Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Estimativa do Teor de Celulose Cristalina de Biomassa Vegetal utilizando o Método Updegraff

Published: May 15, 2021 doi: 10.3791/62031
Automatic Translation
1, 2, 2
1Department of Plant and Soil Science, Texas Tech University, 2Fiber and Biopolymer Research Institute (FBRI), Department of Plant and Soil Science, Texas Tech University

Summary

O método Updegraff é o método mais utilizado para a estimativa de celulose. O principal objetivo desta demonstração é fornecer um protocolo updegraff detalhado para estimativa de conteúdo de celulose em amostras de biomassa vegetal.

Abstract

A celulose é o polímero mais abundante na Terra gerado pela fotossíntese e o principal componente de suporte de carga das paredes celulares. A parede celular desempenha um papel significativo no crescimento e desenvolvimento das plantas, fornecendo força, rigidez, taxa e direção do crescimento celular, manutenção da forma celular e proteção contra estressores bióticos e abióticos. A parede celular é composta principalmente de celulose, lignina, hemicellulose e pectina. Recentemente, as paredes celulares das plantas foram alvo da produção de biocombustível e bioenergia de segunda geração. Especificamente, o componente de celulose da parede celular da planta é usado para a produção de etanol celulósico. A estimativa do teor de celulose de biomassa é fundamental para pesquisas fundamentais e aplicadas na parede celular. O método Updegraff é simples, robusto e o método mais utilizado para a estimativa do teor de celulose cristalina da biomassa vegetal. A fração de parede celular bruta insolúvel de álcool após o tratamento com reagente Updegraff elimina as frações de hemicellulose e lignina. Mais tarde, a fração de celulose resistente ao reagente Updegraff é submetida ao tratamento de ácido sulfúrico para hidrolisar o homopolímero de celulose em unidades de glicose monomérica. Uma linha de regressão é desenvolvida utilizando várias concentrações de glicose e usada para estimar a quantidade de glicose liberada sobre a hidrólise da celulose nas amostras experimentais. Finalmente, o teor de celulose é estimado com base na quantidade de monômeros de glicose por ensaio de antrona colorimétrico.

Introduction

A celulose é o componente primário de suporte de carga das paredes celulares, que está presente tanto nas paredes celulares primárias quanto secundárias. A parede celular é uma matriz extracelular que envolve células vegetais e é composta principalmente de celulose, lignina, hemicellulose, pectina e proteínas matriciais. Aproximadamente um terço da biomassa das plantas é acelulose 1 e desempenha papéis significativos no crescimento e desenvolvimento das plantas, fornecendo força, rigidez, taxa e direção do crescimento celular, manutenção da forma celular e proteção contra estressores bióticos e abióticos. A fibra de algodão contém 95% de teor decelulose 2, enquanto as árvores contêm de 40% a 50% de celulose, dependendo das espécies vegetais e dos tipos de órgãos3. A celulose é composta por unidades repetitivas de celobiose, um disscarido de resíduos de glicose conectados por β-1,4 ligações glicossídicas4. O etanol celulósico é produzido a partir da glicose derivada da celulose presente nas paredescelulares daplanta 5 . A fibra celulósica é composta por várias micro fibrilas nas quais cada micro fibril atua como unidade central com 500-15000 monômeros de glicose1,6. O homopolímero de celulose é sintetizado por complexos de sinthase de celulose incorporados de membrana plasmática (CSC's)1,7. Proteínas de celulose individual synthase A (CESA) sintetizam cadeias glucanas e as cadeias glucan adjacentes são conectadas por ligações de hidrogênio para formar celulose cristalina1,8. A celulose existe em várias formas cristalinas com duas formas predominantes, celulose Iα e celulose Iβ como formas nativas9. Em plantas mais altas, a celulose existe na forma de celulose Iβ, enquanto a celulose vegetal inferior existe na forma Iα10,11. No geral, a celulose desempenha um papel significativo na distribuição de força e rigidez para as paredes celulares da planta.

Os biocombustíveis de primeira geração são produzidos principalmente a partir de amido de milho, açúcares de cana e açúcares de beterraba, que são fontes de alimento, enquanto os biocombustíveis de segunda geração estão focando na produção de biocombustíveis a partir de material de parede celular de biomassa vegetal não-alimentar12. A estimativa precisa do conteúdo de celulose cristalina não é apenas importante para pesquisas fundamentais sobre biosíntese de celulose e dinâmica da parede celular, mas também para pesquisa aplicada de biocombustíveis e produtos biológicos. Vários métodos foram desenvolvidos e otimizados para estimativa de celulose na biomassa vegetal, e o método Updegraff é o método mais utilizado para a estimativa de celulose. O primeiro método relatado para estimativa de celulose foi por Cross e Bevan em 190813. O método baseou-se no princípio da cloração alternativa e extração por sulfato de sódio. No entanto, a celulose obtida pelos protocolos originais e modificados do método Cross e Bevan mostrou contaminação de pequenas frações de lignina, além de uma quantidade substancial de xilanas e mannans14. Apesar de várias modificações para remover lignina e hemicelluloses da fração de celulose, o método Cross-Bevan manteve uma quantidade considerável de mannans junto com celulose. Posteriormente, o método de Kurschner foi desenvolvido empregando ácido nítrico e etanol para extraircelulose 15. Este método afirmava que o total de lignina e 75% dos pentosanos foram removidos, mas os resultados verdadeiros da celulose foram os mesmos estimados pelo método de cloração de Cross e Bevan. Outro método (Norman e Jenkins) foi desenvolvido empregando metanol-benzeno, sulfato de sódio e hipoclorito de sódio para extraircelulose 16. Este método também reteve alguma fração de lignina (3%) e quantidades significativas de pentosanos levando a uma estimativa precisa da celulose. Mais tarde, Kiesel e Semiganowsky utilizaram uma abordagem diferente para hidrolisar a celulose usando ácido sulfúrico concentrado de 80%, e os açúcares reduzidos hidrolisados foram estimados pelo método de Bertrand17. Os dois métodos, Waksman e Stevens18 e Salo14,19 que foram desenvolvidos com base no método de Kiesel e Semiganowsky, também renderam 4-5% menos teor de celulose em comparação com os métodos anteriores20.

O método Updegraff é o método mais utilizado para a estimativa do teor de celulose cristalina. Este método foi descrito pela primeira vez pela Updegraff para a medição da celulose em 196921. O método Updegraff integra o método Kurschner (uso de ácido nítrico), métodos Kiesel e Seminowsky (hidrólise da celulose em monômeros de glicose usando ácido sulfúrico) com algumas modificações, e o ensaio anthrone de Viles e Silverman para simples estimativa colorimétrica de glicose e teor de celulose cristalina22. O princípio deste método é o uso de ácido acético e ácido nítrico (reagente updeenxf) para eliminar hemicellulose e lignina dos tecidos vegetais homogeneizados, o que deixa celulose resistente a ácido acético/nítrico para posterior processamento e estimativa15. A celulose resistente a ácido actic/nítrico é tratada com ácido sulfúrico de 67% para quebrar a celulose em monômeros de glicose e os monômeros de glicose liberados são estimados pelo ensaio de anthrone21,23. Várias modificações do método updegraff original foram utilizadas para simplificar o procedimento e a estimativa de celulose pelo ensaio de anthrone24. Em linhas gerais, este método pode ser dividido em cinco fases. Na primeira fase, o material da planta é preparado. Na segunda fase, a parede celular bruta é separada da biomassa total, já que a celulose é o componente-chave das paredes celulares das plantas. Mais tarde, na terceira fase, a celulose é separada dos componentes da parede celular não celulósica, tratando com reagente Updegraff. Na quarta fase, a celulose resistente a ácido acético/nítrico é dividida em monômeros de glicose por tratamento de ácido sulfúrico. O tratamento de ácido sulfúrico da celulose resulta na formação de compostos 5-hidroximetilfurfurfural a partir da reação de monômeros de glicose com ácido sulfúrico. Finalmente, na última fase, o anthrone gera um complexo azul esverdeado fervendo com o composto furfural gerado na fase anterior25. Este método colorimétrico baseado em anthrone foi usado pela primeira vez em 1942 por Dreywood. Anthrone é um corante que identifica compostos furfurais de pentose e hexose produtos desidratados como 5-hidroximetilfurfural, em condições ácidas. A reação com hexose produz uma cor intensa e melhor resposta em comparação com as pentoses25. A quantidade de glicose encadernada é medida pela absorvância espectrofotômetro a 620 nm e a intensidade do complexo azul esverdeado é diretamente proporcional à quantidade de açúcar na amostra. Os valores medidos de absorvência foram comparados com uma linha de regressão padrão de glicose para calcular a concentração de glicose da amostra. O teor de glicose medido foi utilizado para estimar o teor de celulose da biomassa vegetal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Preparação experimental

  1. Triture material vegetal seco em um pó fino.
  2. Tampão de Solubilização de Proteínas (PSB): Preparar soluções de estoque de 1 M Tris (pH 8.8), 0,5 M ácido etilenodiaminetetraacético (EDTA) (pH 8.0) e autoclave-os. Faça tampão PSB fresco a partir dessas soluções de estoque com concentrações finais de 50 mM Tris, 0,5 mM EDTA e 10% sulfato de dodecil de sódio (SDS) em água estéril.
  3. Prepare 100 mL de 70% de etanol (v/v): 70 mL de 100% etanol e 30 mL de água estéril.
  4. Prepare 100 mL de metanol: clorofórmio em uma proporção de 1:1 (50 mL de metanol e clorofórmio de 50 mL).
  5. Prepare 82,5 mL de reagente Updegraff. Adicione 75 mL de ácido acético de 80% a 7,5 mL de ácido nítrico de modo que a razão final da água: ácido acético: ácido nítrico esteja em 2:8:1 (v/v). Para preparar 80% de ácido acético, dissolva 80 mL de ácido acético glacial em 20 mL de água estéril (v/v).
  6. Prepare um estoque fresco de 1 mg/mL de solução de glicose. Dissolva 10 mg de glicose em 10 mL de água (c/v).
  7. Para preparar 100 mL de ácido sulfúrico de 67% (v/v), adicione 67 mL de ácido sulfúrico concentrado a 33 mL de água. Use sempre uma garrafa de vidro e adicione ácido lentamente à água. Esta etapa é exotérmica (libera calor). Por isso, prepare esta solução no gelo e esfrie na geladeira por pelo menos 2 horas antes do uso.
  8. Prepare anthrone fresco de 0,2% (w/v) para cada lote de amostras experimentais. Pesar 0,2 g de anthrone e dissolver em 100 mL de ácido sulfúrico concentrado pré-refrigerado em uma garrafa de vidro embrulhada com papel alumínio. Mantenha na geladeira por 1-2 horas antes de usar.
    NOTA: O ácido sulfúrico concentrado pré-frio na geladeira no dia do experimento, e a preparação fresca de anthrone é altamente recomendada para uma estimativa precisa do teor de glicose.

2. Preparação de material de biomassa vegetal

  1. Coletar amostras de biomassa vegetal de linhas experimentais de algodão de 2 meses cultivadas na estufa com as mesmas condições de crescimento, o mesmo estágio de desenvolvimento, a mesma posição das plantas e o mesmo tipo de tecido (folha/tronco/raiz).
    NOTA: Colete um mínimo de três réplicas biológicas para cada amostra. Lave-os bem com água para remover toda a sujeira do tecido radicular.
  2. Tecido radicular seco ao ar por 2 dias em toalhas de papel à temperatura ambiente para remover o teor de umidade(Figura 1).
    NOTA: Tecido desejado a seco para a estimativa de celulose para evitar qualquer contaminação fúngica.
  3. Coloque as amostras de raiz em recipientes individuais. Em seguida, rotule-os e seque-os na incubadora a 49 °C durante 10 dias (Tabela de Materiais).
    NOTA: Alternativamente, um secador congelado pode ser usado para secar o tecido vegetal em menos tempo (1 ou 2 dias) sem causar qualquer alteração química no material de biomassa vegetal.
  4. Corte as amostras secas em pequenos pedaços, congele-as em nitrogênio líquido e triture em pó fino uniforme usando uma argamassa e pilão, um moinho de congelador ou um moedor de biomassa(Figura 1).
    NOTA: A fábrica de congeladores foi utilizada a uma taxa de 10 cps para 3 ciclos.
  5. Recolher o tecido aterrado(Figura 2) e proceder com a extração da parede celular.
    NOTA: O processo pode ser pausado neste momento armazenando as amostras em recipientes herméticos à temperatura ambiente.

3. Extração de paredes celulares brutas da biomassa vegetal

NOTA: As paredes celulares da planta contêm celulose, lignina, componentes não celulose, pectina, proteínas matricial, compostos fenólicos e água26. Como a celulose está presente nas paredes celulares, o primeiro passo é separar o componente da parede celular dos componentes da parede não celular da biomassa vegetal26.

  1. Rotule e pese tubos individuais em branco de 2 mL antes de iniciar o processo de extração da parede celular.
  2. Anote os pesos vazios do tubo em um caderno de laboratório antes de prosseguir.
  3. Pese 20 mg de tecido em pó a partir da etapa 2.5 e transfira-o para tubos pré-pesados de 2 mL e rotule-os.
  4. Adicione 1 mL de tampão de solubilização de proteína (PSB) (50 mM Tris hydrochloride (HCl) tampão pH 8,8, 0,5 mM EDTA e 10% sulfato de dodecyl de sódio (SDS) para solubilizar proteínas. Vórtice e centrífuga a 25.200 x g por 5 min a temperatura ambiente (RT). Após a centrifugação, descarte o supernasce e salve a pelota.
    NOTA: O supernante pode ser salvo se o componente proteico precisar ser analisado.
  5. Repita o passo 3.4 mais duas vezes.
  6. À pelota retida, adicione 1 mL de água destilada e vórtice. Centrifugar a 25.200 x g por 5 min em temperatura ambiente (RT) e remover o supernatante.
  7. Repita o passo 3.6 mais duas vezes.
  8. Adicione 1 mL de 70% de etanol à pelota salva, vórtice e aqueça-o a 70 °C por 1h em um banho de água/bloco de calor para remover componentes solúveis e amido das amostras. Vórtice e centrífuga a 25.200 x g por 5 min na RT. Descarte o supernatante e salve a pelota.
  9. Repita o passo 3.8 mais uma vez.
  10. À pelota adicione 1 mL de 100% de metanol e vórtice. Centrifugar a 25.200 x g por 5 min em temperatura ambiente (RT) e remover o supernatante.
  11. Adicione 1 mL de clorofórmio/metanol (clorofórmio e metanol na proporção 1:1) à pelota e vórtice. Centrifugar a 25.200 x g por 5 min no RT e remover o supernaspeso. A adição de metanol e solvente de clorofórmio solubiliza e remove a fração lipídica da biomassa27.
  12. À pelota, adicione 1 mL de 100% de acetona e vórtice. Incubar em temperatura ambiente por 5 minutos. Centrifugar a 25.200 x g por 5 min no RT e remover o supernaspeso. A acetona remove pigmentos como clorofila e ácidos graxos livres da biomassa28,29.
  13. Seque a pelota a 37 °C durante a noite ou prossiga ainda mais pela secagem a vácuo.
    NOTA: A pelota seca é a parede de células brutas usada para a estimativa de celulose cristalina. O processo pode ser pausado neste momento ou continuar usando o secador de vácuo para secagem de amostras.

4. Tratamento com reagente updegraff (ácido acético e nítrico) para remover componentes não celulósicos

NOTA: O protocolo envolve o uso de ácidos e outros produtos químicos. Use equipamentos de proteção individual (EPI) durante todo o processo.

  1. Meça 5 mg da pelota de parede de célula bruta seca em um tubo fresco de 2 mL tampado. Observe o peso exato(Figura 3)30.
  2. Inclua um controle positivo neste momento. Use 2 mg de papel filtro(Tabela de Materiais)como um controle positivo que produz 80% de teor de celulose.
  3. Adicione 1,5 mL do reagente Updegraff ao extrato de parede celular pesado de 5 mg e controle positivo. Misture por vórtice.
    NOTA: O controle positivo deve ser processado da mesma forma que as amostras experimentais a partir desta etapa. Esta etapa deve ser realizada no capô da fumaça com equipamentos de proteção individual (EPI) adequados.
    ATENÇÃO: Esta etapa deve ser realizada em tubos de tampa de parafuso para evitar respingos de amostra e estalo dos tubos. Três réplicas biológicas de cada amostra, juntamente com três réplicas para controle positivo, devem ser incluídas.
  4. Aqueça a suspensão a 100 °C por 30 minutos em um banho de água fervente e esfrie em um banco por 10 minutos. Centrifugar a 25.200 x g por 10 min na RT. Remova o supernatante por centrifugação e salve a pelota.
    NOTA: Os resíduos gerados devem ser coletados separadamente para solventes orgânicos, ácido sulfúrico e reagente updeenx (ácido acético e ácido nítrico). Resíduos com ácido acético e ácido nítrico devem ser mantidos a temperaturas frias com tampas ventiladas e nunca misturados com outros solventes orgânicos e outros ácidos para evitar qualquer explosão.
  5. Adicione 1 mL de água à pelota. Centrífuga a 25.200 x g por 10 min na RT. Remova 500 μL do supernasal e adicione 1 mL de acetona ao tubo.
  6. Centrifugar a 25.200 x g por 5 min na RT. Remova 1 mL de supernadante, e adicione 1 mL de acetona ao tubo e centrífuga a 25.200 x g por 5 min na RT.
  7. Após a centrifugação, remova todo o supernatante e suspenda a pelota em 1 mL de acetona. Incubar os tubos em temperatura ambiente por 5 minutos e girar a 25.200 x g por 5 min no RT.
  8. Descarte o supernatante e salve a pelota. Seque a pelota a 37 °C durante a noite(Figura 3).
    NOTA: O processo pode ser pausado neste momento ou continuar usando o secador de vácuo para secar e seguir para a próxima etapa.

5. Hidrólise de celulose por ácido para produzir unidades monômeros de glicose

  1. Adicione 1 mL de ácido sulfúrico de 67% à pelota seca. Vórtice para misturar a pelota completamente no ácido.
  2. Agite tubos à temperatura ambiente por 1h para dissolver a pelota de celulose em 67% de ácido sulfúrico.
    NOTA: Como alternativa, a solubilização da pelota de celulose em 67% de ácido sulfúrico pode ser melhorada por sônica de cada amostra por 10 minutos após 30 minutos de incubação no shaker. Após a sônicação, as amostras podem ser re incubadas no shaker em RT. No entanto, observamos a solubilidade completa da pelota de celulose sem sônica quando começamos com 5 mg de extrato de parede celular bruta(Figura 3). Este procedimento funcionou bem para várias amostras de biomassa vegetal3.

6. Medir o teor de glicose pelo ensaio anthrone e estimativa do teor de celulose

  1. Nesta fase, a celulose é na forma de monômeros de glicose livres. Determine a quantidade de celulose medindo a quantidade de glicose presente na amostra por espectrofotometria.
  2. Pegue 10 μL da amostra da etapa 5 e adicione-a a 490 μL de água destilada estéril para fazer uma diluição de cada amostra para 500 μL. Vortex a mistura diluída de amostra e água por 10 segundos.
  3. Adicione 1 mL de 0,2% reagente de anthrone recém-preparado a cada tubo e misture imediatamente por vórtice.
  4. Ferva amostras a 100 °C por 10 minutos e esfrie os tubos no gelo por 5 minutos. Transfira 200 μL de cada amostra em três poços de uma placa de 96 poços. Coloque a placa de 96 poços em um espectotômetro para medir a absorvância a 620 nm.
    NOTA: Para ferver em alta temperatura, use tubos tampados para evitar respingos de produtos químicos nocivos e para evitar a perda de amostras.

7. Preparação da curva padrão de glicose

  1. Para preparar o padrão de glicose, faça um estoque fresco de 1 mg/mL de glicose dissolvendo 10 mg de glicose em 10 mL de água destilada estéril. Adicione esta solução de estoque de 1 mg/mL em incrementos de 20 μL (0, 20, 40, 60, 80.100.120.140, 160, 180 μL) à água destilada estéril (volume total de 1 mL) para preparar padrões de glicose que variam de 0 μg a 180 concentrações de μg/mL(Figura 3). Vórtice cada padrão de glicose depois de adicionar água estéril.
  2. A partir dessas 10 concentrações diferentes, alíquota de 500 μL de cada concentração de glicose em um tubo fresco de 2 mL tampado.
  3. Adicione 1 mL de anthrone recém-preparado 0,2% a cada tubo e misture imediatamente por vórtice. Incubar no gelo e ferver a 100 °C por 10 minutos seguido de incubação no gelo por 5 min23.
  4. Transfira 200 μL de cada padrão para três poços em uma placa de 96 poços micro titer para três réplicas técnicas e meça a absorvância em 620 nm(Figura 3).
  5. Desenvolva uma curva de glicose padrão, traçando diferentes concentrações de glicose (0 a 180 μg/mL) contra valores de absorção normalizados a 620 nm(Figura 7). Utilize a linha de regressão Y= mx+c gerada a partir dos valores de absorção para calcular o teor de celulose nas amostras preparadas.
    NOTA: As normas de glicose devem ser preparadas recentemente para cada conjunto de experimentos. A concentração da glicose deve ser aumentada se os valores de OD forem muito altos/ baixos para que esses valores se enlouqueçam dentro da faixa dos valores de absorção da curva padrão. A linha de regressão gera diferentes valores m e c com base nos padrões de glicose utilizados para cada lote de amostras. Misture os tubos imediatamente após a adição de anthrone23. Anthrone, amostras diluídas e padrões preparados sempre foram mantidos frios até que o ensaio de anthrone foi realizado devido à natureza extermímica dessa reação.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Foram selecionadas plantas de algodão cultivadas na casa verde para este estudo. Duas diferentes linhas experimentais de algodão foram selecionadas para análise comparativa do teor de celulose. Para cada linha experimental, o tecido radicular foi coletado a partir de três réplicas biológicas. Um total de 500 mg de tecido foi homogeneizado e 20 mg dele foi utilizado para extração de parede celular bruta. Mais tarde, 5 mg de extrato de parede de célula bruta foi usado para o tratamento de reagente updegraff para remover hemicellulose e lignina de celulose. A celulose purificada foi hidrolisada pelo tratamento de ácido sulfúrico para quebrar a celulose em unidades de glicose. Os resultados das leituras de absorvência a 620 nm (Tabela Suplementar 1) foram utilizados para medir a concentração de glicose e estimar o teor de celulose pelo ensaio anthrone. Os valores médios de absorção de três réplicas técnicas foram normalizados subtraindo o valor de absorção em branco da concentração de glicose de 0 μg. A curva padrão de glicose foi gerada por meio de um gráfico de barras dispersa(Figura 4).

A linha de regressão resultante, y = mx + c desta curva padrão, é usada para calcular uma concentração de glicose desconhecida nas amostras de teste extraídas usando as leituras de absorvância normalizadas. Para calcular x (a concentração de glicose desconhecida em μg/μL), utilizou-se a fórmula (x = absorvência normalizada-c/m). Os valores c e m da linha de regressão da curva de glicose padrão (R2 = 0,99) foram utilizados para medir a concentração de glicose em μg/μL. Então este valor é dividido por um fator de diluição de 2, pois o volume final é de 500 μL e ainda dividido por um volume amostral de 10 μL para medir a concentração de glicose em μg/μL. Uma vez que o valor calculado é para 5 mg de extrato de parede celular, ele é ainda dividido por 5 ou com o respectivo peso de parede celular bruta usado para cada amostra experimental para obter concentração de glicose por mg. O valor é ainda dividido por 1,1 para compensar a água adquirida no processo de hidrólise (a glicose tem um peso molecular de 180 e uma molécula de água tem um peso molecular de 18 e, portanto, a água gerada no processo de liberação de monômeros de glicose foi removida dividindo o fator umidade, 1,1). O valor resultante será multiplicado por 100 para calcular o teor de celulose cristalina em percentual (Tabela Suplementar 1).

Os resultados do teor de celulose mostram que são consistentes entre as réplicas biológicas, sugerindo a precisão técnica do método Updegraff. Além disso, as diferenças foram traçadas usando gráficos 2D. Esses resultados mostraram as diferenças de teor de celulose nos números amostrais experimentais 1 e 2 (Figura 4). A amostra 1 mostra 43,4% enquanto a amostra 2 mostra 28,12%, sugerindo que este método pode distinguir diferenças entre as amostras experimentais. O teste T do Student foi aplicado em nível de significância de 95% para testar suas diferenças significativas.

Figure 1
Figura 1: Preparação da biomassa vegetal de algodão para estimativa de teor de celulose em raízes. (A) As plantas cultivadas em estufa foram suavemente retiradas do solo e completamente lavadas com água. O tecido radicular da planta foi separado, mantido sobre as toalhas de papel e permitido secar por 2 dias. (B) Em seguida, o tecido radicular foi transferido para recipientes rotulados individualmente e autorizado a secar na incubadora a 49 °C por -10 dias. (C) O tecido seco foi cortado em pequenos pedaços, congelado em nitrogênio líquido, carregado nos frascos de moagem, e aterrado em pó fino usando moinho de congelador. (D) Pó de tecido finamente aterrado foi coletado no tubo de 50 mL. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Gráfico de fluxo das principais etapas envolvidas no método Updegraff. (A) Representação pictórica de etapas-chave no protocolo. (B) Explica etapas críticas que foram mostradas no painel (A). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Preparação de diferentes concentrações de glicose para a curva padrão. (A) Prepare a solução de estoque de glicose dissolvendo 10 mg de glicose em 10 mL de água destilada estéril para que a concentração final do estoque seja de 1 mg/mL. Adicione a solução de estoque de 1 mg/mL de glicose em incrementos de 20 μL a um volume final de 1 mL com água destilada estéril para preparar diferentes concentrações de glicose de 0 μg a 180 μg/mL. (B) Tabela mostrando quantidade de glicose de 1 mg/mL e água destilada estéril a ser adicionada para fazer diferentes concentrações de glicose. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Curva padrão de glicose gerada utilizando valores de absorção de diferentes concentrações de glicose a 620 nm. (A) Tabela mostrando diferentes concentrações de glicose variando de 0 a 180 μg/mL com os respectivos valores de absorvância normalizados a 620 nm. (B) Curva padrão de glicose gerada utilizando um gráfico de dispersão dos valores de absorção(A). (C) Gráfico de barras mostrando diferenças de teor de celulose cristalina nas amostras experimentais 1 e 2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela Suplementar 1: Estimativa do teor de celulose nas amostras experimentais. Clique aqui para baixar esta Tabela.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

As fibras de algodão são fibras naturais produzidas a partir da semente de algodão. A fibra de algodão é uma única célula com ~95% de teor de celulose2 com alto teor de celulose cristalina com aplicações extensas na indústria têxtil31. Como, a fibra de algodão contém ~95% de celulose, temos usado tecidos radiculares de algodão para demonstração da estimativa do teor de celulose cristalina. Os tecidos radiculares de algodão são moderadamente ricos em teor de celulose cristalina e representam uma biomassa vegetal comumente disponível. A quantidade de parede celular total necessária para o teor de celulose cristalina é de apenas 5 mgs e, portanto, este método pode ser empregado para estimar o conteúdo de celulose cristalina em diferentes estágios de desenvolvimento/estimativa de conteúdo específico de celulose. O percentual de ácido sulfúrico (67%) também desempenha um papel crítico na quebra da celulose em monômeros de glicose e dissolvendo a celulose completamente23 sem a necessidade de sônica. A perda de amostra é comum após o tratamento updegraff, pois a pelota de celulose cristalina não é sólida na parte inferior do tubo em diferentes etapas no processo de estimativa. Isso pode ser minimizado removendo pequenos volumes de supernasce em cada etapa de água e lavagem de acetona após o tratamento updegraff. Além disso, o vórtice imediato da amostra e as normas com anthrone desempenham papéis significativos no desenvolvimento de cores e maior precisão das normas, levando a 99,5% de coeficiente de determinação (R2) valores(Figura 3). A curva padrão de glicose é fundamental para determinar a concentração de glicose, que por sua vez é usada para estimar o teor de celulose cristalina. Assim, as concentrações da glicose podem ser ajustadas de acordo com a faixa de concentração necessária. Dependendo da gama de valores para se adequar aos valores experimentais, a curva padrão pode variar de 0 a 100 μg/mL ou 0 a 200 μg/mL até 1000 μg/mL concentrações de glicose; isso altera ainda mais os valores de regressão c e m, melhorando a precisão da estimativa de celulose cristalina. É importante sempre fazer anthrone fresco de 0,2% para ambas as amostras e também para o padrão. R-quadrado, uma medição estatística, representa a variabilidade de todos os pontos de dados na linha de regressão. É importante ferver tanto os padrões quanto as amostras depois de adicionar anthrone pelo mesmo período de tempo. É sempre importante incluir um controle positivo com um conteúdo conhecido de celulose. Para uma reprodutibilidade de dados eficaz, todo o procedimento deve ser seguido com precisão, incluindo a preparação da solução (padrões, curva padrão e reagente updegraff).

Recentemente, a celulose é explorada para aplicações não têxteis, como aerossóis celulósicos, peças de computador e etanol celulósico32,33; portanto, este método terá amplas aplicações no futuro. O avanço científico é feito através de progressos incrementais na compreensão de conceitos, propondo hipóteses alternativas e fornecendo/refutando o conhecimento existente. Progressos semelhantes podem ser vistos no desenvolvimento de um método confiável para a estimativa do conteúdo de celulose na biomassa vegetal. A parede celular é uma matriz complexa e o método Updegraff elimina frações não-celulose de celulose pura de forma sequencial, levando à estimativa precisa do teor de celulose na biomassa vegetal. Além disso, o método colorimétrico simples desenvolvido para a estimativa do teor de celulose medindo a concentração de glicose tornou este método altamente adaptável e amplamente utilizado. No presente estudo, os dados de celulose foram consistentes entre diferentes réplicas biológicas das amostras coletadas de uma única linha. Assim, sugere que os dados produzidos por este método são consistentes, confiáveis, reprodutíveis e fáceis de medir o teor de celulose por simples assistom colorido.

O método Updegraff é o método mais utilizado para a estimativa de celulose. Com a recente expansão da aplicação industrial de celulose como alimentos, madeira, papel, fibras, biocombustíveis, roupas, cosméticos e farmacêuticos, a estimativa precisa do teor de celulose da biomassa vegetal é crucial para diversas aplicações. Embora este seja o método mais utilizado para a estimativa de celulose, é importante tomar várias precauções para obter dados reprodutíveis. As amostras de biomassa devem ser moídas para o mesmo tamanho para obter estimativa precisa e reprodutível do teor de celulose. Deve-se tomar cuidado ao gerar a curva padrão de glicose. Os padrões de glicose utilizados para a preparação da curva padrão de glicose devem ser aumentados ou diminuídos com base nas leituras de absorvência amostral para que as concentrações desconhecidas se enresçam dentro da faixa de concentrações de glicose que são usadas para preparar a curva padrão. Caso não, os valores m e c podem variar, resultando na estimativa imprecisa do teor de celulose cristalina. A preparação fresca de 0,2 % anthrone para cada lote de amostras é outro passo crítico do método Updegraff. É essencial usar anthrone recém-preparado 0,2 % para a estimativa precisa do teor de celulose.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores declaram que não têm conflito de interesses.

Acknowledgments

Agradecemos ao Departamento de Ciência de Plantas & Solos e Cotton Inc. pelo apoio parcial deste estudo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Fisher Chemical A18-500 Used in the protocol
Anthrone Sigma Aldrich 90-44-8 For colorimetric assay
Centrifuge Eppendorf 5424 For centrifugation
Chloroform Mallinckrodt 67-66-3 Used in the protocol
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich 6381-92-6 Used in the protocol
Ethanol Millipore Sigma EM-EX0276-4S Used in the protocol
Filter paper Whatman 1004-090 Positive control
Glacial acetic acid Sigma SKU A6283 Used in the protocol
Heat block/ ThermoMixer F1.5 Eppendorf 13527550 For controlled temperatures
Incubator Fisherbrand 150152633 Used for drying plant sample
Measuring Scale Mettler Toledo 30243386 For specific quantities
Methanol 100 % Fisher Chemical A412-500 Used in the protocol
Microplate (96 well) Evergreen Scientific 222-8030-01F For anthrone assay
Nitric acid Sigma Aldrich 695041 Used in the protocol
Polypropylene Microvials (2 mL) / screw capped tubes BioSpec Products 10831 For high temperatures
Spectrophotometer(Multimode Detector) Beckmancoulter DTX880 1000814 For measuring absorbances
Spex SamplePrep 6870 Freezer / Mill Spex Sample Prep 68-701-15 For grinding plant tissues into fine powder
Sulphuric acid J.T.Baker 02-004-382 Used in the protocol
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma Aldrich 151-21-3 Used in the PSB buffer
Tubes (2 mL) Fisher Scientific 05-408-138 Used in the protocol
Tris Hydrochloride Sigma Aldrich  1185-53-1 Used in the PSB buffer
Ultrapure distilled water Invitrogen 10977 Used in the protocol
Vacuum dryer (vacufuge plus) Eppendorf 22820001 For drying samples
Vortex mixer Fisherbrand 14-955-151 For mixing
Waterbath Thermoscientific TSGP02PM05 For temperature controlled conditions at specific steps
Weighing Paper Fisher Scientific 09-898-12A Used in the protocol

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Somerville, C. Cellulose synthesis in higher plants. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22, 53-78 (2006).
  2. Balasubramanian, V. K., Rai, K. M., Thu, S. W., Hii, M. M., Mendu, V. Genome-wide identification of multifunctional laccase gene family in cotton (Gossypium spp.); expression and biochemical analysis during fiber development. Scientific Reports. 6, 34309 (2016).
  3. Mendu, V., et al. Identification and thermochemical analysis of high-lignin feedstocks for biofuel and biochemical production. Biotechnology for Biofuels. 4, 43 (2011).
  4. Kraszkiewicz, A., Kachel-Jakubowska, M., Lorencowicz, E., Przywara, A. Influence of cellulose content in plant biomass on selected qualitative traits of pellets. Agriculture and Agricultural Science Procedia. 7, 125-130 (2015).
  5. Jordan, D. B., et al. Plant cell walls to ethanol. Biochemical Journal. 442, 241-252 (2012).
  6. Brett, C. T. Cellulose microfibrils in plants: biosynthesis, deposition, and integration into the cell wall. International Review of Cytology. 199, 161-199 (2000).
  7. Li, S., et al. Cellulose synthase complexes act in a concerted fashion to synthesize highly aggregated cellulose in secondary cell walls of plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 11348-11353 (2016).
  8. Polko, J. K., Kieber, J. J. The regulation of cellulose biosynthesis in plants. The Plant Cell. 31, 282-296 (2019).
  9. Brown, R. M. The biosynthesis of cellulose. Journal of Macromolecular Science, Part A. 33, 1345-1373 (1996).
  10. Gautam, S. P., Bundela, P. S., Pandey, A. K., Jamaluddin, M. K., Sarsaiya, A., Sarsaiya, S. A review on systematic study of cellulose. Journal of Applied and Natural Science. 2, (2010).
  11. Coughlan, M. P. Enzymic hydrolysis of cellulose: An overview. Bioresource Technology. 39, 107-115 (1992).
  12. Robak, K., Balcerek, M. Review of second generation bioethanol production from residual biomass. Food Technology and Biotechnology. 56, 174-187 (2018).
  13. Cross, C. F., Bevan, E. J. Cellulose and chemical industry. Journal of the Society of Chemical Industry. 27, 1187-1193 (1908).
  14. Paloheimo, L., Eine, H., Kero, M. L. A method for cellulose determination. Agricultural and Food Science. 34, (1962).
  15. Kurschner, K., Hanak, A., Diese, Z. Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und-Forschung. 59, 448-485 (1930).
  16. Norman, A. G., Jenkins, S. A new method for the determination of cellulose, based upon observations on the removal of lignin and other encrusting materials. Biochemical Journalournal. 27, (1933).
  17. Kiesel, A., Semiganowsky, N. Cellulose-Bestimmung durch quantitative verzuckerung. Berichte der deutschen chemischen Gesellschaft (A and B Series). 60, 333-338 (1927).
  18. Waksman, S. A. S., et al. A system of proximate chemical analysis of plant materials. Industrial Engineering Chemistry and Analytical Edition. 2, 167-173 (1930).
  19. Salo, M. -L. Determination of carbohydrates in animal foods as seven fractions. Agricultural and Food Science. , 32-38 (1961).
  20. Giger-Reverdin, S. Review of the main methods of cell wall estimation: interest and limits for ruminants. Animal Feed Science and Technology. 55, 295-334 (1995).
  21. Updegraff, D. M. Semimicro determination of cellulose inbiological materials. Analytical Biochemistry. 32, 420-424 (1969).
  22. Viles, F. J., Silverman, L. Determination of starch and cellulose with anthrone. Analytical Chemistry. 21, 950-953 (1949).
  23. Scott, T. A., Melvin, E. H. Determination of dextran with anthrone. Analytical Chemistry. 25, 1656-1661 (1953).
  24. Kumar, M., Turner, S. Protocol: a medium-throughput method for determination of cellulose content from single stem pieces of Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 11, 46 (2015).
  25. Yemm, E. W., Willis, A. J. The estimation of carbohydrates in plant extractsby anthrone. Biochemical Journal. 57, 508-514 (1954).
  26. Houston, K., Tucker, M. R., Chowdhury, J., Shirley, N., Little, A. The plant cell wall: A complex and dynamic structure as revealed by the responses of genes under Stress conditions. Frontiers in Plant Science. 7, (2016).
  27. Jiang, G., et al. Biomass extraction using non-chlorinated solvents for biocompatibility improvement of polyhydroxyalkanoates. Polymers. 10, 731 (2018).
  28. Li, T., et al. A saponification method for chlorophyll removal from microalgae biomass as oil feedstock. Marine Drugs. 14, 162 (2016).
  29. Wiltshire, K. H., Boersma, M., Möller, A., Buhtz, H. Extraction of pigments and fatty acids from the green alga Scenedesmus obliquus (Chlorophyceae). Aquatic Ecology. 34, 119-126 (2000).
  30. Foster, C. E., Martin, T. M., Pauly, M. Comprehensive compositional analysis of plant cell walls (lignocellulosic biomass) part II: carbohydrates. Journal of Visualized Experiments. (1837), (2010).
  31. Haigler, C., Betancur, L., Stiff, M., Tuttle, J. Cotton fiber: a powerful single-cell model for cell wall and cellulose research. Frontiers in Plant Science. 3, (2012).
  32. Spirk, S., Nypelö, T., Kontturi, E. Editorial: Biopolymer thin films and coatings. Frontiers in Chemistry. 7, (2019).
  33. Long, L. -Y., Weng, Y. -X., Wang, Y. -Z. Cellulose aerogels: Synthesis, applications, and prospects. Polymers. 10, 623 (2018).

Tags

Ciências Ambientais Questão 171 Parede celular biomassa celulose hemicellulose lignina hemicellulose e ensaio de anthrone
Estimativa do Teor de Celulose Cristalina de Biomassa Vegetal utilizando o Método Updegraff
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dampanaboina, L., Yuan, N., Mendu,… More

Dampanaboina, L., Yuan, N., Mendu, V. Estimation of Crystalline Cellulose Content of Plant Biomass using the Updegraff Method. J. Vis. Exp. (171), e62031, doi:10.3791/62031 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter