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Biochemistry

Complementación de la actividad de empalme por un complejo de galectina-3 - U1 snRNP en perlas

Published: December 9, 2020 doi: 10.3791/61990
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Michigan State University, 2Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan State University

Summary

Este artículo describe los procedimientos experimentales para (a) el agotamiento de U1 snRNP de extractos nucleares, con pérdida concomitante de la actividad de empalme; y (b) reconstitución de la actividad de empalme en el extracto agotado de U1 por partículas de galectina-3 - U1 snRNP unidas a perlas covalentemente acopladas con anticuerpos anti-galectina-3.

Abstract

Los experimentos clásicos de agotamiento-reconstitución indican que la galectina-3 es un factor de empalme requerido en los extractos nucleares. El mecanismo de incorporación de galectina-3 en la vía de empalme se aborda en este trabajo. La sedimentación de extractos nucleares de células HeLa en gradientes de glicerol del 12% al 32% produce fracciones enriquecidas en una partícula endógena ~ 10S que contiene galectina-3 y U1 snRNP. Ahora describimos un protocolo para agotar los extractos nucleares de U1 snRNP con pérdida concomitante de la actividad de empalme. La actividad de empalme en el extracto agotado de U1 puede ser reconstituida por la partícula snRNP de galectina-3 - U1 atrapada en las perlas de agarosa acoplada covalentemente con anticuerpos anti-galectina-3. Los resultados indican que el complejo ternario galectina-3 - U1 snRNP - pre-ARNm es un complejo E funcional que conduce a intermediarios y productos de la reacción de empalme y que la galectina-3 entra en la vía de empalme a través de su asociación con U1 snRNP. El esquema de uso de complejos de afinidad o inmunoseleccionados en perlas para reconstituir la actividad de empalme en extractos agotados de un factor de empalme específico puede ser generalmente aplicable a otros sistemas.

Introduction

La producción de la mayoría de los ARN mensajeros eucariotas (ARNm) implica la eliminación de intrones y la ligadura de exones en un proceso nuclear denominado empalme pre-ARNm1. Dos clases de complejos ARN-proteína (RNPs) dirigen el procesamiento del ARN pre-mensajero en ARNm maduro a través de complejos espliceosómicos. Una clase, los RNPs pre-mensajeros nacientes, se forma co-transcripcionalmente por la unión de proteínas RNP nucleares heterogéneas y otras proteínas de unión a ARN, incluyendo algunos miembros de la familia SR, produciendo complejos hnRNP2. Los RNPs nucleares pequeños ricos en uracilo de segunda clase (U snRNPs con SnRNAs U1, U2, U4, U5 y U6) se asocian con proteínas específicas de U y del núcleo3,4. Los snRNPs U interactúan de manera ordenada con regiones específicas de RNPs pre-mensajeros en una vía de remodelación dinámica a medida que los intrones se extirpan y los exones se ligan para producir mRNPs maduros5. Muchas proteínas nucleares adicionales participan en estos eventos de procesamiento6.

La galectina-1 (Gal1) y la galectina-3 (Gal3) son dos proteínas que son factores necesarios en la vía de empalme como lo demuestran los estudios de agotamiento-reconstitución7,8. La eliminación de ambas galectinas del empalme de extractos nucleares competentes (NE) suprime el ensamblaje del espliceosoma y la actividad de empalme en un paso temprano. La adición de cualquiera de las dos galectinas a un NE tan doblemente agotado restaura ambas actividades. Gal1 y Gal3 son componentes de los empaliceosomas activos, como lo demuestra la inmunoprecipitación específica de pre-ARNm, intermedios de empalme y ARNm maduro por antisuero específico para Gal1 o Gal39. Es importante destacar que Gal3 se asocia con partículas endógenas U snRNA que contienen partículas en el NE fuera de la vía de empalme, como lo demuestra la precipitación de snRNPs por anti-Gal3 antisera10. Finalmente, el silenciamiento de Gal3 en células HeLa altera los patrones de empalme de numerosos genes11.

En NE preincubado para desmontar spliceosomas preformados12, los snRNPs se encuentran en múltiples complejos sedimentando en gradientes de glicerol desde 7S hasta mayores de 60S. Aunque el fraccionamiento del gradiente de glicerol es una técnica común para el aislamiento de complejos y componentes espliceosómicos (ver referencias13,14,15 por ejemplo), hemos ampliado este método caracterizando fracciones específicas mediante inmunoprecipitaciones de anticuerpos. Un sedimento snRNP a 10S contiene solo SnRNA U1 junto con Gal3. La inmunoprecipitación de la fracción 10S con antisueros específicos para Gal3 o U1 snRNP co-precipita tanto U1 como Gal3 indicando que algunas de las monopartículas U1 snRNP están unidas a Gal310. Como U1 snRNP es el primer complejo que se une a pre-mRNP en el ensamblaje espliceosómico1,5, este paso representa un sitio de entrada potencial para Gal3 en la vía de empalme. Sobre esta base, demostramos que las monopartículas 10S Gal3-U1 snRNP unidas a perlas que contienen anti-Gal3 restauraron la actividad de empalme a un NE agotado U1 snRNP, estableciendo este complejo como un mecanismo por el cual Gal3 es reclutado en la vía espliceosomal16. Esto contrasta con los intentos de aislar los espliceosomas en etapas específicas de la reacción de empalme y catalogar los factores asociados17,18. En tales estudios, se determina la presencia de ciertos factores en algún momento, pero no el mecanismo por el cual se cargaron.

Anteriormente habíamos descrito en detalle la preparación de NE, el sustrato de empalme, el ensamblaje de la mezcla de reacción de empalme y el análisis de productos en nuestra documentación del papel de las galectinas en el empalme pre-ARNm19. Ahora describimos los procedimientos experimentales para el fraccionamiento de extractos nucleares para obtener una fracción enriquecida en el complejo Gal3 - U1 snRNP y para la inmunoselección de este último complejo para reconstituir la actividad de empalme en un extracto nuclear agotado de U1.

Figure 1
Figura 1: Diagrama esquemático que ilustra la complementación de la actividad de empalme en extracto nuclear agotado de U1 snRNP por un complejo Gal3-U1 snRNP en perlas. (A) NE en Buffer C (NE(C)) se incuba con perlas de proteína A-sefalrosa covalentemente acopladas con snRNP anti-U1 (perlas αU1). La fracción no unida se agota de U1 snRNP (U1ΔNE). (B) NE en el tampón D (NE(D)) se fracciona sobre un gradiente de glicerol de 12%-32% por ultracentrifugación. Las fracciones correspondientes a la región 10S (fracciones 3-5) se combinan y mezclan con perlas covalentemente acopladas con anticuerpos anti-Gal3 (perlas αGal3). El material unido a las perlas contiene una monopartícula Gal3-U1 snRNP. (C) El complejo snRNP Gal3-U1 de la Parte (B) se mezcla con U1ΔNE de la Parte (A) en un ensayo de empalme utilizando sustrato de pre-ARNm MINX marcado con 32P y los intermedios y productos de la reacción de empalme se analizan mediante electroforesis en gel y autorradiografía. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Protocol

1. Notas sobre los procedimientos generales

  1. Asegúrese de que todos los productos químicos (componentes tampón, enzimas, etc.) se mantengan libres de ribonucleasa (RNasa). Secuestrar todas las botellas de reactivos compradas comercialmente del uso general en el laboratorio. Use guantes para todos los pasos del procedimiento experimental. Utilice solo cristalería y utensilios que hayan sido horneados (consulte el paso 1.2 a continuación) y soluciones que hayan sido tratadas previamente (consulte el paso 1.3 a continuación).
  2. Hornea toda la cristalería (vasos de precipitados, frascos, botellas, pipetas, etc.) durante un mínimo de 4 h a 177 °C. Envuelva otros utensilios (espátulas, barras de agitación, etc.) en papel de aluminio antes de hornear en las mismas condiciones.
  3. Preparar una solución al 0,1% (vol/vol) de dietilpirocarbonato (DEPC) en agua de doble destilación (ddH2O). Usando una barra de agitación magnética, revuelva esta solución durante la noche y luego en autoclave. Utilice este H2O tratado con DEPC para hacer todas las soluciones que contengan Tris; luego, esterilice el filtro con un filtro de vacío en la parte superior de la botella. Use ddH2O regular para preparar todas las demás soluciones (sin Tris); luego, tratar con DEPC (0,1%, vol/vol) y autoclave.
    NOTA: Los búferes utilizados en el siguiente conjunto de procedimientos experimentales se enumeran alfabéticamente en la Tabla 1.
Nombre del búfer Composición
Búfer de borato 0,2 M de borato de sodio, pH 9
Búfer C 20 mM HEPES, pH 7,9, 25% (vol/vol) glicerol, 0,42 M NaCl, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM fenilmetilsulfonil fluoruro (PMSF), 0,5 mM de ditiotreitol (TDT)
Búfer D 10 mM HEPES, pH 7,9, 20% (vol/vol) glicerol, 0,1 M KCl, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM PMSF, 0,5 mM TDT
60%D 60% Buffer D y 40% H2O
Etanolamina 0.2 M etanolamina, pH 8
Búfer de enlace HEPES 20 mM HEPES, pH 7.9
Tampón de lavado HEPES 20 mM HEPES, pH 7.9, 0.5 M NaCl
Búfer de carga de ARN 90% formamida, 20 mM EDTA, pH 8, 0.05% (p/v) azul de bromofenol
Búfer SDS-PAGE 25 mM Tris, 169 mM de glicina, 0,1% de dodecil sulfato de sodio (SDS), pH 8,8
Búfer de muestra SDS 62.5 mM Tris, pH 6.8, 2% SDS, 10% glicerol, 5% 2-mercaptoetanol, 0.1% (p/v) azul de bromofenol
Tampón TBE para geles de ARN 89 mM Tris, 89 mM de ácido bórico, 2,5 mM de EDTA, pH 8,3
Búfer TE 10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA
Búfer de transferencia 25 mM Tris, 1.92 M de glicina, 20% de metanol, pH 8.3
Búfer T-TBS Tris de 10 mM, 0,5 M de NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,5
Tampón de lavado TX 0.05% Triton X-100 (TX) en 60%D

Tabla 1: Nombre y composición de los búferes

2. Preparación del NE agotado de U1 snRNP (U1 ΔNE)

  1. Preparación de perlas anti-U1 para inmunoadsorción
    1. Pre-hinchar 50 mg de proteína A-sefalrosa CL-4B perlas en exceso de H2O tratado con DEPC para producir aproximadamente 200 μL de perlas hinchadas y luego lavar en el tampón de lavado HEPES.
    2. Para este lavado y todos los lavados posteriores, peletizar las perlas por centrifugación (1.000 x g en un rotor de cucharón oscilante a 4 °C durante 10-15 s) y retirar el lavado sin encuadernar con un micropipettor y desechar.
    3. Mezcle 150 μL de perlas lavadas con 150 μL de suero autoinmune humano específico para U1 snRNP (volumen de anticuerpos a volumen de perlas en una proporción de 1: 1).
    4. Ajustar, sobre la base del volumen total de (~300 μL desde el paso 2.1.3 anterior), la mezcla a 20 mM HEPES, pH 7.9, correspondiente a las condiciones del tampón de unión HEPES; incubar esta mezcla con balanceo continuo a temperatura ambiente durante 60 min.
    5. Lavar las perlas unidas con anticuerpos con 1 ml de tampón de borato (0,2 M de borato de sodio, pH 9) y resuspend en 1 ml del mismo tampón de borato.
    6. Para acoplar covalentemente el anticuerpo unido a las perlas de proteína A-sefalrosa, agregue dimetilpimelimida a una concentración final de 20 mM e incube a temperatura ambiente con balanceo durante 60 min.
    7. Lave las perlas con 1 ml de tampón de borato.
    8. Para bloquear cualquier reactivo reticulado no reaccionado, agregue 1 ml de etanolamina de 0,2 M (pH 8) e incube a temperatura ambiente con balanceo durante 60 min.
    9. Lave las perlas acopladas a anticuerpos, en lo sucesivo designadas como perlas anti-U1, dos veces con 0,5 ml de tampón de lavado TX (0,05% Tritón X-100 en 60% D).
  2. Agotamiento de U1 snRNP de NE (ver Figura 1A)
    NOTA: El procedimiento para preparar NE a partir de células HeLa fue desarrollado inicialmente por Dignam et al.20. Hemos descrito los materiales y métodos detallados para la preparación de NE para ensayos de empalme19 (véanse los pasos 2.1 y 3.1 de esa referencia). NE, tal como se preparó inicialmente, está en el búfer C y en lo sucesivo se designará como NE(C). NE(C) dializado y equilibrado con buffer D se designará como NE(D).
    1. Incubar 200 μL de NE(C) con 100 μL de perlas anti-U1 del paso 2.1.9 anterior.
    2. Añadir 5 μL de RNasin a la mezcla.
    3. Gire la cabeza del microtubo sobre la cola a 4 °C durante 1 h.
    4. Granular la mezcla por centrifugación (1.000 x g en un rotor de cucharón oscilante a 4 °C durante 10-15 s) y recoger el material no unido (U1ΔNE) utilizando una jeringa Hamilton.
    5. Dializar todo el volumen de U1ΔNE, junto con una alícuota separada de 50 μL del NE(C) original no agotado, en compartimentos separados de un microdializador, con agitación, durante 75 min contra 60% D utilizando una membrana de diálisis con un corte de peso molecular de 8 K.
    6. Inmediatamente después de la diálisis, divida estas preparaciones (U1ΔNE y NE en 60% D) en alícuotas de 20 μL; luego congele en un baño de hielo seco / etanol y guárdelo a -80 ° C.
  3. Análisis del contenido de ARN y proteína de U1ΔNE y material unido a perlas anti-U1
    1. Después de la extracción del material no unido (U1ΔNE) (paso 2.2.4), lave el material unido a las perlas anti-U1 agregando 0,5 ml de tampón de lavado TX. Peletizar la mezcla por centrifugación (1.000 x g en un rotor de cucharón oscilante a 4 °C durante 10-15 s) y retirar el sobrenadante con un micropipettor y desechar.
    2. Repita los pasos de lavado 2.3.1 dos veces.
    3. Retire el material unido a las perlas anti-U1 agregando 100 μL de tampón de muestra SDS 2x a 100 μL de las perlas e incubando durante 10 min a temperatura ambiente.
    4. Pellet la mezcla por centrifugación (1.000 x g en un rotor de cucharón oscilante a 4 °C durante 10-15 s); retire el sobrenadante con la jeringa Hamilton y congele en un baño de hielo seco / etanol. Conservar a -80 °C.
    5. Compare el NE no agotado, el NE agotado (U1ΔNE) y el material unido a las perlas (eliminado de las perlas por el tampón de muestra SDS como se describe en los pasos 2.3.3 y 2.3.4 anteriores). Siga los pasos 2.3.6-2.3.8 para el análisis de ARN o los pasos 2.3.9-2.3.10 para el análisis de proteínas.
    6. Para cada muestra, extraer el ARN con 200 μL de fenol-cloroformo (50:50, v/v); luego extraer de nuevo con 180 μL de cloroformo-isoamilo alcohol (25:1, v/v). Después de la extracción, agregue 300 μL de etanol frío a prueba de 200, invierta para mezclar y almacene el ARN precipitado durante la noche a -20 ° C.
    7. Centrifugar el ARN precipitado con etanol (12.000 x g durante 10 min a 4 °C). Lavar los pellets con 150 μL de etanol frío al 70%. Centrifugar de nuevo (12.000 x g) a 4 °C durante 15 min. Retire el sobrenadante con un micropipetador y seque los gránulos en una aspiradora de velocidad durante 10-15 minutos sin calor.
    8. Resuspender el pellet de ARN seco en 10 μL de tampón de carga de ARN, suavemente vórtice, calentar a 75-85 ° C durante 90 s, y luego incubar en hielo durante 2 min. Separe los snRNAs mediante electroforesis en gel (2 h a 16 mA) a través de geles de poliacrilamida al 13% - 8,3 M de urea y luego se tiñe con bromuro de etidio o se someta a northern blotting10,16.
    9. Cargue las muestras de proteínas, en tampón de muestra SDS desde el paso 2.3.5, en geles de poliacrilamida al 12.5% y electroforesa a 200 V durante aproximadamente 45-50 min en tampón SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio).
    10. Transfiera las proteínas separadas a la membrana de nitrocelulosa a 400 mA durante 2 h en tampón de transferencia. Después de la transferencia, bloquee la membrana incubando durante la noche en T-TBS que contiene 10% de leche seca sin grasa. A continuación, inmunoblote la membrana para revelar proteínas específicas8,21.

3. Inmunoprecipitación de fracciones 10S de gradientes de glicerol por anti-Gal3

  1. Preparación de perlas anti-Gal3 para inmunoadsorción
    NOTA: La derivación y caracterización de antisueros policlonales de conejo frente a Gal3 para conejo #2421 y para conejo #4910 han sido descritos anteriormente.
    1. Use suero preinmune de conejo # 49 como control.
    2. Para la preparación de perlas anti-Gal3 siga el procedimiento descrito anteriormente para la preparación de perlas anti-U1 (paso 2.1), con la excepción de que correspondiente al paso 2.1.3, la proporción de antisuero (por ejemplo, anti-Gal3, # 49) a cuentas es de 3: 1.
    3. Justo antes de usar, lave las perlas acopladas a anticuerpos, en lo sucesivo designadas como perlas anti-Gal3, dos veces con 0,5 ml de tampón de lavado TX. Retire el sobrenadante, primero con un micropipetador para sacar la mayor parte del líquido y luego con una jeringa Hamilton para sacar el líquido de las perlas; descartar.
  2. Inmunoprecipitación de fracciones de gradiente de glicerol por anti-Gal3 (ver Figura 1B)
    1. Fraccionar NE(D) sobre un gradiente de glicerol del 12%-32%10. Combine y mezcle las fracciones de gradiente de glicerol 3, 4 y 5 (numeradas desde la parte superior del gradiente), que están cerca de la región 10S del gradiente.
    2. Preparar dos muestras, cada una con alícuota de 150 μL de fracciones de gradiente combinadas 3-5 (paso 3.2.1), y colocar en 50 μL de perlas anti-Gal3.
    3. Paralelamente, preparar dos muestras cada una con 150 μL de fracción 1 (que contenga Gal3 no en complejo con U1 snRNP10; paso 3.2.1) y colocar en 50 μL de perlas anti-Gal3.
    4. Como control, coloque 150 μL de 60% D en otro microtubo de cuentas anti-Gal3 de 50 μL.
    5. Mezcle suavemente golpeando el tubo, luego gire la cabeza sobre la cola del microtubo a 4 ° C durante 1 h.
    6. Pellet la mezcla por centrifugación suave (1.000 x g en un rotor de cucharón oscilante a 4 °C durante 10-15 s).
    7. Retire el sobrenadante (material no unido) con una jeringa Hamilton. No lave las perlas y utilizar inmediatamente para la adición de las reacciones de empalme (sección 4.2).
  3. Análisis del contenido de ARN y proteína en el material no unido y unido a partir de la precipitación anti-Gal3 de fracciones de gradiente 10S
    1. Para el análisis de los componentes del material unido y no unido a partir de la precipitación anti-Gal3 de las fracciones de gradiente 10S, recoja el material no unido (sobrenadante después del paso 3.2.6), transfiéralo a un microtubo fresco y congele a -20 °C.
    2. Lave las perlas precipitadas del paso 3.2.6 (que contiene material unido a anti-Gal3) agregando 0.5 ml de tampón de lavado TX.
    3. Pellet la mezcla por centrifugación suave (1.000 x g en un rotor de cucharón oscilante a 4 °C durante 10-15 s); retire el sobrenadante con un micropipetador y deséchelo. Repita los pasos de lavado dos veces más.
    4. Agregue 50 μL de tampón de muestra 2X SDS a las perlas anti-Gal3 lavadas y granuladas.
    5. Mezclar las perlas suavemente e incubar durante 10 min a temperatura ambiente.
    6. Peletizar la mezcla por centrifugación suave (1.000 x g en un rotor de cucharón oscilante a 4 °C durante 10-15 s), recoger el sobrenadante mediante jeringa Hamilton y almacenar en un microtubo fresco a -20 °C.
    7. Comparar el material no unido (sección 3.3.1) y el material unido (paso 3.3.6) de la precipitación anti-Gal3 en términos de COMPONENTES de ARN y proteínas, utilizando los procedimientos descritos en los pasos 2.3.6. a 2.3.10, respectivamente.

4. Montaje de la reacción de empalme y análisis de los productos

  1. Preparación del sustrato de empalme
    NOTA: El sustrato pre-ARNm, designado MINX, contiene dos secuencias de exones y una secuencia de intrón de Adenovirus22. La secuencia de ADN MINX en el plásmido está bajo el control de los promotores de la ARN polimerasa T3, T7 o SP6. Los materiales y métodos detallados para la linealización del ADN plásmido MINX con endonucleasa de restricción BamHI, la transcripción por ARN polimerasa SP6 en presencia de α-32P[GTP] y la purificación de MINX marcado con 32P para ensayos de empalme se describen anteriormente19 (véanse los pasos 2.2 y 3.2 de dicha referencia).
    1. Almacenar el MINX radiomarcado como precipitado de etanol a -20 °C; use el sustrato de empalme etiquetado dentro de las 4-6 semanas posteriores a la transcripción.
    2. Justo antes de su uso, centrifugue el etanol precipitado con la etiqueta 32P MINX a 12.000 x g durante 10 min a 4 °C; retire el sobrenadante con un micropipetador y deseche.
    3. Añadir 150 μL de etanol al 70% y centrífuga a 12.000 x g durante 15 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y seque el pellet en speed vac sin calor durante 15 min.
    4. Rehidratar el pellet en 50 μL de agua DEPC. Punto 2 μL en cada uno de los dos filtros GF/C; sumergir los filtros en ácido tricloroacético (TCA) al 5% en frío durante 10 min. Enjuague con TCA al 5% en frío, seguido de etanol a prueba de 180 en un matraz al vacío. Seque al aire los filtros y se someta a un conteo de centelleo en 4 mL de Safety-Solve.
    5. Diluir MINX marcado con 32P en 60% D a 104 cpm/μL para el ensayo de empalme.
  2. Montaje de la reacción de empalme (ver Figura 1C)
    1. Montar, sobre hielo, las reacciones de empalme en un volumen total de 24 μL (8 μL U1ΔNE (a partir del paso 2.2.6), 3,5 mM MgCl2, 1,5 mM ATP, 20 mM de fosfato de creatina, 0,5 mM TDT, 20 unidades de RNasina, sustrato de empalme MINX marcado con 4 μL 32P (104 cpm/μL), 60% D) y añadir a cada tubo de perlas de la sección 3.2.7. Ensamble un conjunto idéntico de reacciones de empalme en un volumen total de 24 μL pero sin U1ΔNE y agréguelo a cada tubo de perlas a partir del paso 3.2.7.
    2. Preparar una reacción de empalme de control en un volumen total de 12 μL (4 μL NE(D), 3,5 mM MgCl2, 1,5 mM ATP, 20 mM de fosfato de creatina, 0,5 mM de TDT, 20 unidades de RNasin, sustrato de empalme MINX marcado con 2 μL 32P (104 cpm/μL), 60% D).
    3. Mezcle los tubos suavemente golpeando y gire el extremo sobre la cola a 30 ° C durante 90 minutos. Pellet la mezcla por centrifugación suave a 1.000 x g en un rotor de cucharón oscilante a 4 °C durante 10-15 s.
    4. Detenga la reacción y eluya las proteínas de las perlas agregando 24 μL de tampón de muestra SDS 2x a los tubos que contienen perlas, y 12 μL de tampón de muestra SDS 2x al tubo de control que contiene NE pero no perlas. Calentar los tubos a 100 °C durante 7 min.
    5. Centrifuga los tubos suavemente a 1.000 x g en un rotor de cucharón oscilante a 4 °C durante 10-15 s.
    6. Transfiera los sobrenadantes (eluciones) a microtubos frescos: aproximadamente 48 μL de los tubos de perlas y 24 μL del tubo de control NE.
    7. Añadir proteinasa K (20 mg/mL) para digerir y solubilizar las proteínas: añadir 5 μL a la elución de 48 μL de las perlas y añadir 2,5 μL al control ne de 24 μL.
    8. Incubar los tubos a 37°C durante 40 min.
    9. Centrifuga suavemente los tubos a 1.000 x g en un rotor de cucharón oscilante a 4 °C durante 10 s.
    10. Diluir las eluciones de perlas con 39,5 μL de TE y 10 μL de 3 M de acetato de sodio. Diluir el control NE con 63,5 μL TE y 10 μL 3 M de acetato de sodio.
    11. Extraer y analizar el ARN como se describe a continuación (sección 4.3).
  3. Análisis de productos de la reacción de empalme
    1. Extraer los ARN de cada muestra con fenol-cloroformo, seguido de cloroformo-isoamílico alcohol; precipitar los ARN con etanol, centrifugar, lavar los gránulos, retirar el sobrenadante y secar los gránulos siguiendo el mismo procedimiento descrito en los pasos 2.3.6 y 2.3.7.
    2. Resuspender el pellet de ARN seco en 10 μL de tampón de carga de ARN, suavemente vórtice, calentar a 75-85 ° C durante 90 s, y luego incubar en hielo durante 2 min.
    3. Preparar 20 ml de una solución que contenga poliacrilamida al 13% (bisacrilamida:acrilamida, 1,9:50 [wt/wt]) en 8,3 M de urea; geles de fundición de 15 cm de longitud utilizando esta solución.
    4. Una vez que el gel está fundido, electroforesarlo (sin ninguna muestra cargada) a 400 V durante 20 minutos utilizando TBE como amortiguador de funcionamiento. Después de este paso, lave los pozos con el búfer de ejecución TBE.
    5. Cargue las muestras de ARN, en tampón de carga de ARN, y electroforesa con TBE ejecutando tampón a 400 V durante 3,5 a 4 h. Después de la electroforesis, retire la urea sumergiendo y girando el gel en agua destilada durante 10 min.
    6. Seque al vacío el gel en papel de filtro de 3 M, primero durante 2 h 15 min a 80 °C y luego durante 30 min sin calor para enfriarlo lentamente. Someter el gel seco a autoradiografía sobre película para detectar las posiciones de migración de los componentes radiactivos.

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Representative Results

Los complejos NE agotados de U1 snRNP (U1ΔNE de la Sección 2.2.6) y Gal3 - U1 snRNP de la región 10S del gradiente de glicerol inmunoprecipitado por anti-Gal3 (paso 3.2.7) se mezclaron en una reacción de empalme. Esta mezcla de reacción contenía SnRNA U1 (Figura 2A, carril 3), así como la proteína específica U1, U1-70K (Figura 2B, carril 3). Como era de esperar, el anti-Gal3 precipitó Gal3 (Figura 2B, carril 3). Estos componentes (SNRNA U1, proteína U1-70K y Gal3) no se encontraron en la precipitación de control preinmune (PI) (Figura 2A, Figura 2B, carril 2). En comparación con un NE no agotado realizado como control positivo (Figura 2C, carril 1), U1ΔNE no exhibió actividad de empalme (Figura 2C, carril 2). La actividad de empalme en el U1ΔNE podría ser reconstituida por el complejo snRNP Gal3 - U1 unido a perlas (Figura 2C, carril 6). Se encontraron tanto productos de la reacción de empalme, exones ligados y lariat de intrón extirpado (resaltado por flechas a la derecha), como intermedios, exón 1 y exón de lariat 2. Los componentes de las fracciones 3-5 fueron críticos para restaurar el empalme a U1ΔNE. Cuando las fracciones 3-5 fueron reemplazadas por tampón solo (60% D) en la inmunoprecipitación, no se pudo observar actividad de empalme al mezclar con U1ΔNE (Figura 2C, carril 2), lo que indica que las perlas anti-Gal3 no fueron responsables de la restauración de la actividad de empalme en esta última. De manera más persuasiva, cuando las fracciones 3-5 fueron reemplazadas por la fracción 1 en el procedimiento de inmunoprecipitación y luego agregadas a U1ΔNE, no se encontraron intermedios o productos de la reacción de empalme (Figura 2C, carril 4). Análisis previos habían documentado que el Gal3 en la fracción 1 representaba la proteína Gal3 libre, no en asociación con ningún complejo RNP10 y el northern blotting del material inmunoprecipitado de la fracción 1 no reveló ningún snRNA U116. Finalmente, los inmunoprecipitados de la fracción 1 y las fracciones 3-5 no exhibieron actividad de empalme cuando se ensayaron en ausencia de U1ΔNE (Figura 2C, carriles 3 y 5, respectivamente).

Figure 2
Figura 2: Resultados representativos de las composiciones de ARN y polipéptidos del precipitado anti-Gal3 de la región 10S del gradiente de glicerol y su capacidad para reconstituir el empalme en extracto nuclear agotado de U1 snRNP (U1ΔNE). (A) Análisis de Northern blotting de SnRNA U1 unido a perlas acopladas con suero preinmune (PI; carril 2) o a perlas acopladas con anti-Gal3 (αGal3; carril 3). El carril 1 representa el 20% de la cantidad de fracciones combinadas de gradiente de glicerol sometidas a inmunoprecipitación. El carril 2 y el carril 3 representan cada uno el 25% del material encuadernado eluido de las respectivas perlas. (B) Análisis de Western blotting de polipéptidos unidos a perlas junto con suero preinmune (carril 2) o anti-Gal3 (carril 3). Las identidades de proteínas se indican a la derecha. El carril 1 representa el 20% de la cantidad de fracciones combinadas de gradiente de glicerol sometidas a inmunoprecipitación. El carril 2 y el carril 3 representan cada uno el 75% del material encuadernado eluido de las respectivas perlas. (C) Análisis de la capacidad de restaurar la actividad de empalme a U1ΔNE mediante inmunoprecipitados anti-Gal3 (αGal3) de gradiente de glicerol fracción 1 (Fr 1), fracciones 3-5 (Fr 3-5) o 60% Buffer D (60% D). El signo + o - sobre la línea sólida en negrita indica la presencia o ausencia de cada uno de estos precipitados en la mezcla de reacción de empalme. El signo + o - debajo de la línea sólida en negrita indica la presencia o ausencia de U1ΔNE (o NE en buffer D). Carril 1: 4 μL NE en un ensayo de empalme de 12 μL, el 100% de los cuales fueron sometidos a análisis de gel. Para los carriles 2-6, el volumen total del ensayo de empalme fue de 24 μL, el 50% de los cuales se sometieron a análisis de gel. Carril 2: 8 μL U1ΔNE más perlas de precipitación del 60% D. Carril 3: cuentas de precipitación de Fr 1. Carril 4: 8 μL U1ΔNE más perlas de precipitación de Fr 1. Carril 5: cuentas de precipitación de Fr 3-5. Carril 6: 8 μL U1ΔNE más perlas de precipitación de Fr 3-5. Las posiciones de migración del sustrato pre-ARNm, los intermedios y los productos (lariat intrón y exones ligados, resaltados por flechas) se indican a la derecha. Los datos del Panel C se derivan del mismo experimento que se muestra en el Panel A, Figura 2 de Haudek et al.16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los resultados mostrados en la Figura 2 se obtuvieron con anti-Gal3 (#49). Los mismos resultados se pudieron observar con otro anti-Gal3 (#24) pero el suero preinmune de conejo #49 no logró reconstituir el empalme en U1ΔNE después de la incubación con fracciones 3-516. Todos estos resultados sugieren fuertemente que el sustrato pre-ARNm puede unirse a la partícula 10S Gal3 - U1 snRNP inmovilizada en perlas y que el complejo ternario es funcional en la vía de empalme.

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Discussion

Este informe proporciona los detalles experimentales que documentan que un complejo snRNP Gal3 - U1 atrapado en perlas recubiertas anti-Gal3 puede unirse al sustrato pre-ARNm y este complejo ternario puede restaurar la actividad de empalme a un NE agotado de U1 snRNP. Gal3 es un miembro de una familia de proteínas originalmente aisladas sobre la base de su actividad de unión a carbohidratos específicos de galactosa23 . Los estudios tempranos de inmunofluorescencia y fraccionamiento subcelular proporcionaron el indicio inicial de una asociación de Gal3 con componentes de la maquinaria de empalme: colocalización en motas nucleares con polipéptidos del núcleo Sm de snRNPs y la familia de factores de especiado ricos en serina y arginina (SR)24,25 y sedimentación en gradientes de sulfato de cesio a una densidad (1.3-1.35 g/mL) que coincida con los de hnRNP y snRNP24 . Experimentos posteriores de agotamiento-reconstitución, a su vez, mostraron que Gal3 (así como otro miembro de la familia de la galectina, la galectina-1 (Gal1)) eran factores necesarios, pero redundantes, en los ensayos de empalme libre de células7,8.

Cuando el NE se fracciona sobre un gradiente de glicerol, la inmunoprecipitación de fracciones de gradiente con anti-Gal3 produjo distintos complejos con proporciones variables de diferentes snRNAs y proteínas asociadas, lo que sugiere que Gal3 se asocia con múltiples snRNPs en ausencia de sustrato de empalme pre-ARNm10. En particular, Gal3 y U1 snRNP se ensamblan en una monopartícula que sedimenta a la región ~10S del gradiente (fracciones 3-5 de un gradiente de glicerol del 12%-32%). Dado que la unión de U1 snRNP al sitio de empalme 5'del pre-ARNm representa el paso inicial en el ensamblaje del espliceosoma5,26, fue posible que Gal3 pueda entrar en la vía de empalme a través de su asociación con U1 snRNP. Esta noción está respaldada por la observación de que Gal3, como parte del complejo 10S Gal3-U1 snRNP, podría asociarse con un sustrato pre-ARNm pero no con ARN de control que carece de sitios de empalme, lo que sugiere que el reconocimiento del sitio de empalme 5'por U1 snRNP fue un requisito clave en su ensamblaje en un espliceosoma. Además, el pretratamiento de las fracciones que contenían la partícula Gal3-U1 snRNP con nucleasa microcócica abolió la carga de Gal3 sobre el pre-ARNm10. La pregunta clave, entonces, es si este complejo ternario temprano, formado por Gal3, U1 snRNP y pre-ARNm, representa un complejo E funcional comprometido con la vía de empalme o un complejo H sin salida que no puede entrar en la vía de empalme5,26. Abordamos esta pregunta probando si el snRNP Gal3 - U1 puede reconstituir la actividad de empalme en NE agotado de U1 snRNP con pérdida concomitante de la capacidad de empalme (U1ΔNE). Los resultados de nuestros experimentos, cuyo protocolo se detalla en el presente artículo, indican que Gal3 - U1 snRNP se une al sustrato pre-ARNm para formar un complejo E funcional y que se requiere U1 snRNP para incorporar Gal3 en la vía de empalme16.

Es necesario tener en cuenta dos pasos críticos dentro del protocolo experimental descrito. En primer lugar, el paso 3.2.7 exige la eliminación del material no unido sobrenadante después de la precipitación anti-Gal3 de las fracciones de glicerol. La eliminación completa del líquido de las perlas de agarosa peletizadas requiere que la punta de la aguja de la jeringa Hamilton se inserte en la parte inferior de las perlas. Esto debe hacerse con cuidado de modo que las perlas no obstruyan la aguja de la jeringa ni se pierdan al adherirse a la aguja a medida que esta última se extrae del tubo. En segundo lugar, es importante que las perlas peletizadas se utilicen para el montaje de las reacciones de empalme con el menor retraso posible. La coordinación de estos dos pasos fue fundamental para el éxito del procedimiento. En este sentido, también cabe destacar que recientemente hemos mejorado la recuperación de complejos snRNP Gal3-U1 en la fracción de pellets mediante la sustitución de perlas cl-4B de proteína A-sefalrosa por nanopartículas magnéticas de proteína A en el acoplamiento covalente del anticuerpo anti-Gal3 a perlas.

La conclusión clave se deriva de experimentos en los que U1ΔNE, desprovisto de actividad de empalme, se complementa con la partícula 10S Gal3 - U1 snRNP inmunoprecipitada por perlas covalentemente derivatizadas con anticuerpos anti-Gal3. Aunque hubo evidencia clara de eliminación de intrones, la eficiencia de la unión de exones fue menor que la observada en la reacción realizada en ausencia de perlas (compare el carril 6 versus el carril 1 en la Figura 2C). En nuestros ensayos de empalme sin células, aproximadamente el 30% de la radiactividad en el sustrato pre-ARNm se convierte típicamente en exones ligados. Esta deficiencia en la ligadura de exones podría deberse a: (a) alguna cantidad menos que óptima de un componente crítico, ya sea en U1ΔNE (Figura 1A) o en el complejo Gal3 - U1 snRNP (Figura 1B); o (b) algunas restricciones estructurales (por ejemplo, dificultad para experimentar un cambio conformacional) del snRNP Gal3 - U1 inmovilizado en las perlas anti-Gal3 durante la reacción de empalme (Figura 1C).

Otros investigadores han informado del uso de inmunoselección en fase sólida para atrapar complejos específicos y documentar la actividad catalítica o alguna progresión ordenada de las estructuras del espliceosoma. Por ejemplo, Chiu et al. mostraron que la adición del factor de empalme de levadura Cwc25 puede perseguir el sustrato pre-ARNm en un spliceosoma ensamblado atrapado por anticuerpos en la primera reacción catalítica, produciendo los intermedios, exón 1 y lariat-exón227. En el mismo sistema de levadura, Krishnan et al. utilizaron una etiqueta de proteína A para inmovilizar, a través de IgG biotinilada, el complejo de espliceosoma Bact purificado a perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina en un estudio biofísico de remodelación pre-ARNm (distancia entre el sitio de empalme 5'y el punto de ramificación) antes del primer paso de empalme28. Nuestro presente artículo amplía estos estudios anteriores en términos de completar ambos pasos de la reacción de empalme y, por lo tanto, pueden tener un significado de naturaleza técnica: este mismo conjunto de procedimientos podría aplicarse a cualquier número de otros factores de empalme que se asocian con snRNPs para examinar cuándo y cómo estos factores se cargan en complejos espliceosómicos. La capacidad de monitorear la formación de productos de ARNm a partir de la reacción de empalme constituye una fuerte evidencia de que estos empaliceosomas ensamblados son realmente funcionales. Esto puede mejorar nuestra comprensión de cómo se forman los espliceosomas, ya que los informes anteriores que utilizan enfoques proteómicos17 solo catalogan la presencia de algunos factores en un complejo dado en lugar de cómo los factores pueden haberse cargado en el complejo.

Una clara limitación de la aplicabilidad general de estos procedimientos a otras proteínas o snRNPs para evaluar su papel en el empalme es la disponibilidad de un anticuerpo específico dirigido contra el factor particular que precipitará eficientemente su complejo asociado. Por ejemplo, los antisueros policlonales anti-Gal3 de varios conejos (por ejemplo, #24, #49) inmunoprecipitaron el complejo Gal3-U1 snRNP a partir de extracto nuclear o fracciones de glicerol 3-5 (U1 snRNA y proteína U1 70K co-precipitadas con el antígeno cognado, Gal3). En contraste, dos anticuerpos monoclonales disponibles comercialmente dirigidos contra Gal3, Mac-2 y NCL-GAL3, no produjeron los mismos resultados. Los epítopos de Mac-2 y NCL-GAL3 han sido mapeados al dominio amino-terminal del polipéptido Gal329 y es posible que sus respectivos epítopos no sean accesibles en el complejo Gal3-U1 snRNP. Además, es posible que un factor unido a anticuerpos (por ejemplo, Gal3) y su complejo asociado (por ejemplo, U1 snRNP) ya no puedan formar interacciones adicionales con el pre-ARNm u otros componentes espliceosómicos. Esto puede deberse a la interferencia física del anticuerpo o de la matriz a la que el anticuerpo está acoplado covalentemente. Por lo tanto, cada sistema de interés debe evaluarse caso por caso. A pesar de estas limitaciones, sin embargo, parece que el esquema de uso de complejos de afinidad o inmunoseleccionados en perlas para reconstituir la actividad de empalme en extractos agotados de un factor de empalme específico puede ser generalmente aplicable a otros sistemas.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo ha sido apoyado por national Science Foundation Grant MCB-0092919 y Michigan State University Intramural Research Grant 09-CDFP-2001 (a RJP) y por National Institutes of Health Grant GM-38740 y Michigan AgBioResearch Project MICL02455 (a JLW).

El sustrato minx de pre-ARNm utilizado en los ensayos de empalme fue un amable regalo de la Dra. Susan Berget (Baylor College of Medicine, Houston, TX, EE. UU.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-U1 snRNP The Binding Site Hu ENA-RNP #33471 human autoimmune serum specific for U1 snRNP
bottle top vacuum filter Fisher Scientific Corning 431153 (0.22 μm; PES 150 ml) for filtering solutions containing Tris
centrifuge International Equipment Company IEC Model PR-6 for pelletting Sepharose beads in immunoprecipitation
diethylpyrocarbonate (DEPC) Sigma-Aldrich 159220-5G for treatment of water used in preparation of all solutions
dimethylpimelimidate (DMP) Sigma-Aldrich 80490-5G for cross-linking antibody to Sepharose beads
electrophoresis cell BioRad Laboratories, Inc Mini-Protean II for SDS-PAGE separation of proteins
ethanolamine Sigma-Aldrich 411000-100ml for blocking after the cross-linking reaction
gel electrophoresis system Hoefer, Inc HSI SE 500 Series for separating snRNAs by gel electrophoresis
gel slab dryer BioRad Model 224 for drying gel slabs for autoradiography
Hybond ECL membrane GE Healthcare RPN3032D (0.2 μm; 30 cm x 3 m) for immunoblotting of proteins on membrane
microdialyzer (12 x 100 μl sample capacity) Pierce Microdialyzer System 100 for exchanging the buffer of nuclear extract  
microdialyzer membranes (8K cutoff) Pierce 66310 for exchanging the buffer of nuclear extract 
non-fat dry milk Spartan Stores Spartan Instant Non-fat Dry Milk
Protein A Sepharose CL-4B Millipore-Sigma GE 17-0780-01 for coupling antibody to beads
Proteinase K Millipore-Sigma P2308-5mg for stopping the splicing reaction to isolate the RNAs
RNasin Promega N2111 for inhibiting ribonuclease activity
rocker/rotator Lab Industries, Inc  Labquake Shaker 400-110 for mixing protein solutions in coupling reactions and in immunoprecipitation
Safety-Solve Research Products International Corp. No. 111177 scintillation counting cocktail for determination of radioactivity in splicing substrate
scintillation counter Beckman Instruments LS6000SC scintillation counter for determination of radioactivity 
speed vaccum concentrator Savant SVC 100H for drying ethanol-precipitated RNA pellets
Transphor electrophoresis unit Hoefer, Inc Hoefer TE Series Transphor for protein transfer from SDS-PAGE to blotting membrane

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References

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Voss, P. G., Haudek, K. C., Patterson, R. J., Wang, J. L. Complementation of Splicing Activity by a Galectin-3 - U1 snRNP Complex on Beads. J. Vis. Exp. (166), e61990, doi:10.3791/61990 (2020).

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