Summary
Метод Updegraff является наиболее широко используемым методом для оценки целлюлозы. Основная цель этой демонстрации заключается в предоставлении подробного протокола Updegraff для оценки содержания целлюлозы в образцах биомассы растений.
Abstract
Целлюлоза является наиболее распространенным полимером на Земле, генерируемым фотосинтезом и основным несущим компонентом клеточных стенок. Клеточная стенка играет значительную роль в росте и развитии растений, обеспечивая прочность, жесткость, скорость и направление роста клеток, поддержание формы клеток, а также защиту от биотических и абиотических стрессоров. Клеточная стенка в основном состоит из целлюлозы, лигнина, гемичеллозы и пектина. Недавно стенки клеток растений были ориентированы на производство биотоплива и биоэнергии второго поколения. В частности, целлюлозный компонент стенки клеток растения используется для производства целлюлозного этанола. Оценка содержания целлюлозы в биомассе имеет решающее значение для фундаментальных и прикладных исследований клеточной стенки. Метод Updegraff прост, надежн и наиболее широко используется метод для оценки кристаллического содержания целлюлозы биомассы растений. Алкоголь нерастворимых сырой фракции стенки клетки при лечении реагентом Updegraff устраняет гемичеллулозы и лигнина фракций. Позже, Updegraff реагент устойчивых целлюлозы фракция подвергается серной кислоты лечения гидролизов целлюлозы гомополимера в мономерных единиц глюкозы. Регрессионная линия разработана с использованием различных концентраций глюкозы и используется для оценки количества глюкозы, высвобождаемой при целлюлозном гидролизе в экспериментальных образцах. Наконец, содержание целлюлозы оценивается на основе количества мономеров глюкозы по колоритическому анализу антрона.
Introduction
Целлюлоза является основным нагрузоносным компонентом клеточных стенок, который присутствует как в первичных, так и в вторичных клеточных стенках. Клеточная стенка является внеклеточной матрицей, которая окружает растительные клетки и в основном состоит из целлюлозы, лигнина, гемицеллюлозы, пектина и матричных белков. Приблизительно одна треть биомассы растений целлюлозы1 и играет значительную роль в росте и развитии растений, обеспечивая прочность, жесткость, скорость и направление роста клеток, поддержание формы клеток, а также защиту от биотических и абиотических стрессоров. Хлопковое волокно содержит 95% целлюлозы2 содержание, в то время как деревья содержат от 40% до 50% целлюлозы в зависимости от видов растений итипов органов 3. Целлюлоза состоит из повторяющихся единиц целлобиозы, дисахарид остатков глюкозы, соединенных β-1,4 гликозидионыхсвязей 4. Целлюлозный этанол производится из глюкозы, полученной из целлюлозы, присутствуют в стенках клеток растений5. Целлюлозное волокно состоит из нескольких микро фибрилляций, в которых каждый микро фибриллятор действует как основной блок с 500-15000 мономеровглюкозы 1,6. Целлюлозный гомополимер синтезируется плазменной мембраной встроенных целлюлозно-синтазных комплексов (CSC's)1,7. Индивидуальные целлюлозные синтазы (CESA) белки синтезируют глюкановые цепи и прилегающие к ним глюкановые цепи соединены водородными связями для формирования кристаллическойцеллюлозы 1,8. Целлюлоза существует в нескольких кристаллических формах с двумя преобладающими формами, целлюлозой I и целлюлозой I, как родные формы9. В высших растениях целлюлоза существует в форме целлюлозы I, в то время как нижняя целлюлоза растений существует вформе I q 10,11. В целом, целлюлоза играет значительную роль в придав прочности и жесткости стенок клеток растений.
Биотопливо первого поколения в основном производится из кукурузного крахмала, тростникового сахара и свеклы сахаров, которые являются источниками пищи, в то время как биотопливо второго поколения фокусируется на производстве биотоплива из непродовольственных растений биомассы клеточный материалстены 12. Точная оценка содержания кристаллической целлюлозы важна не только для фундаментальных исследований биосинтеза целлюлозы и динамики клеточных стенок, но и для прикладных исследований биотоплива и био продуктов. Разработаны и оптимизированы различные методы оценки целлюлозы в биомассе растений, а метод Ульдеграффа является наиболее широко используемым методом оценки целлюлозы. Первый зарегистрированный метод оценки целлюлозы был Кросс и Беван в 1908году 13. Метод был основан на принципе альтернативного хлорирования и экстракции сульфатом натрия. Тем не менее, целлюлоза, полученная в оригинале, а также измененные протоколы Креста и Беван метод показал загрязнение небольших фракций лигнина в дополнение к значительному количеству ксиланов и маннан14. Несмотря на несколько изменений для удаления лигнина и гемичеллозы из целлюлозной фракции, метод Кросс-Беван сохранил значительное количество маннан вместе с целлюлозой. Позже метод Куршнера был разработан с использованием азотной кислоты и этанола для извлечения целлюлозы15. Этот метод заявил, что общий лигнин и 75% пентозанов были удалены, но истинные результаты целлюлозы были такими же, как те, которые оцениваются методом хлорирования Креста и Бевана. Другой метод (Норман и Дженкинс) был разработан с использованием метанола-бензола, сульфата натрия и гипохлорита натрия для извлеченияцеллюлозы 16. Этот метод также сохранил некоторую долю лигнина (3%) и значительное количество пентозанов, что приводит к точной оценке целлюлозы. Позже Кизель и Семигановский использовали другой подход к гидролизной целлюлозе, используя 80% концентрированной серной кислоты, а гидролизированные пониженные сахара оценивались методомБертрана 17. Два метода, Waksman и Стивенс18 и Сало 14,19, которые были разработаны на основе метода Kiesel и Semiganowsky, также дали 4-5% меньше содержания целлюлозы по сравнению с предыдущими методами20.
Метод Updegraff является наиболее широко используемым методом для оценки кристаллического содержания целлюлозы. Этот метод был впервые описан Updegraff для измерения целлюлозы в 1969году 21. Метод Updegraff интегрирует метод Kurschner (использование азотной кислоты), методы Кизела и Семиновского (гидролиз целлюлозы в мономеры глюкозы с использованием серной кислоты) с некоторыми модификациями, и антронный анализ Viles и Silverman для простой колоритной оценки содержания глюкозы икристаллической целлюлозы 22. Принцип этого метода является использование уксусной кислоты и азотной кислоты (Updegraff реагент) для устранения гемичеллозы и лигнина из гомогенизированных тканей растений, что оставляет уксусной / азотной кислоты устойчивых целлюлозы для дальнейшей обработки иоценки 15. Ацетическая/азотная кислотная устойчивая целлюлоза лечится 67% серной кислотой, чтобы разбить целлюлозу на мономерыглюкозы,а выпущенные мономеры глюкозы оцениваются по анализу21,23. Несколько модификаций оригинального метода Updegraff были использованы для упрощения процедуры и оценки целлюлозы с помощью анализа24. В целом этот метод можно разделить на пять этапов. На первом этапе готовится растительный материал. На втором этапе стена сырой клетки отделяется от общей биомассы, так как целлюлоза является ключевым компонентом стенок клеток растений. Позже, в третьей фазе, целлюлоза отделяется от неклеточных компонентов клеточной стенки путем лечения реагентом Updegraff. В четвертой фазе устойчивая к уксусу/азотной кислоте целлюлоза разбита на мономеры глюкозы путем лечения серной кислотой. Серная кислота лечения целлюлозы приводит к образованию 5-гидроксиметилфурфальных соединений от реакции мономеров глюкозы с серной кислотой. Наконец, на последнем этапе, антрон генерирует зеленовато-голубой комплекс путем кипения с меховым соединением, генерируемым в предыдущей фазе25. Этот цветометрический метод на основе антрона был впервые использован в 1942 году Дрейвудом. Антрон является красителем, который определяет меховые соединения пентозы и шестинозных обезвоженных продуктов, таких как 5-гидроксиметилфурфурурал, в кислых условиях. Реакция с шестиосной производит интенсивный цвет и лучший ответ по сравнению с пентозами25. Количество связанной глюкозы измеряется абсорбации спектрофотометра на уровне 620 нм, а интенсивность зеленовато-голубого комплекса прямо пропорциональна количеству сахара в образце. Измеренные значения абсорбции сравнивались со стандартной линией регрессии кривой глюкозы для расчета концентрации глюкозы в образце. Измеренное содержание глюкозы было использовано для оценки содержания целлюлозы в биомассе растения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Экспериментальная подготовка
- Измельчить сушеный растительный материал в мелкий порошок.
- Белка Solubilization Buffer (PSB): Подготовка фондовых растворов 1 M Tris (рН 8,8), 0,5 М этилендиаминтетраатетической кислоты (EDTA) (рН 8,0) и автоклав их. Сделайте свежий буфер PSB из этих фондовых растворов с конечной концентрацией 50 мМ Трис, 0,5 мМ EDTA и 10% додекилового сульфата натрия (SDS) в стерильной воде.
- Приготовьте 100 мл 70% этанола (v/v): 70 мл 100% этанола и 30 мл стерильной воды.
- Приготовьте 100 мл метанола: хлороформ в соотношении 1:1 (метанол 50 мл и 50 мл хлороформа).
- Приготовьте 82,5 мл реагента Updegraff. Добавьте 75 мл 80% уксусной кислоты в 7,5 мл азотной кислоты, чтобы конечное соотношение воды: уксусная кислота: азотная кислота в 2:8:1 (v/v). Для приготовления 80% уксусной кислоты растворите 80 мл ледниковой уксусной кислоты в 20 мл стерильной воды (v/v).
- Приготовьте свежий запас раствора глюкозы 1 мг/мл. Растворите 10 мг глюкозы в 10 мл воды (w/v).
- Для приготовления 100 мл 67% серной кислоты (v/v) добавьте 67 мл концентрированной серной кислоты в 33 мл воды. Всегда используйте стеклянную бутылку и добавить кислоту медленно в воду. Этот шаг экзотермический (высвобождает тепло). Таким образом, подготовить этот раствор на льду и охладить в холодильнике, по крайней мере за 2 часа до использования.
- Приготовьте свежий 0,2% антрона (w/v) для каждой партии экспериментальных образцов. Взвесите 0,2 г антрона и растворите в 100 мл предварительно охлажденной концентрированной серной кислоты в стеклянной бутылке, завернутой алюминиевой фольгой. Хранить в холодильнике 1-2 часа перед использованием.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительно охлаждающая концентрированная серная кислота в холодильнике в день эксперимента, и свежий препарат антрона настоятельно рекомендуется для точной оценки содержания глюкозы.
2. Подготовка растительного материала из биомассы
- Сбор образцов биомассы растений из 2-месячных экспериментальных линий хлопка, выращенных в теплице с теми же условиями роста, той же стадией развития, тем же положением растений и тем же типом ткани (лист/стебель/корень).
ПРИМЕЧАНИЕ: Соберите как минимум три биологических репликации для каждого образца. Тщательно вымойте их водой, чтобы удалить всю грязь из корневой ткани. - Воздушно-сухая корневая ткань в течение 2 дней на бумажных полотенцах при комнатной температуре для удаления содержания влаги(рисунок 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Воздушно-сухая желаемая ткань для оценки целлюлозы, чтобы предотвратить любое грибковое загрязнение. - Поместите корневые образцы в отдельные контейнеры. Затем этикетки и высушить их в инкубаторе при 49 градусов по Цельсию в течение 10дней (Таблица материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, фен может быть использован для высыхания тканей растений за меньшее время (1 или 2 дня), не вызывая каких-либо химических изменений в материале биомассы растения. - Разрежьте высушенные образцы на мелкие кусочки, заморозьте их в жидком азоте и измельчите в единый мелкий порошок с помощью раствора и пестика, морозильной мельницы или мясорубкииз биомассы (рисунок 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Морозильная мельница использовалась со скоростью 10 CPS в течение 3 циклов. - Соберите заземленную ткань(рисунок 2) и приступить к извлечению клеточной стенки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс может быть приостановлен в этот момент путем хранения образцов в герметичных контейнерах при комнатной температуре.
3. Извлечение стенок сырых клеток из биомассы растений
ПРИМЕЧАНИЕ: Стенки клеток растений содержат целлюлозу, лигнин, неклеточные компоненты, пектин, матричные белки, фенольные соединения иводу 26. Так как целлюлоза присутствует в клеточных стенках, первым шагом является отделяние компонента клеточной стенки от неклеточных компонентов стенки биомассы растения26.
- Этикетка и весят отдельные пустые 2 мл труб перед началом процесса извлечения клеточной стенки.
- Сделайте заметку о пустой массе трубки в лабораторном блокноте, прежде чем продолжить.
- Взвесьте 20 мг порошкообразной ткани от шага 2.5 и перенесите его в предварительно взвешенные трубки 2 мл и обозначите их.
- Добавьте 1 мл буфера растворимости белка (PSB) (50 мМ Трис гидрохлорид (HCl) буфер рН 8,8, 0,5 мМ EDTA и 10% додекил сульфата натрия (SDS) для растворимости белков. Вихрь и центрифуга при температуре 25 200 х г в течение 5 мин при комнатной температуре (RT). После центрифугации отбросьте супернатант и сохраните гранулы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Супернатант может быть сохранен, если белковый компонент нуждается в анализе. - Повторите шаг 3.4 еще два раза.
- К сохраненным гранулам добавьте 1 мл дистиллированной воды и вихря. Центрифуга при температуре 25 200 х 5 мин при комнатной температуре (РТ) и удалить супернатант.
- Повторите шаг 3.6 еще два раза.
- Добавьте 1 мл 70% этанола в сохраненные гранулы, вихрь и нагрейте его при температуре 70 градусов по Цельсию в течение 1 ч в водяной бане/тепловом блоке, чтобы удалить растворимые компоненты и крахмал из образцов. Вихрь и центрифуга при 25200 х г в течение 5 мин на RT. Отбросьте супернатант и сохраните гранулы.
- Повторите шаг 3.8 еще раз.
- К гранулам добавить 1 мл 100% метанола и вихря. Центрифуга при температуре 25 200 х 5 мин при комнатной температуре (РТ) и удалить супернатант.
- Добавьте 1 мл хлороформа/метанола (хлороформ и метанол в соотношении 1:1) к гранулам и вихрю. Центрифуга при 25200 х г в течение 5 мин на RT и удалить супернатант. Добавление метанола и хлороформного растворителя solubilizes и удаляет липидную фракцию из биомассы27.
- К гранулам добавьте 1 мл 100% ацетона и вихря. Инкубация при комнатной температуре в течение 5 мин. Центрифуга при 25200 х г в течение 5 мин на RT и удалить супернатант. Ацетон удаляет пигменты, такие как хлорофилл и свободные жирные кислоты избиомассы 28,29.
- Высушите гранулы при 37 градусах по Цельсию на ночь или продолжайте далее путем вакуумной сушки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Высушенные гранулы сырой клеточной стенки, используемой для оценки кристаллической целлюлозы. Процесс может быть приостановлен в этот момент или продолжить использование вакуумной сушилки для сушки образцов.
4. Лечение реагентом Updegraff (ацетической и азотной кислотой) для удаления неклеточных компонентов
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол включает в себя использование кислот и других химических веществ. Носите средства индивидуальной защиты (PPE) на протяжении всего процесса.
- Измерьте 5 мг высушенной сырой гранулы стены клетки в свежую трубку крышкой винта 2 mL. Обратите внимание на точныйвес (рисунок 3)30.
- Включите положительный контроль на данном этапе. Используйте 2 мг фильтровальнойбумаги (Таблица материалов)в качестве положительного контроля, который дает 80% содержание целлюлозы.
- Добавьте 1,5 мл реагента Updegraff в взвешенный 5 мг экстракта клеточной стенки и положительный контроль. Смешайте вихрем.
ПРИМЕЧАНИЕ: Положительный контроль должен обрабатываться так же, как экспериментальные образцы с этого шага. Этот шаг должен быть выполнен в дымовой капот с надлежащим персональным защитным оборудованием (СИЗ).
ВНИМАНИЕ: Этот шаг должен быть выполнен в винт крышка труб для предотвращения брызг образца и popping труб. Следует включить три биологических реплицирования каждого образца и три репликации для положительного контроля. - Нагрейте подвеску при температуре 100 градусов по Цельсию в течение 30 минут в кипящей водяной бане и охладите на скамейке в течение 10 минут. Центрифуга при 25200 х г в течение 10 мин на RT. Удалите супернатант центрифугой и сохраните гранулы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образуемые отходы должны собираться отдельно для органических растворителей, серной кислоты и реагента Updegraff (уксусная кислота и азотная кислота). Отходы с уксусной кислотой и азотной кислотой следует хранить при низких температурах с вентилируемыми колпачками и никогда не смешивать с любыми другими органическими растворителями и другими кислотами, чтобы предотвратить любой взрыв. - Добавьте в гранулы 1 мл воды. Центрифуга при 25200 х г в течение 10 мин при RT. Удалите 500 МКЛ супернатанта и добавьте 1 мл ацетона в трубку.
- Центрифуга при 25200 х г в течение 5 мин в RT. Удалите 1 мл супернатанта и добавьте 1 мл ацетона в трубку и центрифугу при 25 200 х г в течение 5 мин в RT.
- После центрифугации снимите все супернатанты и приостановит гранулы в 1 мл ацетона. Инкубировать трубки при комнатной температуре в течение 5 минут и спина на 25200 х г в течение 5 минут на RT.
- Откажитесь от супернатанта и сохраните гранулы. Высушите гранулы при 37 градусах по Цельсию на ночь(рисунок 3).
ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс может быть приостановлен в этот момент или продолжить дальнейшее использование вакуумной сушилки для сушки и перейти к следующему шагу.
5. Гидролиз целлюлозы кислотой для производства мономерных единиц глюкозы
- Добавьте 1 мл 67% серной кислоты в высушенные гранулы. Vortex смешать гранулы полностью в кислоте.
- Встряхните трубки при комнатной температуре в течение 1 ч, чтобы растворить целлюлозные гранулы в 67% серной кислоты.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, solubilization целлюлозы гранулы в 67% серной кислоты могут быть улучшены путем sonication каждого образца в течение 10 минут после 30 мин инкубации в шейкере. После sonication, образцы могут быть повторно инкубированы в шейкере на RT. Тем не менее, мы наблюдали полную solubility целлюлозы гранулы без sonication, когда мы начинаем с 5 мг экстракта сырой клеточной стенки (Рисунок 3). Эта процедура хорошо работала для различных образцов биомассы растений3.
6. Измерение содержания глюкозы путем анализа антрона и оценки содержания целлюлозы
- На данном этапе целлюлоза находится в виде свободных мономеров глюкозы. Определите количество целлюлозы, измерив количество глюкозы, присутствуют в образце спектрофотометрии.
- Возьмите 10 йл образца из шага 5 и добавьте его в 490 йл стерильной дистиллированной воды, чтобы разбавить каждый образец до 500 йл. Vortex разбавленной смеси образца и воды в течение 10 секунд.
- Добавьте 1 мл 0,2% свежеприготовленного реагента антрона в каждую трубку и немедленно перемешайте вихрем.
- Отварить образцы при 100 градусах Цельсия в течение 10 минут и охладить трубки на льду в течение 5 минут. Передача 200 йл каждого образца в трех скважинах 96 пластины скважины. Загрузите пластину 96 хорошо в спектрофотометр для измерения абсорбтности на 620 нм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для кипячения при высокой температуре, используйте винтовые трубки, чтобы предотвратить брызги вредных химических веществ и избежать потери образцов.
7. Подготовка стандартной кривой глюкозы
- Для приготовления стандарта глюкозы сделайте свежий бульон из 1 мг/мл глюкозы путем растворения 10 мг глюкозы в 10 мл стерильной дистиллированной воды. Добавьте этот запас раствор 1 мг/мл в 20 шагом (0, 20, 40, 60, 80,100,120,140, 160, 180 МКЛ) к стерильной дистиллированной воде (общий объем 1 мл) для подготовки стандартов глюкозы в диапазоне от 0 мкг до 180 мкг/мл концентраций (рисунок 3). Vortex каждого стандарта глюкозы после добавления стерильной воды.
- Из этих 10 различных концентраций, aliquot 500 йл каждой концентрации глюкозы в свежем 2 мл винт ограничен трубки.
- Добавьте 1 мл свежеприготовленного 0,2% антрона в каждую трубку и немедленно перемешайте вихрем. Инкубировать на льду и кипятить при 100 градусах Цельсия в течение 10 мин с последующим инкубацией на льду в течение 5мин 23.
- Передача 200 йл каждого стандарта на три скважины в 96 колодцах микро рейтеровой пластины для трех технических репликаций и измерение поглощения на уровне 620 нм(рисунок 3).
- Разработать стандартную кривую глюкозы путем построения различных концентраций глюкозы (от 0 до 180 мкг/мл) против нормализованных значений поглощения на уровне 620 нм(рисунок 7). Для расчета содержания целлюлозы в подготовленных образцах используйте регрессивную линию Y'mx'c, генерируемую из значений абсорбции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Глюкоза стандарты должны быть свежеприготовлены для каждого набора эксперимента. Концентрация глюкозы должна быть увеличена, если значения OD слишком высоки/низки, так что эти значения подпадают под диапазон стандартных значений абсорбции кривой. Линия регрессии генерирует различные значения m и c на основе стандартов глюкозы, используемых для каждой партии образцов. Смешайте трубки сразу после добавления антрона23. Антрон, разбавленные образцы и подготовленные стандарты всегда были холодными до тех пор, пока анализ антрона не был выполнен из-за экзотермического характера этой реакции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Хлопковые растения, выращенные в зеленом доме, были отобраны для этого исследования. Для сравнительного анализа содержания целлюлозы были отобраны две различные экспериментальные линии хлопка. Для каждой экспериментальной линии корневая ткань была собрана из трех биологических репликаций. В общей сложности 500 мг ткани была гомогенизирована и 20 мг его было использовано для извлечения сырой клеточной стенки. Позже, 5 мг экстракта сырой клеточной стенки был использован для лечения реагентов Updegraff для удаления гемичеллозы и лигнина из целлюлозы. Очищенная целлюлоза была гидролизована серной кислотой для того чтобы сломать вниз целлюлозу в блоки глюкозы. Результаты показаний абсорбции на уровне 620 нм(Дополнительная таблица 1) были использованы для измерения концентрации глюкозы и оценки содержания целлюлозы по анализу антрона. Средние значения абсорбции трех технических репликаций были нормализовываются путем вычитания пустого значения абсорбции концентрации глюкозы в 0 мкг. Стандартная кривая глюкозы была создана с помощью рассеянного графика бар(рисунок 4).
Полученная линия регрессии, y mx q c из этой стандартной кривой, используется для расчета неизвестной концентрации глюкозы в извлеченных тестовых образцах с использованием нормализованных показаний абсорбции. Для расчета x (неизвестная концентрация глюкозы в мкг/йл) использовалась формула (х - нормализованная абсорбанса-с/м). Значения c и m от регрессионные линии стандартной кривой глюкозы (R2 и 0.99) были использованы для измерения концентрации глюкозы в мкг/ОЛ. Затем это значение делится на коэффициент разбавления 2, так как конечный объем составляет 500 йл и далее делится на объем образца 10 МКЛ для измерения концентрации глюкозы в мкг/ОЛ. Так как рассчитанное значение для 5 мг экстракта клеточной стенки, оно далее делится на 5 или с соответствующим весом стенки сырой клетки, используемой для каждого экспериментального образца, чтобы получить концентрацию глюкозы на мг. Значение далее делится на 1,1, чтобы компенсировать воду, полученную в процессе гидролиза (глюкоза имеет молекулярный вес 180 и молекула воды имеет молекулярный вес 18 и, следовательно, вода, генерируемая в процессе высвобождения мономеров глюкозы, была удалена путем деления фактора влажности, 1.1). В результате значение будет умножено на 100 для расчета кристаллического содержания целлюлозы в процентах(Дополнительная таблица 1).
Результаты содержания целлюлозы показывают, что они согласуются между биологическими репликациями, что свидетельствует о технической точности метода Updegraff. Кроме того, различия были построены с использованием 2D графиков. Эти результаты показали различия в содержании целлюлозы в сравненных экспериментальных числах выборки 1 и 2(рисунок 4). Пример 1 показывает 43,4%, в то время как выборка 2 показывает 28,12%, что позволяет предположить, что этот метод может различать различия между экспериментальными образцами. Студенческий t-тест был применен на уровне 95% значимости, чтобы проверить их значительные различия.
Рисунок 1: Подготовка биомассы хлопкового растения для оценки содержания целлюлозы в корнях. (A)Парниковые выращенные растения аккуратно вытащили из почвы и тщательно промыли водой. Корневая ткань растения была отделена, хранится на бумажных полотенцах и позволяет промокнеть в течение 2 дней. (B)Затем корневая ткань была перенесена в индивидуально маркированную тару и позволила высохнуть в инкубаторе при 49 градусов по Цельсию в течение -10 дней. (C)Высушенная ткань была разрезана на мелкие кусочки, заморожена в жидком азоте, загружена в шлифовальные флаконы и заземлена в мелкий порошок с помощью морозильной мельницы. (D)Мелко заземленный порошок ткани был собран в трубке 50 мл. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Диаграмма потока основных шагов, участвующих в методе Updegraff. (A)Пикториальное представление ключевых шагов в протоколе. (B)Объясняет критические шаги, которые были показаны в панели (A). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Подготовка различных концентраций глюкозы для стандартной кривой. (A) Подготовка запасного раствора глюкозы путем растворения 10 мг глюкозы в 10 мл стерильной дистиллированной воды, так что окончательная концентрация бульона составляет 1 мг/мл. Добавьте раствор бульона в 1 мг/мл глюкозы в 20 мкл шагом к окончательному объему 1 мл со стерильной дистиллированной водой, чтобы подготовить различные концентрации глюкозы от 0 мкг до 180 мкг/мл. (B)Таблица, показывающая количество глюкозы 1 мг/мл и стерильной дистиллированной воды, которая будет добавлена, чтобы сделать различные концентрации глюкозы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Стандартная кривая глюкозы генерируется с использованием значений абсорбции различных концентрацийглюкозы на уровне 620 нм. (A)Таблица, показывающая различные концентрации глюкозы в диапазоне от 0 до 180 мкг/мл с соответствующими нормализованным значениями поглощения на уровне 620 нм. (B) Стандартная кривая глюкозы, генерируемая с помощью диаграммы рассеяния из значений абсорбции(A). (C)Бар график, показывающий кристаллические различия содержания целлюлозы в экспериментальных образцах 1 и 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительная таблица 1: Оценка содержания целлюлозы в экспериментальных образцах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хлопковые волокна являются натуральными волокнами, произведенными из хлопчатобумажного семе. Хлопковое волокно является одной клеткой с содержанием целлюлозы 95%2 с высоким содержанием кристаллической целлюлозы с обширным применением в текстильнойпромышленности 31. Поскольку хлопчатобумажное волокно содержит 95% целлюлозы, мы использовали ткани из хлопчатобумажных корней для демонстрации оценки кристаллического содержания целлюлозы. Ткани корней хлопка умеренно богаты кристаллическим содержанием целлюлозы и представляют собой широко доступную биомассу растений. Количество общей клеточной стенки, необходимой для кристаллического содержания целлюлозы составляет всего 5 мг и, следовательно, этот метод может быть использован для оценки кристаллического содержания целлюлозы на различных стадиях развития / ткани конкретной оценки содержания целлюлозы. Процент серной кислоты (67%) также играет важную роль в разрушении целлюлозы в мономеры глюкозы и растворения целлюлозыполностью 23 без необходимости sonication. Потеря образца является общим после лечения Updegraff как кристаллические гранулы целлюлозы не является твердым в нижней части трубки на разных этапах в процессе оценки. Это может быть сведено к минимуму путем удаления небольших объемов супернатанта на каждом шагу воды и ацетона моет после Updegraff лечения. Кроме того, немедленное вихревое определение выборки и стандартов с антроном играет значительную роль в развитии цвета и повышении точности стандартов, что приводит к 99,5% коэффициент определения (R2) значения (рисунок 3). Стандартная кривая глюкозы является ключевой в определении концентрации глюкозы, которая, в свою очередь, используется для оценки кристаллического содержания целлюлозы. Следовательно, концентрации глюкозы могут быть скорректированы в соответствии с требуемым диапазоном концентраций. В зависимости от диапазона значений, подходящих под экспериментальные значения, стандартная кривая может варьироваться от 0 до 100 мкг/мл или от 0 до 200 мкг/мл до 1000 мкг/мл концентрации глюкозы; это еще больше изменяет значения регрессии c и m, повышая точность оценки кристаллической целлюлозы. Важно всегда делать свежие 0,2% антрона как для образцов, так и для стандарта. R-квадрат, статистическое измерение, представляет изменчивость всех точек данных на линии регрессии. Важно варить как стандарты, так и образцы после добавления антрона в течение одного и того же периода времени. Всегда важно включить положительный контроль с известным содержанием целлюлозы. Для эффективной воспроизводимости данных вся процедура должна точно следовать, включая подготовку решения (стандарты, стандартная кривая и реагент Updegraff).
В последнее время целлюлоза исследуется для не текстильных приложений, таких как целлюлозные аэрозоли, компьютерные детали и целлюлозный этанол32,33; следовательно, этот метод будет иметь широкое применение в будущем. Научное развитие достигается за счет постепенного прогресса в понимании концепций, предложения альтернативных гипотез и предоставления/опровержения существующих знаний. Аналогичный прогресс наблюдается в разработке надежного метода оценки содержания целлюлозы в биомассе растений. Клеточная стенка является сложной матрицей, и метод Updegraff последовательно устраняет неклеточные фракции из чистой целлюлозы, что приводит к точной оценке содержания целлюлозы в биомассе растения. Кроме того, простой колоритометрический метод, разработанный для оценки содержания целлюлозы путем измерения концентрации глюкозы, сделал этот метод очень адаптируемым и широко используемым. В текущем исследовании данные целлюлозы были последовательными между различными биологическими репликациями образцов, собранных из одной линии. Таким образом, это говорит о том, что данные, полученные с помощью этого метода, являются последовательными, надежными, воспроизводимыми и легко измеряют содержание целлюлозы простым колоритическим анализом.
Метод Updegraff является наиболее широко используемым методом для оценки целлюлозы. С недавним расширением промышленного применения целлюлозы, таких как продукты питания, дерево, бумага, волокна, биотопливо, одежда, косметика и фармацевтические препараты, точная оценка содержания целлюлозы в биомассе растений имеет решающее значение для различных применений. Хотя это наиболее широко используемый метод оценки целлюлозы, важно принять ряд мер предосторожности для получения воспроизводимых данных. Образцы биомассы должны быть основаны на том же размере для получения точной и воспроизводимой оценки содержания целлюлозы. Следует позаботиться при генерации кривой стандарта глюкозы. Стандарты глюкозы, используемые для подготовки стандартной кривой глюкозы, должны быть увеличены или уменьшены на основе показаний абсорбции образца, чтобы неизвестные концентрации подпадают под диапазон концентраций глюкозы, которые используются для подготовки стандартной кривой. В случае нет, значения m и c могут варьироваться, что приводит к неточной оценке кристаллического содержания целлюлозы. Свежая подготовка 0,2% антрона для каждой партии образцов является еще одним важным шагом метода Updegraff. Для точной оценки содержания целлюлозы необходимо использовать свежеприготовленный 0,2% антрона.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим Департамент растений и почвоведения и хлопка инк за их частичную поддержку этого исследования.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Fisher Chemical | A18-500 | Used in the protocol |
| Anthrone | Sigma Aldrich | 90-44-8 | For colorimetric assay |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | For centrifugation |
| Chloroform | Mallinckrodt | 67-66-3 | Used in the protocol |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | 6381-92-6 | Used in the protocol |
| Ethanol | Millipore Sigma | EM-EX0276-4S | Used in the protocol |
| Filter paper | Whatman | 1004-090 | Positive control |
| Glacial acetic acid | Sigma | SKU A6283 | Used in the protocol |
| Heat block/ ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 13527550 | For controlled temperatures |
| Incubator | Fisherbrand | 150152633 | Used for drying plant sample |
| Measuring Scale | Mettler Toledo | 30243386 | For specific quantities |
| Methanol 100 % | Fisher Chemical | A412-500 | Used in the protocol |
| Microplate (96 well) | Evergreen Scientific | 222-8030-01F | For anthrone assay |
| Nitric acid | Sigma Aldrich | 695041 | Used in the protocol |
| Polypropylene Microvials (2 mL) / screw capped tubes | BioSpec Products | 10831 | For high temperatures |
| Spectrophotometer(Multimode Detector) | Beckmancoulter DTX880 | 1000814 | For measuring absorbances |
| Spex SamplePrep 6870 Freezer / Mill | Spex Sample Prep | 68-701-15 | For grinding plant tissues into fine powder |
| Sulphuric acid | J.T.Baker | 02-004-382 | Used in the protocol |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | 151-21-3 | Used in the PSB buffer |
| Tubes (2 mL) | Fisher Scientific | 05-408-138 | Used in the protocol |
| Tris Hydrochloride | Sigma Aldrich | 1185-53-1 | Used in the PSB buffer |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977 | Used in the protocol |
| Vacuum dryer (vacufuge plus) | Eppendorf | 22820001 | For drying samples |
| Vortex mixer | Fisherbrand | 14-955-151 | For mixing |
| Waterbath | Thermoscientific | TSGP02PM05 | For temperature controlled conditions at specific steps |
| Weighing Paper | Fisher Scientific | 09-898-12A | Used in the protocol |
References
- Somerville, C. Cellulose synthesis in higher plants. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22, 53-78 (2006).
- Balasubramanian, V. K., Rai, K. M., Thu, S. W., Hii, M. M., Mendu, V. Genome-wide identification of multifunctional laccase gene family in cotton (Gossypium spp.); expression and biochemical analysis during fiber development. Scientific Reports. 6, 34309 (2016).
- Mendu, V., et al. Identification and thermochemical analysis of high-lignin feedstocks for biofuel and biochemical production. Biotechnology for Biofuels. 4, 43 (2011).
- Kraszkiewicz, A., Kachel-Jakubowska, M., Lorencowicz, E., Przywara, A. Influence of cellulose content in plant biomass on selected qualitative traits of pellets. Agriculture and Agricultural Science Procedia. 7, 125-130 (2015).
- Jordan, D. B., et al. Plant cell walls to ethanol. Biochemical Journal. 442, 241-252 (2012).
- Brett, C. T. Cellulose microfibrils in plants: biosynthesis, deposition, and integration into the cell wall. International Review of Cytology. 199, 161-199 (2000).
- Li, S., et al. Cellulose synthase complexes act in a concerted fashion to synthesize highly aggregated cellulose in secondary cell walls of plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 11348-11353 (2016).
- Polko, J. K., Kieber, J. J. The regulation of cellulose biosynthesis in plants. The Plant Cell. 31, 282-296 (2019).
- Brown, R. M. The biosynthesis of cellulose. Journal of Macromolecular Science, Part A. 33, 1345-1373 (1996).
- Gautam, S. P., Bundela, P. S., Pandey, A. K., Jamaluddin, M. K., Sarsaiya, A., Sarsaiya, S. A review on systematic study of cellulose. Journal of Applied and Natural Science. 2, (2010).
- Coughlan, M. P. Enzymic hydrolysis of cellulose: An overview. Bioresource Technology. 39, 107-115 (1992).
- Robak, K., Balcerek, M. Review of second generation bioethanol production from residual biomass. Food Technology and Biotechnology. 56, 174-187 (2018).
- Cross, C. F., Bevan, E. J. Cellulose and chemical industry. Journal of the Society of Chemical Industry. 27, 1187-1193 (1908).
- Paloheimo, L., Eine, H., Kero, M. L. A method for cellulose determination. Agricultural and Food Science. 34, (1962).
- Kurschner, K., Hanak, A., Diese, Z. Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und-Forschung. 59, 448-485 (1930).
- Norman, A. G., Jenkins, S. A new method for the determination of cellulose, based upon observations on the removal of lignin and other encrusting materials. Biochemical Journalournal. 27, (1933).
- Kiesel, A., Semiganowsky, N. Cellulose-Bestimmung durch quantitative verzuckerung. Berichte der deutschen chemischen Gesellschaft (A and B Series). 60, 333-338 (1927).
- Waksman, S. A. S., et al. A system of proximate chemical analysis of plant materials. Industrial Engineering Chemistry and Analytical Edition. 2, 167-173 (1930).
- Salo, M. -L. Determination of carbohydrates in animal foods as seven fractions. Agricultural and Food Science. , 32-38 (1961).
- Giger-Reverdin, S. Review of the main methods of cell wall estimation: interest and limits for ruminants. Animal Feed Science and Technology. 55, 295-334 (1995).
- Updegraff, D. M. Semimicro determination of cellulose inbiological materials. Analytical Biochemistry. 32, 420-424 (1969).
- Viles, F. J., Silverman, L. Determination of starch and cellulose with anthrone. Analytical Chemistry. 21, 950-953 (1949).
- Scott, T. A., Melvin, E. H. Determination of dextran with anthrone. Analytical Chemistry. 25, 1656-1661 (1953).
- Kumar, M., Turner, S. Protocol: a medium-throughput method for determination of cellulose content from single stem pieces of Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 11, 46 (2015).
- Yemm, E. W., Willis, A. J. The estimation of carbohydrates in plant extractsby anthrone. Biochemical Journal. 57, 508-514 (1954).
- Houston, K., Tucker, M. R., Chowdhury, J., Shirley, N., Little, A. The plant cell wall: A complex and dynamic structure as revealed by the responses of genes under Stress conditions. Frontiers in Plant Science. 7, (2016).
- Jiang, G., et al. Biomass extraction using non-chlorinated solvents for biocompatibility improvement of polyhydroxyalkanoates. Polymers. 10, 731 (2018).
- Li, T., et al. A saponification method for chlorophyll removal from microalgae biomass as oil feedstock. Marine Drugs. 14, 162 (2016).
- Wiltshire, K. H., Boersma, M., Möller, A., Buhtz, H. Extraction of pigments and fatty acids from the green alga Scenedesmus obliquus (Chlorophyceae). Aquatic Ecology. 34, 119-126 (2000).
- Foster, C. E., Martin, T. M., Pauly, M. Comprehensive compositional analysis of plant cell walls (lignocellulosic biomass) part II: carbohydrates. Journal of Visualized Experiments. (1837), (2010).
- Haigler, C., Betancur, L., Stiff, M., Tuttle, J. Cotton fiber: a powerful single-cell model for cell wall and cellulose research. Frontiers in Plant Science. 3, (2012).
- Spirk, S., Nypelö, T., Kontturi, E. Editorial: Biopolymer thin films and coatings. Frontiers in Chemistry. 7, (2019).
- Long, L. -Y., Weng, Y. -X., Wang, Y. -Z. Cellulose aerogels: Synthesis, applications, and prospects. Polymers. 10, 623 (2018).
