнуть из-за пограничных отражений.
    2. Контролируйте и записывайте напряжение источника на выходе/входе источника усилителя, чтобы можно было быстро обнаружить незначительную изменчивость или серьезную неисправность. Используйте датчик напряжения или другое устройство, безопасное для использования в интересуемом диапазоне напряжения привода. Периодически проверяйте калибровку датчика напряжения с помощью хорошо известного источника, такого как генератор сигналов.
    3. Контролируйте, контролируйте и записывайте температуру камеры и ее содержимого. Реакции клеток, преобразователей и среды распространения могут быть чувствительны к температуре. В SAT2 мониторинг и управление осуществляются с помощью пары циркуляционных портов, подключенных к системе кондиционирования воды, в то время как в SAT3 используется аквариумный обогреватель (не показан). Установите температуру воды по мере необходимости, чтобы имитировать соответствующие физиологические условия для терапевтического применения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: внутренние температуры могут изменяться как в результате внешних факторов, так и в результате сгенерированного США нагрева преобразователя и среды.
    4. Тщательно дегазируйте жидкость (жидкости) камеры, чтобы свести к минимуму вероятность непреднамеренной кавитации и/или рассеяния от ранее существовавших пузырьков на пути распространения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: если дегазирование не проводить, например, из-за негативного воздействия на клетки, то будет повышен фоновый уровень активности пузырьков, для чего подойдет.
  6. Откалибруйку полностью собранной системы.
    1. Включить средство измерения поля давления, падающего на подвергшиеся воздействию ячейки, когда все компоненты системы находятся на месте, включая экспозиционный отсек ячейки. В SAT2 и 3 это достигается с помощью отверстия в крышке камеры, через которое можно вставить иглу или волоконно-оптический гидрофон, не нарушая измеряемое поле. Сделайте измерения как можно ближе к тому, где расположены ячейки.
    2. Выбирайте гидрофон с чувствительным радиусом(rcv)достаточно малым, чтобы он не искажал измеряемое поле давления. Допустимый размер является функцией частоты источника(f)ирадиуса (asrc),а также расстояния между источником и полем сканирования(zrcv). Общим критерием выбора размера гидрофона является: Equation 6 , приводящий к: Equation 7 , где c — скорость звука72.
    3. Убедитесь, что гидрофон откалиброван в условиях, используемых при характеристике системы, включая температуру, указанную в разделе 1.6. В частности, если гидрофон удерживается под углом по отношению к плоскости сканирования, гидрофон должен быть откалиброван под этим углом, поскольку эффекты направленности могут значительно отличаться от ожидаемых, основанных исключительно на геометрии. Изменение чувствительности гидрофона по отношению к температуре должно быть получено от производителя.
    4. Сканируйте всю область, в которой могут подвергаться воздействию клетки. Чтобы зафиксировать соответствующий уровень детализации поля, используйте расстояние сканирования не более 1/5-й длины волны на самой высокой интересующей частоте. Если наблюдается неожиданная сложность поля, рассмотрите возможность использования коротких пакетных сигналов (например, 1-3 цикла), чтобы обеспечить идентификацию и количественную оценку прямых и рассеянных полевых вкладов.
  7. Включите возможность мониторинга кавитации.
    1. Определите тип и размещение датчика мониторинга как часть конструкции всей системы, а не как модернизацию. На практике это приводит к тому, что система максимально компактна без ущерба для возможности надежно выровнять критически важные компоненты системы.
    2. Поместите устройство мониторинга кавитации в систему таким образом, чтобы его можно было повторно позиционировать с минимальным дополнительным временем настройки или нарушением рабочего процесса. В SAT2 это достигается с помощью одноэлементного пьезоэлектрического преобразователя, действующего как PCD, установленного в крышке камеры, в то время как SAT3 интегрирует PCD в исходное основание с помощью отражателя 90°.
    3. Выберите форму PCD в соответствии с целями экспериментов. На рисунке 2расчеты полуамплитудных контуров несфокусированных (слева) и сфокусированных (справа) устройств показывают глубокие различия в пространственной чувствительности по отношению к частоте. Несфокусированное устройство лучше подходит для мониторинга больших объемов со скромными пространственными вариациями по отношению к частоте, в то время как сфокусированное устройство лучше подходит для более радиально компактных измерений на интересующих частотах.
    4. Выберите центральную частоту и полосу пропускания PCD в соответствии с потребностями эксперимента. Центральная частота обычно выбирается как минимум в пять раз больше, чем у источника в США, чтобы свести к минимуму чувствительность к прямому излучению источника. Полоса пропускания обычно максимизируется для наблюдения за широким диапазоном поведения пузырьков (гармонический и широкополосный шум).
    5. Выберите методы кондиционирования, записи и обработки, позволяющие анализировать кавитационные данные, как описано в следующем разделе.

2. Контрольно-измерительные приборы и обработка для кавитационного мониторинга

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе представлены компоненты и функции потока сигнала, рекомендуемые для сбора данных кавитационного мониторинга, а также обработка данных, которая приводит к качественным и количественным оценкам кавитационной активности.

  1. Контрольно-измерительные приборы (см. также рисунок 3).
    1. Если приложение не требует индивидуального устройства, выберите PCD из широкого спектра коммерчески доступных одноэлементных преобразователей, обычно продаваемых для неразрушающего контроля подводных целей. Эти поставщики также имеют кабели и аксессуары (например, зеркальный отражатель в SAT3).
    2. Сведите к минимуму реакцию ПХД на источник в США. Это может быть сделано как путем выбора PCD (центральная частота и полоса пропускания), так и с помощью выемки или фильтра высоких частот. Последний реализуется либо как автономный модуль, либо как часть устройства обработки сигнала.
    3. Используйте дигитайзер с большим динамическим диапазоном (не менее 12 бит) для захвата как можно большего количества данных с минимальной вероятностью высокого отсечения сигнала и максимальным отношением сигнал/шум (SNR) наименьших сигналов. При сравнении устройств просмотрите спецификации сигнала к шуму и искажениям и/или эффективному количеству бит, поскольку они являются более полными описаниями достижимого динамического диапазона. Также подумайте, достаточен ли размер буфера памяти для требуемой длины и скорости сбора данных.
    4. Оптимизируйте использование динамического диапазона дигитайзера. Сигналы PCD могут охватывать несколько порядков величины, как из-за длительной экспозиции (по мере устранения пузырьков), так и при проведении экспериментов на различных уровнях привода в США. Поэтому необходимо проверить, что цепочка кондиционирования сигналов масштабирует все сигналы таким образом, чтобы их можно было правильно записать.
    5. Включите предусилитель в сигнальную цепочку, чтобы можно было адекватно улавливать наименьшие ожидаемые сигналы. По нашему опыту, самошум pcD значительно ниже, чем у большинства дигитайзеров, поэтому скромная степень предварительной амплификации (например, <100x) все еще может улучшить SNR конечного результата.
    6. Отфильтруйте частоту источника США перед предварительным усилением, чтобы избежать насыщения усилителя.
    7. Если для обеспечения усиления и/или фильтрации используется импульс/приемник США, используйте его в режиме импульса для подтверждения длины /выравнивания пути или проверки на наличие неожиданных рассеивателей в пути распространения между PCD и отсеком экспозиции ячейки.
    8. Обеспечьте потоковую передачу данных в хранилище в режиме реального времени. В системах SAT2 и SAT3 используются 12-разрядные потоковые USB-осциллографы (см. Таблицу материалов),которые имеют удобство портативности и хорошо построенные пользовательские интерфейсы.
    9. Подтвердите правильное соответствие импеданса в сигнальной цепочке, чтобы избежать ошибок усиления или полосы пропускания. Устройства PCD обычно имеют выходное сопротивление около 50 Ом, поэтому подходящим процессом является замена PCD известным сигналом от генератора сигналов (с выходным сопротивлением 50 Ом) и подтверждение того, что размер сигнала, появляющийся на дигитайзере, соответствует ожиданиям, линейно масштабируется при изменении вводимого сигнала, и для наибольшего интересующего сигнала не наблюдается отсечения.
  2. Предварительная обработка
    1. Скорректировать необработанные сигналы напряжения для всех известных коэффициентов и чувствительности в пути сигнала, которые относятся к обработке данных в интересуемом диапазоне частот.
    2. Если данные были записаны с помощью входной связи постоянного тока или иным образом показывают смещение постоянного тока, удалите это смещение путем прямого вычитания или с помощью фильтра высоких частот.
  3. Вычислите спектр мощности P каждого записанного сигнала.
    1. Установите длину преобразования Фурье Nft таким образом, чтобы фундаментальная частота источника США f 0 была большим целым числом, кратным ширине контейнера преобразования: Nft =   nfs/f0, где n — целое число, а fs — частота выборки оцифрованных данных. Установите n ≥ 50 для четкого захвата спектральных объектов. Для примера фундаментального образца 1 МГц, отобранного на частоте 50 МГц, Nft составляет 2500, а ширина бункера - 0,02 МГц.
    2. Поскольку длина преобразования Nft обычно меньше длительности записанного сигнала, используйте оценку спектральной плотности мощности(PSD),такую как метод73Уэлча. Мощность в полосе частот, охватывающей f1-f2, составляет , где Equation 13 dF — ширина бункера преобразования.
    3. Чтобы охарактеризовать активность пузырьков во время каждого воздействия, оцените вклад в спектр мощности от целых кратных f0 (гармоники), нечетных целых кратных f0 /2(ультрагармоника) и широкополосного шума (инерционная кавитация).
    4. Содержание гармоник и ультрагармоний наиболее просто оценивается путем выбора значений спектра мощности на определенных частотах. Однако тональные отклики с большой амплитудой могут распространяться на небольшое число смежных частотных бункеров (например, f0 ± 2-3), поэтому они должны быть включены в узкополосные расчеты мощности и исключены из широкополосных расчетов.
    5. Оцените мощность кавитации широкополосного диапазона путем вычитания гармонического и ультрагармонического вкладов из общего спектра мощности. С другой стороны, эти вклады могут быть оценены с использованием более сложной предварительной обработки74.
    6. Оценить кумулятивную энергию кавитационного сигнала в течение длительности воздействия, предпочтительно в соответствии с признаком спектра /типом активности пузырьков.
    7. Предполагая, что все записи данных имели одинаковую продолжительность Tr,кумулятивная энергия в записанных данных равна Equation 15 , где M указывает на количество записей.
    8. Если между записями есть промежутки, как это может произойти, когда экспозиция непрерывна, а сохраненные файлы захватывают часть общей продолжительности экспозиции Te,совокупная энергия может быть оценена как Equation 16
    9. Оцените измерение SNR путем сравнения уровней спектра с уровнями фонового шума, зарегистрированного в отсутствие США.

3. Экспериментальный протокол

  1. Подготовка к SAT
    1. Минимизируйте вероятность кавитации в пути распространения путем дегазации заполняемой жидкости (обычно фильтроированной воды) под давлением -10 5 Па в течение неменее двух часов. Рекомендуется подтверждение с помощью зонда растворенного кислорода, что парциальное давление кислорода ниже 10 кПа.
    2. Медленно заполняйте испытательную камеру, чтобы свести к минимуму повторное введение воздуха в дегазированную жидкость. При необходимости продолжайте дегазировку заполненной камеры.
    3. Очистите все остаточные пузырьки от поверхностей датчика и контейнера для среды сразу после заполнения и снова непосредственно перед началом экспериментов по воздействию.
    4. Убедитесь, что температура камеры и ее содержимого стабилизировались, прежде чем начинать эксперименты по воздействию.
    5. Позвольте усилителю мощности источника в США прогреться (в соответствии с рекомендацией производителя), чтобы коэффициент усиления и выход были стабильными по отношению ко времени.
  2. Подготовка экспозиционного отсека
    1. Суспензия кавитационного агента
      1. При разведении кавитационного агента осторожно и непрерывно перемешивать, чтобы получить однородную суспензию, не зацепляя макропузырьки и не разрушая агент (особенно если они представляют собой очищенные пузырьки).
      2. При работе с МБ вынимайте и дозируйте медленно, используя самую большую из доступных калибровочных игл, чтобы свести к минимуму разрушение в процессе загрузки75. Тупая заполняемая игла 18 г регулярно используется с системами SAT.
  3. Подготовка к SAT2
    1. Стерилизуйте крышку PDMS перед использованием в экспериментах с живыми клетками.
    2. Сформируйте экспозиционный отсек для клеток, прижав крышку PDMS к чашке для культивирование.
    3. Подготовьте шприц тупой иглой 18 г и заполните примерно 10 мл жидкости (например, суспензией MB или контролем воды).
    4. Вставьте иглу через одно из заполненных отверстий PDMS и медленно заполните камеру, наклоняясь так, чтобы макропузырьки могли выйти через открытое заливное отверстие. Для достижения наилучших результатов наклоните камеру так, чтобы открытое отверстие было выше заполняемого отверстия.
    5. При заполнении закройте открытое отверстие, вставив короткий (4-5 мм) полимерный стержень. Установите узел таким образом, чтобы оба отверстия были горизонтальными.
    6. Снимите тупую заполняющую иглу во время инъекции дополнительной жидкости, чтобы воздух не втягивается. Закройте отверстие другим полимерным стержнем. Этот процесс завершает герметизацию экспозиционного отсека клетки.
    7. Визуально проверьте отсек на наличие застрявных макропузырьков и, если таковые обнаружены, повторите 3.3.3.-3.3.6.
    8. Прижмите поместить отсек экспозиции ячейки в держатель отсека. Установите крышку камеры на место на камере. Опускание крышки под углом к горизонтали препятствует макропузырькам опираться на погруженные части (поглотитель, держатель).
    9. Учитывайте плавучесть частиц в суспензии при определении ориентации клеточного экспозиционного отсека (например, плавающие пузырьки или тонущие наночастицы) и как это повлияет на их контакт с клетками.
    10. Во всех операциях используйте как можно меньше силы, чтобы свести к минимуму изгиб поверхности роста клеток и отслоение клеток.
  4. Подготовка к SAT3
    1. Заполните Transwell приблизительно 150 мкл жидкости (например, суспензией MB или контролем воды).
    2. Сформируйте отсек для воздействия клеток, тщательно запечатав трансвелл с помощью резиновой пробки, удалив любую переливную жидкость чистым бумажным полотенцем или салфеткой. Перед использованием в экспериментах с живыми клетками стерилизуйте резиновую пробку.
    3. Визуально проверьте отсек на наличие застрявных макропузырьков, и если таковые обнаружены, удалите вилку, удалите макропузырьки и повторите 4.4.2.
    4. Прижмите поместить отсек экспозиции ячейки в держатель отсека. Установите крышку камеры на место на камере. Опускание крышки под углом к горизонтали препятствует макропузырькам опираться на погруженные части (поглотитель, держатель).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как отмечалось выше, макропузырьки могут вызывать различные неповторяемые и потенциально вредные последствия для экспериментов по воздействию в США. Наиболее важно, что макропузырьки, захваченные в компартменте воздействия клеток, могут вызывать реакции ПХД и местные клеточные биоэффекты, которые не являются репрезентативными для предполагаемого лечения. Всегда визуально проверяйте все компоненты системы, чтобы найти и удалить макропузырьки перед началом экспериментов в США.

4. Сбор данных

  1. Установить фоновые уровни реакции ПХД путем проведения первоначальных экспериментов с камерой воздействия клеток, заполненной контрольной жидкостью (например, дегазированной водой или клеточными средами).
  2. Записывайте данные PCD без управления источником в США для установления уровня фонового электронного шума.
  3. Записывайте данные PCD во время вождения источника в США на полном диапазоне запланированных уровней привода. Эти данные укажут, какие части акустического отклика не связаны с кавитационными агентами, которые будут протестированы впоследствии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обычные лабораторные жидкости (например, PBS или клеточные среды) будут демонстрировать кавитацию при умеренном давлении (например, 0,5 МПа на 0,5 МГц), если они не дегазированы.
  4. Перед началом измерений дайте время для термического уравновешивания суспензии с температурой камеры. Для этой цели может быть полезна тонкоигольная термопара.
  5. Мониторинг экспериментов в режиме реального времени как во временной, так и в частотной областях.
    1. Мониторинг PCD во временной области показывает, соответствуют ли сигналы текущим настройкам приборов. В частности, следует избегать отсечения сигнала, поскольку оно будет появляться в частотной области как многотональный гармонический отклик.
    2. Мониторинг ПХД во временной области также показывает, видны ли кавитационные сигналы раньше, чем ожидалось, на основе времени распространения от источника США к отсеку воздействия ПХД. Если такие сигналы видны, это может указывать на утечку кавитационного агента в испытательную камеру.
    3. Мониторинг частотной области PCD указывает на тип поведения пузырьков и может быть использован для регулировки уровней привода по мере необходимости для достижения желаемого клеточного стимула (например, более низкие уровни привода для гармонического возбуждения).
  6. Чтобы убедиться, что первые экспозиции не пропущены, запустите процесс сбора данных до включения сигнала источника привода США.
  7. Контролируйте выходной сигнал усилителя, который управляет источником СИГНАЛОВ США (в отличие от выходного сигнала генератора сигналов) на протяжении всего эксперимента, чтобы убедиться, что экспозиция протекает так, как ожидалось. Используйте высоковольтный зонд для этого измерения и убедитесь, что осциллограф настроен на компенсацию затухания зонда.
  8. После экспонирования образца осторожно извлеките его из испытательной камеры.
    1. Снимите и очистите крышку PDMS (SAT2)/резиновую заглушку (SAT3) в рамках подготовки к последующему использованию.
    2. Перенесите чашку для культивирования (SAT2)/Transwell (SAT3) по мере необходимости для последующего анализа (например, микроскопии, флуоресцентной визуализации).
    3. После небольшого числа воздействий (например, 3-5) рекомендуется повторно получить исходные кавитационные сигналы (в отсутствие кавитационного агента) и сравнить с исходным набором данных, чтобы убедиться, что камерная среда не была загрязнена.

Representative Results

На рисунке 4 показаны примеры реакций PCD во временной и частотной областях, иллюстрирующие три различных кавитационных поведения. Все данные были собраны на SAT3 с использованием SonoVue MBs, разбавленных в 5 раз в PBS, с конечной концентрацией ~2*107 МБ/мл. Температура для всех примеров в этом разделе составляла 19 ± 1 °C. Американский источник приводился в действие импульсом 2,0 мс на частоте 0,5 МГц для достижения пиковых отрицательных давлений 0,20(рисунок 4A и 4B),0,30(рисунок 4C и 4D)и 0,70 МПа(рисунок 4E и 4F). Запись сигнала началась за 1,4 мс до начала импульса США t = 0. Следы вставки показывают сигнал в записанном виде (красный) и с фильтром высоких частот 2 МГц (синий) для временного окна, центрированного во время полета от источника к отсеку воздействия ячейки к PCD. Низкоуровневая реакция до этого времени обусловлена непосредственно полученным излучением от источника, что характерно в конфигурациях, где ПХД находится позади источника в США.

При самом низком падающих давлении отклик PCD полностью состоит из целочисленных гармоник фундаментальной частоты США 0,5 МГц. Увеличение с 0,20 до 0,30 МПа приводит к выраженной ультрагармонии в спектре в дополнение к дальнейшему повышению целочисленных гармоник. Формы сигналов временной области при этих двух давлениях выглядят одинаково, хотя результаты 0,30 МПа показывают большую изменчивость в течение длительности импульса. При самом высоком давлении амплитуда формы сигнала временной области выросла нелинейно относительно более низких давлений в результате явно повышенного широкополосного шума, видимого в спектре. Этот шум обычно считается результатом инерционной кавитации и в этом примере соответствует разрушению МБ.

Чтобы увидеть это более четко, ответы PCD как функция времени показаны на рисунке 5. На левой панели(рисунок 5А)полные спектры показаны в течение 50 секунд времени экспозиции, в течение которого источник излучал 2,0 мс импульсов каждые 0,20 секунды. Соответствующие суммарные, гармонические и широкополосные мощности показаны на правой панели(рисунок 5B). США были включены при t = 3,0 с, в это время были замечены широкополосные ответы с большой амплитудой. Считается, что начальный всплеск соответствует разрушению самых больших пузырьков в суспензии (SonoVue является полидисперсным) и является распространенным наблюдением в кавитационных экспериментах с пузырьками с оболочкой и даже с недетагазированной средой (например, PBS).

