Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Моделирование рака молочной железы в ткани молочной железы человека с использованием микрофизиологической системы

Published: April 23, 2021 doi: 10.3791/62009
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 5, 4, 1
1Department of Surgery, Louisiana State University Health Sciences Center, 2Department of Bioinnovation, Tulane University, 3Tulane University School of Medicine, 4Department of Biological and Agricultural Engineering, Louisiana State University, 5Department of Medicine, Tulane University School of Medicine

Summary

Этот протокол описывает построение микрофизиологической системы in vitro для изучения рака молочной железы с использованием первичной ткани молочной железы человека с готовыми материалами.

Abstract

Рак молочной железы (БК) остается основной причиной смерти женщин. Несмотря на то, что ежегодно в исследования BC инвестируется более 700 миллионов долларов, 97% препаратов-кандидатов не проходят клинические испытания. Поэтому необходимы новые модели, чтобы улучшить наше понимание болезни. Программа NIH Microphysiological Systems (MPS) была разработана для улучшения клинического перевода фундаментальных научных открытий и перспективных новых терапевтических стратегий. Здесь мы представляем метод генерации MPS для рака молочной железы (BC-MPS). Эта модель адаптирует ранее описанный подход культивирования первичной белой жировой ткани человека (WAT) путем сэндвичинга WAT между листами стволовых клеток, полученных из жировой ткани (ASC). Новые аспекты нашего BC-MPS включают посев клеток BC в небольшнюю ткань молочной железы человека (HBT), содержащую нативный внеклеточный матрикс, зрелые адипоциты, резидентные фибробласты и иммунные клетки; и сэндвичинг примеси BC-HBT между листами ASC, полученными из HBT. Полученный BC-MPS стабилен в культуре ex vivo в течение не менее 14 дней. Эта модельная система содержит несколько элементов микросреды, которые влияют на БК, включая адипоциты, стромальные клетки, иммунные клетки и внеклеточный матрикс. Таким образом, BC-MPS может быть использован для изучения взаимодействий между BC и его микросредой.

Мы демонстрируем преимущества нашего BC-MPS, изучая два поведения BC, которые, как известно, влияют на прогрессирование рака и метастазирование: 1) подвижность BC и 2) метаболические перекрестные помехи BC-HBT. В то время как подвижность BC ранее была продемонстрирована с использованием прижизальной визуализации, BC-MPS позволяет получать покадровую визуализацию с высоким разрешением с использованием флуоресцентной микроскопии в течение нескольких дней. Кроме того, в то время как метаболические перекрестные помехи были ранее продемонстрированы с использованием клеток BC и мышиных преадипоцитов, дифференцированных в незрелые адипоциты, наша модель BC-MPS является первой системой, демонстрирующей этот перекрестный разговор между первичными адипоцитами молочной железы человека и клетками BC in vitro.

Introduction

Каждый год более 40 000 женщин США умирают от рака молочной железы (BC)1. Несмотря на то, что ежегодно в исследования BC инвестируется более 700 миллионов долларов, 97% препаратов-кандидатов BC не проходят клинические испытания2,3. Новые модели необходимы для улучшения конвейера разработки лекарств и нашего понимания БК. Микрофизиологическая программа NIH (MPS) очерчена функции, необходимые для прорывных моделей для улучшения перевода фундаментальной науки в клинический успех4. Они включали использование первичных клеток или тканей человека, стабильных в культуре в течение 4 недель, и включение нативной тканевой архитектуры и физиологического ответа.

Современные модели IN vitro BC, такие как двумерная культура клеточных линий BC, кокультура мембранных вставок и трехмерные сфероиды и органоиды, не соответствуют критериям MPS NIH, потому что ни один из них не повторяет архитектуру нативной ткани молочной железы. Когда к этим системам добавляется внеклеточный матрикс (ECM), ECM молочной железы не используется; вместо этого используются коллагеновые гели и матрицы базальных мембран.

Современные системы in vivo, такие как ксенотрансплантаты, полученные от пациентов (PDX), также не соответствуют критериям MPS NIH, потому что мышиные ткани молочной железы значительно отличаются от человеческой груди. Кроме того, взаимодействия иммунной системы и BC все чаще признаются ключевыми в развитии опухоли, но иммунокомпрометированные мышиные модели, используемые для генерации опухолей PDX, не имеют зрелых Т-клеток, В-клеток и естественных клеток-киллеров. Кроме того, в то время как PDX позволяет поддерживать и расширять первичные опухоли молочной железы, полученные опухоли PDX инфильтрируются первичными мышиными стромальными клетками и ECM5.

Чтобы преодолеть эти проблемы, мы разработали новый, ex vivo, трехмерный MPS человеческой груди, который соответствует критериям NIH MPS. Основа нашей молочной mpS производится путем сэндвичинга первичной ткани молочной железы человека (HBT) между двумя листами стволовых клеток, полученных из жировой ткани (ASC), также выделенных из HBT(рисунок 1). Плунжеры для переноса листов ячеек на сэндвич HBT могут быть напечатаны на 3D-принтере или изготовлены из простых акриловых пластиков(Рисунок 1H,I). Этот метод адаптирует наш ранее описанный подход к культивации первичной ткани белых адипоцитов человека6,7. Затем MPS молочной железы может быть засеяна моделью BC по выбору, начиная от стандартных клеточных линий BC до первичных опухолей молочной железы человека. Здесь мы показываем, что эти BC-MPS стабильны в культуре в течение нескольких недель(рисунок 2); включают нативные элементы HBT, такие как адипоциты молочной железы, ECM, эндотелий, иммунные клетки(рисунок 3); и резюмировать физиологические взаимодействия между БК и ГБТ, такие как метаболические перекрестные помехи(рисунок 4). Наконец, мы показываем, что BC-MPS позволяет изучать амебоидное движение клеток BC по всему HBT(рисунок 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все человеческие ткани были собраны в соответствии с протоколом #9189 утвержденным Офисом Институционального наблюдательного совета LSUHSC.

1. Посев стволовых клеток, полученных из жировой основе (ИСК), для клеточных листов

  1. Покупайте ИСС из коммерческих источников или изолируйте из первичной ткани молочной железы человека, следуя установленным протоколам8,9. Посейте ИСС молочной железы человека с плотностью 70% (~ 80 000 клеток / см2 площади поверхности) на 6-скважинные стандартные пластины для культивации тканей в модифицированной орлиной среде Dulbecco (DMEM), дополненной 10% фетальной бычий сывороткой и 1% пенициллином / стрептомицином (BC-MPS Media). Убедитесь, что ИКС, используемые для формирования листов ячеек, должны быть меньше прохода 10.
    1. Для каждого колодца микрофизиологической системы рака молочной железы (BC-MPS), который будет генерироваться, семена клеток в 1 стандартной тканевой культуре колодца и 1 скважине аналогичного размера на поли(N-изопропилакриламид) (pNIPAAm) с покрытием тканевой культуры пластиковой пластины. Для одной 6-скважинной пластины BC-MPS потребуется одна стандартная тканевая культура, 6-скважинная пластина (нижняя) и одна пластина с покрытием pNIPAAm (сверху). Пластины pNIPAAm можно приобрести из коммерческих источников или с покрытием в лаборатории10,11,12.
  2. Культивирование ИСК в тканевом культуре инкубатора при 37°С и 5%СО2. Меняйте носитель каждые 2-3 дня в шкафу биобезопасности.
  3. Культивируйте ИСК до тех пор, пока они не станут на 100% слиненными и не образуют полосатый рисунок. В зависимости от слияния, при котором они были посеяны, на это уйдет 7-10 дней. Листы слиющеных клеток необходимы для закрепления плавучих жировой ткани молочной железы.

2. Подготовка материалов, необходимых для BC-MPS

  1. Для приготовления желатина для 6-скважинных пластин делают 12% раствор желатина в дистиллированномH2O. Смешайте 19 г желатина типа B (прочность геля ~225 Bloom) и 125 млH2O в стеклянной среде 250 мл. Добавьте 1,6 мл 1 М NaOH в раствор для нейтрализации рН.
  2. Автоклав раствора под жидким циклом в течение 25 мин для стерилизации раствора.
  3. Дайте раствору остыть до 37 °C. В шкаф стерильной биобезопасности добавляют 16 мл стерильного 10x сбалансированного солевого раствора Хэнкса (HBSS) в раствор для получения конечного объема 160 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Желатиновый раствор можно использовать сразу или хранить при комнатной температуре для последующего использования. Приготовленный желатин стабилен при комнатной температуре в течение 1 месяца. Если потребуется всего несколько плунжеров, то раствор 10 мл может быть изготовлен и стерильно отфильтрован в тот же день, что и изготовление BC-MPS, как описаноранее 7.
    1. Для приготовления желатинового раствора путем фильтрации стерилизации разводят 1 мл 10x HBSS с 9 млH2O, чтобы сделать 1x раствор HBSS в конической трубке 15 мл. Добавьте 100 мкл 1 М NaOH к каждой пробирке 10 мл, а затем добавьте 0,7 г желатина в раствор. Энергично перемешайте раствор, чтобы растворить желатин.
    2. Высиживайте трубку на водяной бане при 75 °C в течение 20 минут, встряхивая каждые 5 минут. Используйте шприц 10 мл и шприц-фильтр 0,22 мкм для фильтрации желатинового раствора. Отфильтруйте желатиновый раствор непосредственно на плунжерах в шкафу биобезопасности.
  4. 3D-печать или использование простого акрила для изготовления плунжеров, используемых для переноса листов ячеек. Убедитесь, что плунжеры свободно вписываются в нужный размер колодца. Стандартный 3D-печатный плунжер показан на рисунке 1. Плунжеры могут быть спроектированы с использованием стандартного программного обеспечения для автоматизированного проектирования, такого как TinkerCad, и напечатаны с использованием 3D-принтеров с нитью, совместимых с полимолочной кислотой (PLA)13,14.
  5. Для подготовки стойки для удержания плунжеров поместите трубчатую стойку на 15 мл в шкаф биобезопасности. Поместите плунжеры вверх ногами в стойку так, чтобы нижняя часть плунжеров была обращена вверх. Поместите пластиковую коробку с крышкой для транспортировки BC-MPS в шкаф биобезопасности. Рекомендуется, чтобы коробка была не менее 35,5 см длиной x 28 см шириной x 8,25 см высотой, чтобы поместиться 4 пластины BC-MPS. Снимите крышку с коробки и распылите вниз стойку, плунжеры и коробку с 70% EtOH.
  6. Подготовьте стерильные бритвенные лезвия и щипцы путем автоклавирования или путем помещения их в шкаф биобезопасности и промывки 70% EtOH.
  7. Распылите плунжеры и коробку с 70% EtOH и включите ультрафиолетовый свет в шкафу биобезопасности не менее чем на 30 минут, чтобы стерилизовать расходные материалы.

3. Подготовьте желатиновые плунжеры и нанесите на верхние листы клеток

  1. Если желатиновый раствор был предварительно приготовлен, нагрейте его на водяной бане при температуре 37°С, чтобы растопить.
  2. Пипетка желатиновым раствором на плунжеры в шкафу биобезопасности с помощью серологической пипетки 5 или 10 мл. Плунжер на 1 скважину из 6-ю скважинной пластины потребует ~2,5 мл желатина.
  3. После того, как желатин затвердеет на плунжерах (~30-45 мин), переместите пластины ASC с покрытием pNIPAAm в шкаф биобезопасности. Аккуратно поместите плунжеры в колодцы пластин ASC с покрытием pNIPAAm так, чтобы желатин контактировал с ИСС. Поместите металлическую шайбу (~7,5 г) на плунжер, чтобы утяжелеть плунжер так, чтобы желатин находился в непосредственном контакте с листом ячейки ASC. Оставьте плунжеры на листах ячейки ASC при комнатной температуре на 30 мин.
  4. Осторожно переместите пластину с плунжерами в стерильную коробку в шкафу биобезопасности и поместите на нее крышку. Переместите коробку в холодильник с 4 °C на 30 минут. Если холодильник с 4 °C недоступен, поместите тарелку на лед в ведро со льдом в шкаф биобезопасности на 30 минут.

4. Подготовка линий раковых клеток

  1. Засейте линии раковых клеток в стандартную чашку для культуры тканей T75 и храните их в культуре, чтобы они были ~ 80% сливаться в день обработки BC-MPS. (~ 200 000 раковых клеток потребуется на BC-MPS). Выращивайте раковые клетки в нормальных средах.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для идентификации и изоляции раковых клеток рекомендуется, чтобы клетки были трансфекционными флуоресцентными белками, чтобы отличить их от ИСС и ткани молочной железы. Количество раковых клеток, необходимых для BC-MPS, было оптимизировано для клеток MCF7 и MDA-MB-231. Другие клеточные линии могут потребовать дальнейшей оптимизации.
  2. В день подготовки BC-MPS переместите колбу, содержащую раковые клетки, в кабинет биобезопасности. Аспирировать мочку из колбы. Промыть колбу 5 мл PBS.
  3. Добавьте 1 мл раствора клеточного отслоения в колбу, содержащую раковые клетки, а затем инкубируют колбу в инкубаторе с 37 °C до тех пор, пока клетки не отделятся (~2-5 мин).
  4. В шкафу биобезопасности добавляют 9 мл PBS в колбу, переносят клетки pBS в коническую трубку 15 мл и подсчитывают номер клеток с помощью гемоцитометра.
  5. Центрифугируют раковые клетки при 500 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
  6. Повторно суспендируют ячейки в среде BC-MPS таким образом, чтобы было 2 x 106 ячеек / мл.
  7. Поместите раковые клетки в водяную баню с 37 °C, пока они не будут готовы к добавлению в ткани человека.

5. Обработка тканей молочной железы человека

  1. В шкафу биобезопасности промыть ткань молочной железы человека (HBT) 3x с 10 мл стерильного PBS.
  2. Используйте стерильные щипцы и лезвие бритвы, чтобы грубо измерзть BC-MPS и попытаться удалить как можно больше фасций и соединительной ткани. Неспособность удалить соединительную ткань может привести к тому, что верхний слой ASC не будет должным образом закреплять HBT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фасция и соединительная ткань могут быть идентифицированы по ее белому или прозрачному внешнему виду по сравнению с желтым цветом жировой ткани.
  3. После того, как соединительная ткань была удалена, используйте стерильное лезвие бритвы, чтобы мелко измечить ткань, пока она не обреаст однородную жидкую консистенцию. Ткань тонко изменяется, когда ее можно легко пипетить с помощью серологического наконечника 25 мл.
  4. Используйте стерильное лезвие бритвы, чтобы отрезать наконечник от наконечника пипетки p1000, чтобы помочь в пипетке измельченного HBT.
  5. В пробирке 1,5 мл смешайте измельченный HBT, линии раковых клеток и жиму BC-MPS (для 1 скважины из 6-й пластины для этого требуется 200 мкл измельченного HBT, 100 мкл среды BC-MPS и 100 мкл раковых клеток).
  6. Переместите пластину ASC, которая будет использоваться для нижнего листа ячейки, из инкубатора в шкаф биобезопасности. Аспирировать носитель с нижней пластины ASC. Пипетка смеси на центр колодца нижней пластины ASC с помощью наконечника пипетки p1000, у которого дистальный конец был отрезан от шага 5.4
  7. Переместите коробку, содержащую верхнюю пластину ASC с плунжерами на ней, в шкаф биобезопасности. Аккуратно снимите желатиновые плунжеры с пластины, покрытой pNIPAAm, и поместите поверх смеси HBT. Добавьте в скважину носитель BC-MPS (на 1 скважину из 6-скважинной пластины добавьте 2 мл среды). Осторожно переместите нижние пластины ASC со смесью BC-MPS и плунжерами в стерильную пластиковую коробку и поместите крышку коробки для транспортировки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Крышка пластины с 6 скважинами не будет помещаться обратно на пластину ASC, пока плунжеры включены. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать заражения культуры.
  8. Инкубируют нижнюю пластину в коробке в инкубаторе при 37°С до тех пор, пока желатин не расплавится, а верхний слой ASC не начнет прилипать к нижнему слою (~30 мин).
  9. Переместите коробку с пластинами в шкаф биобезопасности. Аккуратно снимите плунжеры с нижних пластин. Ткань с раковыми клетками будет закреплена на дне колодца.
  10. Поместите крышку 6-скважинной пластины обратно на нижнюю пластину и инкубировать при 37 °C, чтобы полностью расплавить желатин и позволить верхнему слою полностью закрепиться на нижнем слое (~ 30-60 мин).
  11. Аккуратно переместите пластины в шкаф биобезопасности и аспирируйте жиме серологической пипеткой 10 мл. Добавьте 2 мл свежих сред в каждую скважину. Аспирировать от края колодца и пипетку на край колодца, чтобы избежать смещения ткани.
  12. Поддерживайте BC-MPS при 37 °C и 5% CO 2 в течение желаемого периодавремени и меняйте носитель каждые 2-3 дня.

6. Переваривание BC-MPS для анализа

  1. Когда BC-MPS будет готов к анализу, переместите пластину в шкаф биобезопасности. Удалите жижи серологической пипеткой, чтобы избежать случайного смещения любой ткани.
  2. Добавьте 1 объем PBS к каждой скважине.
  3. Снимите PBS серологической пипеткой.
  4. Добавьте 1 мл раствора для диссоциации клеток в каждую скважину. Переместите пластину обратно в инкубатор и инкубировать при 37 °C в течение 5 минут, чтобы клетки отсоегорели. В шкафу биобезопасности используйте клеточный скребок, чтобы полностью отсоедить клетки и ткани от культуральная пластина.
  5. Переложите раствор с тканью в коническую трубку 15 мл с помощью серологической пипетки. Добавьте 2 мл PBS в каждую скважину, чтобы собрать оставшиеся ячейки и перенести этот раствор в коническую трубку. Если ячейки флуоресцентные, оберните трубку алюминиевой фольгой, чтобы защитить ее от света.
  6. Инкубируют трубку при 37 °C при постоянном перемешивании в орбитальном шейкере при 1 х г в течение 10-20 мин, чтобы полностью диссоциировать клетки из ткани.
  7. В шкафу биобезопасности используйте серологическую пипетку, чтобы разрушить любые оставшиеся скопления клеток в пробирке и отфильтровать образец через тканевой сетчатый фильтр 250 мкм в новую пробирку 15 мл. Пипетку раствора медленно пробирают через ситечко, чтобы он не переполнился.
  8. Промойте ситечко 1 мл PBS, чтобы собрать все клетки, все еще наблюдав в ситечке.
  9. Центрифугировать образцы при 500 х г при комнатной температуре в течение 5 мин. После центрифугирования адипоциты будут плавать на верхнем слое раствора, в то время как раковые клетки и ИСС будут смешаны вместе в грануле в нижней части трубки.
  10. Для выделения адипоцитов аккуратно перелейте верхний слой в новую трубку или альтернативно отрежьте наконечник пипетки p1000 и перенесите верхний слой в новую трубку. Центрифугируйте образец при 500 х г в течение 5 мин еще раз и используйте шприц и иглу для удаления раствора из-под адипоцитов так, чтобы остались только адипоциты. Адипоциты теперь готовы к анализу
  11. После удаления адипоцитов из раствора отделите ИСС и раковые клетки друг от друга для анализа, если раковые клетки ранее были трансфектированы флуоресцентным белком. Аспирировать оставшийся раствор из трубки, содержащей ИСК и раковые клетки, не нарушая клеточную гранулу. Повторно суспендируйте гранулы в среде PBS или BC-MPS и используйте проточную цитометрию для сортировки клеток на основе флуоресценции.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Стабильность в культуре
BC-MPS представляет собой стабильную микрофизиологическую систему, которую можно культивировать in vitro в течение не менее 14 дней. Яркое изображение листов ячейки ASC было сделано с 100-кратным увеличением для отображения полосатого рисунка смежного листа(рисунок 2A). Листы клеток ASC стабильны в культуре в течение не менее 4 недель. BC-MPS через 14 дней в культуре в одной скважине из 6 скважин пластины был сфотозирован цветной камерой, демонстрирующей, что плавучий HBT все еще стабильно закреплен листами клеток ASC на дне скважины через 14 дней(рисунок 2B). Это показывает, что клеточный лист, используемый для сэндвича жировой ткани, все еще неповрежден. Тройную отрицательную клеточную линию BC MDA-MB-231, экспрессирующую RFP, культивировали в HBT в течение 14 дней, а затем визуалировали с помощью флуоресцентного микроскопа, демонстрирующего стабильность BC-MPS с клеточными линиями до, по крайней мере, 14дней (рисунок 2C). Наличие клеток BC в ткани демонстрирует способность раковых клеток вторгаться в HBT. Тройной отрицательный ЭКСПЛАНТ PDX был иссечен с мыши, окрашен клеточным трекером CMTPX и культивирован HBT. Флуоресцентные микроскопические снимки были сделаны на 6-й день, чтобы показать стабильность BC-MPS с опухолевыми эксплантами в течение не менее 6 дней(рисунок 2D). Это демонстрирует, что BC-MPS может быть использован для культивировании опухолевых эксплантов с HBT, а также клеточных линий.

Собственные элементы HBT
BC-MPS содержит нативные элементы HBT в культуре. BC-MPS, содержащие 100 мг HBT, культивировали in vitro в течение 14 дней. Ткань была изображена с помощью микроскопии Brightfield через 14 дней в культуре(рисунок 3A). Это изображение демонстрирует сохранение кластеров зрелых адипоцитов через 14 дней в культуре. Затем ткань фиксировали 10% формалином, парафином, срезали на 5 мкм с помощью микротома, а затем окрашивали пентахромным окрашиванием Movats с использованием стандартного протокола. Фиксированные участки были сфотированы в 100x(рисунок 3B)или 20x(рисунок 3C). Изображения демонстрируют, что BC-MPS содержит нативный коллаген (фиолетовый), ретикулярные волокна (синий), а адипоциты большой унилокулярной формы между соединительной тканью сохраняются через 14 дней в культуре. Чтобы идентифицировать первичные макрофаги в системе, HBT культивировали в течение 0, 3 и 7 дней, а затем фиксировали и окрашивали анти-CD45, анти-CD68 и анти-CD206. CD45 использовался в качестве общего идентификатора лейкоцитов. CD68 использовался в качестве моноцитарного пятна для идентификации макрофагов, в то время как CD206 идентифицирует общий рецептор, присутствующий на макрофагах. Окрашивание маркеров макрофагов было количественно определено с помощью программного обеспечения для визуализации(рисунок 3D). Это демонстрирует сохранение первичных макрофагов через 3 и 7 дней в культуре. Эти данные демонстрируют, что BC-MPS сохраняет нативные элементы HBT в культуре. Дальнейшие эксперименты могут быть проведены для изучения того, как клетки BC реконструируют нативные элементы HBT. Это может включать оценку изменений в маркерах макрофагов, чтобы определить, изменяются ли они присутствием клеток BC. Изменения в ECM могут быть дополнительно проанализированы путем сравнения пентахромного окрашивания Movats образцов, которые были культивированы с клетками BC или без них, чтобы определить, изменяется ли содержание коллагена, и размер адипоцитов можно сравнить с использованием программного обеспечения для анализа изображений, такого как Image J, чтобы определить, изменяют ли клетки BC размер адипоцитов.

Метаболические перекрестные помехи
Метаболические перекрестные помехи между адипоцитарным раком является важным путем, посредством которого микроокружение опухоли влияет на прогрессирование БК. Клетки БК, которые накапливают внутриклеточные липиды, демонстрируют повышенную лекарственную устойчивость и более инвазивный фенотип15. В то время как было показано, что клетки BC индуцируют липолиз в незрелых, мышиных адипоцитах, физиологическая значимость этого остается неясной, потому что метаболические перекрестные помехи между BC и первичными адипоцитами молочной железы человека никогда не были показаны. Чтобы продемонстрировать, что BC-MPS может моделировать этот метаболический адипоцит-BC, меченые RFP клетки MDA-MB-231 культивировали отдельно или в BC-MPS в течение 14 дней. Клетки ферментарно переваривали в одноклеточную суспензию, окрашивали нейтральным липидным красителем Бодипи и анализировали с помощью проточной цитометрии(Рисунок 4А,В)16. Доля липид-положительных клеток MDA-MB-231 была в 26,2 раза больше sEM +/- 2,5 в BC-MPS по сравнению с 2D культурой(рисунок 4C). Это увеличение липидного окрашивания демонстрирует, что раковые клетки взаимодействуют с адипоцитами и поглотывают липиды, высвобождаемые из зрелых адипоцитов. Сортировка ячеек была выполнена для выбора ячеек RFP+ Bodipy+. После сортировки клетки были покрыты коллагеном, покрыты стеклянными крышками и допущены к прикреплению на ночь. На следующий день клетки фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 30 мин, а затем визуалировали на флуоресцентный микроскоп с 100-кратным увеличением. Клетки, культивируемые в BC-MP(рисунок 4E),демонстрировали повышенное количество липидных капель по сравнению с клетками, культивируемыми в стандартной 2D-культуре(рисунок 4D). Это демонстрирует метаболические перекрестные помехи между клетками BC и HBT, а также показывает, как накопление липидов может быть проанализировано с помощью проточной цитометрии или флуоресцентной микроскопии. Дальнейший анализ накопления липидов в раковых клетках может быть выполнен путем количественной оценки размера липидных капель и количества липидных капель на клетку.

Амебоидное движение
Метаболический перекрестный разговор между клетками BC и адипоцитами увеличивает инвазивную способность рака. Чтобы оценить повышенную инвазивную способность раковых клеток, культивируемых с помощью HBT, миграция клеток BC по всему HBT была оценена с помощью флуоресцентной микроскопии. Метастатическую клеточную линию TNBC MDA-MB-231, экспрессизирующую RPF, культивировали в BC-MPS в течение 4 дней, чтобы позволить системе стабилизироваться. Покадровая флуоресцентная микроскопия была выполнена через 4 дня для получения изображения подвижности MDA-MB-231 с одним изображением, отбираемым каждые 20 мин в течение 19 ч при 37 °C и 5% CO2. Полученное видео продемонстрировало паттерны движения амебоидов и удивительно высокую степень подвижности для клеток MDA-MB-231(рисунок 5 и видео 1). Это демонстрирует увеличение инвазивной способности клеток BC и способности клеток BC вторгаться в HBT. Миграция клеток БК в ГБТ может быть дополнительно проанализирована с использованием ранее опубликованных методов количественной оценки скорости и направленности мигрирующих клеток17,18. Также наблюдалось, что клетки MDA-MB-231 подвергаются митозу. Это поведение согласуется с его агрессивным фенотипом, является важным поведением для прогрессирования рака и метастазирования и подчеркивает новое поведение BC, которое может быть нацелено на терапию BC.

Figure 1
Рисунок 1:Общий рабочий процесс настройки BC-MPS. (A) Желатин затвердевает в вертикальном плунжере. (B) Плунжер с желатином помещается на термоотзывчивый верхний лист ячейки ASC. (C) Вес используется для принуждения желатина поддерживать контакт с клеточным листом, в то время как клетки инкубируются при комнатной температуре в течение 30 мин с последующей инкубацией при 4 °C в течение 30 мин. (D) Поршень удаляют из холодной чашки, удаляя с собой неповрежденный клеточный лист. (E)Плунжер с верхним листом ячейки переносится в чашку, содержащую нижний лист ячейки и измельченные ячейки HBT и BC. (F)Нижняя клеточная чашка со средой, плунжером, HBT, BC и обоими клеточными листами инкубируют при 37 °C в течение 30-60 мин, чтобы желатин расплавился, а клеточные листы - от контактов. (G)Удаление плунжера оставляет HBT и BC зажатыми между двумя листами ячейки ASC. 3D-печатный плунжер был разработан с использованием бесплатного онлайн-программного обеспечения TinkerCad (https://www.tinkercad.com/) и напечатан на 3D-принтере. Плунжер состоит из полимолочной кислоты. (H)Указаны размеры плунжера для 1 скважины 6-скважинной плиты. Углубление плунжера составляет 2,5 мм. (I) Показано изображение фактического 3D-печатного плунжера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2:Репрезентативная стабильность BC-MPS в культуре. (A) Яркое изображение поля при 100-кратном увеличении слиющихся ИСС, демонстрирующее полосатый рисунок слиющихся клеток. Шкала bar = 100 мкм.(B)BC-MPS, содержащая 100 мг HBT, культивировалась в 6-скважинной пластине. Через 14 дней была сделана цветная фотография, чтобы продемонстрировать, что HBT закреплен на дне скважины плиты из 6 скважин. (C) Тройная отрицательная клеточная линия BC MDA-MB-231, экспрессирующая RFP, культивировалась с HBT в течение 14 дней, а затем визуализирована с использованием флуоресцентной микроскопии с 40-кратным увеличением. Изображения демонстрируют, что клетки MDA-MB-231 все еще жизнеспособны и растут в HBT. Шкала бар = 200 мкм D) PDX Опухоли тройного негативного рака молочной железы у мышей были измельчены на 3 см2 штуки и помечены Cell Tracker Red CMPTX. Кусочки культивировали в HBT, и полученный BC-MPS был визуализирован с использованием флуоресцентного микроскопа с 40-кратным увеличением на 6-й день, демонстрируя его стабильность в культуре. Шкала = 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3:Репрезентативное сохранение нативных элементов HBT, присутствующих в BC-MPS. BC-MPS культивировали в течение 14 дней, а затем либо визуалировали с помощью яркой полевой микроскопии в 40x(A),а затем фиксировали 10% формалином и окрашивали пентахромным окрашиванием Movats. Снимки были сделаны в 100x(B)или 20x(C). Визуализация HBT указывает на сохранение крупных унилокуляторных адипоцитов, сгруппированных вместе, а срезы тканей указывают на наличие сохранения нативного ECM, такого как коллаген (желтый) и ретикулярные волокна между адипоцитами (синий). Для демонстрации сохранности макрофагов в модели HBT культивировали в течение 0, 3 или 7 дней, окрашивали под маркеры макрофагов и визуалировали с помощью конфокальной микроскопии(D). Флуоресцентная интенсивность окрашивания маркеров макрофагов была количественно определена с использованием коммерчески доступного программного обеспечения, демонстрирующего, что макрофаги все еще присутствуют в ткани после 3 и 7 дней в культуре. Шкала = 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4:Репрезентативные метаболические перекрестные помехи между адипоцитами и раковыми клетками в BC-MPS. Меченые RFP клетки MDA-MB-231 культивировали в BC-MPS против 2D в течение 14 дней, затем окрашивали Бодипи (250 нМ) и анализировали с помощью проточной цитометрии. (A) Поток окрашенных Бодипи MDA-MB-231 клеток через 14 дней в 2D-культуре. Ячейки в B2 были Bodipy+RFP+; ячейки в B1 были Bodipy-RFP+. B2/(B1+B2) = 3,26%, что указывает на минимальное накопление липидов. (B) Анализ проточной цитометрии окрашенных Бодипи MDA-MB-231 клеток через 14 дней в BC-MPS. B2/(B1+B2) = 85,35%, что указывает на обширное накопление липидов. (C) Накопление липидов в клетках MDA-MB-231 через 14 дней в 2D-культуре по сравнению с BC-MPS. Флуоресцентный микроскопический анализ окрашивания Бодипи MDA-MB-231, культивированного в 2D(D)против BC-MPS(E),демонстрирует повышенное накопление липидов в клетках, выращенных в BC-MPS. Полосы ошибок указывали SEM. ** p < 0,01, n = 2 биологических репликата, шкала = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5:Репрезентативная миграция TNBC в BC-MPS. Меченые RFP клетки MDA-MB-231 культивировали в BC-MPS в течение 4 дней, а затем последовательные покадровые изображения клеток BC-MPS + MDA-MB-231 с мечеными RFP были захвачены с помощью флуоресцентного микроскопа (один кадр на 60 минут, 100-кратное увеличение). Желтые звездочки = митотическое событие. Желтая рамка = клеточный мусор, используемый для позиционного ориентира. Синие стрелки = 231 клетка, показывающая амебоидное движение с псевдоподами и высокую подвижность. Шкала = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Видео 1: Репрезентативная миграция TNBC в BC-MPS. BC-MPS, содержащие меченые RFP клетки MDA-MB-231, культивировали в течение 4 дней, а флуоресцентную микроскопию использовали для изображения клеток каждые 20 мин через 19 часов при 37 °C и 5% CO2. Изображения были скомпилированы в видео (один кадр на 60 минут, 100-кратное увеличение). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Новые системы моделирования рака молочной железы человека необходимы для лучшего понимания заболевания. Разработка микрофизиологических систем человека для моделирования условий заболевания, которые включают нативные ECM и стромальные клетки, увеличит прогностическую силу доклинических исследований. Представленная здесь модель BC-MPS представляет собой недавно разработанную систему, которая преодолевает ограничения предыдущих моделей, позволяет оценить BC в своей родной среде HBT. Эта система может использоваться с линиями раковых клеток или с опухолевыми эксплантами и стабилен в течение не менее 14 дней. Флуоресцентная маркировка клеток BC позволяет в режиме реального времени контролировать подвижность раковых клеток и взаимодействие клеток с клетками, миграцию, жизнеспособность или пролиферацию либо в режиме реального времени, либо в определенные моменты времени(рисунок 3 и рисунок 5). Эта модельная система может быть использована для выяснения важных аспектов биологии рака, поскольку она связана с взаимодействиями между раковыми клетками и их микросредой. Опрос этой системы может информировать о регуляции TME прогрессирования рака, лекарственном ответе и инициировании метастазирования.

Чтобы успешно настроить систему, необходимо выполнить несколько важных шагов. Первым критическим этапом является культивирование и перенос листов ячеек ASC. Пластины с покрытием pNIPAAm чувствительны к температуре. Когда пластины выше 32 ° C, поверхность гидрофобна, и ИСС будут прилипать к поверхности. Поверхность станет гидрофильной ниже этой температуры и клетки начнут отсоедатьсяна 19. Таким образом, необходимо определить, как быстро данный тип клеток начнет отсоединичать от этих поверхностей. Для ИСК, полученных из HBT, это займет > 30 минут, если клетки сливаются. Чтобы предотвратить отсоединение клеток во время нормального технического обслуживания, среда должна быть предварительно нагрета до 37 ° C, а пластины для культивирования тканей не должны храниться при комнатной температуре слишком долго, чтобы предотвратить охлаждение пластин и отсоединение клеток. Также важно определить оптимальное время для того, чтобы желатиновые плунжеры были на пластинах с покрытием pNIPAAm для переноса всего клеточного листа. ИКС должны быть слижены, и весь лист должен быть перенесен. Если верхний лист ячейки не успевает полностью отсоедиться и связаться с желатином, то клеточный лист будет сломан во время переноса. Если весь клеточный лист не переносится полностью, то ИСС не смогут сэндвичировать плавучую ткань молочной железы.

ИСС, используемые для сэндвича HBT, представляют собой нормальные стромальные клетки микроокружения молочной железы, которые секретируют ECM, факторы роста и цитокины, которые влияют на BC20. Чтобы сэндвич HBT между двумя клеточными листами, листы ASC переносятся с использованием термореактивных пластин для культивирование тканей. Это позволяет нативному ECM, секретируемым ASC, быть неповрежденным и служит для закрепления плавучих адипоцитов в ткани. Использование ИСС, полученных из ткани молочной железы человека, гарантирует, что взаимодействия, которые ИСС имеют с раковыми клетками, будут имитировать то, что происходит при раке молочной железы, поскольку ИСС из разных депо демонстрируют разную экспрессию генов и ремоделирование ECM21.

Вторым критическим этапом является обработка HBT. Необходимо использовать свежеизолированный HBT для сохранения жизнеспособности тканей. При обработке HBT очень важно мелко измертить ткань и удалить как можно больше фасций. Если в HBT остаются большие куски фасции, это помешает клеточным листам правильно закрепить плавучую ткань. Кроме того, фасция, оставленная в ткани, может диссоциировать от пластины, и она будет тянуть за ней несколько кластеров HBT, делая скважину непригодной для дальнейших экспериментов. HBT должен быть помещен в середину колодца перед добавлением верхнего клеточного листа, иначе ASC не смогут адекватно сэндвичировать HBT, а ткань на краю колодцев не будет закреплена. Если эти критические шаги соблюдаются, то процесс создания BC-MPS является простым для настройки.

Модель, подробно описанная здесь, представляет собой улучшенную систему для изучения БК в ее естественном микроокружении первичного HBT, которая сохраняет зрелые адипоциты, ECM и резидентные иммунные клетки(рисунок 4). Доклинические модели, которые имитируют жировую микросреду, не имеют нескольких элементов микросреды, таких как зрелые адипоциты, иммунные клетки, фибробласты и ECM. Использование полностью зрелого HBT позволяет одновременно и взаимно опрашивать эту сложную среду, которая включает в себя множество элементов, которые влияют на развитие рака, лекарственную реакцию и инвазивность через паракринную и юкстакринную сигнализацию22,23,24,25. Резидентные фибробласты и ИСС влияют на метастазирование рака путем ремоделирования ECM в ткани и через паракринные сигналы26,27. ECM и его ремоделирование необходимы для инициирования метастазирования. Изменения в ECM микроокружения опухоли влияют на миграцию и метастазирование BC, но большинство исследований BC не включают нативный ECM в свои исследования и вместо этого используют упрощенные модели, состоящие из коллагена I или матригеля28,29. ECM в BC-MPS происходит от HBT и от ASC. Таким образом, можно изучить способ, которым нативный ECM реконструируется в микроокружении опухоли в ткани молочной железы и влияет на метастазирование. Таким образом, эта модель BC-MPS включает в себя несколько элементов микроокружения опухоли, которых не было в предыдущих модельных системах.

Эта модель может быть использована для изучения метаболических перекрестных помех между полностью зрелыми адипоцитами и клетками BC. Предыдущие модели, изучающие взаимодействие между адипоцитами и раковыми клетками, используют преадипоциты, которые дифференцируются in vitro. Преадипоциты, дифференцированные in vitro, не полностью созревают в той же степени, что и адипоциты, дифференцированные in vivo30,31. Чтобы понять, как адипоциты влияют на прогрессирование рака и реакцию на лекарства, жизненно важно правильно имитировать сложный молекулярный и химический состав нативных адипоцитов. Здесь мы продемонстрировали, что наша система позволяет оценивать метаболические перекрестные помехи, которые происходят между адипоцитами и клетками BC(рисунок 4).

BC-MPS также может быть использован при проведении исследования in vitro о том, как такие состояния, как ожирение, которые не могут быть должным образом смоделировано с использованием стандартных клеточных линий, влияют на прогрессирование рака. Ожирение связано с изменением микросреды HBT и увеличением метастазирования в БК, хотя точные механизмы до конца не изучены32,33,34. Фибробласты, ИСС, адипоциты и ECM изменяются во время ожирения и в дальнейшем способствуют прогрессированию и метастазированию рака25,35,36. Таким образом, важно использовать нативные стромальные клетки и ECM из ткани ожирения, чтобы понять, как эти изменения в стромальных клетках и ECM влияют на BC. Используя HBT и ASC от пациентов с ожирением или худощавостью в модели BC-MPS, можно выяснить механизмы, с помощью которых ожирение способствует метастатическому фенотипу.

Метод, представленный здесь, предназначен для культивирования клеток рака молочной железы в культуре, которая охватывает ИСС, зрелые адипоциты и нативный ECM. Предыдущие модели кокультурных систем изучали, как эти отдельные различные элементы стромальной среды влияют на рак. Поскольку ИСС и адипоциты влияют на прогрессирование БК, может быть сложно определить, какой тип клеток отвечает за влияние на БК. Однако это можно определить, сравняв BC-MPS с более простыми моделями кокультур с одним типом клеток. Одним из преимуществ этой системы по сравнению с системами на кристалле или биопечатью является то, что для настройки системы не требуется специального оборудования за пределами пластин с покрытием pNIPAAm, которые являются коммерчески доступными. Модельные системы ткани молочной железы были ранее описаны с использованием биопечати для осаждения ИСС в каркасы, которые затем дифференцируются в культуре22. Это требует дополнительных 2-3 недель для дифференцировки клеток, а ASC, дифференцированные в культуре, не полностью дифференцируются в зрелые адипоциты. Зрелые адипоциты из HBT в BC-MPS готовы к использованию в тот момент, когда они удалены у пациента.

Модельная система, описанная здесь, является полезной системой для изучения перекрестных помех между раковыми клетками и микросредой, однако она имеет некоторые ограничения. Одним из основных ограничений является наличие первичной ткани молочной железы человека. Жировая ткань человека не может быть криоконсервирована без потери жизнеспособности, и поэтому ткань, используемая для изготовления BC-MPS, должна быть недавно получена и использована37. Другим ограничением является то, что модель, представленная здесь, представляет собой статическую систему, которая культивируется в обычных 6 плитах скважины. Системе не хватает микрофлюидного потока, который присутствует в органах на чипе, который может влиять на доступность кислорода и питательных веществ, явную стресс и распределение лекарств38,39. Третьим ограничением является необходимость отделения клеток друг от друга в конце эксперимента, если различные типы клеток необходимо анализировать индивидуально. Это требует необходимости маркировки клеток, чтобы их можно было отделить друг от друга.

Включение многих элементов микроокружения опухоли создает физиологическую модель для изучения прогрессирования рака и начала метастазирования. В дополнение к возможности изучения раковых клеток в более физиологической модели, BC-MPS также может быть использован для изучения отдельных элементов микросреды и того, как на них влияет рак. В то время как данные, представленные здесь, демонстрируют, как BC-MPS может использоваться с одной клеточной линией, BC-MPS может быть легко адаптирован в соответствии с конкретными экспериментальными потребностями исследователя. Например, тучный HBT можно сравнить с постным HBT, чтобы определить, как ожирение влияет на метастазирование и прогрессирование рака. Различные подтипы BC могут быть посеяны в BC-MPS для изучения того, как подтипы рака по-разному взаимодействуют с микросредой. Методы редактирования генов могут быть использованы для определения того, как конкретные гены влияют на взаимодействие между БК и микросредой. Эта модель и ее приложения позволят более точно понять, как стромальная среда и рак молочной железы взаимодействуют, способствуя прогрессированию рака и метастазированию.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить Tulane Flow Cytometry and Cell Sorting Core, а также Tulane Histology Core за их техническую поддержку. Эта работа была поддержана исследовательским грантом Юго-восточного общества пластических и реконструктивных хирургов 2019 года и Национальным научным фондом (EPSCoR Track 2 RII, OIA 1632854).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accumax Innovative Cell Technologies 1333 Cell disassoication solution for separation of BC-MPS
Accutase Corning 25-058-CI Cell detachment solution for passaging of cells
BioStor Container 16oz National Scientific Supply Co MPCE-T016 For Transport of sterile tissue
Cell Culture 75 cm flasks Corning 430641U For culturing ASCs
Conical Tubes 15mL  ThermoScientific 339650
Curved Forceps ThermoScientific 1631T5 For maneuvering tissue while mincing 
DMEM low glucose, w/ Glutamax Gibco 10567-014 For culturing ASCs and BC-MPS
FBS Qualified Gibco 26140-079
Gelatin Sigma G9391
HBSS 10x Gibco 14185-052
NaOH Sigma 221465
Nunc UpCell 6 well plates ThermoScientific 174901 Top ASC cell sheet
PBS Gibco 10010-023
Pen/Strep 5,000U Gibco 15070-063
Petri Dish 150 cm FisherBrand FB0875714 For holding tissue while mincing 
Razor Blades VWR 55411-055 Single Edge for mincing tissue
Strainer 250um  ThermoScientific 87791 For separation of BC-MPS
Tissue Culture 6 well plates Corning 3506 Bottom ASC cell Sheet
Weights/Washers BCP Fasteners BCP672 For weighing plungers down 1/2" inner diameter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DeSantis, C. E., et al. Breast cancer statistics, 2019. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 69 (6), 438-451 (2019).
  2. NIH Categorical Spending -NIH Research Portfolio Online Reporting Tools (RePORT). , Available from: https://report.nih.gov/categorical_spending.aspx (2020).
  3. Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. Estimation of clinical trial success rates and related parameters. Biostatistics. 20 (2), 273-286 (2019).
  4. Sutherland, M. L., Fabre, K. M., Tagle, D. A. The National Institutes of Health Microphysiological Systems Program focuses on a critical challenge in the drug discovery pipeline. Stem Cell Research & Therapy. 4, Suppl 1 1 (2013).
  5. Wang, X., et al. Breast tumors educate the proteome of stromal tissue in an individualized but coordinated manner. Science Signaling. 10 (491), (2017).
  6. Lau, F. H., et al. Sandwiched white adipose tissue: A microphysiological system of primary human adipose tissue. Tissue Engineering. Part C, Methods. 24 (3), 135-145 (2018).
  7. Scahill, S. D., Hunt, M., Rogers, C. L., Lau, F. H. A microphysiologic platform for human fat: sandwiched white adipose tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e57909 (2018).
  8. Yu, G., et al. Adipogenic differentiation of adipose-derived stem cells. Adipose-Derived Stem Cells. 702, 193-200 (2011).
  9. Bunnell, B., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: Isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
  10. Ebara, M., Hoffman, J. M., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. Surface modification of microfluidic channels by UV-mediated graft polymerization of non-fouling and 'smart' polymers. Radiation Physics and Chemistry. 76 (8-9), 1409-1413 (2007).
  11. Lin, J. B., et al. Thermo-responsive poly(N-isopropylacrylamide) grafted onto microtextured poly(dimethylsiloxane) for aligned cell sheet engineering. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 99, 108-115 (2012).
  12. Turner, W. S., Sandhu, N., McCloskey, K. E. Tissue engineering: Construction of a multicellular 3D scaffold for the delivery of layered cell sheets. Journal of Visualized Experiments. (92), e51044 (2014).
  13. Tinkercad. Create 3D digital designs with online CAD. Tinkercad. , (2020).
  14. Halfter, K., Mayer, B. Bringing 3D tumor models to the clinic - predictive value for personalized medicine. Biotechnology Journal. 12 (2), (2017).
  15. Wang, Y. Y., et al. Mammary adipocytes stimulate breast cancer invasion through metabolic remodeling of tumor cells. JCI insight. 2 (4), 87489 (2017).
  16. Qiu, B., Simon, M. BODIPY 493/503 staining of neutral lipid droplets for microscopy and quantification by flow cytometry. Bio-Protocols. 6 (17), 1912 (2016).
  17. Fotos, J. S., et al. Automated time-lapse microscopy, and high-resolution tracking of cell migration. Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).
  18. Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).
  19. Akiyama, Y., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. Ultrathin poly(N-isopropylacrylamide) grafted layer on polystyrene surfaces for cell adhesion/detachment control. Langmuir: the ACS Journal of Surfaces and Colloids. 20 (13), 5506-5511 (2004).
  20. Shingyochi, Y., Orbay, H., Mizuno, H. Adipose-derived stem cells for wound repair and regeneration. Expert Opinion on Biological Therapy. 15 (9), 1285-1292 (2015).
  21. Tokunaga, M., et al. Fat depot-specific gene signature and ECM remodeling of Sca1(high) adipose-derived stem cells. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 36, 28-38 (2014).
  22. Belgodere, J. A., et al. Engineering breast cancer microenvironments and 3D bioprinting. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 66 (2018).
  23. Cao, Y. Adipocyte and lipid metabolism in cancer drug resistance. The Journal of Clinical Investigation. 129 (8), 3006-3017 (2019).
  24. Dirat, B., et al. Cancer-associated adipocytes exhibit an activated phenotype and contribute to breast cancer invasion. Cancer Research. 71 (7), 2455-2465 (2011).
  25. Druso, J. E., Fischbach, C. Biophysical properties of extracellular matrix: Linking obesity and cancer. Trends in Cancer. 4 (4), 271-273 (2018).
  26. Luo, H., Tu, G., Liu, Z., Liu, M. Cancer-associated fibroblasts: A multifaceted driver of breast cancer progression. Cancer Letters. 361 (2), 155-163 (2015).
  27. Chandler, E. M., et al. Implanted adipose progenitor cells as physicochemical regulators of breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (25), 9786-9791 (2012).
  28. Oskarsson, T. Extracellular matrix components in breast cancer progression and metastasis. The Breast. 22, 66-72 (2013).
  29. Liu, J., et al. Collagen 1A1 (COL1A1) promotes metastasis of breast cancer and is a potential therapeutic target. Discovery Medicine. 25 (139), 211-223 (2018).
  30. Ahfeldt, T., et al. Programming human pluripotent stem cells into white and brown adipocytes. Nature Cell Biology. 14 (2), 209-219 (2012).
  31. Volz, A. -C., Omengo, B., Gehrke, S., Kluger, P. J. Comparing the use of differentiated adipose-derived stem cells and mature adipocytes to model adipose tissue in vitro. Differentiation; Research in Biological Diversity. 110, 19-28 (2019).
  32. Zimta, A. A., et al. Molecular links between central obesity and breast cancer. International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5364 (2019).
  33. Bousquenaud, M., Fico, F., Solinas, G., Rüegg, C., Santamaria-Martínez, A. Obesity promotes the expansion of metastasis-initiating cells in breast cancer. Breast Cancer Research. 20 (1), 104 (2018).
  34. Robado de Lope, L., Alcíbar, O. L., Amor López, A., Hergueta-Redondo, M., Peinado, H. Tumour-adipose tissue crosstalk: fuelling tumour metastasis by extracellular vesicles. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1737), 20160485 (2018).
  35. Insua-Rodríguez, J., Oskarsson, T. The extracellular matrix in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 41-55 (2016).
  36. Sabol, R. A., et al. Leptin produced by obesity-altered adipose stem cells promotes metastasis but not tumorigenesis of triple-negative breast cancer in orthotopic xenograft and patient-derived xenograft models. Breast Cancer Research: BCR. 21 (1), 67 (2019).
  37. Cui, X. D., Gao, D. Y., Fink, B. F., Vasconez, H. C., Pu, L. L. Q. Cryopreservation of human adipose tissues. Cryobiology. 55 (3), 269-278 (2007).
  38. Skardal, A., Shupe, T., Atala, A. Organoid-on-a-chip and body-on-a-chip systems for drug screening and disease modeling. Drug Discovery Today. 21 (9), 1399-1411 (2016).
  39. Clark, A. M., Allbritton, N. L., Wells, A. Integrative microphysiological tissue systems of cancer metastasis to the liver. Seminars in Cancer Biology. , (2020).

Tags

Исследования рака Выпуск 170 Рак молочной железы микрофизиологическая система ткань молочной железы человека стволовые клетки полученные из жировой ткани первичная культура разработка лекарств метаболические перекрестные помехи
Моделирование рака молочной железы в ткани молочной железы человека с использованием микрофизиологической системы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brown, L. M., Hebert, K. L.,… More

Brown, L. M., Hebert, K. L., Gurrala, R. R., Byrne, C. E., Burow, M., Martin, E. C., Lau, F. H. Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System. J. Vis. Exp. (170), e62009, doi:10.3791/62009 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter