激光多普勒灌注成像在鼠标欣德利姆

Summary

在这里，我们提出了一个协议，演示了激光多普勒灌注成像的技术和必要的控制，以测量小鼠后肢的血流。

Abstract

血流恢复是实验性后肢缺血或缺血性输液后的关键结果测量。激光多普勒灌注成像 （LDPI） 是评估血流恢复的常见、非侵入性、可重复性的方法。该技术计算了当激光击中移动的红血球时产生的多普勒频率变化的样本组织的整体血流量。测量以任意灌注单元表示，因此腿部的对交不干预通常用于帮助控制测量。测量深度在0.3-1毫米范围内：对于后肢缺血，这意味着皮肤灌注被评估。皮肤灌注取决于几个因素-最重要的是皮肤温度和麻醉剂，必须仔细控制，以产生可靠的读数。此外，头发和皮肤色素着色可以改变激光到达或穿透真皮的能力。本文演示了鼠标后肢的 LDPI 技术。

Introduction

皮肤溃疡与伤口愈合不足是人类患者截肢的主要原因^1。足够的伤口愈合需要更高的动脉灌注水平比需要保持完整的皮肤，这是妥协的外周动脉疾病^2，3，4患者。其他几个类风湿病和糖尿病也可能导致不安和皮肤微循环不足，以愈合伤口^5，6。许多糖尿病患者患有伴随的外周动脉疾病，使他们面临截肢的特别高风险。激光多普勒灌注成像 （LDPI） 用于临床情况，用于评估皮肤微循环，以及在研究情况中评估实验后肢缺血、缺血-输液和显微外科皮瓣⁷后的血流和血流恢复。

LDPI 系统投射低功率激光束，该光束由扫描镜偏转，以移动到感兴趣的区域。这与激光多普勒流量计不同，后者为与流测探针⁸直接接触的较小组织区域提供了灌注测量。当激光束与微血管中移动的血液相互作用时，它就会经历多普勒频率变化，这种移位由扫描仪照射并转换为任意灌注单元。由于LDPY是一种基于光的技术，因此其渗透深度限制在0.3-1毫米，这意味着大部分皮肤灌注被评估为^7。皮肤流量可以通过皮肤温度和交感神经系统改变，这可能受到各种麻醉剂⁹的影响。光学激光的测量也受到环境照明条件、皮肤色素沉着的影响，并可能被过度的毛皮或头发^堵塞。

LDPI 是最常用的研究技术，用于监测缺血后的灌注恢复，因为它具有非侵入性，不需要对比度管理，并且具有快速扫描时间，允许对多个动物进行数据收集。这使得它非常理想，以帮助确定治疗动脉生成或血管生成的治疗是否有效的小动物模型。根据LDBI测量的后肢缺血后的血流量恢复与辅助动脉发育密切相关，当通过其他方法评估，如微滤铸造或微^CT10，11。本协议的目的是演示使用 LDPI 对后肢灌注的评估。

Protocol

动物实验是根据华盛顿大学机构动物护理和使用委员会批准的协议进行的。

1. 扫描仪准备

1. 调整扫描仪高度，使扫描对象的距离约为 30 厘米。
2. 打开成像器并启动相关软件。
3. 打开 测量 程序。如果软件与扫描仪进行正确通信，将显示红外激光打开警告。
4. 使用制造商提供的标准校准机器（视频未显示，将取决于正在使用的机器的特定型号）。
5. 调整扫描仪设置，以适合房间的背景材料和照明设置。
   1. 根据制造商的说明设置增益级别 DC FLUX 和 CONC（视频未显示）。
   2. 通过将激光束指向黑色背景材料来设置背景阈值，并按 自动 BK 集。

2. 鼠标预扫描准备

1. 设置异氟素感应室，对废气进行适当清理。
   注意：将感应室放在加热垫上将有助于防止在麻醉感应期间小鼠温度损失。
2. 打开位于非反射表面下方扫描区域（在此情况下为黑色氯丁橡胶织物）下方的热毯。设置家温毯，以保持37°C的体温。
3. 将温度探针定位为家温毯和润滑剂，以便它们准备好插入。
4. 将麻醉面膜和清除系统放置在扫描区域。
5. 用异氟烷蒸发器麻醉小鼠。将氧气速率设定为1升/分钟的流量，并将异氟烷调整至4%，以便麻醉感应。打开流到麻醉感应室，鼠标呼吸速度会变慢。当鼠标失去正确的反射时，可以达到足够的麻醉效果。
6. 将鼠标转移到麻醉面膜/鼻锥，并附上废气清理器，并将异氟烷调整到1.5%。
   注意：这种麻醉水平通常足以使小鼠在扫描过程中相对静止，但并不是要提供手术麻醉水平，因此麻醉的深度不会被检查。改变异丙酮水平会导致心跳、呼吸和皮肤灌注的变化，因此在任何时间课程实验和所有实验对象中都应使用一致的百分比。也可以使用替代麻醉技术，如氯胺酮Xylazine的IP注射，但同样的麻醉技术应该在整个课程研究的任何时间使用，因为不同的麻醉剂对皮肤灌注的影响不同。
7. （可选视扫描区域而定）如果计划要扫描的感兴趣区域被毛皮覆盖，请使用小型电动修剪器或脱毛霜从感兴趣的区域去除头发。
   注意：脱毛霜应完全去除，扫描前鼠标皮肤干燥。
8. 将鼠标置于覆盖家温毯的黑色非反射表面上的适当扫描位置，确认两个后肢在整个平衡和扫描过程中都保留在热源上（图 1）。
   注意：保持双脚在家庭热毯上很重要，以防止温度发生区域变化。
9. 插入与家温毯相关的润滑直肠温度探头。
10. 将鼠标温度等于所需的扫描温度（37 °C）;约5-10分钟。
11. 选择 扫描仪设置，可以从顶部菜单或扫描仪设置图标访问。通过更改 X-Y 坐标来调整扫描区域，以适应感兴趣的区域。扫描速度将取决于扫描分辨率。更高的分辨率将导致更长的扫描时间。对于专注于全球灌注的重复扫描，而不是专注于解剖灌注的更高分辨率，4 毫秒/像素的扫描速度是足够的。
    注意：如果研究人员试图直接研究发育中的附带循环（最好在离皮肤较近的腹腔大腿和小腿中成像），则应考虑更高的分辨率和单扫描。在评估鼠标脚垫末端器官的全球灌注时，以较低的分辨率/速度（例如，4 毫秒/像素）进行重复扫描是足够的。视频中显示的软件在重新启动时自动加载以前使用的扫描区域、速度和分辨率模板，或者，如果用于各种实验的不同感兴趣区域，可以从存储的文件中检索到该模板。
12. 如果执行重复扫描，请选择 重复扫描和线扫描 选项卡。扫描次数可以更改（在此例中为 3 次扫描）以及重复间隔。重复间隔的最短时间是估计的扫描时间，扫描时间显示在由扫描区域和扫描分辨率确定的框右侧的灰色区域。添加几秒钟后，用户可以暂停，如果需要，可能会在扫描之间重新定位鼠标。

3. 扫描

1. 选择 "图像扫描 "选项卡并选择 "标记 "按钮。激光将移动以勾勒扫描区域的轮廓。调整鼠标位置，以便扫描的目标位于标记区域内。
   注意：对于脚垫或脚垫和小腿扫描，与后肢扩展的易于定位相比，提供更一致的兴趣区域。股动脉和树突动脉和辅助材料非常接近大腿和小腿的腹腔表面，因此，如果使用这些感兴趣的区域，首选苏平定位。
2. 通过选择 重复扫描 图标开始重复测量，然后按 播放按钮 启动扫描。
3. 确认弹出窗口中的扫描距离，然后单击 OK 开始扫描。
4. 在扫描鼠标移动时监视鼠标;如果鼠标移动得足够充分，后爪不再位于扫描中间的扫描区域，请重新启动扫描。在分析软件中可以容纳鼠标后爪位置的微小变化。
5. 在扫描过程中监测鼠标温度，因为即使使用家热毯，鼠标也可能波动。如果鼠标温度变化太大，这可能导致扫描之间的显著变化。一般来说，温度范围为 36.8-37.2 °C 将导致可接受的数据。
6. 将捕获的扫描保存 在"保存"下，作为 窗口，其中包含鼠标标识符和时间点，以便于进行数据分析。如果在主题详细信息窗口中需要，请输入鼠标和时间点详细信息。
7. 关闭异氟素并取出直肠温度探头。
8. 用 70% 乙醇对直肠温度探头进行消毒，以便准备在下一只小鼠中使用。
9. 允许鼠标从麻醉中恢复到显示右反射的地步，在返回笼子之前，将鼠标从苏平位置翻转到易发生位置。
   注：由于恢复速度非常快，也可以在氯胺酮/西拉津的加热回收笼中，可以在异氟烃的加热毯上进行恢复。

4. 捕获 LDPI 数据 （图 3）

1. 打开成像审查软件程序。
2. 转到文件菜单，打开并定位已保存的文件。
3. 从工具栏中选择 投资回报率 图标。
4. 选择 "添加多边形 "按钮。
5. 使用鼠标跟踪感兴趣的区域 （ROI） 以进行控制后肢。多边形跟踪不必精确，因为灰色背景不会包含在计算的平均值中。
6. 手术后肢重复步骤 4.3-4.5。
7. 选择 统计 图标以打开 图像投资回报率统计结果 （PU） 窗口。
8. 通过复制/粘贴将 Polygon 1（控制后肢）和多边形 2（手术后肢）的结果导出到数据收集工作表中。

5. 分析

1. 捕获数据作为每次扫描的手术/控制比率。
2. 使用平均手术/控制的所有三个扫描的数据点为特定的鼠标在那个时间点。由于对后肢缺血反应的生物变异性，一般每个时间点需要 8-10 只小鼠才能达到可重复的结果，标准误差为 10% 。
   注意：在允许鼠标从麻醉中恢复之前，有必要对重复扫描进行快速分析，以检查数据是否太可变（例如，扫描 1-3 之间的 100-150 多个灌注单元不同）。重复扫描之间的高变异性表明，鼠标在扫描过程中没有完全平衡（图 2），在不丢失数据点的情况下可以进行重复扫描，如果图像直到以后才进行分析，就会发生这种变化。为了更好地显示扫描变化（图 2），可能需要更改调色板以优化显示通量值的动态范围。

Representative Results

成功的 LDPI 应导致三次扫描之间一致的重复测量扫描，注液单位变化不超过 100-150 次（相当于鼠标脚垫通常平均灌注的 10% 左右）（图 2）。如图 2所示，重复扫描有助于确定鼠标已得到适当的均衡，以便缺血/控制比最能反映基础血流，而不是温度变化导致的皮肤灌注变化。使用单次扫描数据点将增加变异性，导致需要更多的实验鼠。当用于后肢缺血时，与控制后肢相比，手术后肢应减少全球灌注。结果表示为手术后肢灌注/控制后肢灌注的比例。随着小鼠最初血管化并随着时间的推移发展其内在的辅助网络，LDPI的血流量恢复应在术后时间过程中看到（图4）。恢复程度取决于小鼠应变和后肢缺血模型的严重程度。

图1。用于激光多普勒灌注功能的鼠标定位，用于心室脚垫的成像。 麻醉小鼠使用异叶素鼻锥 （A） 被放置在容易的位置与后肢扩展， 允许扫描腹腔脚垫。用于家温毯的直肠温度探头 （P） 到位，可在扫描期间保持一致的体温。家温毯垫位于用于提供扫描背景的非反射氯丁橡胶材料下面。指示扫描区域中间的激光在鼠标尾部旁边可见。 请单击此处查看此图的更大版本。

图2。通过调色板调整更好地观察到鼠标温度变化的扫描变化演示。（A） 激光多普勒重复扫描，在重复扫描过程中鼠标核心温度变化引起显著变化，根据重复通量扫描中转化为颜色的灌注单元可见。（B） 将调色板上的动态范围（扫描窗口左侧显示）从A中的 0-1000 更改为B中的 0-1500（红色箭头），使变化更加明显。（C） 统计数据显示，在A和B的 rfx 图像上，控制后肢（在 rfx 图像上呈黑色的 Polygon 1）感兴趣区域的平均灌注值 （以红色圆形为圆圈） 的平均灌注值在 3^次扫描^中为 655 到 791 之间，平均灌注范围为 缺血后肢感兴趣的区域（A和Brfx 图像上的 2 个红色多边形 2）变化较小（361 到 400），导致重复扫描之间的缺血/控制比显著差异 （0.60， 0.53， 和0.46）。（D） 窗口更改测量软件（左面板）和图像审查软件（右面板）中调色板的动态范围。红色箭头显示增加或减少上范围的位置。请单击此处查看此图的更大版本。

图3。通过重复扫描捕获激光多普勒灌注成像的数据。 （A） 顶部工具栏，带 1.添加投资回报率图标。2. 添加多边形图标。3. 主题详细信息图标（访问 B中的窗口弹出）。4. 统计图标（访问 C中的窗口弹出窗口）。（B） 主题详细信息窗口。（C） 统计窗口显示每个投资回报率的平均灌注值（以红色圈转）。（D） 反复扫描与多边形 ROI 跟踪围绕控制后爪 （黑色） 和缺血后爪 （红色）. 请单击此处查看此图的更大版本。

图4。时间课程使用 LDPI 数据进行实验。 P27 淘汰小鼠 （3-5 个月大的雌性 CDKN1b^{- /-} C57Bl/6 背景上的小鼠）在股动脉结缘后与 （n=6） 和无 （n=10） 与年龄匹配的雌性野生型C57Bl/6小鼠相比，口服多氧环素治疗与（n=11）和无（n=9）口服多氧环素治疗（作者未公布的数据）相比。错误条表示平均值 （SEM） 的标准误差。 请单击此处查看此图的更大版本。

Discussion

一致的技术对于通过 LDPI 获得可靠的结果至关重要。在整个过程中应使用相同的麻醉剂、温度设置、鼠标位置和感兴趣的区域。不同的麻醉剂将导致更高或更低的灌注值^9。异氟乙烯麻醉是方便的，因为它的快速发病和出现，以及整体安全。应使用一致百分比的异氟兰作为麻醉深度与这种血管扩张剂可能会改变皮肤灌注。如果感兴趣的区域包括毛皮，那么每次都应该使用相同的脱毛方法，因为化学脱毛小鼠的灌注值将高于用电动剪子⁷去除毛皮的小鼠。小鼠温度对灌注成像有很大影响，36 °C的小鼠的灌注值明显低于38°C、12的小鼠。缺血后肢对区域温度变化的反应可能也不同于控制后肢（图2）。在此协议中，用于在扫描过程中使用家温毯来维持鼠标温度，这比在 37 °C 加热板上对鼠标进行 5 分钟的预平衡，然后在 Niiyama 等人所示的非加热表面进行扫描，从而在扫描过程中提供更一致的温度控制

如果只选择脚垫作为感兴趣的区域，则由于在感兴趣的扫描区域的可重复性，因此首选易选定位。这种方法的优点是，它研究离心脏最远的区域，以及与缺血性足部溃疡最常见的临床相关区域。脚垫是无毛的，所以剪报或脱毛是没有必要的，简化准备和测量时间。此外，非白鼠的小腿或大腿皮肤可能有色素素斑块，这可能会干扰LDPI测量。如果选择的兴趣区域包括小腿和大腿，那么苏宾定位是首选，因为股骨和树突动脉沿着后肢的腹腔表面运行，可以使用 LDPI⁷进行成像。从后置位置看，很难捕捉到脚的一致成像，因为侧面和顶部表面的成像可能变化无一些。

后肢缺血后的抵押和血流量恢复取决于许多不同的因素，包括后肢缺血模型、小鼠菌株、性别和年龄。某些小鼠株，如C57Bl/6有强大的基线抵押品，在诱导急性后肢缺血后，灌注下降较少，而其他如BALB/c有不良的抵押品^14，15。雌性小鼠的恢复情况比雄性小鼠差。年龄较大的小鼠的血流量恢复也比¹⁶岁的小鼠差。因此，小鼠需要与菌株、年龄和性别相匹配，以便使用 LDPI 数据得出有关血流量恢复的可靠结论。即使与小鼠的近亲繁殖菌株进行严格匹配和使用，小鼠对后肢缺血反应也有一定的生物变异性，因此有效数据需要足够的小鼠数量（通常每个时间点为 8-10 个小鼠）。此外，LDPI的正常化并不一定意味着恢复正常水平的动脉流动，因为测量是在麻醉小鼠谁没有任何骨骼肌肉需求。最后，由于渗透深度的限制，在LDBE中不可能对可能穿过大腿和小腿更深肌肉的辅助途径进行详细的解剖学研究。

其他几种方法已用于评估血流恢复，包括基于灌注的皮肤成像，如激光斑点成像17，18，19或更深的结构^，如骨骼肌肉²⁰的对比增强超声波，MRI²¹和（13）N-氨PET^22。此外，还用于对微^CT10、OCT23等辅助血管进行解剖成像，以及使用内视显微镜²⁴进行对比增强的超声波检查。由于扫描时间快、数据采集和分析相对容易，避免了静脉对比的需要，LDPI是文献中大多数群体使用的主要方法。缺点包括该技术测量血流速度，并提供任意灌注单位的数据，而不是测量绝对组织灌注，扫描深度相对较浅，并且提供相对较差的解剖细节。

LDPI最常用于评估各种后肢缺血模型⁷后的恢复情况。它也被用于缺血-输液研究，无论是在后肢²⁵以及在更深的浮游器官或脊髓^{26，27，28。}然而，对深层结构的评估需要扫描结构的手术暴露，因此由于疤痕，重复测量更加困难。进一步应用是评估皮瓣输液后，显微外科^29。

总之，LDPI 是一种有效、易于执行且可重复的方法，用于测量后肢皮肤灌注，以反映整体动脉灌注。使用 LDPI 获取可靠数据时，需要一致的技术。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Black nonreflective material			Fabric store, black neoprene recommended by company
F/air cannister	A.M. Bickford Inc	80120
Homeothermic blanket with rigid metal probe	Harvard Apparatus		Also comes with flexible probe, but this is less durable
Isoflurane Anesthesia machine	Drager		Multiple manufacturers
Isoflurane induction chamber	VetEquip	941444	2 L chamber
Moor laser Doppler perfusion imager	Moor Instruments	MoorLDI2-IR	Higher resolution imager (MoorLDI2-HIR)
Mouse Anesthesia nose cone			Multiple manufacturers
Nair	Nair
Oxygen tank			Multiple manufacturers
Surgilube	Multiple distributors