Через несколько секунд широкополосный отклик быстро уменьшился, по-видимому, из-за разрушения пузырьков, и сигнал преимущественно состоял из гармоник. Это говорит о том, что освобожденный газ и оставшиеся МБ вибрируют стабильно и неинерциально. При t~50 с широкополосный компонент упал до уровня исходного фонового шума. Поэтому такие тесты воздействия важны при попытке понять временные рамки, в течение которых различные пузырьковые эффекты могут воздействовать на клетки в камере.

Пузырьки, вероятно, будут транслироваться в ответ на силы излучения, генерируемые во время воздействия США, и перемещение МБ в поле зрения ПХД и из него может привести к повышенной изменчивости контролируемого кавитационного сигнала, особенно при работе с разбавленными суспензиями. Поэтому чувствительная область ПХД должна охватывать как можно большую часть поверхности воздействия клеток. Сравнение откликов сфокусированных и несфокусированных ПХД с одинаковыми центральными частотами (см. Рисунок 2)показано на Рисунке 6с использованием разбавления МБ 20:1 в нормальной PBS - SAT2. Спектры времени и усредненные по выборке на панели рисунок 6A показывают, что несфокусированный ПХД содержит более сильный широкополосный отклик, сопровождаемый уменьшенной изменчивостью от образца к образцу как в гармонической(рисунок 6B),так и в ультрагармонической степенях(рисунок 6C).

Важно признать, что среды, используемые для работы клеток in vitro, не дегазированы и могут представлять повышенный фоновый уровень активности пузырьков. На рисунке 7 показан ответ в SAT2 PBS, используемого в предоставленном поставщиком виде и после двух часов дегазации в вакууме, после чего насыщение воздуха было снижено с 92% до 46%, как определено с помощью оптического датчика (PreSens, Германия). Спектры на рисунке 7А были усреднены за время экспозиции и повторены с пятью независимыми образцами, и ясно показывают явно повышенные ультрагармонические показатели в нормальном PBS. Степени, суммированные по трем гармоникам(рисунок 7B),находятся в пределах стандартного отклонения каждого экспериментального выхода. Напротив, ультрагармонические суммы на рисунке 7C показывают, что нормальный PBS имеет почти на порядок более высокий уровень и значительно более высокую изменчивость между выборками. Эти примеры показывают, что общая клеточная среда может демонстрировать поведение, которое может быть (неправильно) отнесено к присутствию МБ. Поскольку обычно нецелесообразно дегазировать культурную среду из-за негативного воздействия на клетки и/или стабильность кавитационного агента, крайне важно выполнить соответствующие контрольные действия в любом исследовании, связанном с кавитацией.

Figure 1
Рисунок 1: Иллюстрации двух конструкций систем воздействия США, включающих кавитационный мониторинг: SAT3 (D-F). (A) Аннотированная сборка SAT2 с боковой стенкой, удаленной для ясности. (B) SAT2 с неповрежденной боковой стенкой. (C)Отсек для воздействия ячеек SAT2, в разобранном виде. (D) Аннотированная сборка SAT3. (E)SAT3 в нормальной (слева) и линзированной (справа) конфигурациях для согласования ширины луча на разных частотах. (F)Отсек для воздействия ячеек SAT3, в разобранном виде. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Расчеты контуров поля полуамплитудного давления для несфокусированных (слева) и сферически сфокусированных (справа) преобразователей диаметром 12,7 мм. Частоты 2, 4 и 8 МГц показаны в виде красных, синих и зеленых контуров соответственно для элемента PCD в начале координат (0,0). Самые внешние контуры несфокусированного устройства относительно нечувствительны к частоте, но внутренняя структура зависит от частоты. Сферически сфокусированное поле сжимается по мере увеличения частоты, но внутри контуров поля плавно меняются. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Приборы для обработки и записи кавитационного сигнала (синие стрелки), возбуждения источника США (красные линии) и запуска сбора данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Время (слева) и частота (справа) ПХД-откликов, записанных с помощью МБ, разбавленных в 5 раз в PBS. Падающее пиковое отрицательное давление составляло (A, B) 0,2 МПа, (C, D) 0,4 МПа, (E, F) 0,7 МПа, все на частоте 0,5 МГц. Запись сигнала начинается за 1,4 мс до начала t=0 ультразвукового импульса длительностью 2,0 мс. (А, С, Е) Сигналы временной области (красный) отображаются на фиксированной вертикальной шкале, указывающей, как изменяется уровень отклика при давлении инцидента. Следы вставки показывают сигнал в записанном виде (красный) и с фильтром высоких частот 2 МГц (синий) для временного окна, центрированного во время полета от источника к отсеку воздействия ячейки к PCD. (Б, Д, Ф) Спектральные плотности шума и мощности сигнала рассчитаны для t<0 и t>0 соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: История спектра в течение 50 секунд воздействия суспензии МБ, разбавленной в 5 раз в PBS. (A)Полные спектры и(B)суммарные, гармонические и широкополосные мощности сигнала, все в функции времени. Условия привода: 0,5 МГц, пиковое отрицательное давление 0,7 МПа, длительность импульса 2,0 мс, период повторения импульса 200 мс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Эффект геометрии фокусировки ПХД, зарегистрированной при разбавлении микропузырьков 20:1 в нормальной PBS. Условия привода: 1,0 МГц, пиковое отрицательное давление 0,50 МПа, длительность импульса 3,0 мс, период повторения импульса 10 мс. (A) Полные спектры, усредненные за время экспозиции, и три независимых повтора образца. (B) Мощность в гармониках 3, 4 и 5 МГц и (C) мощность в ультрагармониках 2,5, 3,5 и 4,5 МГц. Толстые линии являются образцом, затененные области указывают +/- 1 стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7: Влияние дегазированных носителей, записанных с помощью PBS. (A) Полные спектры, усредненные за время экспозиции, и пять независимых повторов выборки. (B) Мощность в гармониках 3, 4 и 5 МГц и (C) мощность в ультрагармониках 2,5, 3,5 и 4,5 МГц. Толстые линии являются образцом, затененные области указывают +/- 1 стандартное отклонение. Условия привода: 1,0 МГц, пиковое отрицательное давление 0,50 МПа, длительность импульса 1,0 мс, период повторения импульса 200 мс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

параметр единица минимум максимум
частота МГц 0.02 15
давление (пиковое отрицательное) Мпа 0.1 20
длина импульса Циклов 1 Хо
рабочий цикл % 1 Хо
время экспозиции секунда 10 1000

Таблица 1: Сводка диапазона сообщаемых параметров, способствующих сонопорации in vitro.

Discussion

Критические шаги для любого акустического измерения были инкапсулированы Апфелем в 1981году 76 как «знай ти жидкость, знай свое звуковое поле, знай, когда что-то происходит». В контексте этого протокола они охватывают калибровку и выравнивание датчиков, а также этапы подготовки воды и обработки пузырьков. Во-первых, важно, чтобы гидрофон, используемый для калибровки датчика привода и/или ПХД, сам по себе был точно откалиброван посредством регулярного внешнего обслуживания или внутреннего сравнения с эталонным стандартом. Аналогичным образом, реакция как датчика привода, так и ПХД должна регулярно характеризоваться для проверки любых изменений в выходе и/или потери чувствительности. Если условия вождения и чувствительность системы к приему неизвестны, то будет невозможно вывести какую-либо значимую связь между условиями воздействия, биоэффектами и акустическими излучениями. Непосредственно в связи с этим необходимо тщательно проверить выравнивание преобразователей друг с другом и камерой для отбора проб, чтобы убедиться, что условия воздействия в камере соответствуют ожидаемым, а объем отбора проб для ПХД соответствует интересуемой области. Как указано, температура и содержание газа в суспендивной среде могут существенно влиять на конечные результаты, и консистенция чрезвычайно важна в этом отношении77,78. Аналогичным образом, подготовка, характеристика и обработка суспензии кавитационного агента требуют очень пристального внимания для обеспечения ожидаемого распределения по размеру и концентрации частиц в образце. Например, если концентрация пузырьков слишком высока, произойдет эффективное экранирование объема образца от падающего поля США. Агенты MB особенно подвержены разрушению и слиянию, и дальнейшие рекомендации по их обращению можно найти в Mulvana et. ал. (2012)79.

Очень распространенной проблемой с обнаружением кавитационных сигналов является достижение адекватного SNR. Это частично связано с природой самого сигнала, как описано, но также может быть связано с источниками электрического шума в экспериментальной установке. Проверка соединений между компонентами системы, в частности с участием коаксиальных кабелей, может помочь устранить некоторые из них. Может потребоваться замена или ремонт коаксиальных кабелей. Идентификация, удаление или деактивация другого оборудования в лаборатории, такого как насосы, которые могут вызвать электрический шум, также может помочь. Плохое согласование электрического импеданса между компонентами системы может быть еще одной причиной плохого соотношения сигнал/шум, а также потенциального повреждения оборудования и должно быть тщательно проверено. Параметры запуска генератора сигналов и осциллографа также должны быть проверены, чтобы убедиться, что они настроены соответствующим образом для эксперимента и не вернулись к настройкам по умолчанию производителя. Если происходит значительное разрушение пузырьков во время обработки, в случае SAT2 может быть полезно прикрепить второй шприц к выходному отверстию и использовать его для осторожного извлечения жидкости из камеры, тем самым втягивая суспензию. Это также может помочь в устранении макропузырьков или обеспечении потока во время воздействия США, если это возможно.

Невозможно полностью устранить акустические отражения в камере образца, и, следовательно, поле падающего не будет полностью однородным по всему объему образца. Как упоминалось на этапах 1.3.2 и 1.3.3, пропускаемость акустических окон будет зависеть от частоты, и поэтому следует тщательно рассмотреть желаемую полосу пропускания для измерений акустической эмиссии. В частности, могут наблюдаться значительные множественные отражения высокочастотных компонентов. Это еще одна причина, по которой калибровка поля в полностью собранной системе так важна для минимизации неопределенности в давлении инцидента. Следует также рассмотреть вопрос о надлежащем обустраивание регистрируемых сигналов для сведения к минимуму последствий множественных отражений. Использование коммерческих устройств для удобства и потребность в акустической прозрачности означает, что некоторая оптическая прозрачность должна быть принесено в жертву. Это может повлиять на качество последующей визуализации, например, для оценки жизнеспособности клеток или поглощения лекарственного средства. Некоторые из мембран, используемых в коммерческих устройствах, также являются пористыми и, таким образом, происходит несовершенная изоляция между камерой для образцов и окружающей водяной баней. Как указано выше, соответствующий риск загрязнения может быть уменьшен с помощью меньшей подкамеры, содержимое которой может регулярно заменяться. Устройства для клеточных культур, указанные в Таблице материалов, подходят в первую очередь для клеточных монослоев, которые могут не быть репрезентативными для тканей с точки зрения всех биоэффектов, опосредованных УЗИ/кавитацией. Близость клеток к твердой поверхности также будет влиять на динамику МБ таким образом, что может не отражать условия in vivo, например, способствуя микропотоку и микроджеттингу, как описано во введении. Однако эти ограничения могут быть устранены путем простой замены альтернативных моделей тканей.

Цель предложения САТ состоит в том, чтобы обеспечить средства повышения воспроизводимости условий акустического воздействия и акустической эмиссии между исследованиями биоэффектов, опосредованных США, что, как мы надеемся, будет способствовать лучшему пониманию основных механизмов и разработке методов мониторинга лечения для повышения безопасности и эффективности. Системы спроектированы таким образом, чтобы быть совместимыми с коммерчески доступными устройствами для культивирования клеток, что позволяет выполнять широкий спектр биологических анализов в соответствии с интересующим применением и позволяет проводить эксперименты с высокой пропускной способностью, устраняя необходимость в трудоемких процедурах выравнивания между прогонами. Стандартизация протоколов для характеристики условий воздействия и улавливания акустических излучений, зависящая от системы изменчивость, как мы надеемся, может быть уменьшена. Диапазон параметров, которые должны быть изучены для конкретного эксперимента, будет зависеть от применения (желаемый биоэффект, тип клетки, глубина ткани-мишени, если in vivo и т. Д.) И характер любого используемого кавитационного агента. Учитывая большое количество переменных (частота США, амплитуда давления, длина импульса, частота повторения импульсов и т.д.), полное изучение всего пространства параметров вряд ли осуществимо. Преимущество предлагаемого протокола заключается в том, что он позволяет быстро установить некоторые границы в этом пространстве параметров. Например, он позволяет определить минимальное давление, при котором генерируется кавитационный сигнал, максимальное давление или длину импульса, которые могут быть использованы до того, как произойдет отслоение/гибель клеток, и давление, при котором производятся дробные гармоники или широкополосный шум. Рекомендуется, чтобы такой набор обзорных измерений проводился в качестве первого шага в любом исследовании.

Как представлено, SATs предназначены для мониторинга акустического излучения в режиме реального времени, при этом биологические анализы выполняются вне эксперимента. Однако было бы относительно просто модифицировать SAT, чтобы обеспечить прямое оптическое наблюдение за камерой образца с помощью объектива микроскопа. Это, в свою очередь, может быть связано с флуоресцентной и/или высокоскоростной системой микроскопии, чтобы, например, можно было наблюдать поглощение лекарств и динамику пузырьков. Выход PCD в том виде, в какой он представлен в настоящее время с точки зрения напряжения, указывает: i) типы кавитационного поведения и их относительные пропорции; ii) как долго сохраняются эти кавитационные поведения; iii) коррелируют ли наблюдаемые кумулятивные по времени характеристики воздействия с конкретным биоэффектом; и iv) согласуются ли относительные уровни и зависящие от времени поведения с предыдущими экспериментами в системе воздействия. Хотя чувствительность приема ПХД может быть количественно определена, для того чтобы достоверно охарактеризовать акустическое излучение с точки зрения абсолютной энергии, требуется дополнительная пространственная информация. Это может быть достигнуто путем замены PCD на массив зонда для реализации пассивного акустического картирования (PAM)80. Это, однако, увеличит сложность обработки сигналов и требуемое вычислительное время и мощность.

Другие приборы для измерения электрического сопротивления мембраны или применения физических методов нацеливания, например магнитных полей, также могут быть включены. Также можно было бы использовать трехмерные тканевые структуры, такие как опухолевые сфероиды, органоиды или даже образцы тканей ex vivo на акустически «мягких» гелевых субстратах вместо клеточных монослоев для изучения УС и кавитационных опосредованных эффектов в более реалистичных тканевых средах.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы благодарят Исследовательский совет по инженерным и физическим наукам за поддержку этой работы через грант EP/L024012/1. VB также поддерживается Исследовательским советом по инженерным и физическим наукам (EPSRC) и Советом по медицинским исследованиям (MRC) (грант EP / L016052/1). VB и AV благодарят Фонд Кларендона за стипендии для аспирантов. AV также благодарит Эксетерский колледж за стипендию Сантандера. Авторы в долгу перед Джеймсом Фиском и Дэвидом Солсбери за их неоценимую помощь в изготовлении аппарата. Они также с благодарностью признают вклад докторов Дарио Каруго и Джошуа Оуэна в разработку более ранних прототипов SATs.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absorber Precision Acoustics APTFlex F28 panel 1.0 cm standard thickness
Amplifier (power) E&I Ltd. 1040L 400W power amplifier to drive ultrasound source
Amplifier (pre) Stanford Research Systems SR445A Fixed gain multi-stage preamplifier for PCD signals
Aquarium heater Aquael Ultra 50W Different models for different tank sizes.
Digitizer TiePie Engineering HS5-110-XM Extended memory option: 32M points per channel
Hydrophone Precision Acoustics FOH 0.01 mm diameter sensitive area minimises directivity effects
Microbubbles Bracco SonoVue FDA approved microbubbles
PCD mirror (SAT3) Olympus NDT F-102 90 degree beam reflection
PCD transducer Olympus NDT V320-SU Immersion transducer, 7.5MHz
PCD waterproof cable Olympus NDT BCU-58-1 W
PDMS (SAT2 compartment lid) Corning Sylgard 184 See Carugo et al. (2015) for preparation guidelines
Polymer rod (SAT2 seal) Zeus PTFE monofilament
Rubber plug (SAT3 lid/seal) VWR 391-2101 6mm bottom dia., 8mm top dia., red
Signal generator Agilent 33250 Waveform generator for ultrasound source
Substrate for cell exposure compartment, SAT2 Ibidi µ-Dish 35mm
Substrate for cell exposure compartment, SAT3 Corning Transwell 6.5mm
Ultrasound source (SAT3) Sonic Concepts H107 with central hole Use of a HIFU-capable source allows pressures >1MPa to be generated both at the focus and pre-focally for expanded spatial coverage

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Maier, A., Steidl, S., Christlein, V., Hornegger, J. Medical Imaging Systems - An Introductory Guide. Lecture Notes in Computer Science. , Springer. (2018).
  2. Tachibana, K., Tachibana, S. Albumin microbubble echo-contrast material as an enhancer for ultrasound accelerated thrombolysis. Circulation. 92, 1148-1150 (1995).
  3. Bao, S., Thrall, B. D., Miller, D. L. Transfection of a reporter plasmid into cultured cells by sonoporation in vitro. Ultrasound in Medicine and Biology. 23 (6), 953-959 (1997).
  4. Price, R. J., Skyba, D. M., Kaul, S., Skalak, T. C. Delivery of colloidal particles and red blood cells to tissue through microvessel ruptures created by targeted microbubble destruction with ultrasound. Circulation. 98 (13), 1264-1267 (1998).
  5. Theek, B., et al. Sonoporation enhances liposome accumulation and penetration in tumors with low EPR. Journal of Controlled Release. 231, 77-85 (2016).
  6. Dimcevski, G., et al. A human clinical trial using ultrasound and microbubbles to enhance gemcitabine treatment of inoperable pancreatic cancer. Journal of Controlled Release. 243, 172-181 (2016).
  7. Snipstad, S., et al. Ultrasound Improves the Delivery and Therapeutic Effect of Nanoparticle-Stabilized Microbubbles in Breast Cancer Xenografts. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (11), 2651-2669 (2017).
  8. Unga, J., Hashida, M. Ultrasound induced cancer immunotherapy. Advanced Drug Delivery Reviews. 72, 144-153 (2014).
  9. Yang, C., Du, M., Yan, F., Chen, Z. Focused ultrasound improves NK-92MI cells infiltration into tumors. Frontiers in Pharmacology. 10, 326 (2019).
  10. McDannold, N., Arvanitis, C. D., Vykhodtseva, N., Livingstone, M. S. Temporary disruption of the blood-brain barrier by use of ultrasound and microbubbles: Safety and efficacy evaluation in rhesus macaques. Cancer Research. 72 (14), 3652-3663 (2012).
  11. O'Reilly, M. A., Hynynen, K. Ultrasound and microbubble-mediated blood-brain barrier disruption for targeted delivery of therapeutics to the brain. Methods in Molecular Biology. 1831, 111-119 (2018).
  12. Mainprize, T., et al. Blood-Brain Barrier Opening in Primary Brain Tumors with Non-invasive MR-Guided Focused Ultrasound: A Clinical Safety and Feasibility Study. Scientific Reports. 9, 321 (2019).
  13. Ebben, H. P., Nederhoed, J. H., Lely, R. J., Wisselink, W., Yeung, K. Microbubbles and UltraSound-accelerated Thrombolysis (MUST) for peripheral arterial occlusions: Protocol for a phase II single-arm trial. BMJ Open. 7, 014365 (2017).
  14. de Saint Victor, M., Barnsley, L. C., Carugo, D., Owen, J., Coussios, C. C., Stride, E. Sonothrombolysis with Magnetically Targeted Microbubbles. Ultrasound in Medicine & Biology. 45 (5), 1151-1163 (2019).
  15. Dixon, A. J., Li, J., Rickel, J. M. R., Klibanov, A. L., Zuo, Z., Hossack, J. A. Efficacy of Sonothrombolysis Using Microbubbles Produced by a Catheter-Based Microfluidic Device in a Rat Model of Ischemic Stroke. Annals of Biomedical Engineering. , (2019).
  16. Horsley, H., et al. Ultrasound-activated microbubbles as a novel intracellular drug delivery system for urinary tract infection. Journal of Controlled Release. 301, 166-175 (2019).
  17. Lattwein, K. R., et al. Sonobactericide: An Emerging Treatment Strategy for Bacterial Infections. Ultrasound in Medicine and Biology. 46 (2), 193-215 (2020).
  18. Crum, L. A., Fowlkes, J. B. Acoustic cavitation generated by microsecond pulses of ultrasound. Nature. 319, 52-54 (1986).
  19. Holland, C. K., Apfel, R. E. Thresholds for transient cavitation produced by pulsed ultrasound in a controlled nuclei environment. Journal of the Acoustical Society of America. 88, 2059-2069 (1990).
  20. Rifai, B., Arvanitis, C. D., Bazan-Peregrino, M., Coussios, C. C. Cavitation-enhanced delivery of macromolecules into an obstructed vessel. The Journal of the Acoustical Society of America. 128, (2010).
  21. Wu, J., Ross, J. P., Chiu, J. F. Reparable sonoporation generated by microstreaming. The Journal of the Acoustical Society of America. 111 (3), 1460-1464 (2002).
  22. Doinikov, A. A., Bouakaz, A. Acoustic microstreaming around a gas bubble. The Journal of the Acoustical Society of America. 127 (2), 703-709 (2010).
  23. De Cock, I., et al. Ultrasound and microbubble mediated drug delivery: acoustic pressure as determinant for uptake via membrane pores or endocytosis. Journal of Controlled Release Official Journal of the Controlled Release Society. 197, 20-28 (2015).
  24. Pereno, V., Lei, J., Carugo, D., Stride, E. Microstreaming inside Model Cells Induced by Ultrasound and Microbubbles. Langmuir. 36, 6388-6398 (2020).
  25. Chen, H., Brayman, A. A., Kreider, W., Bailey, M. R., Matula, T. J. Observations of translation and jetting of ultrasound-activated microbubbles in mesenteric microvessels. Ultrasound in Medicine and Biology. 37 (12), 2139-2148 (2011).
  26. Lentacker, I., De Smedt, S. C., Sanders, N. N. Drug loaded microbubble design for ultrasound triggered delivery. Soft Matter. 5, 2161-2170 (2009).
  27. Song, J. H., Moldovan, A., Prentice, P. Non-linear Acoustic Emissions from Therapeutically Driven Contrast Agent Microbubbles. Ultrasound in Medicine and Biology. 45 (8), 2188-2204 (2019).
  28. Ohl, C., Arora, M., Ikink, R., De Jong, N., Versluis, M., Delius, M. Sonoporation from Jetting Cavitation Bubbles. Biophysical Journal. 91 (11), 4285-4295 (2006).
  29. Li, Z. G., Liu, aQ., Klaseboer, E., Zhang, J. B., Ohl, C. D. Single cell membrane poration by bubble-induced microjets in a microfluidic chip. Lab on a Chip. 13 (6), 1144-1150 (2013).
  30. Wang, Q. X., Manmi, K. Three dimensional microbubble dynamics near a wall subject to high intensity ultrasound. Physics of Fluids. 26, 032104 (2014).
  31. Suslick, K. S. Ultrasound: Its Chemical, Physical, and Biological Effects. Radiology. , VHC Publishers. New York. (1988).
  32. Mitragotri, S. Healing sound: the use of ultrasound in drug delivery and other therapeutic applications. Nature reviews. Drug discovery. 4 (3), 255-260 (2005).
  33. Mitragotri, S. Sonophoresis: Ultrasound-mediated transdermal drug delivery. Percutaneous Penetration Enhancers Physical Methods in Penetration Enhancement. , 3-14 (2017).
  34. Park, J., Lee,, et al. Enhanced Transdermal Drug Delivery by Sonophoresis and Simultaneous Application of Sonophoresis and Iontophoresis. AAPS PharmSciTech. 20 (3), 96 (2019).
  35. Lentacker, I., De Cock, I., Deckers, R., De Smedt, S. C., Moonen, C. T. W. Understanding ultrasound induced sonoporation: Definitions and underlying mechanisms. Advanced Drug Delivery Reviews. 72, 49-64 (2014).
  36. Wawryka, P., Kiełbik, A., Iwanek, G. Microbubble based sonoporation - the basics into clinical implications. Medical Research Journal. 4 (3), 178-183 (2019).
  37. Hilgenfeldt, S., Lohse, D., Zomack, M. Sound scattering and localized heat deposition of pulse-driven microbubbles. The Journal of the Acoustical Society of America. 107 (6), 3530-3539 (2000).
  38. Holt, R. G., Roy, R. A. Measurements of bubble-enhanced heating from focused, MHz-frequency ultrasound in a tissue-mimicking material. Ultrasound Medical Biology. 27 (10), 1399-1412 (2001).
  39. Tan, J., Li, P., Xue, H., Li, Q. Cyanidin-3-glucoside prevents hydrogen peroxide (H 2 O 2 )-induced oxidative damage in HepG2 cells. Biotechnology Letters. 42 (11), 2453-2466 (2020).
  40. Costley, D., et al. Treating cancer with sonodynamic therapy: A review. International Journal of Hyperthermia. 31 (2), 107-117 (2015).
  41. You, D. G., et al. ROS-generating TiO2 nanoparticles for non-invasive sonodynamic therapy of cancer. Scientific Reports. 6, 23200 (2016).
  42. Canavese, G., et al. Nanoparticle-assisted ultrasound: A special focus on sonodynamic therapy against cancer. Chemical Engineering Journal. 340, 155-172 (2018).
  43. Beguin, E., et al. Direct Evidence of Multibubble Sonoluminescence Using Therapeutic Ultrasound and Microbubbles. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (22), 19913-19919 (2019).
  44. Stride, E., et al. Microbubble Agents: New Directions. Ultrasound in Medicine and Biology. 46 (6), 1326-1343 (2020).
  45. Rapoport, N., Gao, Z., Kennedy, A. Multifunctional nanoparticles for combining ultrasonic tumor imaging and targeted chemotherapy. Journal of the National Cancer Institute. 99 (14), 1095-1106 (2007).
  46. Cao, Y., et al. Drug release from phase-changeable nanodroplets triggered by low-intensity focused ultrasound. Theranostics. 8 (5), 1327-1339 (2018).
  47. Zhang, L., et al. Mitochondria-Targeted and Ultrasound-Activated Nanodroplets for Enhanced Deep-Penetration Sonodynamic Cancer Therapy. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (9), 9355-9366 (2019).
  48. Delogu, L. G., et al. Functionalized multiwalled carbon nanotubes as ultrasound contrast agents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (41), 16612-16617 (2012).
  49. Paris, J. L., et al. Ultrasound-mediated cavitation-enhanced extravasation of mesoporous silica nanoparticles for controlled-release drug delivery. Chemical Engineering Journal. 340, 2-8 (2018).
  50. Mannaris, C., et al. Gas-Stabilizing Gold Nanocones for Acoustically Mediated Drug Delivery. Advanced Healthcare Materials. 7 (12), 1800184 (2018).
  51. Kwan, J. J., et al. Ultrasound-induced inertial cavitation from gas-stabilizing nanoparticles. Physical Review E - Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 92 (2), (2015).
  52. Kwan, J. J., et al. Ultrasound-Propelled Nanocups for Drug Delivery. Small. 11 (39), 5305-5314 (2015).
  53. Mannaris, C., et al. Microbubbles, Nanodroplets and Gas-Stabilizing Solid Particles for Ultrasound-Mediated Extravasation of Unencapsulated Drugs: An Exposure Parameter Optimization Study. Ultrasound in Medicine and Biology. 45, 954-967 (2019).
  54. Roovers, S., et al. The Role of Ultrasound-Driven Microbubble Dynamics in Drug Delivery: From Microbubble Fundamentals to Clinical Translation. Langmuir. 35, 10173-10191 (2019).
  55. Lentacker, I., Geers, B., Demeester, J., De Smedt, S. C., Sanders, N. N. Design and Evaluation of Doxorubicin-containing Microbubbles for Ultrasound-triggered Doxorubicin Delivery: Cytotoxicity and Mechanisms Involved. Molecular Therapy. 18 (1), 101-108 (2010).
  56. De Cock, I., Lajoinie, G., Versluis, M., De Smedt, S. C., Lentacker, I. Sonoprinting and the importance of microbubble loading for the ultrasound mediated cellular delivery of nanoparticles. Biomaterials. 83, 294-307 (2016).
  57. Roovers, S., et al. Sonoprinting of nanoparticle-loaded microbubbles: Unraveling the multi-timescale mechanism. Biomaterials. 217, 119250 (2019).
  58. Carugo, D., et al. Modulation of the molecular arrangement in artificial and biological membranes by phospholipid-shelled microbubbles. Biomaterials. 113, 105-117 (2017).
  59. Stride, E. P., Coussios, C. C. Cavitation and contrast: The use of bubbles in ultrasound imaging and therapy. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine. 224 (2), 171-191 (2010).
  60. Stride, E., Coussios, C. Nucleation, mapping and control of cavitation for drug delivery. Nature Reviews Physics. 1, 495-509 (2019).
  61. Dong, Y., et al. Antibiofilm effect of ultrasound combined with microbubbles against Staphylococcus epidermidis biofilm. International Journal of Medical Microbiology. 307 (6), 321-328 (2017).
  62. Van Rooij, T., et al. Vibrational Responses of Bound and Nonbound Targeted Lipid-Coated Single Microbubbles. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (5), 785-797 (2017).
  63. Duan, X., Yu, A. C. H., Wan, J. M. F. Cellular Bioeffect Investigations on Low-Intensity Pulsed Ultrasound and Sonoporation: Platform Design and Flow Cytometry Protocol. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 66 (9), 1422-1434 (2019).
  64. Hu, Y., Wan, J. M. F., Yu, A. C. H. Membrane Perforation and Recovery Dynamics in Microbubble-Mediated Sonoporation. Ultrasound in Medicine and Biology. 39 (12), 2393-2405 (2013).
  65. Carugo, D., Owen, J., Crake, C., Lee, J. Y., Stride, E. Biologicallyand acoustically compatible chamber for studying ultrasound-mediated delivery of therapeutic compounds. Ultrasound in Medicine and Biology. 41 (7), 1927-1937 (2015).
  66. Pereno, V., et al. Layered acoustofluidic resonators for the simultaneous optical and acoustic characterisation of cavitation dynamics, microstreaming, and biological effects. Biomicrofluidics. 12 (3), 034109 (2018).
  67. Fan, Z., Liu, H., Mayer, M., Deng, C. X. C. X. Spatiotemporally controlled single cell sonoporation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (41), 16486-16491 (2012).
  68. Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Biophysical insight into mechanisms of sonoporation. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2016).
  69. Helfield, B. L., Chen, X., Qin, B., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Mechanistic Insight into Sonoporation with Ultrasound-Stimulated Polymer Microbubbles. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (11), 2678-2689 (2017).
  70. Aron, M., Vince, O., Gray, M., Mannaris, C., Stride, E. Investigating the Role of Lipid Transfer in Microbubble-Mediated Drug Delivery. Langmuir. 35 (40), 13205-13215 (2019).
  71. Kinsler, L. E., Frey, A. R., Coppens, A. B., Sanders, J. V. Fundamentals of Acoustics, 4th Edition. , Wiley. ISBN: 0-471-84789-5 (2000).
  72. Wear, K. A. Considerations for Choosing Sensitive Element Size for Needle and Fiber-Optic Hydrophones-Part I: Spatiotemporal Transfer Function and Graphical Guide. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 66 (2), 318-339 (2019).
  73. Stoica, P., Moses, R. Spectral Analysis of Signals. , Prentice Hall. Upper Saddle River, NJ. (2005).
  74. Lyka, E., Coviello, C., Kozick, R., Coussios, C. C. Sum-of-harmonics method for improved narrowband and broadband signal quantification during passive monitoring of ultrasound therapies. Journal of the Acoustical Society of America. 140 (1), 741-754 (2016).
  75. Barrack, T., Stride, E. Microbubble Destruction During Intravenous Administration: A Preliminary Study. Ultrasound in Medicine and Biology. 35 (3), 515-522 (2009).
  76. Apfel, R. E. Acoustic cavitation. Methods in Experimental Physics. 19, 355-411 (1981).
  77. Mulvana, H., Stride, E., Tang, M. X., Hajnal, J. V., Eckersley, R. J. The Influence of Gas Saturation on Microbubble Stability. Ultrasound in Medicine and Biology. 38 (6), 1097-1100 (2012).
  78. Mulvana, H., Stride, E., Hajnal, J. V., Eckersley, R. J. Temperature dependent behavior of ultrasound contrast agents. Ultrasound in Medicine and Biology. 36 (6), 925-934 (2010).
  79. Mulvana, H., Eckersley, R. J., Tang, M. X., Pankhurst, Q., Stride, E. Theoretical and Experimental Characterisation of Magnetic Microbubbles. Ultrasound in Medicine and Biology. 38 (5), 864-875 (2012).
  80. Coviello, C., et al. Passive acoustic mapping utilizing optimal beamforming in ultrasound therapy monitoring. Journal of the Acoustical Society of America. 137 (5), 2573-2585 (2015).

Tags

Втягивание Выпуск 170 Ультразвук Микропузырьки Доставка лекарств Биоэффекты Кавитация Сонопорация Мониторинг терапии Пассивное акустическое картирование
Изучение кавитационной усиленной терапии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gray, M., Vasilyeva, A. V., Brans,… More

Gray, M., Vasilyeva, A. V., Brans, V., Stride, E. Studying Cavitation Enhanced Therapy. J. Vis. Exp. (170), e61989, doi:10.3791/61989 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter