Summary
Aqui, apresentamos um modelo de endotoxina de terapia intensiva reprodutível em ratos.
Abstract
A sepse e o choque séptico continuam sendo a principal causa de morte nas unidades de terapia intensiva. Apesar de melhorias significativas no manejo da sepse, a mortalidade ainda varia entre 20 e 30%. Novas abordagens de tratamento para reduzir a falha multiórgão relacionada à sepse e a morte são urgentemente necessárias. Modelos robustos de animais permitem uma ou múltiplas abordagens de tratamento, bem como para testar seu efeito em parâmetros fisiológicos e moleculares. Neste artigo, é apresentado um modelo animal simples.
Em primeiro lugar, a anestesia geral é induzida em animais com o uso de anestesia volátil ou por anestesia intraperitoneal. Após a colocação de um cateter intravenoso (veia da cauda), traqueostomia e inserção de um cateter intraarterial (artéria traseira), inicia-se a ventilação mecânica. Os valores básicos da pressão arterial média, da saturação do oxigênio arterial e da frequência cardíaca são registrados.
A injeção de lipopólises (1 miligrama/quilograma de peso corporal) dissolvida em soro fisiológico tamponado por fosfato induz uma resposta inflamatória forte e reprodutível através do receptor 4. As correções de fluidos, bem como a aplicação da norepinefrina são realizadas com base em protocolos bem estabelecidos.
O modelo animal apresentado neste artigo é de fácil aprendizado e fortemente orientado para o tratamento clínico da sepse em uma unidade de terapia intensiva com sedação, ventilação mecânica, monitoramento contínuo da pressão arterial e amostragem repetitiva do sangue. Além disso, o modelo é confiável, permitindo dados reprodutíveis com um número limitado de animais de acordo com os princípios 3R (reduzir, substituir, refinar) da pesquisa animal. Embora experimentos com animais em pesquisas de sepse não possam ser facilmente substituídos, medições repetitivas permitem uma redução dos animais e manter animais sépticos anestesiados diminui o sofrimento.
Introduction
A sepse e sua forma mais grave, choque séptico, são síndromes no terreno de uma infecção, resultando em uma reação inflamatória exagerada com a liberação de citocinas, levando a alterações fisiológicas e bioquímicas com defesa imunológica suprimida e resultados fatais 1,2. Essa reação inflamatória desequilibrada resulta em disfunção de órgãos e falência de órgãos em vários órgãos vitais, como pulmão, rim e fígado. Com 37%3, a sepse é um dos motivos mais comuns para o paciente ser internado em uma unidade de terapia intensiva (UTI). A mortalidade por sepse atualmente varia em torno de 20-30%4. O tratamento precoce e eficaz com antibióticos é de extrema importância5. A ressuscitação do fluido e vasopressor precisa ser instalada precocemente, fora isso, o tratamento é puramente favorável6.
A sepse é definida como uma infecção comprovada ou suspeita com bactérias, fungos, vírus ou parasitas, que é acompanhada de disfunção de órgãos. Os critérios de choque séptico são atendidos quando um novo colapso cardiovascular irresponsável apenas ao tratamento de fluidos, e um nível de lactato de mais de 2 milmole/litro está presente2. A falência de órgãos relacionada à sepse pode ocorrer em qualquer órgão, mas é muito comum no sistema cardiovascular, no cérebro, no rim, no fígado e no pulmão. A maioria dos pacientes que sofrem de sepse requer intubação endotraqueal para proteger as vias aéreas do paciente, proteger da aspiração e aplicar ventilação expiratória final positiva com uma alta fração de oxigênio inspirado para prevenir ou superar a hipóxia. Para tolerar um tubo traqueal e ventilação mecânica, os pacientes geralmente requerem sedação.
Endotoxinas, como lipopólises (LPS) como componente da membrana de bactérias gram negativas induzem uma forte reação inflamatória através do receptor de pedágio (TLR)47. A ativação de uma via definida garante uma reação inflamatória estável. Citocinas como citocina induzida pela quimiato 1 (CINC-1), proteína quimiofos de monocito 1 (MCP-1) e interleucina 6 (IL-6) são conhecidas como fatores prognósticos para gravidade e desfecho neste modelo8. A aplicação LPS intravenosa tem sido usada com sucesso para estudar vários aspectos da sepse em ratos 8,9.
O tratamento da sepse ainda é um desafio, principalmente pela falta de modelos preditivos de animais. Se a endotoxemia com ativação da inflamação sistêmica é um modelo adequado para o desenvolvimento de terapias farmacológicas é discutível. No entanto, com o conhecido caminho TLR 4 induzido pelo LPS, importantes conhecimentos podem ser adquiridos.
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Protocol
Todos os experimentos apresentados neste protocolo foram aprovados pelas Autoridades Veterinárias do Cantão de Zurique, Suíça (números de aprovação 134/2014 e ZH088/19). Além disso, todas as etapas realizadas neste experimento foram de acordo com as Diretrizes sobre Experimentos com Animais pela Academia Suíça de Ciências Medianas (SAMS) e Diretrizes da Federação das Associações Europeias de Zootecnia (FELASA).
1. Indução de anestesia e monitoramento animal
- Mantenha os ratos Wistar machos com um peso de 250-300 gramas (g) em gaiolas ventiladas sob condições livres de patógenos. Forneça um ciclo claro/escuro de 12-12 horas a uma temperatura ambiente de 22 ± 1 °C, e acesso gratuito a alimentos e água.
- Induzir anestesia geral por indução volátil com isoflurano (concentração de 3-5%) em uma caixa de indução de anestesia por 30 segundos (Figura 1A) ou, alternativamente, induzir anestesia com uma injeção de tiro único de cetamina/xilazina (10/1 miligrama (mg) por 100 g de peso corporal).
- Transfira o animal para um local de trabalho e coloque o animal em um tapete de aquecimento durante todo o experimento. Mantenha a temperatura corporal entre 36,5 e 37 °C.
- Use um nariz para fornecer oxigênio (600 mL/minuto). Adicione isoflurane 2-3% se a anestesia volátil for escolhida para manutenção da anestesia. Certifique-se de que o animal está respirando espontaneamente.
- Confirme o nível de anestesia pela ausência do reflexo do dedo do dedo antes da instalação de traqueostomia e cateteres arteriais e venosos.
- Verifique uma oxigenação suficiente pelo monitoramento periférico de saturação de oxigênio (saturação normal de oxigênio 98 - 100%).
- Use uma pomada (pomada de vitamina A) para proteger os olhos.
- Prepare instrumentos cirúrgicos estéreis e cateteres em uma mesa lateral, conforme mostrado na Figura 1B.
- Além disso, prepare o monitoramento de pressão e saturação de oxigênio conforme exibido na Figura 1C.
2. Acesso intravenoso
- Aplique um torniquete na cauda proximal do rato para facilitar o acesso venoso (Figura 2A).
- Desinfete a cauda 3 vezes com álcool.
- Induzir um cateter intravenoso G26 em uma das duas veias laterais da cauda.
NOTA: Pela nossa experiência é mais fácil colocar o acesso intravenoso na parte distal da cauda do rato, pois a veia aqui está localizada mais perto da pele. Além disso, no caso de uma cannulação falha, há espaço suficiente para se mover proximicamente. - Evite estritamente a injeção de ar.
- Desamarre o torniquete depois de colocar o cateter intravenoso.
- Fixar o cateter intravenoso no lugar com fita adesiva (Figura 2B).
- Conecte as bombas de seringa ao acesso intravenoso para aplicação contínua de fluidos e medicamentos.
- Use torneiras de 3 vias para fluido de bolus, aplicação de drogas e amostragem de sangue venoso.
3. Traqueostomia
- Raspe a área anterior do pescoço do animal.
- Desinfete a pele raspada 3 vezes com solução de providone-iodo.
- Realize uma incisão longitudinal de cerca de 2 cm usando um bisturi (com uma lâmina número 10).
- Retraia a pele com suturas de seda 2-0.
- Prepare sem rodeios a laringe e a traqueia com uma tesoura cirúrgica (Figura 3A).
- Certifique-se de abrir a traqueia com micro tesoura cirúrgica no fechotraqueal 3-5.
- Insira uma cânula traqueal estéril na traqueia. Tenha cuidado, não insira a cânula muito profundamente para evitar ventilação unilateral.
- Fixar a cânula no lugar usando uma sutura de seda 2-0.
- Conecte a cânula a um ventilador para pressão ou ventilação controlada por volume (Figura 3B).
4. Acesso arterial
- Desinfete a cauda de rato 3 vezes com solução povidone-iodo.
- Corte a pele usando um bisturi (com uma lâmina número 10) cerca de 1 cm longitudinalmente no lado ventral.
- Tome cuidado, não corte muito profundamente para evitar uma lesão na artéria traseira.
- Use um microscópio cirúrgico para expor cuidadosamente a artéria. Corte a fáscia ao redor da artéria com micro tesoura cirúrgica.
- Ligate a parte distal da artéria usando uma sutura de seda 6-0.
- Prepare uma sutura de seda proximal 6-0, mas não aperte a seda (Figura 4A).
- Introduza um cateter G-26 na artéria entre a sutura de seda distal e proximal.
- Uma vez que o cateter esteja na artéria, aperte a sutura de seda proximal e fixe o cateter no lugar (Figura 4B).
- Conecte o cateter a um transdutor de pressão para fornecer medição contínua da pressão arterial (pressão arterial média normal: 60 - 100 mmHg) (Figura 4C).
- Além disso, coloque uma torneira de 3 vias entre o cateter conectado ao transdutor de pressão e o cateter G-26 para amostragem arterial de sangue.
5. Medição da linha de base, indução de sepse e medições de seguimento
- Depois que o animal atingiu um estado estável, injete o LPS.
- Coletar amostras de sangue quando um estado estável é atingido (geralmente após 15-30 minutos).
- Substitua a perda de fluido das amostras de sangue pela solução de Ringer em uma proporção de 1:4.
- Para induzir a sepse, injete o LPS como um bolus ou como uma aplicação LPS contínua.
- Para a aplicação do bolus, injete 1 mg de LPS/quilograma de peso corporal (kg) dissolvido em soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) a uma concentração de 1 mg/mL.
- Para aplicação contínua, injete 300 μg de LPS/kg/hora durante todo o experimento usando uma bomba de seringa (solução de estoque de LPS: 1 mg/mL em PBS).
- Evite a injeção de ar o tempo todo para evitar a embolia do ar.
- Defina protocolos de substituição de fluidos, protocolos de aplicação vasoconstritores e critérios de aborto (por exemplo, hipotensão definida como uma pressão arterial média abaixo de 50 mmHg por mais de 30 minutos, apesar da substituição do fluido) antes de configurar o experimento.
NOTA: Sugerimos uma infusão contínua da solução de Ringer a uma taxa de 10 mL/kg/hora. - Subtrair qualquer administração contínua de fluidos (por exemplo, para aplicação contínua de LPS) da quantidade infundida para que os resultados sejam comparáveis com os dos grupos de controle.
NOTA: Ao final do experimento, e antes de colher quaisquer órgãos como fígado, rim ou baço para análises posteriores, como animais histológicos ou bioquímicos, podem ser eutanizados por uma incisão da veia cava inferior. O método recomendado de eutanásia é levar os animais a um plano cirúrgico de anestesia antes da incisão da veia cava inferior e injeção de soro fisiológico gelado no coração esquerdo, especialmente se os marcadores inflamatórios nos órgãos forem avaliados. Certifique-se de cumprir os requisitos legais e as diretrizes locais. Para verificar a falência de órgãos relacionada à sepse, pode-se analisar o marcador pró-apoptose como o caspase-3, bem como a α1-microglobulina para verificar danos tubulares nos rins. A análise específica do órgão de marcadores como CINC-1, MCP-1 e IL-6 também pode fornecer informações sobre a resposta inflamatória específica do órgão.
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Representative Results
O sistema apresentado permite a endotoxemia com animais hemodinamicamente estáveis, conforme relatado anteriormente9. Enquanto a pressão arterial média permanece estável em animais com, e sem estimulação LPS LPS animais tratados desenvolvem características de sepse, como um excesso de base negativa e uma forte reação inflamatória medida por citocinas plasmáticas (6 horas após a aplicação) como CINC-1 (867 ng/mL), MCP-1 (5027 ng/mL) e IL-6 (867 ng/mL)8, Figura 5.
Figura 1: Preparação de equipamentos: Caixa de indução de anestesia e nariz para aplicação de anestesia/oxigênio (A). Material estéril a ser preparado antes da cirurgia: cateteres intravenosos 26G, um bisturi com lâmina número 10, fórceps curvos, fórceps retos, 1 portador de agulha, 2-0 e 6-0 laços de seda, cotonetes, cisores cirúrgicos, microscisores cirúrgicos (B). Equipamento de monitoramento: Monitoramento de anestesia com transdutor de pressão e saturação do sensor de oxigenação periférica (SpO2) para monitoramento contínuo (C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Acesso venoso: Um torniquete é aplicado na cauda do rato proximal (A). O acesso venoso deve ser introduzido na parte distal da cauda e fixado no lugar (B). A embolia aérea deve ser estritamente evitada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Traqueostomia: A laringe e a traqueia são preparadas sem rodeios com tesoura cirúrgica e expostas usando suturas de seda 2-0 (A). Depois de abrir a traqueia usando micro tesoura cirúrgica no fechotraqueal 3-5, uma cânula traqueal é introduzida, fixa em colocada e conectada a um ventilador (B) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Acesso arterial: Após exposição cirúrgica da artéria traseira utilizando uma micro tesoura bisturi e cirúrgica, uma ligadura de seda distal 6-0 é apertada, e uma ligadura proximal é preparada (A). Após a inserção do cateter G-26 na artéria, ele é fixado no lugar (B). O cateter arterial permite a amostragem repetitiva do sangue, bem como para o monitoramento contínuo da pressão arterial (C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Resultados representativos: Enquanto os animais permanecem hemodinamicamente estáveis no LPS, bem como no grupo de sham (A), eles desenvolvem características de endotoxemia, como um excesso de base negativa (B) e mediadores inflamatórios aumentados, como citocinas Proteína quitronoférica induzida 1 (CINC-1) (C), proteína quimiotetreto monocito 1 (MCP-1) (D) e interleucina 6 (IL-6) (E). A figura é reproduzida com permissão de Wolters Kluwer Health Inc., Beck-Schimmer et al, Eur J Anaesthesiol 2017; 34:764-7759. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O protocolo descrito aqui permite um modelo de sepse altamente reprodutível, mas simples de aprender, que pode ser adaptado de acordo com a questão da pesquisa. Dados in vivo essenciais referentes à função do órgão, como frequência cardíaca, pressão arterial e saturação de oxigênio arterial periférico podem ser coletados continuamente, e a amostragem de sangue pode ser realizada repetidamente durante todo o experimento. Além disso, podem ser instaladas modificações em relação aos protocolos de substituição de fluidos e suporte ao vasopressor. Dada a estabilidade hemodinâmica dos animais, os experimentos podem ser realizados ao longo de várias horas, como relatado anteriormente8.
É preciso ressaltar que é preciso escolher um modelo de sepse adequado para responder a uma pergunta específica de pesquisa10,11. Todos os modelos de sepse têm suas vantagens, mas também suas desvantagens. No artigo atual, é apresentado um modelo de endotoxemia, que induz uma inflamação forte, mas estéril. Características-chave da sepse, como o desenvolvimento de uma forte resposta inflamatória12, disfunção endotelial e danos13 e falência multi-órgãos14 estão presentes. Portanto, o modelo apresentado está de acordo com a definição previamente publicada de modelos de sepse em animais pelo "Consenso Internacional de Especialistas para Estudos Pré-Clínicos de Sepse"15. Outros elementos-chave podem ser diferentes do que na sepse bacteriana. A aplicação do bolus LPS, por exemplo, induz uma resposta cardiovascular hipodinâmica16, que não corresponde à resposta hiperdinâmica observada na sepse humana. Este último, no entanto, pode ser induzido por uma infusão contínua de LPS, como também sugerido no atual artigo16. Deve-se considerar que o LPS representa apenas uma toxina e pode ser simplificado demais para certas questões de pesquisa - por outro lado, a simplificação aumenta a reprodutibilidade dos dados. Outra característica dos modelos de endotoxemia é uma resposta diferente de citocina em comparação com modelos bacterianos - endotoxemia induz elevações de citocinas mais altas, mas mais curtas e duradouras10. Embora o modelo permita medições repetitivas ao longo de várias horas, a traqueostomia não é ideal para experimentos de sobrevivência. Em caso de experimentos de sobrevivência, pode ser preferida a intubação traqueal ou a respiração espontânea através de uma máscara.
Três classes fundamentalmente diferentes de modelos de sepse são atualmente aplicadas em pesquisas laboratoriais de sepse: modelos de toxemia (por exemplo, LPS), modelos de infecção bacteriana (por exemplo, Escherichia coli intravenosa) e modelos de disrupção de barreiras hospedeiras (por exemplo, ligadura cecal e punção, CLP)17. Mesmo que os modelos de toxemia com LPS tenham sido propostos como um modelo inadequado para a replicação da sepse humana15, é preciso ressaltar que características dessas classes fundamentais de modelos de sepse foram descritas detalhadamente 8,12,13,14 e foram criticamente revisadas em um artigo recente17.
Não há resposta final do que são os experimentos humanos em animais, mas o sentido mais comum é o princípio 3R, por sua definição, os experimentos em animais devem ser reduzidos, substituídos e refinados18. Enquanto na pesquisa de sepse a substituição de experimentos em animais é difícil, a amostragem repetitiva de sangue e as medições contínuas de dados vitais podem reduzir o número de animais necessários. Além disso, manter animais sépticos anestesiados refina a configuração experimental à medida que o sofrimento animal é diminuído.
Em resumo, apresentamos um modelo bem caracterizado e reprodutível de endotoxemia, um cenário semelhante ao de uma unidade de terapia intensiva com a possibilidade de gerar uma alta densidade de dados e, ao mesmo tempo, limitar a carga animal. Além disso, este modelo pode ser facilmente modificado dependendo da questão da pesquisa precisa ser respondida.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesses em relação ao estudo apresentado. Martin Schläpfer apresentou uma patente para mitigar os efeitos negativos da cirurgia e/ou anestesia para pacientes que usam gases médicos, particularmente oxigênio (O2) e dióxido de carbono (CO2). Ele recebeu bolsas de pesquisa irrestritas da Sedana Medical, suécia, e da Roche, Suíça, não relacionadas a este trabalho.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer a Beatrice Beck-Schimmer (MD) e Erik Schadde (MD) por seu exame crítico e sua valiosa contribuição para este manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-0 silk sutures | Ethicon, Sommerville, NJ | K833 | Standard surgical |
| 26 intravenous catheter | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 391349 | Standard anesthesia equipment |
| 6-0 LOOK black braided silk | Surgical Specalities Corporation, Wyomissing, PA | SP114 | Standard surgical |
| Alaris Syringe Pump | Bencton Dickinson | ||
| Betadine | Mundipharma, Basel, Switzerland | 7.68034E+12 | GTIN-number |
| Curved fine tips microforceps | World precision instruments (WPI), Sarasota, FL | 504513 | Facilitates vascular preparation |
| Fine tips microforceps | World precision instruments (WPI), Sarasota, FL | 501976 | Tips need to be polished regularly |
| Infinity Delta XL Anesthesia monitoring | Draeger, Lübeck, Germany | ||
| Isoflurane, 250 mL bottles | Attane, Piramal, Mumbai, India | LDNI 22098 | Standard vet. equipment |
| Ketamine (Ketalar) | Pfitzer, New York, NY | ||
| Lipopolysaccharide (LPS) from Escherichia coli, serotype 055:B5 | Sigma, Buchs, Switzerland | ||
| Q-tips small | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | EH11.1 | Standard surgical |
| Ringerfundin | Bbraun, Melsungen, Germany | ||
| Tec-3 Isofluorane Vaporizer | Ohmeda, GE-Healthcare, Chicago, IL | not available anymore | Standard vet. equipment |
| Xylazine (Xylazin Streuli) | Streuli AG, Uznach, Switzerland |
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