Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Mikrofizyolojik Sistem Kullanarak İnsan Meme Dokusunda Meme Kanseri Modellemesi

doi: 10.3791/62009 Published: April 23, 2021

Summary

Bu protokol, raf malzemeleri ile birincil insan meme dokusu kullanılarak meme kanserini incelemek için bir in vitro mikrofizyolojik sistemin inşasını açıklar.

Abstract

Meme kanseri (M.Ö. ) kadınlar için önde gelen ölüm nedeni olmaya devam etmektedir. Bc araştırmalarına yılda 700 milyon dolardan fazla yatırım olmasına rağmen, aday BC ilaçlarının% 97'si klinik çalışmalarda başarısız oluyor. Bu nedenle, hastalığı anlamamızı geliştirmek için yeni modellere ihtiyaç vardır. NIH Mikrofizyolojik Sistemler (MPS) programı, temel bilim keşiflerinin klinik çevirisini geliştirmek ve yeni terapötik stratejiler vaat etmek için geliştirilmiştir. Burada meme kanserleri için MPS (BC-MPS) üretmek için bir yöntem sunuyoruz. Bu model, adipoz türevli kök hücre sayfaları (ASC) arasında WAT sandviç yaparak birincil insan beyaz yağ dokusunu (WAT) kültleme yaklaşımını daha önce tanımlanmış bir şekilde uyarlar. BC-MPS'mizin yeni yönleri arasında BC hücrelerinin yerel hücre dışı matris, olgun adipositler, yerleşik fibroblastlar ve bağışıklık hücreleri içeren hastalıksız insan meme dokusuna (HBT) tohumlama; ve BC-HBT admixture'ı HBT türevi ASC levhalar arasında sandviç. Elde edilen BC-MPS, kültür ex vivo'sunda en az 14 gün boyunca kararlıdır. Bu model sistemi, Adipositler, stromal hücreler, bağışıklık hücreleri ve hücre dışı matris dahil olmak üzere M.Ö.'yü etkileyen mikroçevrinin birden fazla unsurunu içerir. Böylece BC-MPS, BC ve mikroçevrim arasındaki etkileşimleri incelemek için kullanılabilir.

BC-MPS'mizin avantajlarını, kanserin ilerlemesini ve metastazını etkilediği bilinen iki BC davranışını inceleyerek gösteriyoruz: 1) BC hareketliliği ve 2) BC-HBT metabolik çapraz konuşma. BC hareketliliği daha önce intravital görüntüleme kullanılarak gösterilmiş olsa da, BC-MPS birkaç gün boyunca floresan mikroskopi kullanarak yüksek çözünürlüklü zaman atlamalı görüntülemeye izin verir. Ayrıca, metabolik çapraz konuşma daha önce bc hücreleri ve olgunlaşmamış adipositlere farklılaştırılmış murine pre-adipositler kullanılarak gösterilmiş olsa da, BC-MPS modelimiz birincil insan meme adipositleri ile BC hücreleri in vitro arasındaki bu çapraz sapı gösteren ilk sistemdir.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Her yıl, 40.000'den fazla ABD'li kadın meme kanserinden ölüyor (M.Ö.1. Bc araştırmalarına yılda 700 milyon dolardan fazla yatırım olmasına rağmen, aday BC ilaçlarının% 97'si klinik çalışmalarda başarısız2,3. İlaç geliştirme boru hattını ve M.Ö. anlayışımızı geliştirmek için yeni modellere ihtiyaç vardır. NIH Mikrofizyolojik (MPS) Programı, temel bilimi klinik başarıya çevirmek için çığır açan modeller için gerekli özellikleri tanımlamamıştır4. Bunlar arasında birincil insan hücrelerinin veya dokularının kullanımı, 4 hafta boyunca kültürde stabil ve doğal doku mimarisinin ve fizyolojik yanıtın dahil edilmesi yer aldı.

BC hücre çizgilerinin iki boyutlu kültürü, membran kesici uç ortak kültürü ve üç boyutlu küreseller ve organoidler gibi mevcut in vitro BC modelleri NIH'nin MPS kriterlerini karşılamaz, çünkü bunların hiçbiri yerel meme dokusu mimarisini yeniden tamamlamaz. Bu sistemlere hücre dışı matris (ECM) eklendiğinde meme ECM kullanılmaz; bunun yerine kollajen jelleri ve bodrum membran matrisleri kullanılır.

Hasta türevli ksinograftlar (PDX) gibi mevcut in vivo sistemler de benzer şekilde NIH'nin MPS kriterlerini karşılamamaktadır, çünkü murine meme dokuları insan göğüslerinden büyük ölçüde farklıdır. Ayrıca, immün sistem-BC etkileşimleri tümör gelişiminde giderek daha fazla anahtar olarak kabul edilmektedir, ancak PDX tümörleri üretmek için kullanılan immün sistemi baskılanmış murin modelleri olgun T hücreleri, B hücreleri ve doğal öldürücü hücrelerden yoksundur. Ayrıca, PDX primer meme tümörlerinin korunmasına ve genişletilmesine izin verirken, ortaya çıkan PDX tümörleri primer murine stromal hücreler ve ECM5ile sızmaktadır.

Bu zorlukların üstesinden gelmek için, NIH MPS kriterlerini karşılayan bir roman, ex vivo, üç boyutlu insan göğsü MPS geliştirdik. Meme MPS'mizin temeli, birincil insan meme dokusunun (HBT) HBT'den izole edilmiş iki yağ türevi kök hücre (ASC) yaprağı arasına sandviç yapılmasıyla yapılır (Şekil 1). Hücre yapraklarını sandviç HBT'ye aktarmak için pistonlar 3D baskılı veya basit akrilik plastiklerden yapılabilir(Şekil 1H,I). Bu teknik, birincil insan beyaz adiposit dokusunu kültleme için daha önce tarif ettiğimiz yaklaşımı uyarlar6,7. Meme MPS daha sonra standart BC hücre çizgilerinden primer insan meme tümörlerine kadar tercih edilen bir BC modeli ile tohumlanabilir. Burada, bu BC-MPS'lerin kültürde birkaç hafta boyunca istikrarlı olduğunu gösteriyoruz (Şekil 2); meme adipositleri, ECM, endotel, bağışıklık hücreleri gibi HBT'nin doğal unsurlarını içerir (Şekil 3); ve M.Ö. ile HBT arasındaki metabolik çapraz konuşma gibi fizyolojik etkileşimleri yeniden özetler (Şekil 4). Son olarak, BC-MPS'nin HBT boyunca BC hücrelerinin amipoid hareketinin incelenmesine izin verdiğini gösteriyoruz (Şekil 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tüm insan dokuları LSUHSC Kurumsal İnceleme Kurulu Ofisi tarafından onaylandığı şekilde protokol #9189 uygun olarak toplanarak toplandırıldı.

1. Hücre sayfaları için Yağ türevi Kök Hücrelerin (ASC) tohumlama

  1. Asc'leri ticari kaynaklardan satın alın veya belirlenen protokolleri izleyerek birincil insan meme dokusundan izole edin8,9. Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta (DMEM) 6 kuyu standart doku kültürü plakalarına%70 yoğunlukta (~80.000 hücre/cm 2 yüzey alanı) tohum insan meme ASC'leri %10 fetal sığır serumu ve %1 Penisilin/Streptomisin (BC-MPS Media) ile desteklenmiştir. Hücre sayfalarını oluşturmak için kullanılacak ASC'lerin geçiş 10'dan az olmasını sağlayın.
    1. Üretilecek meme kanseri mikrofizyolojik sisteminin (BC-MPS) her kuyusu için, 1 standart doku kültüründe tohum hücreleri iyi ve poli (N-izopropilakrilamid) (pNIPAAm) kaplı doku kültürü plastik plakası üzerinde benzer boyutta 1 kuyu. Bir adet 6 kuyulu BC-MPS plakası, bir standart doku kültürü 6 kuyu plakası (alt) ve bir pNIPAAm kaplı plaka (üst) gerektirecektir. pNIPAAm plakaları ticari kaynaklardan satın alınabilir veya laboratuvar içi10, 11,12.
  2. 37 ° C ve% 5 CO 2'de bir doku kültürü inkübatöründe kültürASC'leri. Biyogüvenlik kabininde her 2-3 günde bir medyayı değiştirin.
  3. ASC'leri %100 birleşene ve çizgili bir desen oluşturana kadar kültürlendirin. Tohumlandıkları izdihama bağlı olarak, bu 7-10 gün sürecektir. Şamandıra yağ meme dokusunu tutturmak için birleştirilmiş hücre tabakaları gereklidir.

2. BC-MPS için gerekli malzemelerin hazırlanması

  1. 6 kuyulu plakalar için jelatin hazırlamak için damıtılmış H 2 O'da%12jelatin çözeltisi yapın, 250 mL cam medya şişesinde 19 g jelatin tipi B (jel mukavemeti ~ 225 Bloom) ve125mL H 2 O karıştırın. pH'ı nötralize etmek için çözeltiye 1,6 mL 1 M NaOH ekleyin.
  2. Çözeltiyi sterilize etmek için çözeltiyi 25 dakika boyunca sıvı bir döngü altında otoklavlayın.
  3. Çözeltinin 37 °C'ye kadar soğumasını bekleyin. Steril bir biyogüvenlik kabininde, 160 mL'lik son bir hacim elde etmek için çözeltiye 16 mL steril 10x Hanks dengeli tuz çözeltisi (HBSS) ekleyin.
    NOT: Jelatin çözeltisi hemen kullanılabilir veya daha sonra kullanılmak üzere oda sıcaklığında saklanabilir. Hazırlanan jelatin 1 ay boyunca oda sıcaklığında stabildir. Sadece birkaç pistona ihtiyaç duyulursa, daha önce açıklandığı gibi BC-MPS yapmakla aynı gün içinde 10 mL'lik bir çözelti yapılabilir ve steril filtrelenebilir7.
    1. Filtre sterilizasyonu ile jelatin çözeltisi hazırlamak için, 15 mL konik tüpte 1x HBSS çözeltisi yapmak için 10x HBSS'nin 1 mL'si ile 9 mL H2O seyreltin. Her 10 mL tüpe 100 μL 1 M NaOH ekleyin ve ardından çözeltiye 0,7 g jelatin ekleyin. Jelatin çözmek için çözeltiyi kuvvetlice karıştırın.
    2. Tüpü 75 °C'lik bir su banyosunda her 5 dakikada bir 20 dakika sallayarak kuluçkaya yatırın. Jelatin çözeltisini filtrelemek için 10 mL şırınna ve 0,22 μm şırınna filtresi kullanın. Jelatin çözeltisini doğrudan bir biyogüvenlik kabininde pistonlara filtreleyin.
  4. 3D baskı veya hücre sayfalarını aktarmak için kullanılan pistonları yapmak için basit akrilik kullanın. Pistonların istenen boyuta gevşek bir şekilde uyduğundan emin olun. Şekil 1'de standart bir 3D baskılı piston gösterilmiştir. Pistonlar, TinkerCad gibi standart bilgisayar destekli tasarım yazılımı kullanılarak tasarlanabilir ve polilaktik asit (PLA)13, 14ile uyumlu filament 3D yazıcılar kullanılarak basılabilir.
  5. Pistonları tutmak için bir raf hazırlamak için biyogüvenlik kabinine 15 mL tüp rafı yerleştirin. Pistonları rafa baş aşağı yerleştirin, böylece pistonların altı yukarı bakacak şekilde. BC-MPS'yi taşımak için kapaklı plastik bir kutuyu biyogüvenlik kabinine yerleştirin. Kutunun 4 plaka BC-MPS'ye uyacak şekilde en az 35,5 cm uzunluğunda x 28 cm genişliğinde x 8,25 cm yüksekliğinde olması önerilir. Kapağı kutudan çıkarın ve rafı, pistonları ve kutuyu% 70 EtOH ile püskürtün.
  6. Steril jilet ve forsepsleri otoklavlayarak veya biyogüvenlik kabinine yerleştirerek ve % 70 EtOH ile yıkayarak hazırlayın.
  7. Pistonları ve kutuyu% 70 EtOH ile püskürtün ve malzemeleri sterilize etmek için biyogüvenlik kabininde UV ışığını en az 30 dakika açın.

3. Jelatin pistonları hazırlayın ve üst hücre sayfalarına uygulayın

  1. Jelatin çözeltisi daha önce hazırlanmışsa, eritmek için 37 ° C'lik bir su banyosunda ısıtın.
  2. Jelatin çözeltisini 5 veya 10 mL serolojik pipet kullanarak biyogüvenlik kabindeki pistonlara pipetlayın. 6 kuyulu bir plakanın 1 kuyusu için bir piston ~ 2,5 mL jelatin gerektirecektir.
  3. Jelatin pistonlarda katılaştıktan sonra (~30-45 dk) pNIPAAm kaplı ASC plakalarını biyogüvenlik kabinine taşıyın. Pistonları pNIPAAm kaplı ASC plakalarının kuyularına hafifçe yerleştirin, böylece jelatin ASC'lere temas eder. Jelatin ASC hücre tabakasıyla doğrudan temas edecek şekilde pistonu tartmak için pistona bir metal yıkayıcı (~7,5 g) yerleştirin. Pistonları ASC hücre levhalarında oda sıcaklığında 30 dakika bekletin.
  4. Pistonlu plakayı hafifçe biyogüvenlik dolabındaki steril kutuya hareket ettirin ve kapağı üzerine yerleştirin. Kutuyu 30 dakika boyunca 4 °C buzdolabına taşıyın. 4 °C buzdolabı yoksa, plakayı 30 dakika boyunca biyogüvenlik dolabındaki bir buz kovasına yerleştirin.

4. Kanser hücre hatlarının hazırlanması

  1. Kanser hücre hatlarını standart bir T75 doku kültürü çanağı ile tohumlayın ve BC-MPS'nin işlanacağı gün ~% 80 birleştiğinde kültürde tutun. (~BC-MPS başına 200.000 kanser hücresine ihtiyaç duyulacaktır). Kanser hücrelerini normal ortamda büyütün.
    NOT: Kanser hücrelerini tanımlamak ve izole etmek için, hücrelerin ASC'lerden ve meme dokusundan ayırt etmek için floresan bir proteinle transktöre edilmesi önerilir. BC-MPS başına ihtiyaç duyulan kanser hücrelerinin sayısı MCF7 ve MDA-MB-231 hücreleri için optimize edilmiştir. Diğer hücre hatları daha fazla iyileştirme gerektirebilir.
  2. BC-MPS'nin hazırlandığı gün kanser hücrelerini içeren şişeyi biyogüvenlik kabinine taşıyın. Medyayı şişeden epire edin. Matarayı 5 mL PBS ile yıkayın.
  3. Kanser hücrelerini içeren şişeye 1 mL hücre müfrezesi çözeltisi ekleyin ve ardından hücreler ayrılana kadar şişeyi 37 °C'lik bir inkübatörde kuluçkaya yatırın (~2-5 dk).
  4. Biyogüvenlik kabininde şişeye 9 mL PBS ekleyin, PBS'deki hücreleri 15 mL konik bir tüpe aktarın ve hemositometre kullanarak hücre numarasını sayın.
  5. Kanser hücrelerini oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüj edin.
  6. BC-MPS ortamlarındaki hücreleri 2 x 106 hücre/mL olacak şekilde yeniden kullanın.
  7. Kanser hücrelerini insan dokusuna eklenmeye hazır olana kadar 37 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin.

5. İnsan meme dokusunun işlenmesi

  1. Biyogüvenlik kabininde insan meme dokusunu (HBT) 10 mL steril PBS ile 3x yıkayın.
  2. BC-MPS'yi kaba bir şekilde kıymak için steril forseps ve jilet kullanın ve mümkün olduğunca fazla fasya ve bağ dokusunu çıkarmaya çalışın. Bağ dokusunun çıkarılmaması, ASC üst tabakasının HBT'yi düzgün bir şekilde tutturamamasına neden olabilir.
    NOT: Fasya ve bağ dokusu yağ dokusunun sarı rengine göre beyaz veya berrak görünümü ile tanımlanabilir.
  3. Bağ dokusu çıkarıldıktan sonra, homojen bir sıvı kıvamına gelene kadar dokuyu ince bir şekilde kıymak için steril bir jilet kullanın. Doku, 25 mL serolojik bir uç kullanılarak kolayca pipetlenebildiğinde ince bir şekilde kıyılır.
  4. Kıyılmış HBT'nin pipetlemesine yardımcı olmak için p1000 pipet ucunun ucunu kesmek için steril bir jilet kullanın.
  5. 1,5 mL'lik bir tüpte kıyılmış HBT, kanser hücresi hatları ve BC-MPS ortamını karıştırın (6 kuyu plakasının 1 kuyusu için bu 200 μL kıyılmış HBT, 100 μL BC-MPS ortamı ve 100 μL kanser hücresi gerektirir).
  6. Alt hücre sayfası için kullanılacak ASC plakasını inkübatörden biyogüvenlik kabinine taşıyın. Ortamı alt ASC plakasından aspire edin. Karışımı, distal ucu 5.4 adımından kesilmiş bir p1000 pipet ucu kullanarak alt ASC plakasının kuyusunun ortasına pipetleyin
  7. Üzerinde pistonlar bulunan üst ASC plakasını içeren kutuyu biyogüvenlik kabinine taşıyın. Jelatin pistonlarını pNIPAAm kaplı plakadan hafifçe çıkarın ve HBT karışımının üzerine yerleştirin. Kuyuya BC-MPS medya ekleyin (6 kuyu plakasının 1 kuyusu için 2 mL medya ekleyin). BC-MPS karışımı ve pistonları ile alt ASC plakalarını steril plastik kutuya dikkatlice hareket ettirin ve taşıma için kutunun kapağını yerleştirin.
    NOT: Pistonlar açıkken 6 kuyulu plaka kapağı ASC plakasına geri sığmaz. Kültürü kirletmemek için dikkatli olunmalıdır.
  8. Alt plakayı, jelatin eriyene ve üst ASC tabakası alt katmana (~30 dk) yapışmaya başlayana kadar 37 ° C'de bir inkübatörde kutuya inkübe edin.
  9. Plakaların olduğu kutuyu biyogüvenlik kabinine taşıyın. Pistonları alt plakalardan yavaşça çıkarın. Kanser hücrelerinin olduğu doku kuyunun dibine tutturulacak.
  10. 6 kuyu plakasının kapağını tekrar alt plakaya yerleştirin ve jelatinleri tamamen eritmek ve üst tabakanın alt katmana tamamen tutturulmasını sağlamak için 37 °C'de kuluçkaya yatırın (~30-60 dk).
  11. Plakaları hafifçe bir biyogüvenlik kabinine taşıyın ve medyayı 10 mL serolojik pipetle aspire edin. Her kuyuya 2 mL taze medya ekleyin. Dokuyu yerinden çıkarmaktan kaçınmak için kuyunun kenarından ve pipetten kuyunun kenarına aspire edin.
  12. BC-MPS'yi istediğiniz süre boyunca 37 °C ve%5 CO 2'de saklayıp her 2-3 günde bir ortam değiştirin.

6. Analiz için BC-MPS sindirimi

  1. BC-MPS analize hazır olduğunda, plakayı biyogüvenlik kabinine taşıyın. Herhangi bir dokunun yanlışlıkla yerinden çıkarılmasını önlemek için medyayı serolojik pipetle çıkarın.
  2. Her kuyuya 1 birim PBS ekleyin.
  3. PBS'yi serolojik pipetle çıkarın.
  4. Her kuyuya 1 mL hücre ilişkilendirme çözümü ekleyin. Plakayı inkübatöre geri taşıyın ve hücrelerin kopmasını sağlamak için 5 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın. Biyogüvenlik kabininde, hücreleri ve dokuyu kültür plakasından tamamen ayırmak için bir hücre kazıyıcı kullanın.
  5. Çözeltiyi doku ile serolojik pipet kullanarak 15 mL konik bir tüpe aktarın. Kalan hücreleri toplamak ve bu çözeltiyi konik tüpe aktarmak için her kuyuya 2 mL PBS ekleyin. Hücreler floresan ise, tüpü ışıktan korumak için alüminyum folyoya sarın.
  6. Hücreleri dokudan tamamen ayrıştırmak için 10-20 dakika boyunca 1 x g'da bir yörünge çalkalayıcıda sürekli ajitasyon altında tüpü 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
  7. Biyogüvenlik kabininde, tüpte kalan hücre kümelerini bozmak için serolojik bir pipet kullanın ve numuneyi 250 μm'lik bir doku süzgecinden yeni bir 15 mL tüpe filtreleyin. Çözeltiyi taşmaması için süzgeçten yavaşça geçirin.
  8. Süzgeçte hala bulunan hücreleri toplamak için süzgeci 1 mL PBS ile durulayın.
  9. Numuneleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjlayın. Santrifüjlemeden sonra, adipositler çözeltinin üst tabakasında yüzerken, kanser hücreleri ve ASC'ler tüpün altındaki bir peletle birbirine karıştırılacaktır.
  10. Adipositleri izole etmek için üst katmanı yavaşça yeni bir tüpe dökün veya alternatif olarak p1000 pipet ucunu kesin ve üst katmanı yeni bir tüpe aktarın. Numuneyi 500 x g'da tekrar 5 dakika santrifüjlayın ve çözeltiyi adipositlerin altından çıkarmak için bir şırınga ve iğne kullanın, böylece sadece adipositler kalır. Adipositler analize hazır
  11. Adipositleri çözeltiden çıkardıktan sonra, kanser hücrelerinin daha önce floresan bir proteinle transklümlü olup olmadığını analiz etmek için ASC'leri ve kanser hücrelerini birbirinden ayırın. Kalan çözeltiyi, hücre peletini bozmadan ASC'leri ve kanser hücrelerini içeren tüpten epire edin. Peleti PBS veya BC-MPS ortamlarında yeniden kullanın ve hücreleri floresansa göre sıralamak için akış sitometrisi kullanın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kültürde istikrar
BC-MPS, en az 14 güne kadar in vitro olarak kültürlenebilen kararlı bir mikrofizyolojik sistemdir. Asc hücre sayfalarının parlak alan görüntüsü, birleştiği levhanın çizgili desenini görüntülemek için 100x büyütmede alınmıştır (Şekil 2A). ASC hücre sayfaları kültürde en az 4 hafta boyunca stabildir. BC-MPS kültürde 14 gün boyunca bir kuyuda 6 kuyu plakası, şamandıra HBT'nin 14 gün sonra ASC hücre sayfaları tarafından hala kuyunun dibine sabitlendiğini gösteren bir renk kamerası ile görüntülenmiştir (Şekil 2B). Bu, yağ dokusunu sandviçlemek için kullanılan hücre tabakasının hala sağlam olduğunu göstermektedir. RFP'yi ifade eden üçlü negatif BC hücre hattı MDA-MB-231, HBT'de 14 gün boyunca kültürlendi ve daha sonra BC-MPS'nin hücre hatlarıyla en az 14 güne kadar stabilitesini gösteren floresan bir mikroskopla görüntülendi (Şekil 2C). Dokudaki BC hücrelerinin varlığı, kanser hücrelerinin HBT'yi istila etme yeteneğini göstermektedir. Üç negatif PDX eksplantı bir fareden çıkarıldı, Cell Tracker CMTPX ile lekelendi ve HBT ile kültürlendi. Bc-MPS'nin tümör eksplantları ile en az 6 gün stabilitesini göstermek için 6. günde floresan mikroskopi görüntüleriçekilmiştir (Şekil 2D). Bu, BC-MPS'nin hücre hatlarının yanı sıra HBT ile tümör eksplantlarını kültüre etmek için kullanılabileceğini göstermektedir.

Yerel HBT öğeleri
BC-MPS, kültürde HBT'nin yerel öğelerini içerir. 100 mg HBT içeren BC-MPS 14 gün boyunca in vitro olarak kültürlendi. Doku, kültürde 14 gün sonra brightfield mikroskopisi kullanılarak görüntülenmiştir (Şekil 3A). Bu resim, kültürde 14 günde olgun adiposit kümelerinin korunmasını göstermektedir. Doku daha sonra% 10 formalin, parafin gömülü, bir mikrotom kullanılarak 5 μm'de bölümlenmiş ve daha sonra standart bir protokol kullanılarak Movats pentachrome lekesi ile boyanmıştır. Sabit bölümler 100x (Şekil 3B) veya 20x (Şekil 3C) olarak görüntülenmiştir. Görüntüler, BC-MPS'nin doğal kollajen (mor), retiküler lifler (mavi) içerdiğini ve bağ dokusu arasındaki adipositlerin büyük uniloküler şeklinin kültürde 14 günde korunduğunu göstermektedir. Sistemdeki birincil makrofajları tanımlamak için HBT 0, 3 ve 7 gün boyunca kültürlendi ve daha sonra ANTI-CD45, anti-CD68 ve anti-CD206 ile sabitlendi ve boyandı. CD45 genel lökosit tanımlayıcısı olarak kullanılmıştır. CD68 makrofajları tanımlamak için monosit lekesi olarak kullanılırken, CD206 makrofajlarda bulunan ortak bir reseptör tanımlar. Makrofaj işaretleyicilerinin boyanmaları bir görüntüleme yazılımı kullanılarak ölçüldü (Şekil 3D). Bu, kültürde 3 ve 7 gün sonra birincil makrofajların korunmasını göstermektedir. Bu veriler, BC-MPS'nin kültürde HBT'nin yerel öğelerini koruduğunu göstermektedir. BC hücrelerinin HBT'nin doğal elementlerini nasıl yeniden şekillendirdiğini incelemek için daha fazla deney yapılabilir. Bu, BC hücrelerinin varlığı tarafından değiştirilip değiştirilmediklerini belirlemek için makrofaj işaretçilerindeki değişiklikleri değerlendirmeyi içerebilir. ECM'deki değişiklikler, bc hücreleri ile veya BC hücreleri olmadan kültürlenen örneklerin Movats pentachrome boyaması karşılaştırılarak kollajen içeriğinin değiştirilip değiştirilmediğini ve Adipositlerin boyutunun, BC hücrelerinin adiposit boyutunu değiştirip değiştirmediğini belirlemek için Image J gibi görüntü analiz yazılımı kullanılarak karşılaştırılabilir.

Metabolik çapraz konuşma
Adiposit-kanser metabolik çapraz sap, tümör mikroçevresinin BC ilerlemesini etkilediği önemli bir yoldur. Hücre içi lipitleri biriktiren BC hücreleri ilaç direncinin arttığını ve daha invaziv bir fenotip15. BC hücrelerinin olgunlaşmamış, murine adipositlerde lipoliz indüklediği gösterilmiş olsa da, M.Ö. ile primer insan meme adipositleri arasındaki metabolik çapraz konuşma hiç gösterilmediği için bunun fizyolojik ilgisi belirsizliğini korumuştur. BC-MPS'nin bu adiposit-BC metabolik çapraz sap RFP etiketli MDA-MB-231 hücrelerinin tek başına veya BC-MPS'de 14 gün boyunca kültürlendiğini göstermek için. Hücreler enzimatik olarak tek hücreli süspansiyona sindirildi, nötr lipid boya bodipy ile boyandı ve akış sitometrisi ile analiz edildi (Şekil 4A,B)16. Lipid pozitif MDA-MB-231 hücrelerinin oranı BC-MPS ve 2D kültüründe 26,2 kat SEM +/- 2,5 daha fazlaydı (Şekil 4C). Lipid lekelemedeki bu artış, kanser hücrelerinin adipositlerle etkileşime girdiğini ve olgun adipositlerden salınan lipitleri aldığını göstermektedir. RFP+ Bodipy+ hücrelerini seçmek için hücre sıralama işlemi gerçekleştirildi. Sıralamadan sonra, hücreler cam örtüleri kaplayan kollajen üzerine kaplandı ve gece boyunca bağlanmasına izin verildi. Ertesi gün hücreler 30 dakika boyunca % 4 paraformaldehitte sabitlendi ve daha sonra 100x büyütmede floresan mikroskopta görüntülendi. BC-MP'de kültürlenen hücreler (Şekil 4E) standart 2B kültüründe kültürlenen hücrelere kıyasla artan lipit damlacıkları görüntüledi (Şekil 4D). Bu, BC hücreleri ve HBT arasındaki metabolik çapraz konuşmayı gösterir ve ayrıca lipid birikiminin akış sitometrisi veya floresan mikroskopi ile nasıl analiz edilebileceğini gösterir. Kanser hücrelerinde lipit birikiminin daha fazla analizi, lipit damlacıklarının büyüklüğü ve hücre başına lipit damlacıklarının sayısı ölçülerek yapılabilir.

Amoeboid hareketi
BC hücreleri ve adipositler arasındaki metabolik çapraz konuşma kanserin invaziv yeteneğini arttırır. HBT ile kültürlenen kanser hücrelerinin artan invaziv yeteneğini değerlendirmek için HBT boyunca BC hücrelerinin göçü floresan mikroskopi ile değerlendirildi. RPF'yi ifade eden metastatik TNBC hücre hattı MDA-MB-231, sistemin stabilize olabilmesi için 4 gün boyunca BC-MPS'de kültürlendi. 37 °C ve %5CO2'de 19 saat boyunca her 20 dakikada bir çekilen bir görüntü ile MDA-MB-231 hareketliliğini görüntülemek için 4 gün sonra hızlandırılmış floresan mikroskopisi yapıldı. Ortaya çıkan video, MDA-MB-231 hücreleri için amoeboid hareket kalıplarını ve şaşırtıcı derecede yüksek bir hareketlilik derecesini göstermiştir (Şekil 5 ve Video 1). Bu, BC hücrelerinin invaziv yeteneğinde ve BC hücrelerinin HBT'yi istila etme yeteneğinde bir artış olduğunu göstermektedir. HBT'deki BC hücrelerinin geçişi,17,18geçiş hücrelerinin hızını ve yönünü ölçmek için daha önce yayınlanan yöntemler kullanılarak daha fazla analiz edilebilir. MDA-MB-231 hücrelerinin de mitoz olduğu gözlendi. Bu davranışlar agresif fenotipi ile tutarlıdır, kanserin ilerlemesi ve metastaz için önemli davranışlardır ve BC tedavileri için hedeflenebilecek yeni BC davranışlarını vurgular.

Figure 1
Şekil 1: BC-MPS kurulumunun genel iş akışı. (A) Jelatin dik bir pistonda katılaştırilir. (B) Jelatinli piston termoresponif üst ASC hücre tabakasına yerleştirilir. (C) Hücreler oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatarken jelatin hücre tabakasıyla teması sürdürmeye zorlamak için bir ağırlık kullanılır ve ardından 30 dakika boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırılabilir. (D) Piston soğuk tabakadan çıkarılır ve sağlam hücre tabakası çıkarılır. (E) Üst hücre tabakasına sahip piston, alt hücre tabakasını ve kıyılmış HBT ve BC hücrelerini içeren bir tabağa aktarılır. (F) Medya, piston, HBT, BC ve her iki hücre çarşaflı alt hücre kabı, jelatin erimesini ve hücre çarşaflarının kontaklardan elde etmesini sağlamak için 37 °C'de 30-60 dk kupürlenir. (G) Pistonun çıkarılması, HBT ve BC'yi iki ASC hücre sayfası arasına sıkıştırır. 3D baskılı piston, ücretsiz çevrimiçi yazılım TinkerCad (https://www.tinkercad.com/) kullanılarak tasarlanmış ve 3D yazıcıya basılmıştır. Piston polilaktik asitten oluşur. (H) 6 kuyulu bir plakanın 1 kuyusu için bir pistonun boyutları belirtilir. Pistonun girintisi 2,5 mm'dir. (I) Gerçek 3D baskılı pistonun görüntüsü gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: BC-MPS'nin kültürde temsili stabilitesi. (A) Birikmiş hücrelerin çizgili desenini gösteren birleştirilmiş ASC'lerin 100x büyütmesinde parlak alan görüntüsü. Ölçek çubuğu = 100 μm. (B) 100mg HBT içeren BC-MPS, 6 kuyu plakasında kültürlendi. 14 gün sonra, HBT'nin 6 kuyu plakasının kuyusunun altına tuttur edildiğini göstermek için renkli bir fotoğraf çekildi. (C) RFP'yi ifade eden üçlü negatif BC hücre hattı MDA-MB-231, HBT ile 14 gün boyunca kültürlendi ve daha sonra 40x büyütmede floresan mikroskopi kullanılarak görüntülendi. Görüntüler, MDA-MB-231 hücrelerinin HBT'de hala uygulanabilir ve büyüdüğünü göstermektedir. Ölçek çubuğu = 200 μm D) Farelerden gelen üçlü negatif meme kanseri PDX Tümörleri 3 cm2 parçaya bölünerek Hücre İzleyici Kırmızı CMPTX ile etiketlendi. Parçalar HBT'de kültürlendi ve ortaya çıkan BC-MPS, kültürdeki kararlılığını gösteren 6. Ölçek çubuğu = 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: BC-MPS'de bulunan HBT'nin doğal elemanlarının temsili korunması. BC-MPS 14 gün boyunca kültürlendi ve daha sonra 40x(A)parlak alan mikroskopisi ile görüntülendi ve daha sonra% 10 formalin ile sabitlendi ve Movats pentachrome lekesi ile boyandı. Görüntüler 100x (B) veya 20x (C) olarak çekildi. HBT'nin görüntülenmesi, birlikte kümelenmiş büyük unilokülatör adipositlerin ve doku dilimlerinin korunmasını gösterir, kollajen (sarı) ve adipositler (mavi) arasındaki retiküler lifler gibi yerel ECM'nin korunmasını gösterir. Modeldeki makrofajların korunmasını göstermek için HBT 0, 3 veya 7 gün boyunca kültürlendi, makrofaj işaretleyicileri için boyandı ve konfokal mikroskopi (D)kullanılarak görüntülendi. Makrofaj işaretleyicilerinin boyanma floresan yoğunluğu, makrofajların kültürde 3 ve 7 gün sonra hala dokuda mevcut olduğunu gösteren ticari olarak mevcut yazılım kullanılarak ölçüldü. Ölçek çubuğu = 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: BC-MPS'de adipositler ve kanser hücreleri arasında temsili metabolik çapraz konuşma. RFP etiketli MDA-MB-231 hücreleri BC-MPS ve 2D'de 14 gün boyunca kültürlendi, daha sonra Bodipy (250 nM) ile boyandı ve akış sitometrisi ile analiz edildi. (A) Bodipy lekeli MDA-MB-231 hücrelerinin 2D kültüründe 14 gün sonra akması. B2'deki hücreler Bodipy+RFP+; B1'deki hücreler Bodipy-RFP+'dir. B2/(B1+B2) = %3.26, minimal lipit birikimini gösterir. (B) BC-MPS'de 14 gün sonra Bodipy lekeli MDA-MB-231 hücrelerinin akış sitometri analizi. B2/(B1+B2) = %85,35, geniş lipit birikimini gösterir. (C) 14 gün sonra MDA-MB- 231 hücrelerde lipid birikimi 2D kültür ve BC-MPS. 2D (D) vs BC-MPS (E) kültürlü MDA-MB-231'in Bodipy lekelemesinin floresan mikroskopi analizi, BC-MPS'de yetişen hücrelerde lipit birikiminin arttığını göstermektedir. Hata çubukları SEM' yi gösterdi. ** p < 0.01, n=2 biyolojik kopyalar, Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: BC-MPS'de TNBC'nin temsili geçişi. RFP etiketli MDA-MB-231 hücreleri BC-MPS'de 4 gün boyunca kültürlendi ve daha sonra floresan mikroskobu kullanılarak RFP etiketli BC-MPS + MDA-MB-231 hücrelerinin sıralı zaman atlamalı görüntüleri yakalandı (60 dakikada bir kare, 100x büyütme.) Sarı yıldız işaretleri = mitotik olay. Sarı kutu = konumsal referans için kullanılan hücresel döküntü. Mavi oklar = psödopodlar ve yüksek hareketlilik ile amipoid hareketi gösteren 231 hücre. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Video 1: BC-MPS'de TNBC'nin temsili geçişi. RFP etiketli MDA-MB-231 hücrelerini içeren BC-MPS 4 gün boyunca kültürlendi ve floresan mikroskopi, hücreleri 19 saatte 37 ° C ve% 5 CO 2'de her20 dakikada bir görüntüledi. Görüntüler bir videoda derlendi (60 dakikada bir kare, 100x büyütme). Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hastalığın daha iyi anlaşılması için insan meme kanserinin modelleneceği yeni sistemlere ihtiyaç vardır. Yerli ECM ve stromal hücreleri içeren hastalık ayarlarını modellemek için insan mikrofizyolojik sistemlerinin geliştirilmesi, klinik öncesi çalışmaların tahmin gücünü artıracaktır. Burada sunulan BC-MPS modeli, önceki modellerin sınırlamalarını aşarak BC'nin kendi yerel HBT ortamında değerlendirilmesini sağlayan yeni geliştirilmiş bir sistemdir. Bu sistem kanser hücre hatları ile veya tümör eksplantları ile kullanılabilir ve en az 14 gün stabil haleilir. BC hücrelerini floresan olarak etiketlemek, kanser hücresi hareketliliği ve hücre hücresi etkileşimlerinin, göçün, canlılığın veya çoğalmanın gerçek zamanlı olarak veya belirli zaman noktalarında izlenmesini sağlar (Şekil 3 ve Şekil 5). Bu model sistem, kanser hücreleri ve mikroçevrimleri arasındaki etkileşimlerle ilgili olarak kanser biyolojisi hakkında önemli yönleri ortaya çıkarmak için kullanılabilir. Bu sistemin sorgulanması, TME'nin kanser ilerlemesini, ilaç yanıtını ve metastazın başlatılmasını bildirebilir.

Sistemi başarıyla kurmak için izlenmesi gereken birkaç kritik adım vardır. İlk kritik adım, ASC hücre sayfalarının kültleme ve transferidir. pNIPAAm kaplı plakalar sıcaklığa duyarlıdır. Plakalar 32 °C'nin üzerinde olduğunda yüzey hidrofobiktir ve ASC'ler yüzeye yapışır. Yüzey bu sıcaklığın altında hidrofilik hale gelecek ve hücreler19'danayırmaya başlayacaktır. Bu nedenle, belirli bir hücre tipinin bu yüzeylerden ne kadar hızlı kopmaya başlayacağını belirlemek gerekir. HBT türevli ASC'ler için, hücreler birleştiğinde bu > 30 dakika sürer. Normal bakım sırasında hücrelerin kopmasını önlemek için ortam önceden 37 °C'ye ısıtılmalı ve doku kültürü plakaları, plakaların soğumasını ve hücrelerin kopmasını önlemek için oda sıcaklığında çok uzun süre tutulmamalıdır. Jelatin pistonlarının tüm hücre tabakasını aktarmak için pNIPAAm kaplı plakalarda olması için en uygun zamanı belirlemek de önemlidir. ASC'lerin bir arada olması ve tüm sayfanın aktarılması gerekir. Üst hücre tabakasının jelatinten tamamen ayrılıp bağlanmak için zamanı yoksa, hücre sayfası aktarım sırasında kırılır. Tüm hücre örtüsü tamamen aktarılırsa, ASC'ler şamandıra meme dokusunu sandviçleyemez.

HBT'yi sandviç yapmak için kullanılan ASC'ler, ECM salgılayan meme mikroçevriminin normal stromal hücreleri, büyüme faktörleri ve BC20'yietkileyen sitokinlerdir. HBT'yi iki hücre sayfası arasında sandviç yapmak için ASC levhaları termresponsif doku kültürü plakaları kullanılarak aktarılır. Bu, ASC'ler tarafından salgılanan yerel ECM'nin sağlam olmasını sağlar ve şamandıra adipositlerini dokuya tutturmaya yarar. İnsan meme dokusundan türetilen ASC'leri kullanarak, ASC'lerin kanser hücreleriyle olan etkileşimlerinin meme kanserinde meydana gelenleri taklit edeceğini sağlar, çünkü farklı depolardan ASC'ler farklı gen ekspresyosu ve ECMtadilatı 21.

İkinci kritik adım HBT'nin işlenmesidir. Dokunun canlılığını korumak için yeni izole edilmiş HBT kullanmak gerekir. HBT'yi işlerken, dokuyu ince bir şekilde kıymak ve fasyanın mümkün olduğunca çoğunu çıkarmak önemlidir. HBT'de büyük fasya parçaları bırakılırsa, bu hücre tabakalarının şamandıra dokusunu düzgün bir şekilde tutturmasını önleyecektir. Ek olarak, dokuda kalan fasya plakadan ayrılabilir ve daha fazla deney için kuyuyu kullanılamaz hale getirmek için HBT'nin birden fazla kümesini çeker. HBT, üst hücre tabakasını eklemeden önce kuyunun ortasına yerleştirilmelidir, aksi takdirde ASC'ler HBT'yi yeterince sandviçleyemez ve kuyuların kenarındaki doku tutturulamaz. Bu kritik adımlar izlenirse, BC-MPS üretim süreci doğrudan kurulum için ileriye doğru yapılır.

Burada ayrıntılı olarak açıklanan model, olgun adipositleri, ECM'yi ve yerleşik bağışıklık hücrelerini koruyan primer HBT'nin doğal mikroçevriminde BC'yi incelemek için geliştirilmiş bir sistemdir (Şekil 4). Yağ mikroçevrimini taklit eden klinik öncesi modeller, olgun adipozitler, bağışıklık hücreleri, fibroblastlar ve ECM gibi mikroçevrinin birden fazla unsurundan yoksundur. Tamamen olgun HBT kullanmak,22 , 23 , 24,25sinyalleme yoluyla kanser gelişimini, ilaç yanıtını ve invazivliği etkileyen birden fazla unsur içeren bu karmaşık ortamın eşzamanlı ve karşılıklı sorgulandırılmasına izin verir. Yerleşik fibroblastlar ve ASC'ler, DOKUDA ECM'nin yeniden şekillendiricisi ve26,27parakrin sinyal yoluyla kanser metastazını etkiler. ECM ve tadilatı metastazın başlatılması için gereklidir. Tümör mikroçevriminin ECM'sindeki değişiklikler M.Ö.'nün göç ve metastazını etkiler, ancak çoğu BC çalışması yerel ECM'yi çalışmalarına dahil etmez ve bunun yerine kollajen I veya matrigel28,29'danoluşan basitleştirilmiş modeller kullanır. BC-MPS'deki ECM, HBT'den ve ASC'lerdendir. Böylece meme dokusundaki tümör mikroçevriminde yerli ECM'nin yeniden şekillendirilme ve metastazı etkileme şekli incelenebilir. Bu nedenle, bu BC-MPS modeli, önceki model sistemlerinde olmayan tümör mikroçevretmenin birden fazla unsurunun bir araya geldiğini içerir.

Bu model, tamamen olgun adipositler ve BC hücreleri arasındaki metabolik çapraz sapı incelemek için kullanılabilir. Adipositler ve kanser hücreleri arasındaki etkileşimi inceleyen önceki modeller in vitro olarak farklılaştırılmış pre-adipositler kullanır. In vitro olarak farklılaşan pre-adipositler, in vivo30,31olarak farklılaşan adipositlerle aynı ölçüde tam olarak olgunlaşmaz. Adipositlerin kanser ilerlemesini ve ilaç tepkisini nasıl etkilediğini anlamak için, yerli adipositlerin karmaşık moleküler ve kimyasal bileşimini düzgün bir şekilde taklit etmek hayati önem taşır. Burada sistemimizin adipositler ve BC hücreleri arasında meydana gelen metabolik çapraz sapı değerlendirmeye izin verdiğini gösterdik (Şekil 4).

BC-MPS, standart hücre hatları kullanılarak düzgün bir şekilde modellenemeyen obezite gibi durumların kanserin ilerlemesini nasıl etkilediğine dair in vitro çalışmanın yapılmasında da kullanılabilir. Obezite, HBT mikroçevriminin değişmesi ve M.Ö.'de metastazdaki artışla ilişkilidir, ancak kesin mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır32,33,34. Fibroblastlar, ASC'ler, adipositler ve ECM obezite sırasında değiştirilir ve kanserin ilerlemesini ve metastazını daha da teşvik eder25,35,36. Bu nedenle, stromal hücrelerde ve ECM'de meydana gelen bu değişikliklerin M.Ö.'leri nasıl etkilediğini anlamak için obez dokudan doğal stromal hücreler ve ECM kullanmak önemlidir. BC-MPS modelinde obez veya yağsız hastalardan HBT ve ASC'ler kullanılarak obezitenin metastatik bir fenotipi teşvik ettiği mekanizmalar aydınlatılabilir.

Burada sunulan yöntem, ASC'leri, olgun adipositleri ve yerel ECM'yi kapsayan bir kültürde meme kanseri hücrelerini kültleme içindir. Ortak kültür sistemlerinin önceki modelleri, stromal ortamın bu bireysel farklı unsurlarının kanseri nasıl etkilediğini incelemiştir. ASC'ler ve adipositler M.Ö. ilerlemesini etkilediği için, M.Ö.'yü etkilemekten hangi hücre tipinin sorumlu olduğunu belirlemek karmaşık olabilir. Ancak bu, BC-MPS'nin tek hücre tipine sahip daha basit ortak kültür modelleriyle karşılaştırılmasıyla belirlenebilir. Bu sistemin çip üzerinde veya biyobaskı sistemlerine kıyasla avantajlarından biri, sistemi ticari olarak mevcut olan pNIPAAm kaplamalı plakaların ötesinde kurmak için özel bir ekipmana ihtiyaç duyulmamasıdır. Meme dokusunun model sistemleri daha önce, ASC'leri daha sonra kültürde farklılaştırılmış iskelelere yatırmak için biyobaskı kullanılarak tanımlanmıştır22. Bu, hücrelerin farklılaşması için ek 2-3 hafta gerektirir ve kültürde farklılaşan ASC'ler olgun adipositler için tam olarak ayırt edilmez. BC-MPS'deki HBT'den olgun adipozitler bir hastadan çıkarıldıkları anda kullanılmaya hazırdır.

Burada açıklanan model sistemi, kanser hücreleri ve mikroçevrim arasındaki çapraz sapı incelemek için yararlı bir sistemdir, ancak bazı sınırlamaları vardır. Başlıca sınırlamalardan biri birincil insan meme dokusunun mevcudiyetidir. İnsan yağ dokusu canlılık kaybı olmadan kriyoprezerserved edilemez ve bu nedenle BC-MPS yapımında kullanılan dokunun taze olarak elde edilmesi ve kullanılması gerekir37. Başka bir sınırlama, burada sunulan modelin normal 6 kuyu plakasında kültürlenen statik bir sistem olmasıdır. Sistem, oksijen ve besin kullanılabilirliğini, saf stresi ve ilaç dağıtımını etkileyebilecek çip üzerindeki organlarda bulunan mikroakışkan akışa sahip değildir38,39. Üçüncü bir sınırlama, farklı hücre türlerinin ayrı ayrı analiz edilmesi gerekiyorsa, deney sonunda hücrelerin birbirinden ayrılması gereğidir. Bu, hücreleri birbirlerinden ayrılabilmeleri için etiketleme gereksinimi gerektirir.

Tümör mikroçevriminin birçok elementinin birleştirilmesi, kanserin ilerlemesini ve metastazın başlatılmasını incelemek için fizyolojik bir model üretir. BC-MPS, kanser hücrelerini daha fizyolojik bir modelde inceleyebilmenin yanı sıra, mikroçevrinin bireysel unsurlarını ve kanserden nasıl etkilendiklerini incelemek için de kullanılabilir. Burada temsil edilen veriler BC-MPS'nin tek bir hücre hattı ile nasıl kullanılabileceğini gösterirken, BC-MPS bir araştırmacının özel deneysel ihtiyacına uyacak şekilde kolayca uyarlanabilir. Örneğin, obez HBT, obezitenin kanser metastazını ve ilerlemesini nasıl etkilediğini belirlemek için yağsız HBT ile karşılaştırılabilir. BC'nin farklı alt tipleri, kanserin alt tiplerinin mikroçevrimle nasıl farklı etkileşime girdiğini incelemek için BC-MPS'ye tohumlanabilir. Gen düzenleme teknikleri, belirli genlerin BC ve mikroçevrim arasındaki etkileşimi nasıl etkilediğini belirlemek için kullanılabilir. Bu model ve uygulamaları, stromal ortamın ve meme kanserinin kanserin ilerlemesini ve metastazını teşvik etmek için nasıl etkileşime girdiğinin daha doğru anlaşılmasını sağlayacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar rakip çıkarları olmadığını beyan ederler.

Acknowledgments

Tulane Akış Sitometri ve Hücre Sıralama Çekirdeği'nin yanı sıra Tulane Histoloji Çekirdeği'ne de teknik destekleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma Southeastern Society of Plastic &Reconstructive Surgeons 2019 Research Grant ve National Science Foundation (EPSCoR Track 2 RII, OIA 1632854) tarafından desteklendi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accumax Innovative Cell Technologies 1333 Cell disassoication solution for separation of BC-MPS
Accutase Corning 25-058-CI Cell detachment solution for passaging of cells
BioStor Container 16oz National Scientific Supply Co MPCE-T016 For Transport of sterile tissue
Cell Culture 75 cm flasks Corning 430641U For culturing ASCs
Conical Tubes 15mL  ThermoScientific 339650
Curved Forceps ThermoScientific 1631T5 For maneuvering tissue while mincing 
DMEM low glucose, w/ Glutamax Gibco 10567-014 For culturing ASCs and BC-MPS
FBS Qualified Gibco 26140-079
Gelatin Sigma G9391
HBSS 10x Gibco 14185-052
NaOH Sigma 221465
Nunc UpCell 6 well plates ThermoScientific 174901 Top ASC cell sheet
PBS Gibco 10010-023
Pen/Strep 5,000U Gibco 15070-063
Petri Dish 150 cm FisherBrand FB0875714 For holding tissue while mincing 
Razor Blades VWR 55411-055 Single Edge for mincing tissue
Strainer 250um  ThermoScientific 87791 For separation of BC-MPS
Tissue Culture 6 well plates Corning 3506 Bottom ASC cell Sheet
Weights/Washers BCP Fasteners BCP672 For weighing plungers down 1/2" inner diameter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DeSantis, C. E., et al. Breast cancer statistics, 2019. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 69, (6), 438-451 (2019).
  2. NIH Categorical Spending -NIH Research Portfolio Online Reporting Tools (RePORT). Available from: https://report.nih.gov/categorical_spending.aspx (2020).
  3. Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. Estimation of clinical trial success rates and related parameters. Biostatistics. 20, (2), 273-286 (2019).
  4. Sutherland, M. L., Fabre, K. M., Tagle, D. A. The National Institutes of Health Microphysiological Systems Program focuses on a critical challenge in the drug discovery pipeline. Stem Cell Research & Therapy. 4, Suppl 1 1 (2013).
  5. Wang, X., et al. Breast tumors educate the proteome of stromal tissue in an individualized but coordinated manner. Science Signaling. 10, (491), (2017).
  6. Lau, F. H., et al. Sandwiched white adipose tissue: A microphysiological system of primary human adipose tissue. Tissue Engineering. Part C, Methods. 24, (3), 135-145 (2018).
  7. Scahill, S. D., Hunt, M., Rogers, C. L., Lau, F. H. A microphysiologic platform for human fat: sandwiched white adipose tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e57909 (2018).
  8. Yu, G., et al. Adipogenic differentiation of adipose-derived stem cells. Adipose-Derived Stem Cells. 702, 193-200 (2011).
  9. Bunnell, B., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: Isolation, expansion and differentiation. Methods. 45, (2), 115-120 (2008).
  10. Ebara, M., Hoffman, J. M., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. Surface modification of microfluidic channels by UV-mediated graft polymerization of non-fouling and 'smart' polymers. Radiation Physics and Chemistry. 76, (8-9), 1409-1413 (2007).
  11. Lin, J. B., et al. Thermo-responsive poly(N-isopropylacrylamide) grafted onto microtextured poly(dimethylsiloxane) for aligned cell sheet engineering. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 99, 108-115 (2012).
  12. Turner, W. S., Sandhu, N., McCloskey, K. E. Tissue engineering: Construction of a multicellular 3D scaffold for the delivery of layered cell sheets. Journal of Visualized Experiments. (92), e51044 (2014).
  13. Tinkercad. Create 3D digital designs with online CAD. Tinkercad. (2020).
  14. Halfter, K., Mayer, B. Bringing 3D tumor models to the clinic - predictive value for personalized medicine. Biotechnology Journal. 12, (2), (2017).
  15. Wang, Y. Y., et al. Mammary adipocytes stimulate breast cancer invasion through metabolic remodeling of tumor cells. JCI insight. 2, (4), 87489 (2017).
  16. Qiu, B., Simon, M. BODIPY 493/503 staining of neutral lipid droplets for microscopy and quantification by flow cytometry. Bio-Protocols. 6, (17), 1912 (2016).
  17. Fotos, J. S., et al. Automated time-lapse microscopy, and high-resolution tracking of cell migration. Cytotechnology. 51, (1), 7-19 (2006).
  18. Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. Journal of Cell Biology. 209, (1), 163-180 (2015).
  19. Akiyama, Y., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. Ultrathin poly(N-isopropylacrylamide) grafted layer on polystyrene surfaces for cell adhesion/detachment control. Langmuir: the ACS Journal of Surfaces and Colloids. 20, (13), 5506-5511 (2004).
  20. Shingyochi, Y., Orbay, H., Mizuno, H. Adipose-derived stem cells for wound repair and regeneration. Expert Opinion on Biological Therapy. 15, (9), 1285-1292 (2015).
  21. Tokunaga, M., et al. Fat depot-specific gene signature and ECM remodeling of Sca1(high) adipose-derived stem cells. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 36, 28-38 (2014).
  22. Belgodere, J. A., et al. Engineering breast cancer microenvironments and 3D bioprinting. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 66 (2018).
  23. Cao, Y. Adipocyte and lipid metabolism in cancer drug resistance. The Journal of Clinical Investigation. 129, (8), 3006-3017 (2019).
  24. Dirat, B., et al. Cancer-associated adipocytes exhibit an activated phenotype and contribute to breast cancer invasion. Cancer Research. 71, (7), 2455-2465 (2011).
  25. Druso, J. E., Fischbach, C. Biophysical properties of extracellular matrix: Linking obesity and cancer. Trends in Cancer. 4, (4), 271-273 (2018).
  26. Luo, H., Tu, G., Liu, Z., Liu, M. Cancer-associated fibroblasts: A multifaceted driver of breast cancer progression. Cancer Letters. 361, (2), 155-163 (2015).
  27. Chandler, E. M., et al. Implanted adipose progenitor cells as physicochemical regulators of breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, (25), 9786-9791 (2012).
  28. Oskarsson, T. Extracellular matrix components in breast cancer progression and metastasis. The Breast. 22, 66-72 (2013).
  29. Liu, J., et al. Collagen 1A1 (COL1A1) promotes metastasis of breast cancer and is a potential therapeutic target. Discovery Medicine. 25, (139), 211-223 (2018).
  30. Ahfeldt, T., et al. Programming human pluripotent stem cells into white and brown adipocytes. Nature Cell Biology. 14, (2), 209-219 (2012).
  31. Volz, A. -C., Omengo, B., Gehrke, S., Kluger, P. J. Comparing the use of differentiated adipose-derived stem cells and mature adipocytes to model adipose tissue in vitro. Differentiation; Research in Biological Diversity. 110, 19-28 (2019).
  32. Zimta, A. A., et al. Molecular links between central obesity and breast cancer. International Journal of Molecular Sciences. 20, (21), 5364 (2019).
  33. Bousquenaud, M., Fico, F., Solinas, G., Rüegg, C., Santamaria-Martínez, A. Obesity promotes the expansion of metastasis-initiating cells in breast cancer. Breast Cancer Research. 20, (1), 104 (2018).
  34. Robado de Lope, L., Alcíbar, O. L., Amor López, A., Hergueta-Redondo, M., Peinado, H. Tumour-adipose tissue crosstalk: fuelling tumour metastasis by extracellular vesicles. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373, (1737), 20160485 (2018).
  35. Insua-Rodríguez, J., Oskarsson, T. The extracellular matrix in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 41-55 (2016).
  36. Sabol, R. A., et al. Leptin produced by obesity-altered adipose stem cells promotes metastasis but not tumorigenesis of triple-negative breast cancer in orthotopic xenograft and patient-derived xenograft models. Breast Cancer Research: BCR. 21, (1), 67 (2019).
  37. Cui, X. D., Gao, D. Y., Fink, B. F., Vasconez, H. C., Pu, L. L. Q. Cryopreservation of human adipose tissues. Cryobiology. 55, (3), 269-278 (2007).
  38. Skardal, A., Shupe, T., Atala, A. Organoid-on-a-chip and body-on-a-chip systems for drug screening and disease modeling. Drug Discovery Today. 21, (9), 1399-1411 (2016).
  39. Clark, A. M., Allbritton, N. L., Wells, A. Integrative microphysiological tissue systems of cancer metastasis to the liver. Seminars in Cancer Biology. (2020).
Mikrofizyolojik Sistem Kullanarak İnsan Meme Dokusunda Meme Kanseri Modellemesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brown, L. M., Hebert, K. L., Gurrala, R. R., Byrne, C. E., Burow, M., Martin, E. C., Lau, F. H. Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System. J. Vis. Exp. (170), e62009, doi:10.3791/62009 (2021).More

Brown, L. M., Hebert, K. L., Gurrala, R. R., Byrne, C. E., Burow, M., Martin, E. C., Lau, F. H. Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System. J. Vis. Exp. (170), e62009, doi:10.3791/62009 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter