Dit protocol beschrijft de constructie van een in vitro microfysiologisch systeem voor het bestuderen van borstkanker met behulp van primair menselijk borstweefsel met kant-en-klare materialen.
Borstkanker (BC) blijft een belangrijke doodsoorzaak voor vrouwen. Ondanks meer dan $ 700 miljoen geïnvesteerd in BC onderzoek jaarlijks, 97% van de kandidaat BC drugs falen klinische proeven. Daarom zijn nieuwe modellen nodig om ons begrip van de ziekte te verbeteren. Het NIH Microphysiological Systems (MPS) programma is ontwikkeld om de klinische vertaling van fundamentele wetenschappelijke ontdekkingen en veelbelovende nieuwe therapeutische strategieën te verbeteren. Hier presenteren we een methode voor het genereren van MPS voor borstkanker (BC-MPS). Dit model past een eerder beschreven benadering van het cultiveren van primair menselijk wit vetweefsel (WAT) aan door WAT tussen vet-afgeleide stamcelbladen (ASC)s te sandwichen. Nieuwe aspecten van onze BC-MPS zijn het zaaien van BC-cellen in niet-ziek menselijk borstweefsel (HBT) met inheemse extracellulaire matrix, volwassen adipocyten, ingezeten fibroblasten en immuuncellen; en het inklemmen van het BC-HBT-mengsel tussen HBT-afgeleide ASC-vellen. De resulterende BC-MPS is stabiel in cultuur ex vivo gedurende ten minste 14 dagen. Dit modelsysteem bevat meerdere elementen van het micromilieu die BC beïnvloeden, waaronder adipocyten, stromale cellen, immuuncellen en de extracellulaire matrix. Zo kan BC-MPS worden gebruikt om de interacties tussen BC en zijn micromilieu te bestuderen.
We tonen de voordelen van onze BC-MPS door twee BC-gedragingen te bestuderen waarvan bekend is dat ze de progressie en metastase van kanker beïnvloeden: 1) BC-beweeglijkheid en 2) BC-HBT metabolische overspraak. Hoewel bc-motiliteit eerder is aangetoond met behulp van intravitale beeldvorming, maakt BC-MPS time-lapse-beeldvorming met hoge resolutie mogelijk met behulp van fluorescentiemicroscopie gedurende meerdere dagen. Bovendien, terwijl metabole overspraak eerder werd aangetoond met behulp van BC-cellen en muriene pre-adipocyten gedifferentieerd in onrijpe adipocyten, is ons BC-MPS-model het eerste systeem dat deze overspraak tussen primaire menselijke melkklieradipocyten en BC-cellen in vitro demonstreert.
Elk jaar sterven meer dan 40.000 Amerikaanse vrouwen aan borstkanker (BC)1. Ondanks meer dan $ 700 miljoen geïnvesteerd in BC onderzoek jaarlijks, 97% van de kandidaat BC drugs falen klinische proeven2,3. Nieuwe modellen zijn nodig om de pijplijn voor de ontwikkeling van geneesmiddelen en ons begrip van BC te verbeteren. Het NIH Microphysiological (MPS) Programma beschrijft de functies die nodig zijn voor baanbrekende modellen voor het verbeteren van de vertaling van basiswetenschap naar klinisch succes4. Deze omvatten het gebruik van primaire menselijke cellen of weefsels, stabiel in cultuur gedurende 4 weken, en opname van inheemse weefselarchitectuur en fysiologische respons.
Huidige in vitro BC-modellen, zoals tweedimensionale cultuur van BC-cellijnen, membraaninzetcocultuur en driedimensionale sferoïden en organoïden, voldoen niet aan de MPS-criteria van de NIH omdat geen van deze de inheemse borstweefselarchitectuur samenvatten. Wanneer extracellulaire matrix (ECM) aan deze systemen wordt toegevoegd, wordt borst-ECM niet gebruikt; in plaats daarvan worden collageengels en keldermembraanmatrices gebruikt.
Huidige in vivo systemen, zoals patiënt afgeleide xenografts (PDX), voldoen ook niet aan de MPS-criteria van de NIH omdat muriene borstweefsels enorm verschillen van menselijke borsten. Bovendien worden interacties tussen het immuunsysteem en BC steeds meer erkend als de sleutel in de ontwikkeling van tumoren, maar de immunocompromitteerde muriene modellen die worden gebruikt voor het genereren van PDX-tumoren missen volwassen T-cellen, B-cellen en natuurlijke killercellen. Bovendien, terwijl PDX het mogelijk maakt om primaire borsttumoren te behouden en uit te breiden, worden de resulterende PDX-tumoren geïnfiltreerd met primaire muriene stromale cellen en ECM5.
Om deze uitdagingen te overwinnen, hebben we een nieuwe, ex vivo, driedimensionale menselijke borst MPS ontwikkeld die voldoet aan de NIH MPS-criteria. De basis van onze borst MPS wordt gemaakt door sandwiching primaire menselijke borstweefsel (HBT) tussen twee vellen vet-afgeleide stamcellen (ASC’s), ook geïsoleerd van HBT (Figuur 1). Plunjers voor het overbrengen van de celbladen naar sandwich de HBT kan 3D-geprint of gemaakt van eenvoudige acryl kunststoffen(figuur 1H,I). Deze techniek past onze eerder beschreven aanpak aan voor het cultiveren van primair menselijk wit adipocytweefsel6,7. De borst MPS kan vervolgens worden gezaaid door een BC-model naar keuze, variërend van standaard BC-cellijnen tot primaire menselijke borsttumoren. Hier laten we zien dat deze BC-MPS meerdere weken stabiel in cultuur zijn (Figuur 2); omvatten inheemse elementen van HBT zoals melkklieradipocyten, ECM, endotheel, immuuncellen (figuur 3); en vat de fysiologische interacties tussen BC en HBT zoals metabole overspraak (figuur 4) samen. Ten slotte laten we zien dat BC-MPS de studie van amoebe beweging van BC-cellen in HBT mogelijk maakt (Figuur 5).
Nieuwe systemen voor het modelleren van menselijke borstkanker zijn nodig om een beter begrip van de ziekte te ontwikkelen. De ontwikkeling van menselijke microfysiologische systemen om ziekte-instellingen te modelleren die inheemse ECM- en stromale cellen omvatten, zal de voorspellende kracht van preklinische studies vergroten. Het HIER gepresenteerde BC-MPS-model is een nieuw ontwikkeld systeem dat de beperkingen van eerdere modellen overwint, waardoor BC in zijn oorspronkelijke HBT-omgeving kan worden geëvalueerd. Di…
The authors have nothing to disclose.
We willen de Tulane Flow Cytometrie en Cell Sorting Core en de Tulane Histology Core bedanken voor hun technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door de Southeastern Society of Plastic &Reconstructive Surgeons 2019 Research Grant en de National Science Foundation (EPSCoR Track 2 RII, OIA 1632854).
Accumax | Innovative Cell Technologies | 1333 | Cell disassoication solution for separation of BC-MPS |
Accutase | Corning | 25-058-CI | Cell detachment solution for passaging of cells |
BioStor Container 16oz | National Scientific Supply Co | MPCE-T016 | For Transport of sterile tissue |
Cell Culture 75 cm flasks | Corning | 430641U | For culturing ASCs |
Conical Tubes 15mL | ThermoScientific | 339650 | |
Curved Forceps | ThermoScientific | 1631T5 | For maneuvering tissue while mincing |
DMEM low glucose, w/ Glutamax | Gibco | 10567-014 | For culturing ASCs and BC-MPS |
FBS Qualified | Gibco | 26140-079 | |
Gelatin | Sigma | G9391 | |
HBSS 10x | Gibco | 14185-052 | |
NaOH | Sigma | 221465 | |
Nunc UpCell 6 well plates | ThermoScientific | 174901 | Top ASC cell sheet |
PBS | Gibco | 10010-023 | |
Pen/Strep 5,000U | Gibco | 15070-063 | |
Petri Dish 150 cm | FisherBrand | FB0875714 | For holding tissue while mincing |
Razor Blades | VWR | 55411-055 | Single Edge for mincing tissue |
Strainer 250um | ThermoScientific | 87791 | For separation of BC-MPS |
Tissue Culture 6 well plates | Corning | 3506 | Bottom ASC cell Sheet |
Weights/Washers | BCP Fasteners | BCP672 | For weighing plungers down 1/2" inner diameter |