Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Förfinad KLARHET-baserad vävnadsrensning för tredimensionell fibroblastorganisation i friska och skadade mushjärtan

doi: 10.3791/62023 Published: May 16, 2021

Summary

En raffinerad metod för vävnad clearing utvecklades och tillämpas på den vuxna mus hjärtat. Denna metod utformades för att rensa tät, autofluorescerande hjärtvävnad, samtidigt som märkt fibroblast fluorescens tillskrivs en genetisk reporter strategi.

Abstract

Hjärt-kärlsjukdom är den vanligaste dödsorsaken i världen och kännetecknas ofta av förhöjd hjärtfibros som kan leda till ökad ventrikulär styvhet med förändrad hjärtfunktion. Denna ökning av hjärt ventrikulär fibros beror på aktivering av bosatta fibroblaster, även om hur dessa celler fungerar inom det 3-dimensionella (3D) hjärtat, vid baslinjen eller efter aktivering, är inte väl förstådd. För att undersöka hur fibroblaster bidrar till hjärtsjukdomar och deras dynamik i 3D-hjärtat utvecklades en förfinad CLARITY-baserad vävnadsrensnings- och bildbehandlingsmetod som visar fluorescerande märkta hjärtfibroblaster i hela mushjärtat. Vävnad bosatta fibroblaster var genetiskt märkta med Rosa26-loxP-eGFP florescent reporter möss korsade med hjärt fibroblast uttrycker Tcf21-MerCreMer knock-in linje. Denna teknik användes för att observera fibroblast lokalisering dynamik i hela vuxna vänstra ventrikel i friska möss och i fibrotic mus modeller av hjärtsjukdomar. Intressant nog, i en skademodell, observerades unika mönster av hjärt fibroblaster i det skadade mushjärtat som följde band av inslagna fibrer i kontraktil riktning. I ischemiska skademodeller inträffade fibroblast död, följt av återpopulation från den infarkt gränszonen. Sammantaget möjliggör denna raffinerade hjärtvävnad klargörande teknik och digitaliserade bildframställning system 3D visualisering av hjärt fibroblaster i hjärtat utan begränsningar av antikroppar penetration misslyckande eller tidigare problem kring förlorade fluorescens på grund av vävnad bearbetning.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Även om kardiomyocyter utgör den största volymfraktionen i hjärtat, är hjärtfibroblaster mer rikliga och är kritiskt involverade i regleringen av utgångsvärdet strukturella och reparativa funktioner i detta organ. Hjärtfibroblaster är mycket mobila, mekaniskt lyhörda och fenotypiskt olika beroende på omfattningen av deras aktivering. Hjärtfibroblaster är nödvändiga för att upprätthålla normala nivåer av extracellulär matris (ECM), och för lite eller för mycket ECM-produktion av dessa celler kan leda till sjukdom1,2,3. Med tanke på deras betydelse vid sjukdom har hjärtfibroblaster blivit ett allt viktigare ämne för undersökning för att identifiera nya behandlingsstrategier, särskilt för att försöka begränsa överdriven fibros4,5,6,7. Vid skada aktiverar och skiljer fibroblaster till en mer syntetisk celltyp som kallas myofibroblast, som kan vara proliferativ och utsöndra riklig ECM, samt ha kontraktil aktivitet som hjälper till att bygga om ventriklarna.

Medan hjärtfibroblaster har utvärderats utförligt för sina egenskaper i 2D-kulturer6,8,9,10, är mycket mindre förstås av deras egenskaper och dynamik i 3D-levande hjärtat, antingen vid baslinjen eller med sjukdomsstimulering. Här har en förfinad metod beskrivits för att rensa det vuxna mushjärtat samtidigt som fluorescensen av fibroblaster märkt med ett Rosa26-loxP-eGFP x Tcf21-MerCreMer genetisk reportersystem. Inom hjärtat är Tcf21 en relativt specifik markör för quiescent fibroblaster4. Efter tamoxifen ges för att aktivera det inducerbara MerCreMer proteinet, i huvudsak alla quiescent fibroblaster kommer permanent att uttrycka förbättrad grön fluorescerande protein (eGFP) från Rosa26 locus, vilket möjliggör deras spårning in vivo.

Många väletablerade vävnadsrensningsprotokoll finns, av vilka några har tillämpats på hjärtat11,12,13,14,15,16,17. Många av de reagenser som används i olika vävnadsrensningsprotokoll har dock visat sig släcka endogena fluorescenssignaler18. Dessutom är det vuxna hjärtat svårt att rensa på grund av rikliga heme gruppinnehållande proteiner som genererar autofluorescens19. Därför var målet med detta protokoll att bevara fibroblast markör fluorescens med samtidig hämning av heme autofluorescens i det skadade vuxna hjärtat för optimal 3D-visualisering in vivo12,13,14,16,17,20.

Tidigare studier som försökte undersöka hjärtfibroblast in vivo använde perfused antikroppar för att märka dessa celler, även om sådana studier begränsades av antikroppar penetration och hjärt vaskulär struktur14,16,17,20. Även om Salamon et al. har visat vävnad clearing med underhåll av aktuella neuronal fluorescens i neonatal hjärtat, och Nehrhoff et al. har visat underhåll av fluorescens märkning myeloiska celler, underhåll av endogena fluorescens genom hela Ventrikulärt väggen har ännu inte visats, inklusive visualisering av vuxna hjärt fibroblaster vid baslinjen eller efter skada13,20. Detta protokoll för vävnadsrensning förfinar en blandning av tidigare protokoll baserade på CLARITY-metoden (klar lipidväxlade akrylamidhybridiserade styva Imaging/immunostaining/in situ-hybridisering-kompatibla vävnad hydrogel) och PEGASOS (polyetylenglykol (PEG)-associerade lösningsmedel system). Detta förfinade protokoll tillät en mer robust undersökning av hjärtfibroblaster i mushjärtat vid baslinjen och hur de svarar på olika typer av skador. Protokollet är enkelt och reproducerbart och kommer att bidra till att karakterisera beteendet hos hjärtfibroblaster in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alla experiment med möss godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Cincinnati Children's Hospital Medical Center. Institutionen är också AAALAC (American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care) certifierad. Möss avlivades via livmoderhalscancer förskjutning, och möss som genomgår överlevnad kirurgiska ingrepp fick smärtlindring (se nedan). Alla metoder som används för smärtlindring och dödshjälp bygger på rekommendationer från panelen för dödshjälp av American Veterinary Medical Association. Alla möss var inrymda i majskolvar med vatten och mat tillgängligt hela tiden. Möss var inhyst 4 till en bur med samma kön. För kirurgi eller oskadad vävnad clearing användes lika många 6-8 veckor gamla manliga och kvinnliga möss.

OBS: Sterila kirurgiska villkor bibehölls vid alla operationer. Kirurgen bytte till rena scrubs och en steril klänning och sedan donerade skoskydd och ett hårnät. Kirurgen skrubbade sedan händerna med klorhexidin och donerade sterila kirurgiska handskar. Kirurgen bistods av en tekniker som sövde, rakade och skrubbade snittplatsen 3 gånger vardera, alternerande mellan 2% klorhexidinglukonat och 70% isopropanol. Mössen fördes sedan till kirurgen, och kirurgi utfördes. Mellan djur steriliserades instrumenten i en pärlsteriliseringsmedel.

1. Cre rekombination

  1. Korsa Rosa26-loxP-eGFP möss (Rosa26-nLacZ [FVB. Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J]) med Tcf21-MerCreMer möss(figur 1A)6,21.
  2. När avkomman till detta kors når 6 veckors ålder, administrera en intraperitoneal injektion på 75 mg/kg tamoxifen upplöst i majsolja. 22 Administrera tamoxifen två gånger, 48 timmar från varandra (figur 1B).
  3. Efter tamoxifeninjektioner, sätt mössen på en diet av tamoxifenmat (~ 0,4 g / kg tamoxifencitrat) i en vecka. Efter en veckas tamoxifen chow, returnera mössen till en normal autoklaverad chow diet i en vecka innan du utför kirurgi (Figur 1B). Ange ett lämpligt antal möss (3 per kirurgiskt tillstånd) som ska vara oskadade kontroller. Offra dessa möss och fortsätt till clearingprocessen som avgränsas nedan efter en veckas normal koladiet.
  4. Efter tamoxifenregimen och rekombinationen, utför kirurgi.

2. Kirurgiska modeller

  1. Ischemi/reperfusion (I/R)23,24
    1. Söv möss med 1,5% isoflurangas i rumsluft i en ventilerad låda; raka sina bröst och halsar med elektriska klippare och skrubba sedan de rakade områdena med en 2% klorhexidinglukonatdränkt bomullspinne.
    2. Använd konstgjord tårsalva för att förhindra torrhet under operationen genom att placera salva på ögonen på de sederade mössen.
    3. Utför ett mellanhalsat snitt med kirurgisk sax för att möjliggöra visualisering av luftstrupen. Intubera med en 20 G kateter genom att placera intuberingsröret i luftstrupen och visualisera luftstrupekatetern genom mitthalssnittet. Placera mössen i respirator medan de är nedsövda med isoflurangas (1,5%) i rumsluften.
    4. Gör ett snitt under vänster främre lem med kirurgisk sax och skär interkostala musklerna mellan revbenen 3 och 4. Sprid revbenen öppna med ett upprullningsdon.
    5. Placera en liten svamp blöt i saltlösning mellan lungan och hjärtat för att förhindra skador på lungan.
    6. Använd en fishhook-nål (6,5 mm, 3/8 c) och bind den vänstra kranskärlen med en utspämbar halkknut med 8-0 prolene, det är jag.
    7. Ta bort svampen med tång.
    8. Suturera interkostala musklerna stängda med 4-0 flätat silke och en kontinuerlig sutur samtidigt som de exteriöriserar slutet av 8-0 prolene slip knut.
    9. Stäng hudsnitten med hjälp av utskjutande knötslim med änden av den ocklusiv halkknuten utskjutande.
    10. Efter en timmes ocklusion, dra den yttre änden av glidknuten för att internt släppa kranskärlens ocklusion, lindra ischemin och orsaka reperfusion.
    11. Administrera 0,02 ml av en 1 mg/ml förlängd frisättningshumorfin via subdermal injektion (72 h frisättning) som smärtstillande medel och placera mössen i en syresatt inkubationskammare vid 37 °C, separat från andra djur. Övervaka mössen minst var 15:e minut tills de har återhämtat sig från anestesi och kan bibehålla en sternal eller sittställning. Sätt tillbaka mössen i deras vanliga hus.
    12. Utvärdera djuren för smärta och ångest i 48 timmar efter operationen och övervaka snittplatsen dagligen tills de är helt läkta.
    13. Observera mössen för hydrering, näring och övergripande välbefinnande efter operation tills de offras.
  2. Hjärtinfarkt (MI)25,26,27
    1. Utför steg 2.1.1–2.1.7.
    2. Använd en kontinuerlig sutur för att stänga interkostala muskler med 4-0 flätat siden.
    3. Stäng hudsnittet med hjälp av uttoningsvävnadslim.
    4. Utför steg 2.1.11–2.1.13.
  3. Angiotensin II/fenylefrinmikro-osmotisk pumpinfusion
    1. Förbered en arbetslösning på 10 μg/μL av angiotensin II och 500 μg/μL arbetslösning av fenylefrin under sterila förhållanden (dvs. i en laminär flödeshuv) genom att tillsätta 1 mg angiotensin II till 100 μL steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och 250 mg fenylefrinhydroklorid i 500 μL PBS.
    2. Beräkna utspädningen av varje arbetslösning och slutlig volym för att dispensera till den mikro-osmotiska pumpen baserat på musvikt.
      OBS: Till exempel kräver en mus på 20 g x 14 dagar x 1,5 μg/dag = 420 μg angiotensin, eller 42 μL arbetslösning, samt 20 g x 14 dagar x 50 μg/dag = 14000 μg fenylefrinhydroklorid, eller 28 μL arbetslösning.
    3. För varje muss vikt, späd ut läkemedlets arbetslager i steril PBS och fyll de mikroomotiska pumparna (0,25 μL/h, 14 dagar, cirka 100 μL) med en 27 G nål och 1 ml spruta.
      OBS: Detta kommer att generera en flödeshastighet på 1,5 μg▼g-1▼dag-1 av angiotensin II och 50 μg▼g-1▼dag-1 fenylefrinhydroklorid en gång placerad i mössen.
    4. Bedöva mössen med 1,5% isofluraninandning (för att effekt) i en ventilerad kammare som innehåller rumsluft.
    5. Placera de bedövade mössen på ett sterilt kirurgiskt bord i opinläge och behåll anestesin med isoflurangasinandning (1,5%) genom en noskon.
    6. Använd konstgjord tårsalva på djurets ögon för att förhindra torrhet under operationen.
    7. Raka pälsen över implantationsområdet med elektriska hårklippare och sterilisera området som ska skäras med etanol och en steril bomullspinne. Gör ett litet snitt (ca 1 cm) med kirurgisk sax i mushudens epidermala lager på höger sidosida av ryggen, under skulderbladet. Använd de tråkiga sidorna av en par kirurgiska saxar för att försiktigt sträcka huden i och runt implantationsområdet för att sätta in minipumpen.
    8. Placera den mikro-osmotiska pumpen i snittet och manövrera den fysiskt till vänster om musens dorsala mittlinje genom att manuellt massera pumpen under huden.
    9. Stäng snittet via kontinuerlig sutur med 4-0 silke med en avsmalning spetsnål.
    10. Efter pumpimplantation, administrera långsam frisättning buprenorfin vid en dos av 0, 1 mg/kg kroppsvikt via subdermal injektion för analgesi (72-h långsam frisättning). Placera mössen i en syresatt inkubationskammare vid 37 °C, åtskilda från andra djur. Övervaka mössen minst var 15:e minut tills de återhämtar sig från anestesi och kan bibehålla en sternal eller sittställning.
    11. Vid återhämtning från anestesi i uppvärmningskammaren på 37 °C, placera tillbaka mössen i sina standardhusenheter.
    12. Övervaka mössen för smärta och ångest i 48 timmar efter operationen och övervaka snittplatsen dagligen tills de är helt läkta.
    13. Observera mössen för hydrering, näring och övergripande välbefinnande efter operation tills de offras.

3. Rensa vuxna mushjärtan med ett modifierat aktivt CLARITY-protokoll

  1. Förbered ett rent kirurgiskt område genom att sterilisera operationsytan och alla kirurgiska verktyg med 70% etanol. Förbered en lösning av kall 1x PBS och 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS (100 ml vardera). Använd handskar, labbrock, ansiktsmask och ögonskydd.
  2. Förbered heparinbufferten genom att späda ut 10 enheter heparin i 0,9% w/v natriumkloridlösning. Injicera varje mus intraperitoneally med 60 μL heparin-NaCl med en 1 ml spruta och 27 G nål.
  3. Fem minuter efter injektionen av heparin-NaCl-lösningen, bedöva mössen med 1,5% isofluraninandning (för att effekt) i en ventilerad kammare som innehåller rumsluft.
  4. Avliva mössen genom livmoderhalsförskjutning, där bakhuvudet hålls med den platta, slutna änden av tång, medan ryggraden är ur led genom att dra svansen.
  5. Rengör musens ventrala yta med 70% etanol på en bomullspinne. Gör ett 3 cm tvärgående snitt ca 3 cm under xiphoidprocessen med kirurgisk sax.
  6. Separera huden från den underliggande bukväggsvävnaden genom att deglovera buken upp till xiphoidprocessen (håll huden närmast svansen och dra huden närmast huvudet upp mot revbenet). Gör ett 2 cm tvärgående snitt i den subkutana bukväggsvävnaden 3 cm under xiphoidprocessen med kirurgisk sax. Gör ett vertikalt snitt från detta tvärgående snitt, upp på mittlinjen och genom bröstkorgen. Fäst bröstkorgen bakåt och blotta hjärtat.
  7. Använd en 27 G nål och 10 ml spruta för att injicera kall PBS i den överlägsna vena cava och aorta (eventuell positionell manipulering av hjärtat bör göras noggrant med trubbiga tång för att undvika punktering) för att rensa blod från hjärtat.
    OBS: Tillräcklig perfusion kan noteras genom svansryckningar och missfärgning av lungorna.
  8. Använd en 27 G nål och 10 ml spruta för att injicera kall 4% PFA i överlägsen vena cava och aorta för att påbörja fixeringsprocessen.
  9. Ta bort hjärtana. Atria, höger ventrikel och septum och vänster ventrikel bör separeras med en rakbladig skalpell. Placera denna vävnad i ett 15 ml centrifugeringsrör fyllt med kallt 4% PFA och placera på en mutter vid 4 °C över natten.
  10. Tvätta hjärtat 3 gånger i 1 timme vardera med kall 1x PBS för att ta bort överskott av PFA.
  11. Förbered hydrogelen (kallas A4P0 för relativ akrylamid/polyakrylamidsammansättning) genom att blanda följande kemikalier i ett 15 ml centrifugeringsrör: 10% av 40% akrylamid, 10% 1x PBS, 80% destillerat vatten.
  12. Tillsätt 0,25% lösningen av fotoinitiatorn (2,2-Azobis[2-(2-imidazolin-2yl)propan)dihydroklorid) till hydrogellösningen strax innan du dränker hjärtat i hydrogelen.
  13. Placera hjärtat i ett koniskt rör som innehåller hydrogelen. Linda det koniska röret i folie och inkubera över natten vid 4 °C utan fysisk störning.
  14. Efter ca 14 timmar vid 4 °C, flytta det koniska röret som innehåller hjärtat till ett 37 °C pärlbad.
  15. Efter 2,5 timmar i pärlbadet, ta bort hjärtat från hydrogelen försiktigt med tång.
  16. Tvätta hjärtat 3 gånger i 1 timme vardera i ett koniskt rör på 15 ml som innehåller 1x PBS vid 37 °C på en mutter.
  17. Placera hjärtat i korgen på den aktiva elektroforesmaskinen med tång och lägg locket på korgen. Se till att locket sitter ordentligt på plats.
  18. Fyll den aktiva elektroforeskammarens reservoar med elektroforesisk clearinglösning genom att hälla lösning i kammaren.
  19. När kammaren är full av elektroforesisk clearinglösning kan korgen som innehåller hjärtat dränkas. Placera locket på elektroforesmaskinen ordentligt.
  20. Kör elektroforesmaskinen vid 1,5 A, 37 °C i 1,5 timmar.
  21. Efter 1,5 h elektrofores, kontrollera hjärtan visuellt för att säkerställa att ingen ogenomskinlig vävnad återstår. Om vävnadsregionerna fortfarande är ogenomskinliga, sänk om hjärtat i elektroforeslösningen i den elektroforesiska kammaren och fortsätt elektroforesen i 0,5 timmar åt gången.
    OBS: Elektrofores ska avbrytas vid första tecken på vävnadsskada (t.ex. vävnadsspäckning).
  22. Tvätta hjärtat i 15 ml koniskt rör som innehåller 1x PBS i 1 timme, 3 gånger vardera, vid 37 °C på en mutter.
  23. Dränk hjärtana i ett 15 ml koniskt rör som innehåller N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)etylendiamin — ett avfärgningsmedel som minskar heme autofluorescens.
    OBS: Denna lösning bör ändras var 24: e timme tills hjärtat är helt klart (ca 2 dagar).
  24. Tvätta hjärtat i ett 15 ml koniskt rör med 1x PBS 3 gånger i 1 timme vardera för att ta bort överflödigt avfärgningsmedel.
  25. Förbered brytningsindexmatchningslösning (RIMS) genom att kombinera 30 ml 0,02 M fosfatbuffert, 40 g 5-(N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-jod-N, N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isoftalamid med omrörning (måste lösas upp helt – detta kan ta upp till en timme), 5 mg natriumazid, 50 μL Tween20 och 1 g 1,4-diazabicyclo[2.2.2]oktan och justera pH-talet till 7,5.
  26. Balansera hjärtana i RIMS i 48 timmar före avbildning.

4. Avbildning rensade hjärtan med hjälp av ett upprätt enda fotonkonfokalt mikroskop

OBS: Bildapparaten består av den nedre halvan av en petriskål i 10 cm glas, en 3D-tryckt bottenbehållare, ett runt glaslock och en 3D-tryckt toppbehållare (Figur 1C-E). 3D-tryckt material tillverkades internt av Cincinnati Children's Hospital Clinical Engineering Department.

  1. Använd vakuumfett för att försegla den 3D-printade bottenbehållaren i en petriskål i glas genom att lägga ett tunt lager vakuumfett på botten av den 3D-tryckta biten (Figur 1C).
    OBS: Behållaren ska vara lika hög som provet som avbildas (dvs. provet ska inte komprimeras av glaslocket som placeras ovanpå det, och provet bör inte heller kunna flyta och röra sig inuti behållaren).
  2. Fyll behållaren med RIMS och ta bort alla bubblor med en rörspets. Placera hjärtat i RIMS försiktigt med vänster ventrikulär vägg vänd uppåt, se till att inga bubblor förs in i lösningen.
  3. Fäst ett glaslock på bottenytan på den 3D-tryckta övre reservoarbiten(kompletterande figur 1A)med vakuumfett (igen genom att placera ett tunt lager vakuumfett på den 3D-tryckta delen och placera den på täckslipen) (Figur 1D).
  4. Placera glaslocket och toppbehållaren, täcksidan nedåt, på bottenbehållaren (Kompletterande figur 1B), utan införande av bubblor. Vidhäftningen mellan RIMS och täckspill ger en tätning mellan de övre och nedre reservoarbitarna(figur 1E).
  5. Fyll toppbehållaren med glycerol för användning med ett 10x glycerol nedsänkningsmål.
  6. Använd ett enda fotonmikroskop utrustat med ett multiphoton confocal scan huvud för att avbilda de rensade hjärtan.
  7. Sänk scenen i det enda fotonmikroskopet och placera Petri-skålen som innehåller provet i mitten av scenen. Höj scenen och sänk 10x glycerol nedsänkningsmålet i glycerol i provapparatens övre reservoar. Se till att provet är i fokus genom att titta på provets kant med hjälp av okularen.
  8. Växla från okularvy till kameravy på datorn genom att klicka på live-knappen.
    1. Ställ in X- och Y-parametrarna genom att först lokalisera den bredaste delen av vävnadsprovet, som ska vara längst ner på Petri-skålen.
    2. Klicka på ND Acquisition och anpassad multipoint. Skapa multipunkter genom att först hitta mitten av vävnadsprovet genom att använda joysticken för att svepa från vänster till höger och uppifrån och ned.
    3. Sedan, baserat på vävnadens storlek, bestämma den kakelstorlek som behövs (vanligtvis 6 x 5 för ett 6-8 veckor gammalt mushjärta). Gör detta genom att köra testavbildning genom att bara fånga X- och Y-parametrar (avmarkera z under fliken ND-förvärv) för att kontrollera om hela vävnadens längd och bredd fångades in.
  9. Om du vill ställa in z-parametrar öppnar du XYZ-navigeringenoch klickar på upp- och nedikonerna tills du hittar exemplets över- och underkant.
    1. Öppna Z-intensitetskorrigeringspanelen och justera fluorescensen upptill, mitten och botten av vävnaden för att korrigera för vävnadstäthet genom att öka eller minska lasereffekten vid varje z-punkt. Ställ in dessa genom att klicka på den inställda pilen till höger på panelen Z-intensitetskorrigering.
    2. Ställ in Z-stegstorleken i ND-förvärvspanelen på 5 μm.
  10. När hjärtats X-, Y- och Z-parametrar har avgränsats och z-intensitetskorrigering har ställts in, använd det automatiserade upprätt mikroskopet med ett 10x glycerol nedsänkningsmål med en resonansskanner och galliumarsenidfosidfotomultiplierrör (GaAsP PMTs) för att avbilda de rensade hjärtana. Kontrollera att XY- och Z-flikarna kontrolleras under ND-förvärvet ochtryck på Kör Z-korrigering.
  11. Sy, blanda och denoise de resulterande bilderna genom att öppna multipoint-bilden i bearbetningsprogramvaran och klicka på stygnknappen. Under bildenklickar du på blinda blandningar, 2 kanal, och hittar sedan. och Under bild, klicka denoise.ai, klicka sedan på den fluorescerande kanalen (dvs. GFP).
    OBS: Denna process resulterar i en 3D-bild av GFP-positiva fibroblaster i hela vänster ventrikel.
  12. Använd sekundär analys programvara för att ytterligare identifiera mönster och trender i spridningen av hjärt fibroblaster. Använd funktionen Fläckar genom att köra guideprogrammet Platser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hjärtfibroblaster är viktiga för hjärtats baslinjefunktion samt för svar på hjärtskada. Tidigare försök att förstå arrangemanget och morfologin av dessa celler har utförts till stor del i 2D-inställningar. En förfinad hjärtvävnadsrensning (figur 2) och 3D-bildteknik har dock publicerats, vilket möjliggör avancerad, mer detaljerad visualisering av hjärtfibroblaster. Med denna bildteknik konstaterades fibroblaster vara tätt packade och ha en spindled morfologi i oskadda hjärtan (Figur 3, Kompletterande videor S1-4).

Efter att vänster Ventrikulärt vävnad clearing hade uppnåtts i ett oskadd hjärta, tillämpades protokollet på flera skada modeller för att undersöka hur detta clearing protokoll skulle fungera när studera skadade hjärtvävnad. Möss utsattes för I/R skada genom tillfällig stängning av den vänstra födans gatan (LCA) för 1 h följt av reperfusion varar 3, 7, 14 eller 28 dagar. Dessa experiment visade att det fanns en förlust av hjärt fibroblaster i regionen ischemisk direkt efter I/R skada, men att dag 7 och dag 14, fibroblaster migrerade eller proliferated att återbefolka detta område av det skadade hjärtat. Dag 28 var hjärtfibroblastpopulationen kring de skadade områdena i hjärtat som störst (Figur 4, Kompletterande videor S5-8).

MI skada är en kirurgisk modell som härrör från permanent LCA ligatur (ingen reperfusion). Hjärtan som hade genomgått MI kirurgi var strukits 1,5 och 3 dagar efter kirurgi för fixering, clearing och analys. Det fanns mycket få fibroblaster kvar i den skadade vänstra ventrikeln 1,5 dagar efter operationen (Figur 5A, Kompletterande Video S9). Men dag 3 expanderade fibroblaster och var närvarande i de flesta av de vänstra ventriklarna förutom en liten region, förmodligen efter att ha migrerat i och / eller förökat sig från en befolkning i gränszonen (Figur 5B, Kompletterande Video S10). Återigen användes analysprogramvara för att bättre visualisera fibroblastlokalisering, och områden med förlust av hjärtfibroblaster beskrevs i orange (Figur 5). Denna analys visade bättre den första förlusten av celler vid dag 1,5 efter MI och hur fibroblaster antingen prolifererade eller migrerade till det skadade området dag 3 för att skenbart reparera området och bilda ett ärr.

Förutom ischemisk skada är reaktionen av hjärtfibroblaster på högt blodtryck inte väl förstådd. För att upptäcka svaret från dessa celler på högt blodtryck administrerades angiotensin II och fenylefrin. Angiotensin II och fenylefrin (Ang/PE) är läkemedel som orsakar ihållande högt blodtryck och hjärtfibroblastaktivering med områden med interstitiell fibros, bekräftad genom tillämpning av detta vävnadsrensningsprotokoll på ang/PE-behandlade hjärtan(figur 6A)5,28. I motsats till ischemisk kirurgi leder infusion av Ang/PE under flera veckor inte till förlust av hjärtvävnad och väggförtunning. Istället observerades ett annat resultat i fibroblast beteende efter denna skada.

När hjärtat pumpar vrider hjärtmuskeln, efter ett högerhänt spiralmönster29,30,31. I Ang/PE-skademodellen anpassade sig fibroblasterna längs axeln i detta högerhänta helixkontraktionsmönster med hjälp av det förfinade vävnadsrensningsprotokollet (figur 6B). Hypotesen att förklara detta beteende är att hjärtfibroblaster kände av riktningen för ventrikulär vägg stam och justering inom myofibers för att ge det största stödet inom ECM som det fibrotiska svaret akut utvecklats under agonistisk infusion (Figur 7). Ett annat intressant fynd var att fibroblasterna verkade små och rundade, i motsats till spindelformen som ses i modeller av I / R och MI-skada (Figur 6, Kompletterande Video S11).

Figure 1
Figur 1: Möss och material som används för att rensa hjärtan.
(A) Schematisk av avelsstrategi för Tcf21-MerCreMer (mcm) x Rosa26eGFP möss som används för vävnadsrensning. B)Tidslinje för tamoxifenbehandling och kirurgi som utförs på möss. Oskadade möss offrade på dag 14. (C) 3D-printad brunn för att hålla hjärtvävnad förseglad till en petriskål i glas med vakuumfett. (D) Tillsats av ett runt täckglas vakuumfett förseglat till toppen av den 3D-printade brunnen ovanpå bottenbrunnen. (E) Vävnad rensade hjärtat i den nedre brunnen på vävnadsapparaten, fylld med brytningsindexmatchningslösning (RIMS). Täcklip (som i D)och topp 3D-tryckt brunnsstycke som läggs över den nedre 3D-printade reservoarkomponenten, innehållande rensad hjärtvävnad. Glycerol tillsätts till toppreservoaren för glycerol nedsänkningsmikroskopi. Skalstänger = 1 cm. Reservoarritningar finns i kompletterande figur 1. Förkortning: eGFP = förbättrat grönt fluorescerande protein. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: Visuellt utseende av hjärtvävnadsrensningsstadier.
A)Från vänster till höger: oklart vänster kammare, elektroforeserad vänster kammare, elektroforeserad vänster kammare behandlad med tvärlänk, elektroforeserad vänster ventrikel behandlad med tvärlänk och inkuberad i RIMS. (B)Oklart och rensat hela mushjärtat. C)Vänster: oskadd, otydlig vänster ventrikel. Höger: oskadd, rensad vänster ventrikel. (D) Vänster: Oklar MI skadad vänster ventrikel. Höger: Rensad MI skadad vänster ventrikel. Skalstänger = 0,5 cm. Förkortning: MI = hjärtinfarkt. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3: Effekten av en ny clearingmetod för oskadda och skenstyrda rensade hjärtan.
Rensade (A) oskadda (skalstång = 400 μm) och (B) skenstyrda hjärtan (skalstång = 500 μm) med Tcf21mcm x Rosa26eGFP fibroblaster (gröna) och pseudofärgade områden med ökad fluorescens (lila) som visar fibroblastlokalisering. Medföljande videor som visar fibroblastvideor finns i kompletterande videor S1-2. Stillbilder visar bakgrundsrensning och underhåll av fibroblast-endogen fluorescens (grön). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4: Dämpning av förlust av fibroblaster i ischemi/reperfusion-skadade rensade hjärtan över tid.
Rensad hjärtvävnad från de angivna I/R-tidpunkterna med Tcf21MerCreMer (mcm) x Rosa26eGFP fibroblaster (grön), pseudofärgade områden med ökad fluorescens (lila) som visar fibroblastlokalisering och orange som beskriver områden utan fibroblaster. Översta raden: stillbilder av vänster ventriklar från I/R-skadade rensade hjärtan. Nedre raden: stillbilder av vänster ventriklar från I/R-skadade rensade hjärtan med Imaris fläckar funktion används för att se fibroblast mönster lättare i hela vänstra ventrikeln. Videor av I / R-skadade rensade hjärtan som visar inte bara grov mönstring av fibroblaster, men också tydliga bilder av enskilda fibroblaster och deras morfologier finns i kompletterande videor S5-8. Skalstänger = 500 μm. Förkortning: I/R = ischemi/reperfusion. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 5
Figur 5: Dämpning av förlust av hjärtfibroblaster efter skada i hjärtinfarkt-skadade rensade hjärtan över tid.
Rensad hjärtvävnad från MI-hjärtan med Tcf21MerCreMer (mcm) x Rosa26eGFP fibroblaster (grön), pseudofärgade områden med ökad fluorescens (lila) som visar fibroblastlokalisering och orange som beskriver områden utan fibroblaster. Översta raden: Stillbilder av vävnad rensade vänstra ventriklarna från MI-skadade hjärtan (gröna). Nedre raden: stillbilder av vävnad rensade vänstra ventriklarna från MI-skadade hjärtan (grön) med Imaris fläckar funktion (lila) överlagrad för att visa brutto fibroblast distribution. Videor av vävnad rensade vänstra ventriklarna från MI-skadade hjärtan visar brutto fibroblast arrangemang i hjärtat samt positionering och morfologi av enskilda fibroblaster i denna 3D in vivo modell (Kompletterande videor S7-8). Skalstänger: 1,5 dag = 1000 μm, 3 dag = 700 μm. Förkortning: MI = hjärtinfarkt. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 6
Figur 6: Rensad vävnad från Angiotensin/fenylefrina hjärtan.
(A) Schematiskt som visar hur Angiotensin/fenylefrina pumpar används för att administrera läkemedel under en tvåveckorsperiod efter tamoxifenaktivering av Tcf21MCM x eGFP. (B) Stillbild, stillbild + Imaris fläckar och video som visar fibroblast organisation och morfologi i Ang/PE-behandlade hjärtan(Kompletterande Video S11) Skala barer = 500 μm. Förkortningar: Ang/PE = angiotensin II/fenylefrin; eGFP = förbättrat grönt fluorescerande protein. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 7
Figur 7: Representativa bilder av observerade fibroblastmönster i Angiotensin/Fenylefrina hjärtan.
(A, Coch D): Bilder av högerhänta spiralvridningsmönster av fibroblaster ur ventrikelns utsida. (B) Bild av fibroblast mönstring ur perspektivet av insidan av ventrikeln. Pilar belyser linjära grupper av fibroblaster som utgör vridmönstret. Skalstänger = 500 μm. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Kompletterande figur 1: 2D-renderingar av apparater för bildreservoarer. A)2D-rendering av nedre halvan av bildbehållaren. Denna behållare är förseglad till Petri-skålen med vakuumfett. Hjärtat placeras i mittöppningen och nedsänkt i RIMS. B)2D-rendering av övre halvan av bildbehållaren. Glaslocket fästs på den platta botten av denna bit med vakuumfett. Detta placeras försiktigt ovanpå bottenbehållaren. Toppbehållaren kan sedan fyllas med glycerol för avbildning. Enheter i mm. Förkortningar: 2D = tvådimensionell; RIMS: Brytning index matchningslösning. Klicka här för att ladda ner den här siffran.

Video S1: Oskadd vävnad rensade hjärtat. Hjärt fibroblaster (grön) i en oskadd vänster ventrikel var små, och många var avrundade med högst två cellulära projektioner. Klicka här för att ladda ner den här videon.

Video S2: Sham vävnad rensade hjärtat. Hjärtfibroblaster (gröna) i vänster ventrikel av ett skenstyrt mushjärta var små och mestadels runda med få projektioner, liknande vad som sågs i oskadda hjärtan. Klicka här för att ladda ner den här videon.

Video S3: Detaljerad fibroblastvy genom ventrikulär vägg i ett oskadd hjärta. Denna video börjar på den inre ventrikulära väggen och zoomar mot hjärtats utsida. Hjärt fibroblaster (grön) visades i detalj och observerades ha rundade eller något långsträckta cellkroppar med högst två cellulära projektioner. Klicka här för att ladda ner den här videon.

Video S4: Detaljerad vy över delar av vänster ventrikulär vägg av oskadd hjärta. Denna ~300-μm-breda del av det rensade oskadda mushjärtat visar 3D-arrangemanget av hjärtfibroblaster (gröna) och deras morfologier i detalj. Klicka här för att ladda ner den här videon.

Video S5: Rensad vänster ventrikel på 3 dagars I/R. Detaljerad vy över den vänstra ventrikeln visade att efter I/R skada, det finns ett område med hjärt fibroblast förlust. Det var också uppenbart att fibroblaster (grön) utvecklade en mycket mer långsträckt form i detta skadade tillstånd i jämförelse med de mer rundade morfologier som ses i oskadda och falska hjärtan. Förkortning: I/R = ischemi/reperfusion. Klicka här för att ladda ner den här videon.

Video S6: Rensad vänster ventrikel på 7 dagars I/R. Detaljerad vy över den vänstra ventrikeln visar att med 7 dagar efter I/R skada, området saknar fibroblaster var mindre än den sett dag 3 efter I/R skada. Det fanns fler fibroblaster (gröna) närvarande, och intressant nog var nya cell morfologier närvarande. Specifikt hade vissa fibroblaster rundade cellkroppar med flera utskjutningar, vilket potentiellt indikerar en ny eller utvecklad roll av fibroblaster i denna miljö. Förkortning: I/R = ischemi/reperfusion. Klicka här för att ladda ner den här videon.

Video S7: Rensad vänster ventrikel på 14 dagars I/R. Detaljerad vy över vänster ventrikel visade att det fortfarande fanns ett område centralt för ventrikulära väggen som hade mycket få fibroblaster men fibroblaster (grön) i periferin av detta tomrum bibehöll den mycket långsträckta morfologi sett i dag 7 post-I/R prover. Intressant nog hade de få fibroblaster som fanns i den skadade regionen en morfologi som den i oskadda hjärtan - små och rundade. Förkortning: I/R = ischemi/reperfusion. Klicka här för att ladda ner den här videon.

Video S8: Rensad vänster ventrikel på 28 dagars I/R. Detaljerad bild av hjärt fibroblaster (grön) dag 28 efter I/R skada visade att det fanns ett litet område i den skadade regionen som saknade fibroblaster. det observerades också att det fanns en region med hög fibroblast densitet som omger denna region, och att morfologier i detta täta område var mycket långsträckta. Förkortning: I/R = ischemi/reperfusion. Klicka här för att ladda ner den här videon.

Video S9: Rensad vänster ventrikel på 1,5 dagars MI. det fanns mycket få hjärt fibroblaster (grön) kvar i den skadade vänstra ventrikeln 1,5 dagar efter MI, hjärt fibroblast död i hela denna region av ventrikeln. Förkortning: MI = hjärtinfarkt. Klicka här för att ladda ner den här videon.

Video S10: Rensad vänster ventrikel på 3 dagars MI. det fanns ett stort område utan hjärt fibroblaster 3 dagar efter MI, men vissa hjärt fibroblaster (grön) åter dök upp i ventrikeln, till skillnad från resultaten som hittades efter 1,5 dagar av MI. Hjärt fibroblast morfologi profiler var också annorlunda än de som ses i I/R skadade hjärtan. Här var fibroblaster långsträckta men det fanns andra som hade rundade cellkroppar (större än de som sågs i oskadda hjärtan) och en subpopulation av dessa hade många cellprojektioner. Förkortningar: MI = hjärtinfarkt; I/R = ischemi/reperfusion. Klicka här för att ladda ner den här videon.

Video S11: Rensad vänster ventrikel av Ang/PE-behandlade möss. det fanns ingen uppenbar förlust av hjärt fibroblaster (grön) efter Ang/PE behandling. Hjärt fibroblaster var dock mestadels små och rundade eller små och långsträckta och tycktes anpassa sig till hjärtats kontraktila mönster. Förkortning: Ang/PE = angiotensin II/fenylefrin. Klicka här för att ladda ner den här videon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denna artikel presenterar en raffinerad metod för vävnad clearing som möjliggör visualisering av hjärt fibroblaster in vivo, både vid baslinjen och efter skada, att karakterisera och bättre förstå fibroblaster i mus hjärtat. Detta förbättrade protokoll behandlar begränsningar i befintliga vävnadsrensningsprotokoll som har försökt identifiera specifika celltyper i vuxen- eller neonatalhjärtat12,13,14,16,17,20. I de första försöken att rensa mushjärtat användes den passiva CLARITY-tekniken, där hjärtat lämnades i en clearingbuffert på en mutter i ungefär 1 vecka för att möjliggöra passiv fördelning av bufferten ihela vävnaden 15,18. Denna process producerade endast clearing av cirka 80 μm djup i vävnaden (data visas inte), vilket överensstämmer med tidigare observationer där flera veckor behövdes för att rensa en 1 dag gammal neonatal mus hjärta13. Aktiv KLARHET med hjälp av ett aktivt elektroforessystem gjorde det möjligt att djupare rensa genom hela ventrikulära väggen, cirka 700 μm-1 mm djup, under en kortare tidsram12,18.

Med hjälp av detta tidigare publicerade aktiva CLARITY protokoll ledde dock till en förlust av fibroblast fluorescens med höga nivåer av vävnad autofluorescens, som tidigare hade noterats för att uppstå i aktiv KLARHET av Kolesova et al.12. För att möjliggöra underhåll av fibroblast fluorescens konstaterades det lämpliga fixering protokollet vara av yttersta vikt. För kort om en fixeringsprocess orsakade förlust av fluorescens under elektrofores. Alltför lång fixeringsprocess orsakade förlust av fluorescens själv. Därför konstaterades över natten fixering vid 4 °C i 4% PFA vara optimal. För att lindra bakgrund fluorescens frågan, en decolorization blötläggning (en princip lånad från CUBIC metoden för clearing) användes för att minska heme bindning inom myoglobin, och därför minska autofluorescens orsakas av denna kromofor18. Avkolonisering behandling resulterade i mer robust clearing av bakgrund fluorescens, med underhåll av reporter fluorescens så att de märkta fibroblaster var mer uttalade (Figur 2A).

Slutligen, för att möjliggöra fullständig optisk transparens, var vävnaden jämvikt i brytningsindexmatchningslösning (RIMS) (figur 2B-D). Genom att matcha vävnadens brytningsindex med omgivningen ökade detta vävnadens optiska transparens, vilket möjliggör djupare avbildning. Höghastighets resonans skanning användes sedan för att avbilda vävnad eftersom det är snabbare än galvanometric skanning. Eftersom mushjärtan är något olika storlekar, sattes individuella XY-bildparametrar och Z-intensitetskorrigeringar. Med dessa parametrar var det möjligt att avbilda genom det oskadda hjärtat för att visualisera fluorescerande fibroblaster i cirka 4 timmar (Figur 3). Bildkvaliteten förbättrades i efterbehandlingen genom att använda programvaran för avblanding och denoising analys för att minska bakgrunden och klargöra fluorescensen i bilden. Dessutom användes sekundär analys programvara för att belysa lokaliseringen av fluorescerande fibroblaster. Denna analys efter avbildningen användes för att tydligt kommentera hjärtfibroblaster genom att eliminera voxel-by-voxel i bakgrunden(figur 3, figur 4, figur 5, figur 6).

Detta optimerade CLARITY-protokoll har tillämpats på optiskt klara både skadade och oskadda hjärtan. Detta möjliggör en bättre förståelse av reaktionen av hjärtfibroblaster till skada. Dessa skador inkluderade en tidskurs för MI och I/ R, samt Ang / PE-dosering. Eftersom ischemisk skada försvagar hjärtvävnaden är det viktigt att större försiktighet tas under elektrofores för att upprätthålla vävnadsintegriteten. För både I/R- och MI-skada krävs en kortare period av elektrofores (≤1,5 h)32. Tidigare studier har inte beaktat effekterna av skada på vävnadsrensningsprocessen. Det nyligen optimerade protokollet som presenteras här rymmer för skada, vilket möjliggör röjning utan ytterligare förstörelse av vävnaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga avslöjanden relaterade till innehållet i detta manuskript.

Acknowledgments

Författarna vill uppmärksamma CCHMC Confocal Imaging Core för deras hjälp och vägledning i utvecklingen av denna modell, liksom Matt Batie från Clinical Engineering för design av alla 3D-tryckta delar. Demetria Fischesser stöddes av ett utbildningsbidrag från National Institutes of Health, (NHLBI, T32 HL125204) och Jeffery D. Molkentin stöddes av Howard Hughes Medical Institute.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-0 braided silk Ethicon K871H
8-0 prolene Ethicon 8730H
40% Acrylamide Solution Bio-Rad 1610140
Angiotensin II Sigma A9525-50G
Artificial Tear Ointment Covetrus 048272
DABCO (1,4-diazabicyclo[2.2. 2]octane) Millipore Sigma D27802-25G
GLUture topical tissue adhesive World Precision Instruments 503763
Heparin Sigma H0777
Imaris Start Analysis Software Oxford Instruments N/A
Micro-osmotic pumps Alzet Model 1002
Nikon Elements Analysis Software Nikon N/A
Nikon A1R HD upright microscope Nikon N/A
Normal autoclaved chow Labdiet 5010
Nycodenz, 5- (N-2, 3-dihydroxypropylacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N,
N'-bis (2, 3 dihydroxypropyl) isophthalamide
CosmoBio AXS-1002424
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
Phenylephrine Hydrochloride Sigma P6126-10G
Photoinitiator Wako Chemicals VA-044
Rosa26-nLacZ [FVB.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J] Jackson Laboratories Jax Stock No:012429
Sodium Azide Sigma Aldrich S2002-5G
Sodium Chloride solution Hospira, Inc. NDC 0409-4888-10
Tamoxifen Sigma Aldrich T5648
Tamoxifen food Envigo TD.130860
Tween-20 Thermo Fisher Scientific BP337-500
Quadrol, N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine, decolorizing agent Millipore Sigma 122262-1L
X-Clarity electrophoretic clearing chamber Logos Biosystems C30001
X-Clarity electrophoretic clearing solution Logos Biosystems C13001
X-Clarity electrophoresis tissue basket Logos Biosystems C12001
X-Clarity electrophoresis tissue basket holder Logos Biosystems C12002

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nagaraju, C. K., et al. Myofibroblast phenotype and reversibility of fibrosis in patients With end-stage heart failure. Journal of the American College of Cardiology. 73, (18), 2267-2282 (2019).
  2. Yoon, S., Eom, G. H. Heart failure with preserved ejection fraction: present status and future directions. Experimental and Molecular Medicine. 51, (12), 1-9 (2019).
  3. Borlaug, B. A., Redfield, M. M. Diastolic and systolic heart failure are distinct phenotypes within the heart failure spectrum. Circulation. 123, 2006-2014 (2011).
  4. Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the cardiac fibroblast. Circulation Journal. 80, (11), 2269-2276 (2016).
  5. Fu, X., et al. Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart. Journal of Clinical Investigation. 128, (5), 2127-2143 (2018).
  6. Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
  7. Sadeghi, A. H., et al. Engineered 3D cardiac fibrotic tissue to study fibrotic remodeling. Advanced Healthcare Materials. 6, (11), 1601434 (2017).
  8. Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141, (22), 4267-4278 (2014).
  9. Bruns, D. R., et al. The right ventricular fibroblast secretome drives cardiomyocyte dedifferentiation. PLoS One. 14, (8), 0220573 (2019).
  10. Skiöldebrand, E., et al. Inflammatory activation of human cardiac fibroblasts leads to altered calcium signaling, decreased connexin 43 expression and increased glutamate secretion. Heliyon. 3, (10), 00406 (2017).
  11. Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the pegasos method. Cell Research. 28, 803-818 (2018).
  12. Kolesová, H., Čapek, M., Radochová, B., Janáček, J., Sedmera, D. Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts. Histochemistry and Cell Biology. 146, (2), 141-152 (2016).
  13. Salamon, R. J., Zhang, Z., Mahmoud, A. I. Capturing the cardiac injury response of targeted cell populations via cleared heart three-dimensional imaging. Journal of Visualized Experiments. (157), (2020).
  14. Wang, Z., et al. Imaging transparent intact cardiac tissue with single-cell resolution. Biomedical Optics Express. 9, (2), 423-436 (2018).
  15. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, (4), 945-958 (2014).
  16. Yokoyama, T., et al. Quantification of sympathetic hyperinnervation and denervation after myocardial infarction by three-dimensional assessment of the cardiac sympathetic network in cleared transparent murine hearts. PLoS One. 12, (7), 0182072 (2017).
  17. Perbellini, F., et al. Free-of-Acrylamide SDS-based Tissue Clearing (FASTClear) for three dimensional visualization of myocardial tissue. Scientific Reports. 7, 5188 (2017).
  18. Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).
  19. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
  20. Nehrhoff, I., et al. 3D imaging in CUBIC-cleared mouse heart tissue: going deeper. Biomedical Optics Express. 7, (9), 3716-3720 (2016).
  21. Yamamoto, M., et al. A multifunctional reporter mouse line for Cre- and FLP-dependent lineage analysis. Genesis. 47, (2), 107-114 (2009).
  22. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50, (5), 600-613 (2011).
  23. Means, C. K., et al. Sphingosine 1-phosphate S1P2 and S1P3 receptor-mediated Akt activation protects against in vivo myocardial ischemia-reperfusion injury. American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 292, (6), 2944-2951 (2007).
  24. Michael, L. H., et al. Myocardial ischemia and reperfusion: A murine model. American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 269, (6), 2147-2154 (1995).
  25. Ahn, D., et al. Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice. American Joural of Physiology: Circulatory Physiology. 286, (3), 1201-1207 (2004).
  26. Patten, R. D., et al. Ventricular remodeling in a mouse model of myocardial infarction. American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 274, (5), 1812-1820 (1998).
  27. Gao, X. M., Dart, A. M., Dewar, E., Jennings, G., Du, X. J. Serial echocardiographic assessment of left ventricular dimensions and function after myocardial infarction in mice. Cardiovascular Research. 45, (2), 330-338 (2000).
  28. Vagnozzi, R. J., et al. An acute immune response underlies the benefit of cardiac stem cell therapy. Nature. 577, 405-409 (2020).
  29. Sengupta, P. P., Tajik, A. J., Chandrasekaran, K., Khandheria, B. K. Twist mechanics of the left ventricle. Principles and application. Journal of the American College of Cardiology: Cardiovascular Imaging. 1, (3), 366-376 (2008).
  30. Arts, T., et al. Macroscopic three-dimensional motion patterns of the left ventricle. Advances in Experimental Medicine and Biology. 346, 383-392 (1993).
  31. Willems, I. E. M. G., Havenith, M. G., De Mey, J. G. R., Daemen, M. J. A. P. The muscle actin-positive cells in healing human myocardial scars. American Journal of Pathology. 145, (4), 868-875 (1994).
  32. Hashmi, S., Al-Salam, S. Acute myocardial infarction and myocardial ischemia-reperfusion injury: A comparison. International Journal of Clinical Experimental Pathology. 8, 8786-8796 (2015).
Förfinad KLARHET-baserad vävnadsrensning för tredimensionell fibroblastorganisation i friska och skadade mushjärtan
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fischesser, D. M., Meyer, E. C., Sargent, M., Molkentin, J. D. Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts. J. Vis. Exp. (171), e62023, doi:10.3791/62023 (2021).More

Fischesser, D. M., Meyer, E. C., Sargent, M., Molkentin, J. D. Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts. J. Vis. Exp. (171), e62023, doi:10.3791/62023 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter