Updegraff-metoden er den mest brukte metoden for celluloseestimering. Hovedformålet med denne demonstrasjonen er å gi en detaljert Updegraff-protokoll for estimering av celluloseinnhold i plantebiomasseprøver.
Cellulose er den mest tallrike polymeren på jorden generert av fotosyntese og den viktigste bærende komponenten av cellevegger. Celleveggen spiller en viktig rolle i plantevekst og utvikling ved å gi styrke, stivhet, hastighet og retning av cellevekst, vedlikehold av celleformer og beskyttelse mot biotiske og abiotiske stressfaktorer. Celleveggen består hovedsakelig av cellulose, lignin, hemicellulose og pektin. Nylig har plantecellevegger blitt målrettet for andre generasjons biodrivstoff- og bioenergiproduksjon. Spesielt brukes cellulosekomponenten til plantecelleveggen til produksjon av cellulosisk etanol. Estimering av celluloseinnhold i biomasse er avgjørende for grunnleggende og anvendt celleveggforskning. Updegraff-metoden er enkel, robust og den mest brukte metoden for estimering av krystallinsk celluloseinnhold av plantebiomasse. Den alkoholløselige råcelleveggfraksjonen ved behandling med Updegraff-reagens eliminerer hemicellulose- og ligninfraksjonene. Senere blir Updegraff reagensresistent cellulosefraksjon utsatt for svovelsyrebehandling for å hydrolysere cellulose homopolymeren i monomeriske glukoseenheter. En regresjonslinje er utviklet ved hjelp av ulike konsentrasjoner av glukose og brukes til å estimere mengden glukose som frigjøres ved cellulosehydrolyse i eksperimentelle prøver. Til slutt er celluloseinnholdet estimert basert på mengden glukosemonomerer ved kolorimetrisk antronanalyse.
Cellulose er den primære bærende komponenten av cellevegger, som finnes i både primære og sekundære cellevegger. Celleveggen er en ekstracellulær matrise som omgir planteceller og hovedsakelig består av cellulose, lignin, hemicellulose, pektin og matriseproteiner. Omtrent en tredjedel av plantene biomasse er cellulose1 og det spiller betydelige roller i plantevekst og utvikling ved å gi styrke, stivhet, hastighet og retning av cellevekst, vedlikehold av celleform og beskyttelse mot biotiske og abiotiske stressfaktorer. Bomullsfiber inneholder 95% cellulose2 innhold, mens trær inneholder 40% til 50% av cellulose avhengig av plantearter og organtyper3. Cellulosen består av gjentatte enheter av cellobiose, et disakkarid av glukoserester forbundet med β-1,4 glykosidiske bindinger4. Cellulosisk etanol produseres fra glukose avledet fra cellulosen som er tilstede i plantecelleveggene5. Cellulosisk fiber består av flere mikrofibriler der hver mikrofibril fungerer som kjerneenhet med 500-15000 glukosemonomerer1,6. Cellulose homopolymer syntetiseres av plasmamembran innebygde cellulosesyntasekomplekser (CSC)1,7. Individuelle cellulosesyntase A (CESA) proteiner syntetiserer glukankjeder og de tilstøtende glukankjedene er forbundet med hydrogenbindinger for å danne krystallinsk cellulose1,8. Cellulose finnes i flere krystallinske former med to dominerende former, cellulose Iα og cellulose Iβ som opprinnelige former9. I høyere planter finnes cellulose i cellulose Iβ-form mens lavere plantecellulose eksisterer i Iα form10,11. Totalt sett spiller cellulosen en betydelig rolle i å gi styrke og stivhet til plantecelleveggene.
Første generasjons biodrivstoff produseres hovedsakelig fra maisstivelse, sukkerrør og betesukker, som er matkilder, mens andre generasjons biodrivstoff fokuserer på biodrivstoffproduksjonen fra biomassemateriale fra ikke-matplantebiomassecelleveggmateriale12. Nøyaktig estimering av krystallinsk celluloseinnhold er ikke bare viktig for grunnleggende forskning på cellulosebiosyntese og celleveggdynamikk, men også for anvendt biodrivstoff- og bioproduktforskning. Ulike metoder er utviklet og optimalisert for estimering av cellulose i plantebiomassen, og Updegraff-metoden er den mest brukte metoden for celluloseestimering. Den første rapporterte metoden for celluloseestimering var av Cross og Bevan i 190813. Metoden var basert på prinsippet om alternativ klorering og ekstraksjon ved natriumsulfat. Cellulosen oppnådd av den opprinnelige så vel som modifiserte protokoller av Cross og Bevan-metoden viste imidlertid forurensning av små brøkdeler av lignin i tillegg til en betydelig mengde xylans og mannans14. Til tross for flere modifikasjoner for å fjerne lignin og hemicelluloses fra cellulosefraksjonen, beholdt Cross-Bevan-metoden en betydelig mengde mannans sammen med cellulose. Senere ble Kurschners metode utviklet ved å bruke salpetersyre og etanol for å trekke ut cellulose15. Denne metoden uttalte at total lignin og 75% av pentosanene ble fjernet, men de sanne celluloseresultatene var de samme som de som ble estimert ved kloreringsmetoden Cross og Bevan. En annen metode (Norman og Jenkins) ble utviklet ved å bruke metanol-benzen, natriumsulfat og natriumhypokloritt for å trekke ut cellulose16. Denne metoden beholdt også en brøkdel av lignin (3%) og betydelige mengder pentosaner som fører til nøyaktig estimering av cellulose. Senere brukte Kiesel og Semiganowsky en annen tilnærming til hydrolysert cellulose ved hjelp av 80% konsentrert svovelsyre, og de hydrolyserte reduserte sukkerene ble estimert av Bertrands metode17. De to metodene, Waksman’s og Stevens18 og Salo14,19 som ble utviklet basert på Kiesel og Semiganowskys metode, ga også 4-5% mindre celluloseinnhold sammenlignet med tidligere metoder20.
Updegraff-metoden er den mest brukte metoden for estimering av krystallinsk celluloseinnhold. Denne metoden ble først beskrevet av Updegraff for måling av cellulose i 196921. Updegraff-metoden integrerer Kurschner-metoden (bruk av salpetersyre), Kiesel- og Seminowsky-metoder (hydrolyse av cellulose i glukosemonomerer ved hjelp av svovelsyre) med noen modifikasjoner, og antronanalysen av Viles og Silverman for enkel kolorimetrisk estimering av glukose og krystallinsk celluloseinnhold22. Prinsippet for denne metoden er bruk av eddiksyre og salpetersyre (Updegraff reagens) for å eliminere hemicellulose og lignin fra det homogeniserte plantevevet, som etterlater eddiksyre / salpetersyreresistent cellulose for videre behandling og estimering15. Den eddiksyreresistente cellulosen behandles med 67% svovelsyre for å bryte cellulosen i glukosemonomerer, og de frigjorte glukosemonomerene er estimert av antronanalyse21,23. Flere modifikasjoner av den opprinnelige Updegraff-metoden ble brukt til å forenkle prosedyren og celluloseestimering ved antronanalyse24. Generelt kan denne metoden deles inn i fem faser. I den første fasen fremstilles plantematerialet. I den andre fasen er råcelleveggen skilt fra den totale biomassen, da cellulose er nøkkelkomponenten i plantecellevegger. Senere, i tredje fase, er cellulosen skilt fra de ikke-cellulosecelleveggkomponentene ved behandling med Updegraff-reagens. I fjerde fase brytes den eddiksyreresistente cellulosen inn i glukosemonomerer ved svovelsyrebehandling. Svovelsyrebehandling av cellulose resulterer i dannelse av 5-hydroksymetylfurfuralforbindelser fra reaksjonen av glukosemonomerer med svovelsyre. Til slutt, i den siste fasen, genererer anthronen et grønt blått kompleks ved å koke med furfuralforbindelsen generert i forrige fase25. Denne antronbaserte kolorimetriske metoden ble først brukt i 1942 av Dreywood. Anthron er et fargestoff som identifiserer furfuralforbindelser av pentose og heksose dehydrerte produkter som 5-hydroksymetylfurfural, under sure forhold. Reaksjon med heksose gir en intens farge og bedre respons sammenlignet med pentoser25. Mengden bundet glukose måles ved spektrofotometerabsorbering ved 620 nm og intensiteten av det grønne blå komplekset er direkte proporsjonal med mengden sukker i prøven. De målte absorbansverdiene ble sammenlignet med en glukosestandard regresjonslinje for å beregne glukosekonsentrasjonen av prøven. Det målte glukoseinnholdet ble brukt til å estimere celluloseinnholdet i plantebiomassen.
Bomullsfibre er naturlige fibre produsert av bomullsseed. Bomullsfiber er en enkelt celle med ~ 95% celluloseinnhold2 med høyt krystallinsk celluloseinnhold med omfattende applikasjoner i tekstilindustrien31. Som, bomullsfiber inneholder ~ 95% cellulose, har vi brukt bomull rotvev for demonstrasjon av estimering av krystallinsk celluloseinnhold. Bomullsrotvev er moderat rik på krystallinsk celluloseinnhold og representerer en vanlig tilgjengelig plantebiomasse. Mengden to…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Institutt for plante- og jordvitenskap og bomull inc. for deres delvise støtte til denne studien.
Acetone | Fisher Chemical | A18-500 | Used in the protocol |
Anthrone | Sigma Aldrich | 90-44-8 | For colorimetric assay |
Centrifuge | Eppendorf | 5424 | For centrifugation |
Chloroform | Mallinckrodt | 67-66-3 | Used in the protocol |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | 6381-92-6 | Used in the protocol |
Ethanol | Millipore Sigma | EM-EX0276-4S | Used in the protocol |
Filter paper | Whatman | 1004-090 | Positive control |
Glacial acetic acid | Sigma | SKU A6283 | Used in the protocol |
Heat block/ ThermoMixer F1.5 | Eppendorf | 13527550 | For controlled temperatures |
Incubator | Fisherbrand | 150152633 | Used for drying plant sample |
Measuring Scale | Mettler Toledo | 30243386 | For specific quantities |
Methanol 100 % | Fisher Chemical | A412-500 | Used in the protocol |
Microplate (96 well) | Evergreen Scientific | 222-8030-01F | For anthrone assay |
Nitric acid | Sigma Aldrich | 695041 | Used in the protocol |
Polypropylene Microvials (2 mL) / screw capped tubes | BioSpec Products | 10831 | For high temperatures |
Spectrophotometer(Multimode Detector) | Beckmancoulter DTX880 | 1000814 | For measuring absorbances |
Spex SamplePrep 6870 Freezer / Mill | Spex Sample Prep | 68-701-15 | For grinding plant tissues into fine powder |
Sulphuric acid | J.T.Baker | 02-004-382 | Used in the protocol |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | 151-21-3 | Used in the PSB buffer |
Tubes (2 mL) | Fisher Scientific | 05-408-138 | Used in the protocol |
Tris Hydrochloride | Sigma Aldrich | 1185-53-1 | Used in the PSB buffer |
Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977 | Used in the protocol |
Vacuum dryer (vacufuge plus) | Eppendorf | 22820001 | For drying samples |
Vortex mixer | Fisherbrand | 14-955-151 | For mixing |
Waterbath | Thermoscientific | TSGP02PM05 | For temperature controlled conditions at specific steps |
Weighing Paper | Fisher Scientific | 09-898-12A | Used in the protocol |