अपडेग्रैफ विधि का उपयोग करके प्लांट बायोमास की क्रिस्टलीय सेल्यूलोज सामग्री का अनुमान
Summary
अपडेग्रैफ विधि सेल्यूलोज अनुमान के लिए सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली विधि है। इस प्रदर्शन का मुख्य उद्देश्य संयंत्र बायोमास नमूनों में सेल्यूलोज सामग्री के अनुमान के लिए एक विस्तृत Updegraff प्रोटोकॉल प्रदान करना है।
Abstract
प्रकाश संश्लेषण और सेल दीवारों के मुख्य लोड-असर घटक द्वारा उत्पन्न पृथ्वी पर सेल्यूलोज सबसे प्रचुर मात्रा में बहुलक है। सेल वॉल कोशिका विकास की ताकत, कठोरता, दर और दिशा प्रदान करके पौधों के विकास और विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है, सेल आकार रखरखाव, और जैव और अजैविक तनाव से सुरक्षा। सेल वॉल मुख्य रूप से सेल्यूलोज, लिग्निन, हेमीसेल्यूलोज और पेक्टिन से बना है। हाल ही में संयंत्र सेल दीवारों दूसरी पीढ़ी के जैव ईंधन और जैव ऊर्जा उत्पादन के लिए लक्षित किया गया है । विशेष रूप से, संयंत्र सेल दीवार के सेल्यूलोज घटक का उपयोग सेल्यूलोसिक इथेनॉल के उत्पादन के लिए किया जाता है। बायोमास की सेल्यूलोज सामग्री का आकलन मौलिक और अनुप्रयुक्त सेल दीवार अनुसंधान के लिए महत्वपूर्ण है। अपडेग्रैफ विधि पौधे बायोमास की क्रिस्टलीय सेल्यूलोज सामग्री के अनुमान के लिए सरल, मजबूत और सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली विधि है। उपरेफ्रीफ रिएजेंट के साथ उपचार पर अल्कोहल अघुलनशील क्रूड सेल दीवार अंश हेमीसेल्यूलोज और लिग्निन अंशों को समाप्त करता है। बाद में, अपडेग्रैफ रिएजेंट प्रतिरोधी सेल्यूलोज अंश को मोनोमेरिक ग्लूकोज इकाइयों में सेल्यूलोज होमोपॉलिमर को हाइड्रोलीज़ करने के लिए सल्फ्यूरिक एसिड उपचार के अधीन किया जाता है। ग्लूकोज की विभिन्न सांद्रता का उपयोग करके एक प्रतिगमन रेखा विकसित की जाती है और प्रयोगात्मक नमूनों में सेल्यूलोज हाइड्रोलिसिस पर जारी ग्लूकोज की मात्रा का अनुमान लगाने के लिए उपयोग किया जाता है। अंत में, सेल्यूलोज सामग्री कोलोरिमेट्रिक एंथ्रोन परख द्वारा ग्लूकोज मोनोमर की मात्रा के आधार पर अनुमानित है।
Introduction
सेल्यूलोज सेल दीवारों का प्राथमिक लोड-असर घटक है, जो प्राथमिक और माध्यमिक कोशिका दोनों दीवारों में मौजूद है। सेल वॉल एक एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स है जो पौधों की कोशिकाओं को घेरे हुए है और मुख्य रूप से सेल्यूलोज, लिग्निन, हेमीसेल्यूलोज, पेक्टिन और मैट्रिक्स प्रोटीन से बना है। लगभग एक तिहाई पौधे बायोमास सेल्यूलोज1 है और यह कोशिका विकास की शक्ति, कठोरता, दर और दिशा प्रदान करके पौधों के विकास और विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, सेल आकार रखरखाव, और बायोटिक और अजैविक तनाव से सुरक्षा। कपास फाइबर में 95% सेल्यूलोज2 सामग्री होती है, जबकि पेड़ों में पौधों की प्रजातियों और अंग प्रकार3के आधार पर 40% से 50% सेल्यूलोज होते हैं। सेल्यूलोज सेलोबीओज़ की दोहराने वाली इकाइयों से बना है, जो β-1,4 ग्लाइकोसिडिक बांड4से जुड़े ग्लूकोज अवशेषों का एक डिसाकराइड है। सेल्यूलोसिक इथेनॉल पौधे की कोशिका दीवारों में मौजूद सेल्यूलोज से प्राप्त ग्लूकोज से उत्पन्न होता है5. सेल्यूलोसिक फाइबर कई माइक्रो फिब्रिल से बना होता है जिसमें प्रत्येक माइक्रो फिब्रिल 500-15000 ग्लूकोज मोनोमर1,6के साथ कोर यूनिट के रूप में कार्य करता है। सेल्यूलोज होमोपॉलिमर प्लाज्मा झिल्ली एम्बेडेड सेल्यूलोज सिंथेस कॉम्प्लेक्स (सीएससी)1, 7द्वारा संश्लेषित कियाजाताहै। व्यक्तिगत सेल्यूलोज सिंथेस ए (सीईएसए) प्रोटीन ग्लूकन चेन और आसन्न ग्लूकन चेन को क्रिस्टलीय सेल्यूलोज1, 8बनाने के लिए हाइड्रोजन बांड से जुड़ेहोतेहैं। सेल्यूलोज दो प्रमुख रूपों, सेल्यूलोज आईα और सेल्यूलोज आई के साथ कई क्रिस्टलीय रूपों में मौजूद है क्योंकि देशी रूप9। उच्च पौधों में, सेल्यूलोज सेल्यूलोज आईए फॉर्म में मौजूद है जबकि निचले पौधे सेल्यूलोज आईα फॉर्म10,11में मौजूद हैं। कुल मिलाकर, सेल्यूलोज पौधे की कोशिका दीवारों को शक्ति और कठोरता प्रदान करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है।
पहली पीढ़ी के जैव ईंधन मुख्य रूप से मकई स्टार्च, गन्ना शर्करा, और चुकंदर शर्करा, जो खाद्य स्रोत हैं से उत्पादित कर रहे हैं, जबकि दूसरी पीढ़ी के जैव ईंधन गैर खाद्य संयंत्र बायोमास सेल दीवार सामग्री12से जैव ईंधन उत्पादन पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं । क्रिस्टलीय सेल्यूलोज सामग्री का सटीक अनुमान न केवल सेल्यूलोज बायोसिंथेसिस और सेल वॉल डायनामिक्स पर मौलिक अनुसंधान के लिए महत्वपूर्ण है बल्कि एप्लाइड बायोफ्यूल और जैव उत्पादों के अनुसंधान के लिए भी महत्वपूर्ण है। पौधे बायोमास में सेल्यूलोज के अनुमान के लिए विभिन्न तरीकों को विकसित और अनुकूलित किया गया है, और अपडेग्रैफ विधि सेल्यूलोज अनुमान के लिए सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली विधि है। सेल्यूलोज अनुमान के लिए पहली रिपोर्ट की गई विधि 190813में क्रॉस और बेवन द्वारा की गई थी। यह विधि सोडियम सल्फेट द्वारा वैकल्पिक क्लोरीनेशन और निष्कर्षण के सिद्धांत पर आधारित थी। हालांकि, क्रॉस और बेवन विधि के मूल और संशोधित प्रोटोकॉलों द्वारा प्राप्त सेल्यूलोज ने काफी मात्रा में जाइलांस और मैनन्स14के अलावा लिग्निन के छोटे अंशों को दूषित दिखाया। सेल्यूलोज अंश से लिग्निन और हेमीसेल्यूलोज को हटाने के लिए कई संशोधनों के बावजूद, क्रॉस-बेवन विधि ने सेल्यूलोज के साथ काफी मात्रा में मैनन बनाए रखा। बाद में, कुर्श्नर की विधि को सेल्यूलोज15निकालने के लिए नाइट्रिक एसिड और इथेनॉल को नियोजित करके विकसित किया गया था। इस विधि में कहा गया है कि कुल लिग्निन और 75% पेंटोसेंट को हटा दिया गया था लेकिन सही सेल्यूलोज परिणाम क्रॉस और बेवन की क्लोरीनेशन विधि द्वारा अनुमानित समान थे। सेल्यूलोज16निकालने के लिए मेथनॉल-बेंजीन, सोडियम सल्फेट और सोडियम हाइपोक्लोराइट को नियोजित करके एक और विधि (नॉर्मन और जेनकिंस) विकसित की गई थी। इस विधि ने लिग्निन के कुछ अंश को भी बनाए रखा (3%) और पेंटोसेंट की महत्वपूर्ण मात्रा सेल्यूलोज के सटीक अनुमान में अग्रणी है। बाद में, किसेल और सेमगनोवस्की ने 80% केंद्रित सल्फ्यूरिक एसिड का उपयोग करके सेल्यूलोज को हाइड्रोलाइज करने के लिए एक अलग दृष्टिकोण का उपयोग किया, और बर्ट्रेंड की विधि17द्वारा हाइड्रोलिज्ड कम शर्करा का अनुमान लगाया गया था। दो तरीकों, वाकमैन और स्टीवंस18 और सालो14, 19 जो किसेल और सेमीगनोवस्की की विधि के आधार पर विकसित किए गए थे, पहले के तरीकों की तुलना में 4-5% कम सेल्यूलोज सामग्री भी मिली20।
अपडेग्रैफ विधि क्रिस्टलीय सेल्यूलोज सामग्री के अनुमान के लिए सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली विधि है। इस विधि को सबसे पहले उपदेग्रैफ ने 196921में सेल्यूलोज के मापन के लिए वर्णित किया था । अपडेग्रैफ विधि कुछ संशोधनों के साथ कुर्श्नर विधि (नाइट्रिक एसिड का उपयोग), किसेल और सेमिनोस्की विधियों (सल्फ्यूरिक एसिड का उपयोग करके ग्लूकोज मोनोमर में सेल्यूलोज का हाइड्रोलिसिस) और ग्लूकोज और क्रिस्टलीय सेल्यूलोस सामग्री22के सरल रंगमेट्रिक अनुमान के लिए विलेस और सिल्वरमैन की एथ्रोन परख को एकीकृत करती है। इस विधि का सिद्धांत समरूप पौधे के ऊतकों से हेमीसेल्यूलोज और लिग्निन को खत्म करने के लिए एसिटिक एसिड और नाइट्रिक एसिड (अपडेग्रैफ रिएजेंट) का उपयोग है, जो आगे के प्रसंस्करण और अनुमान15के लिए एसिटिक/नाइट्रिक एसिड प्रतिरोधी सेल्यूलोज छोड़ देता है। एसिटिक/नाइट्रिक एसिड प्रतिरोधी सेल्यूलोज का इलाज 67% सल्फ्यूरिक एसिड से किया जाता है ताकि सेल्यूलोज को ग्लूकोज मोनोमर में तोड़ दिया जा सके और जारी ग्लूकोज मोनोमर का अनुमान21, 23 को 21,23से किया जाता है । मूल अपडेग्रैफ विधि के कई संशोधनों का उपयोग प्रक्रिया को सरल बनाने और24को परख द्वारा सेल्यूलोज अनुमान को सरल बनाने के लिए किया गया था। मोटे तौर पर इस विधि को पांच चरणों में बांटा जा सकता है। पहले चरण में पौधे की सामग्री तैयार की जाती है। दूसरे चरण में, क्रूड सेल दीवार को कुल बायोमास से अलग किया जाता है, क्योंकि सेल्यूलोज पौधे सेल दीवारों का प्रमुख घटक है। बाद में, तीसरे चरण में, सेल्यूलोज को अपडेग्रैफ रिएजेंट के साथ इलाज करके गैर-सेल्यूलोसिक सेल वॉल घटकों से अलग किया जाता है। चौथे चरण में एसिटिक/नाइट्रिक एसिड प्रतिरोधी सेल्यूलोज को सल्फ्यूरिक एसिड ट्रीटमेंट से ग्लूकोज मोनोमर में तोड़ दिया जाता है। सेल्यूलोज के सल्फ्यूरिक एसिड उपचार के परिणामस्वरूप सल्फ्यूरिक एसिड के साथ ग्लूकोज मोनोमर की प्रतिक्रिया से 5-हाइड्रोक्सीमिथाइलफ्यूरल यौगिकों का गठन होता है। अंत में, अंतिम चरण में, एंथ्रोन पिछले चरण25में उत्पन्न फरफ्यूरल यौगिक के साथ उबलते हुए एक हरे नीले रंग का परिसर उत्पन्न करता है। इस अत्यावन आधारित रंगीन विधि का उपयोग पहली बार ड्रेवुड द्वारा 1 9 42 में किया गया था। एंथ्रोन एक डाई है जो अम्लीय परिस्थितियों में पेंटोज और हेक्सोस निर्जलित उत्पादों जैसे 5-हाइड्रोक्सीमिथाइलफुरल के फर्फुरल यौगिकों की पहचान करती है। हेक्सोस के साथ प्रतिक्रिया पेंटोस25की तुलना में एक तीव्र रंग और बेहतर प्रतिक्रिया पैदा करती है। बाउंड ग्लूकोज की मात्रा 620 एनएम पर स्पेक्ट्रोफोटोमीटर अवशोषण द्वारा मापी जाती है और हरे नीले परिसर की तीव्रता सीधे नमूने में चीनी की मात्रा के आनुपातिक होती है। मापा अवशोषण मूल्यों के नमूने के ग्लूकोज एकाग्रता की गणना करने के लिए एक ग्लूकोज मानक वक्र प्रतिगमन लाइन के साथ तुलना की गई । मापा ग्लूकोज सामग्री संयंत्र बायोमास के सेल्यूलोज सामग्री का अनुमान लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था।
Protocol
Representative Results
Discussion
कॉटन फाइबर कॉटनसीज से उत्पादित प्राकृतिक फाइबर होते हैं। कॉटन फाइबर एक एकल सेल है जिसमें ~ 95% सेल्यूलोज सामग्री2 है जिसमें उच्च क्रिस्टलीय सेल्यूलोज सामग्री है जिसमें कपड़ा उद्योग31म?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इस अध्ययन के आंशिक समर्थन के लिए संयंत्र और मृदा विज्ञान और कपास इंक विभाग को धन्यवाद देते हैं ।
Materials
| Acetone | Fisher Chemical | A18-500 | Used in the protocol |
| Anthrone | Sigma Aldrich | 90-44-8 | For colorimetric assay |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | For centrifugation |
| Chloroform | Mallinckrodt | 67-66-3 | Used in the protocol |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | 6381-92-6 | Used in the protocol |
| Ethanol | Millipore Sigma | EM-EX0276-4S | Used in the protocol |
| Filter paper | Whatman | 1004-090 | Positive control |
| Glacial acetic acid | Sigma | SKU A6283 | Used in the protocol |
| Heat block/ ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 13527550 | For controlled temperatures |
| Incubator | Fisherbrand | 150152633 | Used for drying plant sample |
| Measuring Scale | Mettler Toledo | 30243386 | For specific quantities |
| Methanol 100 % | Fisher Chemical | A412-500 | Used in the protocol |
| Microplate (96 well) | Evergreen Scientific | 222-8030-01F | For anthrone assay |
| Nitric acid | Sigma Aldrich | 695041 | Used in the protocol |
| Polypropylene Microvials (2 mL) / screw capped tubes | BioSpec Products | 10831 | For high temperatures |
| Spectrophotometer(Multimode Detector) | Beckmancoulter DTX880 | 1000814 | For measuring absorbances |
| Spex SamplePrep 6870 Freezer / Mill | Spex Sample Prep | 68-701-15 | For grinding plant tissues into fine powder |
| Sulphuric acid | J.T.Baker | 02-004-382 | Used in the protocol |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | 151-21-3 | Used in the PSB buffer |
| Tubes (2 mL) | Fisher Scientific | 05-408-138 | Used in the protocol |
| Tris Hydrochloride | Sigma Aldrich | 1185-53-1 | Used in the PSB buffer |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977 | Used in the protocol |
| Vacuum dryer (vacufuge plus) | Eppendorf | 22820001 | For drying samples |
| Vortex mixer | Fisherbrand | 14-955-151 | For mixing |
| Waterbath | Thermoscientific | TSGP02PM05 | For temperature controlled conditions at specific steps |
| Weighing Paper | Fisher Scientific | 09-898-12A | Used in the protocol |
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