JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Cancer Research

Modellering af brystkræft i humant brystvæv ved hjælp af et mikrofysiologisk system

Published: April 23, 2021
doi:
10.3791/62009
, , , , , ,
1Department of Surgery,Louisiana State University Health Sciences Center, 2Department of Bioinnovation,Tulane University, 3Tulane University School of Medicine, 4Department of Biological and Agricultural Engineering,Louisiana State University, 5Department of Medicine,Tulane University School of Medicine

Summary

Denne protokol beskriver opførelsen af et in vitro mikrofysiologisk system til undersøgelse af brystkræft ved hjælp af primært humant brystvæv med off the shelf materialer.

Abstract

Brystkræft (BC) er fortsat en førende dødsårsag for kvinder. På trods af mere end 700 millioner dollars investeret i BC forskning årligt, 97% af kandidat BC narkotika mislykkes kliniske forsøg. Derfor er der brug for nye modeller for at forbedre vores forståelse af sygdommen. NIH Microphysiological Systems (MPS) programmet blev udviklet for at forbedre den kliniske oversættelse af grundlæggende videnskabelige opdagelser og lovende nye terapeutiske strategier. Her præsenterer vi en metode til at generere MPS for brystkræft (BC-MPS). Denne model tilpasser en tidligere beskrevet tilgang til dyrkning af primært humant hvidt fedtvæv (WAT) ved at klemte WAT mellem fedtbaserede stamcelleark (ASC)s. Nye aspekter af vores BC-MPS omfatter såning BC celler i ikke-syge menneskelige brystvæv (HBT), der indeholder indfødte ekstracellulære matrix, modne adipocytter, hjemmehørende fibroblaster, og immunceller; og sandwiching bc-HBT blanding mellem HBT-afledte ASC plader. Den resulterende BC-MPS er stabil i kultur ex vivo i mindst 14 dage. Dette modelsystem indeholder flere elementer af mikromiljøet, der påvirker BC, herunder adipocytter, stromale celler, immunceller og den ekstracellulære matrix. BC-MPS kan således bruges til at studere samspillet mellem BC og dets mikromiljø.

Vi demonstrerer fordelene ved vores BC-MPS ved at studere to BC adfærd kendt for at påvirke kræft progression og metastaser: 1) BC motilitet og 2) BC-HBT metabolisk krydstale. Mens BC motilitet tidligere er blevet påvist ved hjælp af intravital billeddannelse, BC-MPS giver mulighed for høj opløsning time-lapse billeddannelse ved hjælp af fluorescens mikroskopi over flere dage. Desuden, mens metabolisk krydstale tidligere blev påvist ved hjælp af BC-celler og murin præ-adipocytter differentieret i umodne adipocytter, vores BC-MPS model er det første system til at demonstrere denne krydstale mellem primære menneskelige bryst adipocytter og BC celler in vitro.

Introduction

Hvert år, mere end 40.000 amerikanske kvinder dør af brystkræft (BC)1. På trods af mere end 700 millioner dollars investeret i BC forskning årligt, 97% af kandidat BC narkotika mislykkes kliniske forsøg2,3. Nye modeller er nødvendige for at forbedre udviklingen af lægemidler pipeline og vores forståelse af BC. NIH Microphysiological (MPS) Program afgrænsede de funktioner, der kræves for banebrydende modeller til forbedring af oversættelsen af grundlæggende videnskab til klinisk succes4. Disse omfattede brugen af primære menneskelige celler eller væv, stabil i kulturen i 4 uger, og inddragelse af indfødte væv arkitektur og fysiologisk respons.

Nuværende in vitro BC modeller, såsom to-dimensionelle kultur BC cellelinjer, membran indsætte co-kultur, og tre-dimensionelle sfæroider og organoider, ikke opfylder NIH’s MPS kriterier, fordi ingen af disse opsummere indfødte brystvæv arkitektur. Når ekstracellulær matrix (ECM) tilsættes til disse systemer, anvendes bryst ECM ikke; i stedet anvendes kollagengeler og kældermembranmatrixer.

Nuværende in vivo-systemer, såsom patient afledt xenografts (PDX), ligeledes ikke opfylder NIH’s MPS kriterier, fordi murine brystvæv meget forskellig fra menneskelige bryster. Desuden er immunsystemet-BC interaktioner i stigende grad anerkendt som nøglen i tumor udvikling, men immunkompromitterede murin modeller, der anvendes til at generere PDX tumorer mangler modne T-celler, B-celler, og naturlige dræberceller. Desuden, mens PDX giver mulighed for primære brysttumorer, der skal opretholdes og udvides, den resulterende PDX tumorer er infiltreret med primære murine stromale celler og ECM5.

For at overvinde disse udfordringer, har vi udviklet en roman, ex vivo, tre-dimensionelle menneskelige bryst MPS, der opfylder NIH MPS kriterier. Grundlaget for vores bryst MPS er lavet ved sandwiching primære menneskelige brystvæv (HBT) mellem to plader af fedt-afledte stamceller (ASCs), også isoleret fra HBT (Figur 1). Stempler til overførsel af cellearkene til sandwich HBT kan 3D-printes eller laves af simpel akrylplast(Figur 1H,I). Denne teknik tilpasser vores tidligere beskrevne tilgang til dyrkning af primær humant hvidt adipocytvæv6,7. Brystet MPS kan derefter være seedet af en BC model valg, lige fra standard BC cellelinjer til primære menneskelige bryst tumorer. Her viser vi, at disse BC-MPS er stabile i kulturen i flere uger (figur 2); omfatter indfødte elementer af HBT, såsom bryst adipocytter, ECM, endotel, immunceller(figur 3); og opsummere de fysiologiske interaktioner mellem BC og HBT, såsom metabolisk krydstale (figur 4). Endelig viser vi, at BC-MPS giver mulighed for undersøgelse af amoeboid bevægelse af BC celler i hele HBT (Figur 5).

Protocol

Alle humane væv blev indsamlet i overensstemmelse med protokol #9189 som godkendt af LSUHSC’s institutionelle undersøgelseskommission. 1. Såning af fedtbaserede stamceller (ASC’ er) til celleark Køb ASC’er fra kommercielle kilder , eller isoler fra det primære humane brystvæv ved at følge de etablerede protokol8,9. Frø humane bryst ASCs ved 70% tæthed (~ 80.000 celler / cm2 overfladeareal) på 6-brønds st…

Representative Results

Stabilitet i kulturenBC-MPS er et stabilt mikrofysiologisk system, der kan dyrkes in vitro i op til mindst 14 dage. Et lysfeltsbillede af ASC-cellearkene blev taget ved 100x forstørrelse for at vise det strierede mønster af sammenløbet ark (Figur 2A). ASC-cellearkene er stabile i kulturen i mindst 4 uger. BC-MPS på 14 dage i kultur i en brønd af en 6 godt plade blev afbildet med et farvekamera, der viser, at den livlige HBT stadig er…

Discussion

Der er behov for nye systemer til modellering af brystkræft hos mennesker for at udvikle en bedre forståelse af sygdommen. Udvikling af humane mikrofysiologiske systemer til modellering af sygdomsindstillinger, der omfatter indfødte ECM- og stromalceller, vil øge prækliniske undersøgelsers prækliniske effekt. BC-MPS-modellen, der præsenteres her, er et nyudviklet system, der overvinder begrænsningerne i tidligere modeller giver mulighed for evaluering af BC i sit oprindelige HBT-miljø. Dette system kan bruges m…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi vil gerne takke Tulane Flow Cytometry og Cell Sortering Core samt Tulane Histology Core for deres tekniske support. Dette arbejde blev støttet af Southeastern Society of Plastic &Reconstructive Surgeons 2019 Research Grant og National Science Foundation (EPSCoR Track 2 RII, OIA 1632854).

Materials

Accumax Innovative Cell Technologies 1333 Cell disassoication solution for separation of BC-MPS
Accutase Corning 25-058-CI Cell detachment solution for passaging of cells
BioStor Container 16oz National Scientific Supply Co MPCE-T016 For Transport of sterile tissue
Cell Culture 75 cm flasks Corning 430641U For culturing ASCs
Conical Tubes 15mL  ThermoScientific 339650
Curved Forceps ThermoScientific 1631T5 For maneuvering tissue while mincing 
DMEM low glucose, w/ Glutamax Gibco 10567-014 For culturing ASCs and BC-MPS
FBS Qualified Gibco 26140-079
Gelatin Sigma G9391
HBSS 10x Gibco 14185-052
NaOH Sigma 221465
Nunc UpCell 6 well plates ThermoScientific 174901 Top ASC cell sheet
PBS Gibco 10010-023
Pen/Strep 5,000U Gibco 15070-063
Petri Dish 150 cm FisherBrand FB0875714 For holding tissue while mincing 
Razor Blades VWR 55411-055 Single Edge for mincing tissue
Strainer 250um  ThermoScientific 87791 For separation of BC-MPS
Tissue Culture 6 well plates Corning 3506 Bottom ASC cell Sheet
Weights/Washers BCP Fasteners BCP672 For weighing plungers down 1/2" inner diameter
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DeSantis, C. E., et al. Breast cancer statistics, 2019. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 69 (6), 438-451 (2019).
  2. . NIH Categorical Spending -NIH Research Portfolio Online Reporting Tools (RePORT) Available from: https://report.nih.gov/categorical_spending.aspx (2020)
  3. Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. Estimation of clinical trial success rates and related parameters. Biostatistics. 20 (2), 273-286 (2019).
  4. Sutherland, M. L., Fabre, K. M., Tagle, D. A. The National Institutes of Health Microphysiological Systems Program focuses on a critical challenge in the drug discovery pipeline. Stem Cell Research & Therapy. 4, 1 (2013).
  5. Wang, X., et al. Breast tumors educate the proteome of stromal tissue in an individualized but coordinated manner. Science Signaling. 10 (491), (2017).
  6. Lau, F. H., et al. Sandwiched white adipose tissue: A microphysiological system of primary human adipose tissue. Tissue Engineering. Part C, Methods. 24 (3), 135-145 (2018).
  7. Scahill, S. D., Hunt, M., Rogers, C. L., Lau, F. H. A microphysiologic platform for human fat: sandwiched white adipose tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e57909 (2018).
  8. Yu, G., et al. Adipogenic differentiation of adipose-derived stem cells. Adipose-Derived Stem Cells. 702, 193-200 (2011).
  9. Bunnell, B., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: Isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
  10. Ebara, M., Hoffman, J. M., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. Surface modification of microfluidic channels by UV-mediated graft polymerization of non-fouling and ‘smart’ polymers. Radiation Physics and Chemistry. 76 (8-9), 1409-1413 (2007).
  11. Lin, J. B., et al. Thermo-responsive poly(N-isopropylacrylamide) grafted onto microtextured poly(dimethylsiloxane) for aligned cell sheet engineering. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 99, 108-115 (2012).
  12. Turner, W. S., Sandhu, N., McCloskey, K. E. Tissue engineering: Construction of a multicellular 3D scaffold for the delivery of layered cell sheets. Journal of Visualized Experiments. (92), e51044 (2014).
  13. Tinkercad. Create 3D digital designs with online CAD. Tinkercad. , (2020).
  14. Halfter, K., Mayer, B. Bringing 3D tumor models to the clinic – predictive value for personalized medicine. Biotechnology Journal. 12 (2), (2017).
  15. Wang, Y. Y., et al. Mammary adipocytes stimulate breast cancer invasion through metabolic remodeling of tumor cells. JCI insight. 2 (4), 87489 (2017).
  16. Qiu, B., Simon, M. BODIPY 493/503 staining of neutral lipid droplets for microscopy and quantification by flow cytometry. Bio-Protocols. 6 (17), 1912 (2016).
  17. Fotos, J. S., et al. Automated time-lapse microscopy, and high-resolution tracking of cell migration. Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).
  18. Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).
  19. Akiyama, Y., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. Ultrathin poly(N-isopropylacrylamide) grafted layer on polystyrene surfaces for cell adhesion/detachment control. Langmuir: the ACS Journal of Surfaces and Colloids. 20 (13), 5506-5511 (2004).
  20. Shingyochi, Y., Orbay, H., Mizuno, H. Adipose-derived stem cells for wound repair and regeneration. Expert Opinion on Biological Therapy. 15 (9), 1285-1292 (2015).
  21. Tokunaga, M., et al. Fat depot-specific gene signature and ECM remodeling of Sca1(high) adipose-derived stem cells. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 36, 28-38 (2014).
  22. Belgodere, J. A., et al. Engineering breast cancer microenvironments and 3D bioprinting. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 66 (2018).
  23. Cao, Y. Adipocyte and lipid metabolism in cancer drug resistance. The Journal of Clinical Investigation. 129 (8), 3006-3017 (2019).
  24. Dirat, B., et al. Cancer-associated adipocytes exhibit an activated phenotype and contribute to breast cancer invasion. Cancer Research. 71 (7), 2455-2465 (2011).
  25. Druso, J. E., Fischbach, C. Biophysical properties of extracellular matrix: Linking obesity and cancer. Trends in Cancer. 4 (4), 271-273 (2018).
  26. Luo, H., Tu, G., Liu, Z., Liu, M. Cancer-associated fibroblasts: A multifaceted driver of breast cancer progression. Cancer Letters. 361 (2), 155-163 (2015).
  27. Chandler, E. M., et al. Implanted adipose progenitor cells as physicochemical regulators of breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (25), 9786-9791 (2012).
  28. Oskarsson, T. Extracellular matrix components in breast cancer progression and metastasis. The Breast. 22, 66-72 (2013).
  29. Liu, J., et al. Collagen 1A1 (COL1A1) promotes metastasis of breast cancer and is a potential therapeutic target. Discovery Medicine. 25 (139), 211-223 (2018).
  30. Ahfeldt, T., et al. Programming human pluripotent stem cells into white and brown adipocytes. Nature Cell Biology. 14 (2), 209-219 (2012).
  31. Volz, A. -. C., Omengo, B., Gehrke, S., Kluger, P. J. Comparing the use of differentiated adipose-derived stem cells and mature adipocytes to model adipose tissue in vitro. Differentiation; Research in Biological Diversity. 110, 19-28 (2019).
  32. Zimta, A. A., et al. Molecular links between central obesity and breast cancer. International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5364 (2019).
  33. Bousquenaud, M., Fico, F., Solinas, G., Rüegg, C., Santamaria-Martínez, A. Obesity promotes the expansion of metastasis-initiating cells in breast cancer. Breast Cancer Research. 20 (1), 104 (2018).
  34. Robado de Lope, L., Alcíbar, O. L., Amor López, A., Hergueta-Redondo, M., Peinado, H. Tumour-adipose tissue crosstalk: fuelling tumour metastasis by extracellular vesicles. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1737), 20160485 (2018).
  35. Insua-Rodríguez, J., Oskarsson, T. The extracellular matrix in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 41-55 (2016).
  36. Sabol, R. A., et al. Leptin produced by obesity-altered adipose stem cells promotes metastasis but not tumorigenesis of triple-negative breast cancer in orthotopic xenograft and patient-derived xenograft models. Breast Cancer Research: BCR. 21 (1), 67 (2019).
  37. Cui, X. D., Gao, D. Y., Fink, B. F., Vasconez, H. C., Pu, L. L. Q. Cryopreservation of human adipose tissues. Cryobiology. 55 (3), 269-278 (2007).
  38. Skardal, A., Shupe, T., Atala, A. Organoid-on-a-chip and body-on-a-chip systems for drug screening and disease modeling. Drug Discovery Today. 21 (9), 1399-1411 (2016).
  39. Clark, A. M., Allbritton, N. L., Wells, A. Integrative microphysiological tissue systems of cancer metastasis to the liver. Seminars in Cancer Biology. , (2020).

Tags

Breast CancerMicrophysiological SystemEx VivoAdipocytesImmune CellsVascular StructuresDuctal StructuresExtracellular MatrixPersonalized MedicinePharmaceutical DevelopmentTumor InitiationFibrosisExtracellular Matrix RemodelingGelatinPNIPAAmASCsPBSRazor BladeCancer Cell LinesBC-MPS Media

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Brown, L. M., Hebert, K. L., Gurrala, R. R., Byrne, C. E., Burow, M., Martin, E. C., Lau, F. H. Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System. J. Vis. Exp. (170), e62009, doi:10.3791/62009 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image