Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

माउस हिंडलिब में लेजर डॉप्लर परफ्यूजन इमेजिंग

Published: April 18, 2021 doi: 10.3791/62012
Automatic Translation
1,2, 2
1Division of Vascular Surgery, University of Washington, 2VA Puget Sound Health Care System

Summary

यहां, हम एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं जो माउस हिंडलिम्ब में रक्त प्रवाह को मापने के लिए लेजर डॉप्लर परफ्यूजन इमेजिंग के लिए तकनीक और आवश्यक नियंत्रण को दर्शाता है।

Abstract

प्रयोगात्मक हिंडलम्ब इस्केमिया या इस्केमिया-रिफ्यूजन के बाद रक्त प्रवाह वसूली एक महत्वपूर्ण परिणाम उपाय है। लेजर डॉप्लर परफ्यूजन इमेजिंग (एलडीपीआई) रक्त प्रवाह वसूली का आकलन करने के लिए एक आम, गैर-विकासशील, दोहराने योग्य विधि है। तकनीक की वजह से आवृत्ति में डॉप्लर बदलाव से नमूना ऊतक में समग्र रक्त प्रवाह की गणना करता है जब एक लेजर लाल रक्त कोशिकाओं चलती हिट । माप मनमाने ढंग से पर्फ्यूजन इकाइयों में व्यक्त किए जाते हैं, इसलिए पैर पर कॉन्ट्रालेटरल गैर-हस्तक्षेप आमतौर पर माप को नियंत्रित करने में मदद करने के लिए उपयोग किया जाता है। माप गहराई 0.3-1 मिमी की सीमा में है; हिंडलिब इस्केमिया के लिए, इसका मतलब है कि डर्मल परफ्यूजन का आकलन किया जाता है। डर्मल परफ्यूजन कई कारकों पर निर्भर है- सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि त्वचा का तापमान और एनेस्थेटिक एजेंट, जिसे विश्वसनीय रीडिंग के परिणामस्वरूप सावधानीपूर्वक नियंत्रित किया जाना चाहिए। इसके अलावा, बाल और त्वचा रंजकता लेजर की क्षमता को बदल या तो पहुंचने या डर्मिस में प्रवेश कर सकते हैं । यह लेख माउस हिंडलिम्ब में एलडीपीआई की तकनीक को दर्शाता है।

Introduction

अपर्याप्त घाव भरने के साथ त्वचा के छाले मानव रोगियों में विच्छेदन का एक प्रमुख कारण है1. पर्याप्त घाव भरने के लिए अक्षुण्ण त्वचा को बनाए रखने के लिए आवश्यक धमनी परफ्यूजन के उच्च स्तर की आवश्यकता होती है, जो परिधीयधमनी रोग2,3, 4के रोगियों में समझौता कियाजाताहै। कई अन्य रूमाटोलॉजिक स्थितियां और मधुमेह भी घावों को ठीक करने के लिए परेशान और अपर्याप्त त्वचा माइक्रोसर्कुलेशन का कारण बन सकता है5,6 कई मधुमेह रोगियों को सहवर्ती परिधीय धमनी रोग होता है, उन्हें विच्छेदन के लिए विशेष रूप से उच्च जोखिम पर रखते हैं। लेजर डॉप्लर पर्फ्यूजन इमेजिंग (एलडीपीआई) का उपयोग नैदानिक स्थितियों में त्वचा माइक्रोसर्कुलेशन का मूल्यांकन करने के साथ-साथ अनुसंधान स्थितियों में प्रयोगात्मक हिंडलिब इस्केमिया, इस्केमिया-रिफ्यूजन, और माइक्रोसर्जिकल फ्लैप्स 7 के बाद रक्त प्रवाह और रक्त प्रवाह वसूली का मूल्यांकन करने के लिए कियाजाताहै।

एलडीपीआई सिस्टम एक कम पावर लेजर बीम प्रोजेक्ट करता है जिसे ब्याज के क्षेत्र में स्थानांतरित करने के लिए स्कैनिंग मिरर द्वारा विक्षेपित किया जाता है। यह लेजर डॉप्लर फ्लोमेट्री से अलग है, जो प्रवाह जांच8के साथ सीधे संपर्क में ऊतक के छोटे क्षेत्र के लिए एक परफ्यूजन माप प्रदान करता है। जब लेजर बीम माइक्रोवैस्कुलेचर में रक्त ले जाने के साथ बातचीत करता है, तो यह डॉप्लर फ्रीक्वेंसी शिफ्ट से गुजरता है, जिसे स्कैनर द्वारा फोटो पता लगाया जाता है और मनमाने ढंग से परफ्यूजन इकाइयों में परिवर्तित किया जाता है। क्योंकि एलडीपीआई एक प्रकाश-आधारित तकनीक है, यह 0.3-1 मिमी तक प्रवेश की गहराई के संदर्भ में सीमित है, जिसका अर्थ है कि अधिकांश भाग के लिए डर्मल परफ्यूजन का मूल्यांकन7है। डर्मल प्रवाह को त्वचा के तापमान और सहानुभूति तंत्रिका तंत्र द्वारा बदला जा सकता है, जो विभिन्न संवेदनाहारी एजेंटों द्वारा प्रभावित हो सकता है9। ऑप्टिकल लेजर से माप भी परिवेश प्रकाश की स्थिति, त्वचा पिगमेंटेशन से प्रभावित होते हैं, और 7 फर याबालोंको ओवरलाइंग करके अवरुद्ध किया जा सकता है।

एलडीपीआई इस्केमिया के बाद पर्फ्यूजन रिकवरी की निगरानी करने के लिए सबसे अधिक उपयोग की जाने वाली शोध तकनीक है क्योंकि यह noninvasive है, इसके विपरीत प्रशासन की आवश्यकता नहीं है, और कई जानवरों पर डेटा संग्रह की अनुमति देने वाले त्वरित स्कैन समय हैं। यह यह निर्धारित करने में मदद करने के लिए आदर्श बनाता है कि चिकित्सीय धमनी विज्ञान या एंजियोजेनेसिस के उद्देश्य से उपचार छोटे पशु मॉडल में प्रभावी हैं या नहीं। एलएलडीपीआई द्वारा मापा जाने वाला हिंडलिब इस्केमिया के बाद रक्त प्रवाह वसूली कोलैटरल धमनी विकास के साथ अच्छी तरह से सहसंबंधित करता है जब माइक्रोफिल कास्टिंग या माइक्रो-सीटी10, 11जैसे अन्य साधनों से मूल्यांकन कियाजाताहै। इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य एलडीपीआई का उपयोग करके हिंडलिब परफ्यूजन के आकलन को प्रदर्शित करना है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

वाशिंगटन विश्वविद्यालय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित एक प्रोटोकॉल के अनुसार पशु प्रयोग किए गए थे ।

1. स्कैनर की तैयारी

  1. स्कैनर ऊंचाई को समायोजित करें ताकि स्कैन किए गए विषय की दूरी लगभग 30 सेमी हो।
  2. इमेजर चालू करें और संबंधित सॉफ्टवेयर लॉन्च करें।
  3. माप कार्यक्रम खोलें। यदि सॉफ्टवेयर स्कैनर के साथ सही ढंग से संवाद कर रहा है, तो चेतावनी पर अवरक्त लेजर टर्न दिखाई देगा।
  4. निर्माता प्रदान मानकों के साथ मशीन कैलिब्रेट (वीडियो में नहीं दिखाया गया है और मशीन के विशिष्ट मॉडल पर निर्भर करेगा इस्तेमाल किया जा रहा है) ।
  5. कमरे में पृष्ठभूमि सामग्री और प्रकाश सेटअप के लिए उपयुक्त होने के लिए स्कैनर सेटिंग्स को समायोजित करें।
    1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार लाभ स्तर डीसी फ्लक्स और कॉनीसेट करें (वीडियो में नहीं दिखाया गया है)।
    2. काले पृष्ठभूमि सामग्री पर लेजर बीम की ओर इशारा करते हुए पृष्ठभूमि सीमा सेट करें, और ऑटो बीके सेट दबाएं।

2. माउस पूर्व स्कैनिंग तैयारी

  1. अपशिष्ट गैस की उचित सफाई के साथ आइसोफ्लुरेन इंडक्शन चैंबर की स्थापना करें।
    नोट: एक वार्मिंग पैड पर इंडक्शन चैंबर रखने संज्ञाहरण प्रेरण के दौरान माउस तापमान हानि को रोकने में मदद मिलेगी ।
  2. होमथॉथर्मिक कंबल चालू करें, जिसे एक गैर-पेशेवर सतह के नीचे स्कैनिंग क्षेत्र में रखा जाता है (इस मामले में एक काला नियोप्रीन कपड़ा)। 37 डिग्री सेल्सियस के शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए होमथॉर्मिक कंबल सेट करें।
  3. होमथॉर्मिक कंबल और स्नेहक के लिए तापमान जांच की स्थिति ताकि वे प्रविष्टि के लिए तैयार हों।
  4. स्कैनिंग एरिया में एनेस्थीसिया मास्क और मैला ढोने की व्यवस्था रखें।
  5. माउस को आइसोफ्लुरेन वाष्पीकरण के साथ एनेस्थेटाइज करें। ऑक्सीजन दर को 1 एल/मिन प्रवाह में सेट करें और एनेस्थीसिया प्रेरण के लिए आइसोफ्लुन को 4% तक समायोजित करें । संज्ञाहरण प्रेरण कक्ष में प्रवाह चालू करें, और माउस श्वास दर धीमी हो जाएगी। पर्याप्त संज्ञाहरण तब प्राप्त होता है जब माउस अपना सही पलटा खो देता है।
  6. माउस को संलग्न अपशिष्ट गैस मेहतर के साथ एनेस्थेटिक मास्क/नाक शंकु में स्थानांतरित करें और आइसोफलुनेन को 1.5% तक समायोजित करें।
    नोट: यह संज्ञाहरण स्तर आम तौर पर स्कैनिंग के दौरान अपेक्षाकृत अभी भी झूठ बोल माउस रखने के लिए पर्याप्त है, लेकिन संज्ञाहरण के शल्य चिकित्सा स्तर प्रदान करने का इरादा नहीं है, तो संज्ञाहरण की गहराई की जांच नहीं की है । आइसोफ्लुन के स्तर को बदलने से दिल की धड़कन, श्वसन और डर्मल परफ्यूजन में परिवर्तन होता है, इसलिए किसी भी समय पाठ्यक्रम प्रयोग में और सभी प्रयोगात्मक विषयों के लिए एक सुसंगत प्रतिशत का उपयोग किया जाना चाहिए। वैकल्पिक एनेस्थेटिक तकनीक जैसे केटामाइन जाइलाज़ीन के आईपी इंजेक्शन का भी उपयोग किया जा सकता है, लेकिन एक ही एनेस्थेटिक तकनीक का उपयोग किसी भी समय पाठ्यक्रम अध्ययन में किया जाना चाहिए क्योंकि विभिन्न एनेस्थेटिक्स डर्मल परफ्यूजन को अलग-अलग प्रभावित करते हैं।
  7. (स्कैनिंग क्षेत्र के आधार पर वैकल्पिक) यदि स्कैन किए जाने वाले ब्याज के नियोजित क्षेत्र को फर द्वारा कवर किया जाता है, तो ब्याज के क्षेत्र से बालों को हटाने के लिए एक छोटे इलेक्ट्रिक ट्रिमर या डिपिलेटरी क्रीम का उपयोग करें।
    नोट: डिपिलेटरी क्रीम को पूरी तरह से हटा दिया जाना चाहिए, और माउस की त्वचा स्कैनिंग से पहले सूख जाती है।
  8. माउस को होमथेरेमेटिक कंबल को कवर करने वाली काले गैर-महंगाई की सतह पर उपयुक्त स्कैनिंग स्थिति में रखें, इस बात की पुष्टि करते हुए कि दोनों हिंडलंब पूरे समतुल्यता और स्कैनिंग(चित्रा 1)में गर्मी के स्रोत पर रहते हैं।
    नोट: तापमान में क्षेत्रीय भिन्नता को रोकने के लिए होमथॉर्मिक कंबल पर दोनों पैरों को बनाए रखना महत्वपूर्ण है।
  9. होमथॉर्मिक कंबल से जुड़े लुब्रिकेटेड गुदा तापमान जांच डालें।
  10. माउस के तापमान को वांछित स्कैनिंग तापमान (37 डिग्री सेल्सियस) तक सीमित करें; लगभग 5-10 मिनट।
  11. स्कैनर सेटअपका चयन करें, जिसे शीर्ष मेनू से या स्कैनर सेटअप आइकन से एक्सेस किया जा सकता है। रुचि के क्षेत्र को समायोजित करने के लिए एक्स-वाई निर्देशांक बदलकर स्कैन क्षेत्र को समायोजित करें। स्कैन गति स्कैन रिज़ॉल्यूशन पर निर्भर करेगी। उच्च संकल्प अब स्कैन समय में परिणाम होगा । वैश्विक परफ्यूजन पर ध्यान केंद्रित करते हुए दोहराने वाली स्कैनिंग के लिए, शारीरिक परफ्यूजन पर ध्यान केंद्रित करने वाले उच्च संकल्प के विपरीत, 4 एमएस/पिक्सेल की स्कैन गति पर्याप्त है।
    नोट: उच्च संकल्प और एकल स्कैन पर विचार किया जाना चाहिए अगर शोधकर्ता सीधे विकासशील जमानत परिसंचरण का अध्ययन करने का प्रयास कर रहा है (सबसे अच्छा वेंट्रल जांघ और बछड़े में छवि जहां यह त्वचा के करीब है) । माउस फुटपैड के अंतिम अंग के लिए वैश्विक परफ्यूजन का आकलन करते समय कम रिज़ॉल्यूशन/स्पीड (जैसे, 4 एमएस/पिक्सेल) पर बार-बार स्कैन पर्याप्त होता है । वीडियो में दिखाया गया सॉफ़्टवेयर पुनः आरंभ होने पर स्कैनिंग क्षेत्र, गति और रिज़ॉल्यूशन के लिए पहले से उपयोग किए गए टेम्पलेट को स्वचालित रूप से लोड करता है, या यदि विभिन्न प्रयोगों के लिए रुचि के विभिन्न क्षेत्रों का उपयोग किया जा रहा है तो इसे संग्रहीत फ़ाइल से वापस लाया जा सकता है।
  12. यदि रिपीट स्कैन करते हैं, तो रिपीट और लाइन स्कैन टैब चुनें। स्कैन की संख्या (इस मामले में 3 स्कैन) के साथ-साथ दोहराने के अंतराल को बदला जा सकता है। दोहराने के अंतराल के लिए न्यूनतम समय अनुमानित स्कैनिंग समय होगा, जो स्कैन क्षेत्र और स्कैन रिज़ॉल्यूशन द्वारा निर्धारित बॉक्स के दाईं ओर ग्रे-आउट क्षेत्र में दिखाया गया है। कुछ सेकंड जोड़ने से उपयोगकर्ता को स्कैन के बीच आवश्यक होने पर माउस को थामने और संभावित रूप से फिर से स्थान देने की अनुमति देता है।

3. स्कैनिंग

  1. इमेज स्कैन टैब चुनें और मार्क बटन चुनें। लेजर स्कैनिंग क्षेत्र की रूपरेखा के लिए कदम होगा। माउस की स्थिति को समायोजित करें ताकि स्कैन किया जाने वाला लक्ष्य चिह्नित क्षेत्र के भीतर हो।
    नोट: फुटपैड या फुटपैड और बछड़े की स्कैनिंग के लिए, विस्तारित हिंडलिम्ब्स के साथ प्रवण स्थिति रीढ़ की स्थिति की तुलना में ब्याज का एक अधिक सुसंगत क्षेत्र प्रदान करती है। ऊर्ध्वाधर धमनी और सैफेनस धमनी और कोलैटरल जांघ और बछड़े की वेंट्रल सतह के बहुत करीब हैं, इसलिए ब्याज के इन क्षेत्रों का उपयोग करते हुए यदि रीढ़ की स्थिति को प्राथमिकता दी जाती है।
  2. रिपीट स्कैनिंग आइकन का चयन करके दोहराया माप शुरू करें और स्कैन शुरू करने के लिए प्ले बटन दबाएं।
  3. पॉप-अप विंडो में स्कैनिंग की दूरी की पुष्टि करें और स्कैनिंग शुरू करने के लिए ओके पर क्लिक करें।
  4. माउस आंदोलन के लिए स्कैनिंग के दौरान माउस की निगरानी करें; यदि माउस पर्याप्त रूप से चलता है कि हिंडपॉज स्कैन के बीच में स्कैनिंग क्षेत्र में नहीं हैं, तो स्कैन को पुनः आरंभ करें। माउस हिंडपंजा स्थिति में छोटे बदलावों को विश्लेषण सॉफ्टवेयर में समायोजित किया जा सकता है।
  5. स्कैनिंग प्रक्रिया के दौरान माउस के तापमान की निगरानी करें क्योंकि यह होमथेरमिक कंबल के उपयोग के साथ भी उतार-चढ़ाव हो सकता है। यदि माउस के तापमान में बहुत अधिक भिन्नता है, तो इसके परिणामस्वरूप स्कैन के बीच महत्वपूर्ण भिन्नता हो सकती है। आम तौर पर, 36.8-37.2 डिग्री सेल्सियस की तापमान सीमा स्वीकार्य डेटा में परिणाम होगा।
  6. फ़ाइल नाम के साथ सेव एएस विंडो के तहत कैप्चर किए गए स्कैन को सहेजें जिसमें माउस पहचानकर्ता और आसान डेटा विश्लेषण के लिए टाइमपॉइंट शामिल है। विषय विवरण विंडो में वांछित होने पर माउस और टाइमपॉइंट विवरण दर्ज करें।
  7. आइसोफ्लुनान बंद करें और गुदा तापमान जांच को हटा दें।
  8. 70% इथेनॉल के साथ गुदा तापमान जांच को कीटाणुरहित करें ताकि यह अगले माउस में उपयोग के लिए तैयार हो।
  9. माउस को संज्ञाहरण से उस बिंदु तक ठीक होने दें जहां यह पिंजरे में लौटने से पहले रीढ़ की स्थिति से प्रवण स्थिति में फ्लिप करके एक राइटिंग पलटा प्रदर्शित करता है।
    नोट: वसूली या तो isoflurane के लिए एक वार्मिंग कंबल पर किया जा सकता है के बाद से वसूली बहुत जल्दी है या केटामाइन के लिए एक गर्म वसूली पिंजरे में/

4. एलडीपीआई डेटा कैप्चर करना(चित्रा 3)

  1. इमेजिंग रिव्यू सॉफ्टवेयर प्रोग्राम खोलें।
  2. फ़ाइल मेनू पर जाएं, खोलें, और सहेजी गई फ़ाइल का पता लगाएं।
  3. टूलबार से आरओआई आइकन चुनें।
  4. ऐड पॉलीगॉन बटन चुनें।
  5. माउस का उपयोग कर नियंत्रण हिंडलिब के लिए ब्याज (आरओआई) के क्षेत्र का पता लगाइए। बहुभुज ट्रेसिंग को सटीक नहीं होना चाहिए क्योंकि ग्रे पृष्ठभूमि को गणना औसत में शामिल नहीं किया जाएगा।
  6. सर्जिकल हिंडलिम्ब के लिए 4.3-4.5 कदम दोहराएं।
  7. इमेज आरओआई स्टैटिस्टिक्स रिजल्ट्स (पीयू) विंडो खोलने के लिए स्टैटिस्टिक्स आइकन चुनें।
  8. बहुभुज 1 (नियंत्रण हिंडलिब) और बहुभुज 2 (सर्जिकल हिंडलिम्ब) के लिए परिणामों को कॉपी/पेस्ट के माध्यम से डेटा संग्रह वर्कशीट में निर्यात करें ।

5. विश्लेषण

  1. प्रत्येक स्कैन के लिए सर्जिकल/नियंत्रण अनुपात के रूप में डेटा कैप्चर करें ।
  2. उस समय बिंदु पर उस विशेष माउस के लिए डेटा बिंदु के लिए सभी तीन स्कैन के लिए औसत शल्य चिकित्सा/नियंत्रण का उपयोग करें । हिंडलिब इस्केमिया की प्रतिक्रिया में जीवविज्ञान परिवर्तनशीलता के कारण, सामान्य रूप से 8-10 चूहों को ~ 10% मानक त्रुटि के साथ प्रजनन योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए प्रति टाइमपॉइंट की आवश्यकता होती है।
    नोट: माउस को संज्ञाहरण से उबरने की अनुमति देने से पहले, यह जांचने के लिए दोहराया गया स्कैन का त्वरित विश्लेषण करना सार्थक है कि क्या डेटा बहुत परिवर्तनीय है (उदाहरण के लिए, स्कैन 1-3 के बीच अलग 100-150 से अधिक परफ्यूजन इकाइयां)। दोहराया स्कैन के बीच उच्च भिन्नता से पता चलता है माउस स्कैन(चित्रा 2)के दौरान पूरी तरह से संतुलन नहीं था, और एक डेटापॉइंट खोने के बिना एक दोहराने स्कैन किया जा सकता है, जो अगर छवियों को बाद की तारीख तक विश्लेषण नहीं कर रहे है हो जाएगा । प्रदर्शित प्रवाह मूल्यों की गतिशील रेंज को अनुकूलित करने के लिए रंग पैलेट को बदलना बेहतर प्रदर्शन स्कैन भिन्नता(चित्र 2)के लिए आवश्यक हो सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

सफल एलडीपीआई के परिणामस्वरूप तीन स्कैन(चित्रा 2)के बीच 100-150 से अधिक परफ्यूजन यूनिट भिन्नता (माउस फुटपैड के लिए सामान्य औसत परफ्यूजन के लगभग 10% के अनुरूप) के साथ लगातार दोहराए गए उपाय स्कैन होने चाहिए। जैसा कि चित्र 2में दर्शाया गया है, दोहराने वाले स्कैन यह निर्धारित करने में मदद करते हैं कि माउस को उचित रूप से समतुल्य किया गया है ताकि इस्कीमिक/नियंत्रण अनुपात सबसे अधिक अंतर्निहित रक्त प्रवाह को दर्शाता है जैसा कि तापमान भिन्नता के कारण डर्मल परफ्यूजन में भिन्नता के विपरीत है । डेटापॉइंट के लिए एकल स्कैन का उपयोग करने से परिवर्तनशीलता में वृद्धि होगी जिससे अधिक प्रायोगिक चूहों की आवश्यकता होगी। जब हिंडलिब इस्केमिया के लिए उपयोग किया जाता है, तो नियंत्रण हिंडलिम्ब की तुलना में सर्जिकल हिंडलिब को वैश्विक परफ्यूजन में कमी आनी चाहिए थी। परिणाम सर्जिकल हिंडलिब परफ्यूजन/नियंत्रण हिंडलिब परफ्यूजन के अनुपात के रूप में व्यक्त किए जाते हैं । चूंकि चूहों को शुरू में वासोडिल और समय के साथ अपने आंतरिक जमानत नेटवर्क का विकास करना, एलडीपीआई द्वारा रक्त प्रवाह वसूली को पश्चात समय पाठ्यक्रम(चित्रा 4)पर देखा जाना चाहिए। वसूली की डिग्री माउस तनाव और हिंडलिब इस्केमिया मॉडल की गंभीरता पर निर्भर है।

Figure 1
चित्रा 1। वेंट्रल फुटपैड के लेजर डॉप्लर परफ्यूजन इमेजिंग के लिए माउस पोजिशनिंग। आइसोफ्लुन नाक शंकु (ए) का उपयोग करके एनेस्थेटाइज्ड माउस को वेंट्रल फुटपैड की स्कैनिंग की अनुमति देने के लिए विस्तारित हिंडलिम्ब्स के साथ प्रवण स्थिति में रखा गया है। स्कैन के दौरान लगातार शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए होमथॉर्मिक कंबल के लिए गुदा तापमान जांच (पी) जगह में है। होमथॉर्मिक कंबल पैड स्कैन के लिए पृष्ठभूमि प्रदान करने के लिए उपयोग की जाने वाली गैर-महंगाई वाली नेओप्रीन सामग्री के नीचे है। स्कैनिंग क्षेत्र के बीच का संकेत लेजर माउस की पूंछ के बगल में दिखाई दे रहा है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2। माउस तापमान परिवर्तन से स्कैन भिन्नता का प्रदर्शन बेहतर रंग पैलेट समायोजन के साथ देखा। (क)लेजर डॉप्लर बार-बार स्कैन के दौरान माउस कोर तापमान भिन्नता के कारण महत्वपूर्ण भिन्नता के साथ स्कैन करता है, जो बार-बार फ्लक्स स्कैन पर रंग करने के लिए अनुवादित परफ्यूजन इकाइयों के आधार पर दिखाई देता है। (ख) बी में 0-1000 से 0-1500 (लाल तीर) में रंग पैलेट (स्कैन विंडो के बाईं ओर दिखाया गया) पर गतिशील सीमा को बदलना भिन्नता को और अधिक स्पष्ट बनाता है। (ग)ब्याज के क्षेत्र के लिए मतलब perfusion मूल्यों दिखा (लाल रंग में परिक्रमा) नियंत्रण हिंडलिब के लिए (एक और बीमें rfx छवि पर काले रंग में बहुभुज 1) 3स्कैन पर 1st स्कैन करने के लिए ७९१ के लिए ६५५ के बीच पर्वतमाला और के लिए मतलब परफ्यूजन इस्कीमिक हिंडलिब (ए और बीमें आरएफएक्स छवि पर लाल रंग में बहुभुज 2) के लिए ब्याज के क्षेत्र में कम भिन्नता (361 से 400) दिखाई गई, जिससे दोहराए गए स्कैन (0.60, 0.53, के बीच इस्कीमिक/नियंत्रण अनुपात में महत्वपूर्ण अंतर हो गया और 0.46)। (घ)विंडो माप सॉफ्टवेयर (बाएं पैनल) और छवि समीक्षा सॉफ्टवेयर (दाएं पैनल) में रंग पैलेट की गतिशील रेंज को बदलने के लिए। लाल तीर दिखाते हैं कि ऊपरी सीमा को कहां बढ़ाना है या घटाना है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3। बार-बार स्कैन के साथ लेजर डॉप्लर परफ्यूजन इमेजिंग के लिए डेटा कैप्चर। (A)1 के साथ टॉप टूलबार । आरओआई आइकन जोड़ें। 2. पॉलीगॉन आइकन जोड़ें। 3. विषय विवरण आइकन (बीमें विंडो पॉप-अप तक पहुंचता है)। 4. सांख्यिकी आइकन (सीमें विंडो पॉप-अप तक पहुंचता है)। (ख)विषय विवरण खिड़की । (ग)सांख्यिकी खिड़की प्रत्येक आरओआई के लिए मतलब परफ्यूजन मूल्यों (लाल रंग में परिक्रमा) दिखा रही है । (घ)पॉलीगॉन आरओआई के साथ बार-बार स्कैन नियंत्रण हिंडपॉ (काला) और इस्कीमिक हिंड पंजा (लाल) के आसपास का पता लगाया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4। एलडीपीआई डेटा के साथ समय पाठ्यक्रम प्रयोग। P27 नॉकआउट चूहों (3-5 महीने पुरानी महिलाCDKN1b-/-एक C57Bl/6 पृष्ठभूमि पर चूहों) के साथ नैतिक धमनी बंधन के बाद (n = 6) और बिना (n = 10) मौखिक करते हैं उम्र से मेल खाती महिला वाइल्डटाइप C57Bl/6 चूहों के साथ (n =11) और बिना (n=9) मौखिक डॉक्सीसाइक्लिन उपचार (लेखक से अप्रकाशित डेटा) की तुलना में एक्स्सीसाइक्लिन उपचार। त्रुटि सलाखों के मतलब (SEM) के मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

एलडीपीआई के साथ विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए लगातार तकनीक महत्वपूर्ण है। पूरे समय के पाठ्यक्रम में एक ही संवेदनाहारी, तापमान सेटिंग्स, माउस की स्थिति और रुचि के क्षेत्र का उपयोग किया जाना चाहिए। विभिन्न एनेस्थेटिक एजेंटों के परिणामस्वरूप उच्च या कम परफ्यूजन मूल्य9होंगे। इसकी तेजी से शुरुआत और उद्भव के साथ-साथ समग्र सुरक्षा के कारण आइसोफ्लुन एनेस्थीसिया सुविधाजनक है। इस वासोडिलेटरी एजेंट के साथ संज्ञाहरण की गहराई के रूप में आइसोफ्लुरेन का लगातार प्रतिशत इस्तेमाल किया जाना चाहिए त्वचा परफ्यूजन बदल सकता है। यदि ब्याज के क्षेत्र में फर शामिल है, तो बालों को हटाने की एक ही विधि का उपयोग हर बार किया जाना चाहिए, क्योंकि रासायनिक रूप से विघटित चूहों में चूहों की तुलना में अधिक परफ्यूजन मूल्य होंगे जिनके फर को इलेक्ट्रिक क्लिपर्स7के साथ हटा दिया गया था। माउस के तापमान का पर्फ्यूजन इमेजिंग पर बड़ा प्रभाव पड़ता है, 36 डिग्री सेल्सियस पर चूहों के साथ 38 डिग्री सेल्सियस7,12पर चूहों की तुलना में काफी कम परफ्यूजन मूल्य होते हैं। इस्कीमिक हिंडलिब नियंत्रण हिंडलिब(चित्रा 2)की तुलना में क्षेत्रीय तापमान भिन्नता पर भी अलग तरह से प्रतिक्रिया दे सकता है। इस प्रोटोकॉल में, स्कैनिंग के दौरान माउस के तापमान को बनाए रखने के लिए एक होमथथर्मिक कंबल का उपयोग किया जाता है, जो स्कैनिंग प्रक्रिया के दौरान पांच मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस वार्मिंग प्लेट पर माउस को पूर्व-समतुल्य होने की तुलना में अधिक सुसंगत तापमान नियंत्रण प्रदान करता है और फिर एक गैर-गर्म सतह पर स्कैनिंग करता है जैसा कि नियामा एट अलद्वारा दिखाया गया है।

यदि केवल फुटपैड को ब्याज के क्षेत्र के रूप में चुना जाता है, तो ब्याज के स्कैन किए गए क्षेत्र में प्रजनन क्षमता के कारण प्रवण स्थिति को प्राथमिकता दी जाती है। इस दृष्टिकोण का लाभ यह है कि यह दिल से दूर क्षेत्र का अध्ययन करता है, और सबसे चिकित्सकीय प्रासंगिक क्षेत्र जहां इस्कीमिक पैर अल्सर आम हैं। फुटपैड गंजे होते हैं, इसलिए क्लिपिंग या डीपिलेशन आवश्यक नहीं है, माप के लिए तैयारी और समय को सरल बनाता है। इसके अलावा, गैर-सफेद चूहों में बछड़े या जांघ की त्वचा में पिगमेंटेशन के पैच हो सकते हैं, जो एलडीपीआई माप में हस्तक्षेप कर सकते हैं। यदि ब्याज के चुने हुए क्षेत्र में बछड़ा और जांघ शामिल हैं, तो रीढ़ की स्थिति को प्राथमिकता दी जाती है क्योंकि फेमोरल और सैफेनस धमनी हिंडलिब की वेंट्रल सतह के साथ चलती है और एलडीपीआई7का उपयोग करके इमेज की जा सकती है। रीढ़ की स्थिति से, पैर की लगातार इमेजिंग को पकड़ना मुश्किल है, क्योंकि पक्ष और शीर्ष सतहों को भिन्नता रूप से चित्रित किया जा सकता है।

हिंडलिब इस्केमिया के बाद कोलैटरलाइजेशन और ब्लड फ्लो रिकवरी हिंडलिब इस्केमिया मॉडल, माउस स्ट्रेन, जेंडर और उम्र सहित कई अलग-अलग कारकों पर निर्भर है। C57Bl/6 जैसे चूहों के कुछ उपभेदों में मजबूत बेसलाइन कोलैटरल हैं, जिसमें तीव्र हिंडलिब इस्केमिया को शामिल करने के बाद परफ्यूजन में कम नाटकीय गिरावट है, जबकि बाल्ब/सी जैसे अन्य लोगों के पास खराब जमानत14,15है । मादा चूहों में पुरुष चूहों की तुलना में बदतर वसूली होती है। पुराने चूहों में भी छोटे चूहों की तुलना में खराब रक्त प्रवाह वसूली है16. इसलिए, चूहों को एलडीएपीआई डेटा का उपयोग करके रक्त प्रवाह वसूली के बारे में तैयार किए जाने वाले विश्वसनीय निष्कर्षों के लिए तनाव, आयु और लिंग मिलान करने की आवश्यकता होती है। यहां तक कि कठोर मिलान और चूहों के inbred उपभेदों का उपयोग करने के साथ, हिंडलिब इस्केमिया के लिए माउस प्रतिक्रिया के लिए जीवविज्ञान परिवर्तनशीलता की एक निश्चित मात्रा है, इसलिए वैध डेटा के लिए पर्याप्त माउस संख्या (आमतौर पर 8-10 चूहों प्रति टाइमपॉइंट) की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, एलडीपीआई के सामान्यीकरण का मतलब धमनी प्रवाह के सामान्य स्तर की बहाली नहीं है क्योंकि माप एनेस्थेटाइज्ड चूहों में किया जाता है जिनके पास कोई कंकाल मांसपेशियों की मांग नहीं है। अंत में, प्रवेश की गहराई में सीमाओं के कारण, जमानत मार्गों के विस्तृत शारीरिक अध्ययन जो जांघ और बछड़े की गहरी मांसपेशी के माध्यम से चल सकते हैं, एलडीपीआई के साथ संभव नहीं हैं।

त्वचा के परफ्यूजन-आधारित इमेजिंग जैसे लेजर स्पेक्टल इमेजिंग17, 18, 19या गहरी संरचनाओं जैसे कंकाल की मांसपेशी20,एमआरआई21, और (13) एन-अमोनिया पीईटी22के विपरीत-संवर्धित अल्ट्रासाउंड सहित रक्त प्रवाह वसूली का आकलन करने के लिए कई अन्य तरीकों का उपयोग किया गया है। इसके अलावा इस्तेमाल किया जाता है माइक्रो सीटी10,अक्टूबर23,और इंट्राविटल माइक्रोस्कोपी24के साथ इसके विपरीत बढ़ाया अल्ट्रासाउंड जैसे जमानत जहाजों की शारीरिक आधारित इमेजिंग । तेजी से स्कैन समय, डेटा कैप्चर और विश्लेषण की सापेक्ष आसानी, और नसों के विपरीत की आवश्यकता से बचने के कारण, एलडीपीआई साहित्य में अधिकांश समूहों द्वारा उपयोग की जाने वाली प्रमुख विधि है। कमजोरियों में शामिल है कि तकनीक रक्त प्रवाह वेग को मापती है और पूर्ण ऊतक परफ्यूजन को मापने के बजाय मनमाने ढंग से परफ्यूजन इकाइयों में डेटा प्रदान करती है, स्कैनिंग गहराई अपेक्षाकृत उथली है, और यह अपेक्षाकृत खराब शारीरिक विस्तार प्रदान करती है।

एलडीपीआई का उपयोग आमतौर पर विभिन्न हिंडलम्ब इस्केमिया मॉडल 7 के बाद वसूली का आकलन करने के लिए कियाजाताहै। इसका उपयोग इस्केमिया-रिफ्यूजन अनुसंधान में हिंडलिब25 के साथ - साथ गहरे स्प्लेन्च्निक अंगों या रीढ़ की हड्डी26 , 27,28दोनों में भी किया गया है। गहरी संरचनाओं के आकलन को स्कैन करने के लिए संरचना के सर्जिकल एक्सपोजर की आवश्यकता होती है, जिससे बार-बार मापन को निशान के कारण अधिक कठिन बना दिया जाता है। एक और आवेदन माइक्रोसर्जरी29के बाद फ्लैप रिप्रफ्यूजन का आकलन है ।

अंत में, एलडीपीआई समग्र धमनी परफ्यूजन के प्रतिबिंब के रूप में हिंडलिम्ब डर्मल परफ्यूजन को मापने के लिए एक प्रभावी, आसानी से प्रदर्शन करने योग्य और दोहराने योग्य विधि है। विश्वसनीय डेटा प्राप्त करने के लिए एलडीपीआई का उपयोग करते समय लगातार तकनीक की आवश्यकता होती है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

डॉ तांग का खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम वीए प्यूगेट साउंड हेल्थ केयर सेंटर में सुविधाओं और संसाधनों के उपयोग के साथ किया गया था। काम लेखक का है और जरूरी स्थिति या दिग्गजों मामलों के विभाग या संयुक्त राज्य अमेरिका सरकार की नीति को प्रतिबिंबित नहीं करता है । डॉ तांग वर्तमान में VA (योग्यता 5 I01 BX004975-02) के माध्यम से वित्त पोषित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Black nonreflective material Fabric store, black neoprene recommended by company
F/air cannister A.M. Bickford Inc 80120
Homeothermic blanket with rigid metal probe Harvard Apparatus Also comes with flexible probe, but this is less durable
Isoflurane Anesthesia machine Drager Multiple manufacturers
Isoflurane induction chamber VetEquip 941444 2 L chamber
Moor laser Doppler perfusion imager Moor Instruments MoorLDI2-IR Higher resolution imager (MoorLDI2-HIR)
Mouse Anesthesia nose cone Multiple manufacturers
Nair Nair
Oxygen tank Multiple manufacturers
Surgilube Multiple distributors

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Varma, P., Stineman, M. G., Dillingham, T. R. Epidemiology of limb loss. Physical Medicine and Rehabilitation Clinics of North America. 25 (1), 1-8 (2014).
  2. Farber, A. Chronic Limb-Threatening Ischemia. New England Journal of Medicine. 379 (2), 171-180 (2018).
  3. Abularrage, C. J., et al. Evaluation of the microcirculation in vascular disease. Journal of Vascular Surgery. 42 (3), 574-581 (2005).
  4. Houben, A., Martens, R. J. H., Stehouwer, C. D. A. Assessing Microvascular Function in Humans from a Chronic Disease Perspective. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (12), 3461-3472 (2017).
  5. Mahe, G., Humeau-Heurtier, A., Durand, S., Leftheriotis, G., Abraham, P. Assessment of skin microvascular function and dysfunction with laser speckle contrast imaging. Circulation: Cardiovascular Imaging. 5 (1), 155-163 (2012).
  6. Murray, A. K., Herrick, A. L., King, T. A. Laser Doppler imaging: a developing technique for application in the rheumatic diseases. Rheumatology (Oxford). 43 (10), 1210-1218 (2004).
  7. Greco, A., et al. Repeatability, reproducibility and standardisation of a laser Doppler imaging technique for the evaluation of normal mouse hindlimb perfusion. Sensors (Basel). 13 (1), 500-515 (2012).
  8. Sonmez, T. T., et al. A novel laser-Doppler flowmetry assisted murine model of acute hindlimb ischemia-reperfusion for free flap research. PLoS One. 8 (6), 66498 (2013).
  9. Gargiulo, S., et al. Effects of some anesthetic agents on skin microcirculation evaluated by laser Doppler perfusion imaging in mice. BMC Veterinary Research. 9, 255 (2013).
  10. Ankri-Eliahoo, G., Weitz, K., Cox, T. C., Tang, G. L. p27(kip1) Knockout enhances collateralization in response to hindlimb ischemia. Journal of Vascular Surgery. 63 (5), 1351-1359 (2016).
  11. McEnaney, R. M., Shukla, A., Madigan, M. C., Sachdev, U., Tzeng, E. P2Y2 nucleotide receptor mediates arteriogenesis in a murine model of hind limb ischemia. Journal of Vascular Surgery. 63 (1), 216-225 (2016).
  12. Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. Methods for Acute and Subacute Murine Hindlimb Ischemia. Journal of Visualized Experiments. (112), e54166 (2016).
  13. Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. Murine model of hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments. (23), e1035 (2009).
  14. Chalothorn, D., Faber, J. E. Strain-dependent variation in collateral circulatory function in mouse hindlimb. Physiological Genomics. 42 (3), 469-479 (2010).
  15. Helisch, A., et al. Impact of mouse strain differences in innate hindlimb collateral vasculature. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 26 (3), 520-526 (2006).
  16. Faber, J. E., et al. Aging causes collateral rarefaction and increased severity of ischemic injury in multiple tissues. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (8), 1748-1756 (2011).
  17. Forrester, K. R., Stewart, C., Tulip, J., Leonard, C., Bray, R. C. Comparison of laser speckle and laser Doppler perfusion imaging: measurement in human skin and rabbit articular tissue. Medical & Biological Engineering & Computing. 40 (6), 687-697 (2002).
  18. Briers, J. D. Laser Doppler, speckle and related techniques for blood perfusion mapping and imaging. Physiological Measurement. 22 (4), 35-66 (2001).
  19. Heeman, W., Steenbergen, W., van Dam, G., Boerma, E. C. Clinical applications of laser speckle contrast imaging: a review. Journal of Biomedical Optics. 24 (8), 1-11 (2019).
  20. Nguyen, T., Davidson, B. P. Contrast Enhanced Ultrasound Perfusion Imaging in Skeletal Muscle. Journal of Cardiovascular Imaging. 27 (3), 163-177 (2019).
  21. Zaccagnini, G., et al. Magnetic Resonance Imaging Allows the Evaluation of Tissue Damage and Regeneration in a Mouse Model of Critical Limb Ischemia. PLoS One. 10 (11), 0142111 (2015).
  22. Penuelas, I., et al. PET as a measurement of hindlimb perfusion in a mouse model of peripheral artery occlusive disease. Journal of Nuclear Medicine. 48 (13), 1216-1223 (2007).
  23. Jia, Y., Qin, J., Zhi, Z., Wang, R. K. Ultrahigh sensitive optical microangiography reveals depth-resolved microcirculation and its longitudinal response to prolonged ischemic event within skeletal muscles in mice. Journal of Biomedical Optics. 16 (8), 086004 (2011).
  24. Turaihi, A. H., et al. Combined Intravital Microscopy and Contrast-enhanced Ultrasonography of the Mouse Hindlimb to Study Insulin-induced Vasodilation and Muscle Perfusion. Journal of Visualized Experiments. (121), e54912 (2017).
  25. Liu, C., et al. Enhanced autophagy alleviates injury during hindlimb ischemia/reperfusion in mice. Experimental and Therapeutic Medicine. 18 (3), 1669-1676 (2019).
  26. Liu, D. L., Svanberg, K., Wang, I., Andersson-Engels, S., Svanberg, S. Laser Doppler perfusion imaging: new technique for determination of perfusion and reperfusion of splanchnic organs and tumor tissue. Lasers in Surgery and Medicine. 20 (4), 473-479 (1997).
  27. Jing, Y., Bai, F., Chen, H., Dong, H. Using Laser Doppler Imaging and Monitoring to Analyze Spinal Cord Microcirculation in Rat. Journal of Visualized Experiments. (135), e56243 (2018).
  28. Zhang, D., Li, S., Wang, S., Ma, H. An evaluation of the effect of a gastric ischemia-reperfusion model with laser Doppler blood perfusion imaging. Lasers in Medical Science. 21 (4), 224-228 (2006).
  29. Fitzal, F., et al. Circulatory changes after prolonged ischemia in the epigastric flap. Journal of Reconstructive Microsurgery. 17 (7), 535-543 (2001).

Tags

मेडिसिन अंक 170 लेजर डॉप्लर परफ्यूजन इमेजिंग लेजर डॉप्लर फ्लोमेट्री चूहे हिंडलिब इस्केमिया इस्केमिया रिपरफ्यूजन आर्टेरियोजेनेसिस
माउस हिंडलिब में लेजर डॉप्लर परफ्यूजन इमेजिंग
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tang, G. L., Kim, K. J. Laser… More

Tang, G. L., Kim, K. J. Laser Doppler Perfusion Imaging in the Mouse Hindlimb. J. Vis. Exp. (170), e62012, doi:10.3791/62012 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter