Summary
该协议描述了使用原始人体乳房组织与现成材料研究乳腺癌的体外微生理系统的构建。
Abstract
乳腺癌（BC）仍然是妇女的主要死因。尽管每年在不列颠哥伦比亚省的研究上投资超过7亿美元，但97%的候选BC药物没有通过临床试验。因此，需要新的模型来改善我们对这种疾病的理解。NIH微生理系统（MPS）计划旨在改善基础科学发现和有前途的新治疗策略的临床翻译。在这里，我们介绍了一种产生乳腺癌 MPS 的方法 （BC-MPS）。该模型通过将WAT夹在脂肪衍生的干细胞片（ASC）之间，来适应先前描述的培养原人类白脂肪组织（WAT）的方法。我们的BC-MPS的新方面包括将BC细胞植入非疾病的人类乳房组织（HBT），其中含有原生细胞外基质、成熟的脂肪细胞、常驻成纤维细胞和免疫细胞：并将BC-HBT混合在HBT衍生的ASC表之间。由此产生的BC-MPS在文化前活力中稳定至少14天。此模型系统包含影响 BC 的微环境的多个元素，包括脂肪细胞、频闪细胞、免疫细胞和细胞外基质。因此，BC-MPS可用于研究BC与其微环境之间的相互作用。
我们通过研究两种已知影响癌症进展和转移的 BC-MPS 行为来展示我们的 BC-MPS 的优势：1） BC 运动和 2） BC-HBT 代谢相声。虽然 BC-MPS 以前曾使用静脉成像来证明其运动性，但允许使用荧光显微镜在几天内进行高分辨率延时成像。此外，虽然代谢相声以前是使用BC细胞和穆林前脂肪细胞分化成不成熟的脂肪细胞来证明的，但我们的BC-MPS模型是第一个在体外证明原人类乳腺脂肪细胞和BC细胞之间的相声的系统。
Introduction
每年，超过40，000名美国妇女死于乳腺癌（BC）1。尽管每年在不列颠哥伦比亚省的研究上投资超过7亿美元，但97%的候选BC药物在临床试验中失败2，3。需要新的模式来改善药物开发管道和我们对不列颠哥伦比亚省的理解。NIH微生理学（MPS）计划界定了突破模型所需的功能，以改进将基础科学转化为临床成功4。其中包括使用原生人体细胞或组织，稳定培养4周，并纳入原生组织结构和生理反应。
目前的体外BC模型，如BC细胞系的二维培养，膜插入共同培养，三维球体和器官，不符合NIH的MPS标准，因为这些都没有回顾本地乳房组织结构。当细胞外基质 （ECM） 添加到这些系统中时，不使用乳房 ECM：相反，使用胶原蛋白凝胶和地下室膜矩阵。
目前体内系统，如患者衍生的异种移植物（PDX），同样不符合NIH的MPS标准，因为乳腺组织与人类乳房有很大的不同。此外，免疫系统-BC相互作用越来越被公认为肿瘤发展的关键，但用于生成PDX肿瘤的免疫功能低下的穆林模型缺乏成熟的T细胞、B细胞和天然杀伤细胞。此外，虽然PDX允许维持和扩大原发性乳房肿瘤，但由此产生的PDX肿瘤被原发性穆林频闪细胞和ECM5渗透。
为了克服这些挑战，我们开发了符合NIH MPS标准的新型、前活体、三维人类乳房MPS。我们的乳房MPS的基础是通过将原发性人类乳房组织（HBT）夹在两片脂肪衍生干细胞（ASCs）之间，也从HBT（图1）中分离出来。将细胞板转移到夹心的柱子可以3D打印或由简单的丙烯酸塑料制成（图1H，I）。这项技术适应了我们以前描述的培养人类白脂肪组织6，7的方法。然后，乳房MPS可以通过不列颠哥伦比亚省的模型进行播种，从标准的BC细胞系到人类原始乳房肿瘤。在这里，我们显示，这些BC-MPS在文化中稳定了几个星期（图2）：包括HBT的原生元素，如乳腺脂肪细胞，ECM，内皮，免疫细胞（图3）：并回顾BC和HBT之间的生理相互作用，如代谢相声（图4）。最后，我们表明，BC-MPS允许研究整个HBT（图5）中BC细胞的动物体运动。
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Protocol
所有人体组织都是按照经LSUHSC机构审查委员会办公室批准的议定书#9189收集的。
1. 为细胞片播种脂肪衍生干细胞（ASC）
- 从商业来源购买ASC或按照既定协议8，9从原人类乳房组织分离。种子人类乳房ASCs在70%密度（+80，000细胞/厘米2表面积）到6井标准组织培养板在杜尔贝科的修改鹰介质（DMEM）补充10%胎儿牛血清，和1%青霉素/链霉素（BC-MPS媒体）。确保用于形成细胞片的 ASC 应小于通道 10。
- 对于将产生的每口乳癌微生理系统（BC-MPS），1个标准组织培养井中的种子细胞和1个大小相近的多（N-异丙烯酰胺）（pNIPAAm）涂层组织培养塑料板上的种子细胞。一个 6 井的 BC-MPS 板将需要一个标准组织培养 6 井板 （底部） 和一个 pNIPAAm 涂层板 （顶部）。pNIPAAm板可以从商业来源购买，也可以涂在实验室10，11，12。
- 组织培养孵化器中的培养 ASC 为 37 °C，二氧化碳为 5%。在生物安全柜中每 2-3 天更换一次媒体。
- 培养 ASC，直到它们成为 100% 的汇合体，并形成一个条纹模式。根据他们播种时的汇合，这需要7-10天。需要结流细胞片来锚定浮力脂肪乳房组织。
2. 准备 BC-MPS 所需的用品
- 要为 6 井板准备明胶，在蒸馏的 H2O. 混合 19 克明胶 B 型（凝胶强度为 +225 Bloom）和 125 毫升 H2O 在 250 mL 玻璃介质瓶中。将 1.6 mL 的 1 M NaOH 添加到中和 pH 的解决方案中。
- 在液体循环下自动将溶液解25分钟，以消毒溶液。
- 允许解决方案冷却到 37 °C。 在无菌生物安全柜中，将 16 mL 的无菌 10 倍汉克斯平衡盐溶液 （HBSS） 添加到溶液中，以获得最终 160 mL 的体积。
注：明胶溶液可立即使用或储存在室温下供以后使用。准备好的明胶在室温下稳定1个月。如果只需要几个柱塞，那么就可以制作一个10mL的解决方案，并在制造BC-MPS的同一天进行无菌过滤，如前所述的7。- 要通过滤芯灭菌来制备明胶溶液，用 9 mL 的 H2O 稀释 1 mL 的 10 倍 HBSS，在 15 mL 锥形管中制作 1 倍 HBSS 溶液。将 100 μL 的 1 M NaOH 添加到每个 10 mL 管中，然后在溶液中加入 0.7 克明胶。将溶液大力混合以溶解明胶。
- 将管子孵化在 75 °C 的水浴中，每 5 分钟摇晃 20 分钟。使用 10 mL 注射器和 0.22μm 注射器过滤器过滤明胶溶液。将明胶溶液直接过滤到生物安全柜中的柱塞上。
- 3D 打印或使用简单的丙烯酸制作用于传输细胞片的柱塞。确保柱塞松散地适合所需的大小井。标准的 3D 打印柱塞显示在图 1 中。柱塞可以使用标准的计算机辅助设计软件，如丁克卡德和打印使用灯丝3D打印机，是兼容的聚乳酸（PLA）13，14。
- 为了准备一个架子，将一个15mL的管架放在生物安全柜中。将柱塞倒置在机架上，使柱塞底部朝上。在生物安全柜中放置一个带盖子的塑料盒，用于运输 BC-MPS。建议该框至少为 35.5 厘米长 x 28 厘米宽 x 8.25 厘米高，以适合 4 板 BC-MPS。从盒子上取下盖子，用 70% 的 EtOH 喷洒到机架、柱塞和盒子下。
- 准备无菌剃须刀刀片和钳子，通过自动切割或放置在生物安全柜和洗涤与70%EtOH。
- 用 70% EtOH 喷洒柱塞和盒子，打开生物安全柜中的紫外线至少 30 分钟，对用品进行消毒。
3. 准备明胶柱塞并涂抹在上部细胞片上
- 如果明胶溶液以前已准备好，请在 37°C 的水浴中加热以将其熔化。
- 使用 5 或 10 mL 血清学移液器将明胶溶液输送到生物安全柜中的柱塞上。6井板1口井的柱塞需要约2.5毫升明胶。
- 一旦明胶凝固在柱塞上（+30-45分钟），将pNIPAAm涂层的ASC板移动到生物安全柜。轻轻地将柱塞放入 pNIPAAm 涂层 ASC 板的井中，以便明胶与 ASC 接触。将金属洗衣机（约7.5克）放在柱塞上，以压低柱塞，使明胶与ASC细胞片直接接触。将柱塞放在 ASC 细胞片上，在室温下 30 分钟。
- 将柱塞轻轻移动板，放入生物安全柜中的无菌箱中，盖上盖子。将盒子移到 4 °C 冰箱 30 分钟。如果没有 4 °C 冰箱，请将盘子放在生物安全柜的冰桶中 30 分钟。
4. 癌细胞系的准备
- 将癌细胞系播种在标准的 T75 组织培养皿中，并将其保存在培养物中，以便在 BC-MPS 处理当天它们达到 80% 的汇流。（BC-MPS 需要 200，000 个癌细胞）。在正常介质中生长癌细胞。
注意：为了识别和分离癌细胞，建议细胞与荧光蛋白相分离，以区别于ASC和乳房组织。MCF7 和 MDA-MB-231 细胞优化了每个 BC-MPS 所需的癌细胞数量。其他细胞系可能需要进一步优化。 - 在 BC-MPS 正在准备的当天，将含有癌细胞的烧瓶移到生物安全柜。从烧瓶中吸气媒体。用 5 mL 的 PBS 清洗烧瓶。
- 将 1 mL 的细胞分离溶液添加到含有癌细胞的烧瓶中，然后在 37 °C 孵化器中孵化烧瓶，直到细胞分离（+2-5 分钟）。
- 在生物安全柜中，将 9 mL 的 PBS 添加到烧瓶中，将 PBS 中的细胞转移到 15 mL 锥形管中，然后使用血细胞计计算细胞号。
- 在室温下以500 x g 的5分钟将癌细胞离心。
- 在 BC-MPS 介质中恢复细胞，以便有 2 x 106 个单元格/mL。
- 将癌细胞放在37°C的水浴中，直到它们准备好加入人体组织。
5. 处理人体乳房组织
- 在生物安全柜中，用10毫升无菌PBS清洗人体乳房组织（HBT）3倍。
- 使用无菌钳子和剃须刀刀片粗切BC-MPS，并尝试去除尽可能多的筋膜和结缔组织。未能去除结缔组织可能导致 ASC 上层无法正确锚定 HBT。
注意：与脂肪组织的黄色相比，筋膜和结缔组织可以通过其白色或清晰的外观来识别。 - 结缔组织被移除后，使用无菌剃须刀刀片细切组织，直到其具有同质液体一致性。当组织可以使用 25 mL 血清学尖端轻松地吹笛时，组织会被细碎。
- 使用无菌剃须刀刀片切断 p1000 移液器尖端的尖端，以帮助管道切割切碎的 HBT。
- 在1.5 mL管混合切碎的HBT，癌细胞系和BC-MPS介质（对于1井的6井板，这需要200μL的切碎的HBT，100μL的BC-MPS介质，和100μL的癌细胞）。
- 将用于底部细胞板的 ASC 板从孵化器移动到生物安全柜。从底部 ASC 板块吸气媒体。使用 p1000 移液器尖端将混合物输送到底部 ASC 板的井中央，该点末端从步骤 5.4 中切断
- 将装有上部 ASC 板的盒子与上面的柱塞移到生物安全柜中。轻轻地从 pNIPAAm 涂层板中取出明胶柱塞，放在 HBT 混合物的顶部。将BC-MPS介质添加到井中（6井板中的1口井添加2 mL介质）。小心地将底部 ASC 板与 BC-MPS 混合物和柱塞移动到无菌塑料盒上，并将盒子的盖子打开以进行运输。
注：6井板盖在柱塞打开时无法重新贴回ASC板。必须小心避免对文化进行恶害。 - 在37°C的孵化器中孵化底部板，直到明胶融化，顶部ASC层开始粘附在底部层（+30分钟）。
- 将带盘子的盒子移到生物安全柜。轻轻地从底部板中取出柱塞。带有癌细胞的组织将被固定在井底。
- 将 6 井板的盖子放回底部板，在 37 °C 孵化，以完全熔化明胶，并让顶层完全锚定到底层（+30-60 分钟）。
- 轻轻地将盘子移到生物安全柜中，然后用 10 mL 血清学移液器吸气介质。为每口井添加2 mL的新鲜介质。从井边吸气，将移液器移到井边，以避免将组织移走。
- 将 BC-MPS 保持在 37 °C 和 5% CO2， 以保持所需的时间长度，每 2-3 天更换一次介质。
6. BC-MPS 的消化供分析
- 当 BC-MPS 准备好分析时，将板移到生物安全柜。用血清移液器取出介质，以避免意外地移除任何组织。
- 向每口井添加 1 卷 PBS。
- 用血清学移液器取出 PBS。
- 向每口井添加 1 mL 的细胞分离解决方案。将板移回孵化器，在37°C下孵育5分钟，使细胞分离。在生物安全柜中，使用细胞刮刀将细胞和组织从培养板中完全分离出来。
- 使用血清学移液器将溶液与组织转移到 15 mL 圆锥管中。将 2 mL 的 PBS 添加到每个井中，以收集任何剩余的细胞，并将此溶液转移到圆锥管中。如果细胞是荧光的，用铝箔包裹管子，以保护它免受光线的照射。
- 在轨道摇床中持续搅拌下，在 37 °C 下孵化管，持续搅拌 1 x g， 持续 10-20 分钟，将细胞与组织完全分离。
- 在生物安全柜中，使用血清学移液器破坏管中剩余的细胞团，并通过 250 μm 组织过滤器将样品过滤到新的 15 mL 管中。将溶液缓慢地通过过滤器，使其不会溢出。
- 用 1 mL PBS 冲洗滤网以收集仍在滤网中的任何细胞。
- 在室温下以 500 x g 的速度将样品离心 5 分钟。离心后，脂肪细胞将漂浮在溶液的顶层，而癌细胞和ASC将混合在管底部的颗粒中。
- 将脂肪细胞分离，轻轻地将顶层倒入新管中，或者切断 p1000 移液器尖端的尖端，并将顶层转移到新管中。将样品在 500 x g 下再离心 5 分钟，并使用注射器和针头从脂肪细胞下方去除溶液，以便仅剩余脂肪细胞。脂肪细胞现在已准备好进行分析
- 从溶液中取出脂肪细胞后，如果癌细胞以前被荧光蛋白转染，则将ASC和癌细胞彼此分离以进行分析。从含有ASC和癌细胞的管子里吸气剩余的溶液，同时不破坏细胞颗粒。在PBS或BC-MPS介质中补充颗粒，并使用流动细胞测量法根据荧光对细胞进行排序。
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Representative Results
文化稳定
BC-MPS 是一个稳定的微生理系统，可以在体外培养至少 14 天。以 100 倍的放大倍数拍摄了 ASC 细胞片的明亮场图像，以显示共体表 （图 2A）的条纹图案。ASC 细胞片在培养中稳定至少 4 周。BC-MPS在6口井板的一口井中进行了14天的培养，用彩色照相机进行成像，表明浮力高清在14天后仍然由ASC细胞板稳定地固定在井底（图2B）。这表明用于夹入脂肪组织的细胞片仍然完好无损。表达 RFP 的三重负 BC 细胞系 MDA-MB-231 在 HBT 中培养了 14 天，然后用荧光显微镜进行成像，以显示 BC-MPS 的稳定性，将细胞系显示到至少 14 天（图 2C）。组织中BC细胞的存在表明癌细胞入侵HBT的能力。从小鼠身上去除三重负 PDX 去除剂，沾染细胞跟踪器 CMTPX，并与 HBT 培养。荧光显微镜图像拍摄于第6天，以显示BC-MPS与肿瘤外植的稳定性至少6天（图2D）。这表明BC-MPS可用于培养具有HBT和细胞系的肿瘤外植。
原生 HBT 元素
BC-MPS 包含文化中 HBT 的原生元素。含有100毫克HBT的BC-MPS在体外培养了14天。组织在培养14天后使用明亮场显微镜成像（图3A）。此图像展示了在文化中 14 天内保存成熟脂肪细胞集群。然后，组织被固定与10%的形式素，石蜡嵌入，用微原子在5μm分割，然后用标准协议沾染莫瓦茨五铬污渍。固定部分的成像为 100 倍（图 3B）或 20 倍（图 3C）。图像表明，BC-MPS包含原生胶原蛋白（紫色）、回膜纤维（蓝色），结缔组织之间的脂肪细胞大单眼形状在培养中保存14天。为了识别系统中的主要巨噬细胞，HBT 进行了 0、3 和 7 天的培养，然后用防 CD45、反 CD68 和反 CD206 进行固定和染色。CD45 用作一般白细胞标识符。CD68被用作单核细胞污渍来识别巨噬细胞，而CD206则识别出巨噬细胞中存在的一个常见受体。使用成像软件（图 3D）对宏字标记的污渍进行量化。这表明在3天和7天的文化之后，主要巨噬细胞被保存。这些数据表明，BC-MPS在文化中保留了HTB的原生元素。可以进行进一步的实验，以研究BC细胞如何重塑HBT的原生元素。这可以包括评估宏噬细胞标记的变化，以确定它们是否因 BC 细胞的存在而改变。ECM 的变化可以通过比较使用或没有 BC 细胞培养的样品的 Movats 五色染色来进一步分析，以确定胶原蛋白含量是否发生变化，并且使用图像 J 等图像分析软件（如图像 J）比较脂肪细胞的大小，以确定 BC 细胞是否改变脂肪细胞大小。
代谢相声
脂肪细胞癌代谢相声是肿瘤微环境影响BC进展的重要途径。积累细胞内脂质的BC细胞表现出更大的耐药性和更具侵入性的表型15。虽然BC细胞已被证明在不成熟、阴唇脂肪细胞中诱导脂溶解，但这一点的生理相关性仍不清楚，因为BC和原人类乳腺脂肪细胞之间的代谢相声从未被显示。为了证明BC-MPS可以模拟这种脂肪细胞-BC代谢相声RFP标记的MDA-MB-231细胞单独培养或在BC-MPS中培养14天。细胞被酶消化成单细胞悬浮，沾染中性脂质染料博迪皮，并通过流动细胞学（图4A，B）16进行分析。脂质阳性MDA-MB-231细胞的比例是26.2倍SEM+/-2.5在BC-MPS与2D培养（图4C）。脂质染色量的增加表明癌细胞正在与脂肪细胞相互作用，并吸收从成熟的脂肪细胞释放的脂质。进行细胞排序，为 RFP® 博迪皮® 细胞进行选择。分拣后，细胞被镀在胶原蛋白上，我涂上玻璃盖片，并允许连夜附着。第二天，细胞被固定在4%的副甲醛中30分钟，然后在荧光显微镜上以100倍的倍率成像。与标准二代培养的细胞（图4D）相比，BC-MP培养的细胞（图4E）显示脂质液滴增加。这演示了 BC 细胞和 HBT 之间的代谢相声，也显示了如何通过流动细胞学或荧光显微镜分析脂质积累。通过量化脂质液滴的大小和每个细胞的脂液滴数量，可以进一步分析癌细胞中的脂质积累。
阿莫博德运动
BC细胞和脂肪细胞之间的代谢相声增加了癌症的侵入能力。为了评估用HBT培养的癌细胞的侵入能力增强，通过荧光显微镜评估了BC细胞在整个HBT中的迁移。转移TNBC细胞线MDA-MB-231表示RPF在BC-MPS中培养了4天，使系统稳定下来。延时荧光显微镜在4天后进行，以图像MDA-MB-231的动量与一个图像捕获每20分钟19小时在37°C和5%CO2。由此产生的视频展示了MDA-MB-231细胞的运动模式和惊人的高运动度（图5和视频1）。这表明 BC 细胞的侵入能力和 BC 细胞入侵 HBT 的能力增加。可以使用先前公布的方法进一步分析HBT中BC细胞的迁移，以量化迁移细胞17、18的速度和方向。MDA-MB-231细胞也被观察到似乎正在经历线粒体病。这些行为与其攻击性表型一致，是癌症进展和转移的重要行为，并突出显示可能针对 BC 疗法的新 BC 行为。
图1：BC-MPS设置的一般工作流程。（A） 明胶在直立柱塞中凝固。（B） 带明胶的柱塞被放置在反应迟钝的上ASC细胞片上。（C） 重量用于迫使明胶与细胞片保持接触，而细胞在室温下孵育30分钟，然后在4°C孵育30分钟。（E） 带上细胞片的柱塞被转移到包含底部细胞片和切碎的 HBT 和 BC 细胞的盘子中。（F） 底部细胞盘与介质， 柱塞， HBT， BC 和两个细胞板在 37 °C 孵育 30-60 分钟， 使明胶融化和细胞表从接触.（G） 拆除柱塞离开 HBT 和 BC 夹在两个 ASC 细胞板之间。3D 打印柱塞使用免费在线软件 TinkerCad （https://www.tinkercad.com/） 设计，并打印在 3D 打印机上。柱塞由多乳酸组成。（H） 表示 6 井板 1 井的柱塞尺寸。柱塞的凹槽为2.5毫米。（I）显示实际3D打印柱塞的图像。请单击此处查看此图的较大版本。
图2：BC-MPS在文化中的代表性稳定性。 （A）一个亮场图像，其倍数是共体ASC的100倍，显示了共体细胞的条纹模式。比例杆 = 100μm. （B） BC-MPS，含有 100 毫克的 HBT，在 6 个井板中培养。14天后，拍摄了一张彩色照片，以证明HBT锚定在6井板的井底。（C） 表达 RFP 的三负 BC 细胞系 MDA-MB-231 与 HBT 一起培养了 14 天，然后使用荧光显微镜在 40 倍的放大倍数下进行成像。图像表明，MDA-MB-231细胞仍然可行，并在HBT中生长。鳞片 = 200 μm D） 小鼠三重阴性乳腺癌的 PDX 肿瘤被切碎成 3 厘米2 块，并贴上细胞跟踪器红色 CMPTX 的标签。这些碎片是在 HBT 中培养的，由此产生的 BC-MPS 在第 6 天使用荧光显微镜以 40 倍的倍数进行成像，以显示其文化稳定性。比例栏 = 200μm. 请单击此处查看此图的更大版本。
图3：代表保存不列颠哥伦比亚省-MPS中存在的 HBT 的原生元素。 BC-MPS 被培养了 14 天，然后用明亮的场显微镜在 40 倍（A）处进行成像，然后用 10% 的形式素固定，并染上莫瓦茨五铬污渍。图像拍摄于100倍（B）或20倍（C）。HBT 的成像表明，大型单体脂肪细胞聚集在一起，组织切片表示存在保存原生 ECM，如胶原蛋白（黄色）和脂肪细胞（蓝色）之间的视网膜纤维。为了证明模型 HBT 中巨噬细胞的保存，培养了 0、3 或 7 天，用于宏噬细胞标记，并使用共焦显微镜（D）进行成像。使用市售软件量化了宏噬细胞标记染色的荧光强度，表明在培养了 3 天和 7 天后，组织中仍然存在巨噬细胞。比例栏 = 200μm. 请单击此处查看此图的更大版本。
图4：BC-MPS中脂肪细胞和癌细胞之间的代表性代谢相声。RFP 标记的 MDA-MB-231 细胞在 BC-MPS 与 2D 中培养了 14 天，然后沾染了 Bodipy （250 nM），并通过流细胞测量进行分析。（A） 在二维培养中14天后，博迪皮染色MDA-MB-231细胞的流动。B2中的细胞是博迪比+RFP+ ：B1中的细胞是博迪皮-RFP+。B2/（B1+B2） = 3.26%，表示脂质积累最小。（B） 在 BC-MPS 中 14 天后，对博迪皮染色 MDA-MB-231 细胞进行流动细胞测量分析。B2/（B1+B2） = 85.35%，表示脂质积累广泛。（C） 在 2D 培养 14 天后， MDA-MB -231 细胞中的脂质积累与 BC-MPS。荧光显微镜分析MDA-MB-231在2D（D）与BC-MPS（E）培养的博迪皮染色，表明在BC-MPS生长的细胞中脂质积累增加。错误栏表示 Sem. ** p < 0.01， n =2 生物复制， 比例杆 = 50μm。请单击此处查看此图的更大版本。
图5：在BC-MPS中TNBC的代表迁移。 RFP 标记的 MDA-MB-231 细胞在 BC-MPS 中培养了 4 天，然后使用荧光显微镜捕获 RFP 标记的 BC-MPS + MDA-MB-231 细胞的连续延时图像（每 60 分钟一帧，放大 100 倍）。黄色星号=线性事件。黄色框=用于位置参考的蜂窝碎片。蓝色箭头 = 231 个细胞，显示具有伪足类动物和高运动性的类动物运动。比例栏 = 100μm. 请单击此处查看此图的更大版本。
视频 1： TNBC 在 BC-MPS 中的代表性迁移。 含有 RFP 标记的 MDA-MB-231 细胞的 BC-MPS 进行了 4 天的培养，荧光显微镜用于在 37 °C 和 5% CO2 的 19 小时内每 20 分钟对细胞进行成像。图像被汇编成视频（每60分钟一帧，放大100倍）。请点击这里下载此视频。
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Discussion
需要新的系统来模拟人类乳腺癌，以更好地了解这种疾病。开发人类微生理系统来模拟疾病设置，包括原生 ECM 和频闪细胞，将提高临床前研究的预测能力。这里介绍的BC-MPS模型是一个新开发的系统，克服了以前模型的局限性，允许在其原生HBT环境中对BC进行评估。该系统可用于癌细胞系或肿瘤外植，稳定至少14天。荧光标记 BC 细胞允许实时可视化癌细胞的活力和细胞-细胞相互作用、迁移、生存能力或增殖，以便实时或在特定时间点（图 3 和 图 5）进行监控。这个模型系统可以用来阐明癌症生物学的重要方面，因为它与癌细胞与其微环境之间的相互作用有关。对该系统的询问可以告知TME对癌症进展、药物反应和转移启动的监管。
要成功建立系统，需要遵循一些关键步骤。第一个关键步骤是培养和转移ASC细胞片。pNIPAAm 涂层板对温度敏感。当板块高于 32 °C 时，表面是疏水的，ASC 将粘附在表面上。表面将变得亲水低于这个温度，细胞将开始分离19。因此，有必要确定给定细胞类型开始从这些表面分离的速度。对于 HBT 衍生的 ASC，如果细胞是汇流的，则需要> 30 分钟。为了防止细胞在正常维护期间分离，介质应预热至37°C，组织培养板不应长时间保持在室温下，以防止板冷却和细胞分离。确定明胶柱塞在 pNIPAAm 涂层板上传输整个细胞板的最佳时间也很重要。ASC 需要汇联，整个表需要转移。如果顶部细胞片没有时间完全分离并绑定到明胶，则细胞片将在转移过程中被打破。如果整个细胞片没有完全转移，那么ASC将无法夹入丰勃的乳房组织。
用于夹紧HBT的ASC是乳房微环境的正常频闪细胞，分泌ECM、生长因子和影响BC20的细胞因子。为了将 HBT 夹在两个细胞板之间，ASC 表使用反应迟钝的组织培养板进行转移。这使得由 ASC 分泌的原生 ECM 能够完好无损，并有助于将浮力脂肪细胞固定在组织中。通过使用来自人类乳房组织的ASC，这确保了ASC与癌细胞的相互作用将模仿乳腺癌中发生的情况，因为来自不同库的ASC显示不同的基因表达和ECM重塑21。
第二个关键步骤是处理高新条约。有必要使用新分离的 HBT 来保持组织的生存能力。在处理 HBT 时，必须细化组织并尽可能多地去除筋膜。如果在 HBT 中留下大块筋膜，这将阻止细胞片正确锚定浮力组织。此外，组织中留下的筋膜可以与板分离，它会拉动 HBT 的多个群集，使油井无法用于进一步实验。在添加顶部细胞片之前，HBT 应放置在井的中间，否则 ASC 将无法充分夹入 HBT，油井边缘的组织将无法固定。如果遵循这些关键步骤，则产生 BC-MPS 的过程将直接启动。
此处详细介绍的模型是研究BC在其原始HBT的自然微环境，保留成熟的脂肪细胞，ECM和常驻免疫细胞（图4）的改进系统。模拟脂肪微环境的临床前模型缺乏微环境的多种元素，如成熟的脂肪细胞、免疫细胞、成纤维细胞和 ECM。使用完全成熟的HBT允许同时和相互审讯这个复杂的环境，其中包括多个元素，影响癌症的发展，药物反应和侵入性通过对羟基苯甲酰和杂音信号22，23，24，25。居民成像细胞和ASC通过在组织中重塑ECM和通过对羟基苯甲酰二甲苯信号26，27影响癌症转移。ECM 及其改造对于开始转移至关重要。肿瘤微环境的 ECM 的改变影响不列颠哥伦比亚省的迁移和转移，但大多数 BC 研究没有将原生 ECM 纳入他们的研究，而是使用由胶原蛋白 I 或母体28，29组成的简化模型。BC-MPS中的ECM来自HBT和ASC。因此，可以研究原生 ECM 在乳房组织肿瘤微环境下重塑并影响转移的方法。因此，这个BC-MPS模型包含了肿瘤微环境的多个元素，而以前的模型系统没有。
该模型可用于研究完全成熟的脂肪细胞和BC细胞之间的代谢相声。先前研究脂肪细胞和癌细胞之间相互作用的模型使用体外分化的脂肪细胞前。体外分化的子细胞前没有完全成熟到与体外30、31分化的脂肪细胞相同的程度。要了解脂肪细胞如何影响癌症进展和药物反应，正确模仿原生脂肪细胞的复杂分子和化学成分至关重要。在这里，我们已经证明，我们的系统允许评估脂肪细胞和BC细胞之间的代谢相声（图4）。
BC-MPS还可用于进行体外研究，研究肥胖等无法使用标准细胞系进行适当建模的情况如何影响癌症的进展。肥胖与HBT的微环境改变和不列颠哥伦比亚省转移的增加有关，尽管确切的机制尚未完全了解32，33，34。纤维细胞、ASC、脂肪细胞和心电图在肥胖期间发生改变，进一步促进癌症的进展和转移。因此，使用来自肥胖组织的原生频闪细胞和 ECM 来了解这些自体细胞和 ECM 的改变如何影响 BC 非常重要。通过利用 BC-MPS 中肥胖或瘦身患者的 HBT 和 ASCs 模型，可以阐明肥胖促进转移表型的机制。
这里介绍的方法是在包括ASC、成熟的脂肪细胞和原生ECM的培养中培养乳腺癌细胞。先前的共文化系统模型研究了这些单个不同元素的频闪环境如何影响癌症。由于ASC和脂肪细胞都影响BC进展，因此确定哪个细胞类型对影响BC负责可能很复杂。但是，这可以通过将 BC-MPS 与具有一种单元类型的更简单的共同培养模型进行比较来确定。与片上或生物打印系统相比，该系统的优点之一是，除了市售的 pNIPAAm 涂层板之外，无需任何特殊设备来设置该系统。乳房组织的模型系统以前曾被描述为使用生物打印将ASC沉积到脚手架中，然后在培养物22中区分。这需要额外的2-3周细胞来区分和ASC区分培养没有完全区分成熟的脂肪细胞。BC-MPS 中 HBT 中成熟的脂肪细胞在从患者身上取出后即可使用。
这里描述的模型系统对于研究癌细胞与微环境之间的相声是有用的系统，但是，它确实有一定的局限性。其中一个主要限制是原始人类乳房组织的可用性。人类脂肪组织不能在不丧失生存能力的情况下冷冻保存，因此用于制造BC-MPS的组织需要新鲜获得和使用37。另一个限制是，这里介绍的模型是一个静态系统，在常规的6井板培养。该系统缺乏芯片上器官中存在的微流体流动，这种流动会影响氧气和营养的供应、压力和药物分布。第三个限制是，如果需要单独分析不同的细胞类型，则细胞需要在实验结束时彼此分离。这就需要给细胞贴上标签，以便它们能够彼此分离。
肿瘤微环境许多元素的结合，为研究癌症的进展和转移的启动生成了生理模型。除了能够以更生理的模型研究癌细胞外，BC-MPS还可用于研究微环境的各个元素以及它们如何受到癌症的影响。虽然此处所代表的数据演示了如何将 BC-MPS 用于一个细胞系，但 BC-MPS 可以很容易地适应研究人员的特定实验需求。例如，肥胖的 HBT 可以与瘦 HBT 进行比较，以确定肥胖如何影响癌症转移和进展。BC的不同亚型可以播种到BC-MPS中，以研究癌症亚型如何与微环境不同地相互作用。基因编辑技术可用于确定特定基因如何影响BC和微环境之间的相互作用。该模型及其应用将使更准确地了解频闪环境和乳腺癌如何相互作用，促进癌症的进展和转移。
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Disclosures
作者宣称他们没有相互竞争的利益。
Acknowledgments
我们要感谢杜兰流细胞测量和细胞分拣核心以及杜兰组织学核心的技术支持。这项工作得到了东南整形和重建外科医生协会2019年研究补助金和国家科学基金会（EPSCoR轨道2 RII，OIA 1632854）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accumax | Innovative Cell Technologies | 1333 | Cell disassoication solution for separation of BC-MPS |
| Accutase | Corning | 25-058-CI | Cell detachment solution for passaging of cells |
| BioStor Container 16oz | National Scientific Supply Co | MPCE-T016 | For Transport of sterile tissue |
| Cell Culture 75 cm flasks | Corning | 430641U | For culturing ASCs |
| Conical Tubes 15mL | ThermoScientific | 339650 | |
| Curved Forceps | ThermoScientific | 1631T5 | For maneuvering tissue while mincing |
| DMEM low glucose, w/ Glutamax | Gibco | 10567-014 | For culturing ASCs and BC-MPS |
| FBS Qualified | Gibco | 26140-079 | |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| HBSS 10x | Gibco | 14185-052 | |
| NaOH | Sigma | 221465 | |
| Nunc UpCell 6 well plates | ThermoScientific | 174901 | Top ASC cell sheet |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Pen/Strep 5,000U | Gibco | 15070-063 | |
| Petri Dish 150 cm | FisherBrand | FB0875714 | For holding tissue while mincing |
| Razor Blades | VWR | 55411-055 | Single Edge for mincing tissue |
| Strainer 250um | ThermoScientific | 87791 | For separation of BC-MPS |
| Tissue Culture 6 well plates | Corning | 3506 | Bottom ASC cell Sheet |
| Weights/Washers | BCP Fasteners | BCP672 | For weighing plungers down 1/2" inner diameter |
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