Summary
Deze studie heeft tot doel een nieuw humaan organotypisch retinale cultuurmodel (HORC) te ontwikkelen dat voorkomt dat de retinale integriteit tijdens explantbehandeling in gevaar komt. Dit wordt bereikt door het netvlies te kweken met het bovenliggende glasvocht en het onderliggende retinale pigmentepitheel-vaatvlies (RPE-vaatvlies) en sclera.
Abstract
Eerdere menselijke organotypische retinale cultuur (HORC) modellen hebben gebruik gemaakt van losse netvliezen; zonder de structurele ondersteuning die wordt verleend door retinale pigmentepitheel-vaatvlies (RPE-vaatvlies) en sclera, kan de integriteit van het fragiele netvlies gemakkelijk worden aangetast. Het doel van deze studie was om een nieuw HORC-model te ontwikkelen dat het netvlies, RPE-vaatvlies en sclera bevat om de retinale integriteit te behouden bij het kweken van retinale explantaten.
Na het snijden omcirkelend langs de limbus om iris en lens te verwijderen, werden vier diepe incisies gemaakt om de oogschelp plat te maken. In tegenstelling tot eerdere HORC-protocollen werd een trephine gebruikt om niet alleen het netvlies door te snijden, maar ook het RPE-vaatvlies en sclera. De resulterende drielaagse explantaten werden gedurende 72 uur gekweekt. Hematoxyline en Eosine-kleuring (H&E) werd gebruikt om anatomische structuren te beoordelen en retinale explantaten werden verder gekenmerkt door immunohistochemie (IHC) voor apoptose, Müller-celintegriteit en retinale ontsteking. Om de mogelijkheid van ziekte-inductie te bevestigen, werden explantaten blootgesteld aan hoge glucose (HG) en pro-inflammatoire cytokines (Cyt), om diabetische retinopathie (DR) na te bootsen. De Luminex magnetische kraaltest werd gebruikt om DR-gerelateerde cytokines te meten die vrijkomen in het kweekmedium.
H&E-kleuring onthulde verschillende retinale lamellen en compacte kernen in retinale explantaten met het onderliggende RPE-vaatvlies en sclera, terwijl netvliezen zonder de onderliggende structuren een verminderde dikte en ernstig kernverlies vertoonden. IHC-resultaten wezen op afwezigheid van apoptose en retinale ontsteking, evenals behoud van Müller-celintegriteit. De Luminex-assays toonden een significant verhoogde secretie van DR-geassocieerde pro-inflammatoire cytokines in retinale explantaten blootgesteld aan HG + Cyt ten opzichte van baseline niveaus na 24 uur.
We hebben met succes een nieuw HORC-protocol ontwikkeld en gekarakteriseerd waarin de retinale integriteit werd bewaard zonder apoptose of retinale ontsteking. Bovendien suggereert de geïnduceerde secretie van DR-geassocieerde pro-inflammatoire biomarkers bij blootstelling van retinale explantaten aan HG + Cyt dat dit model kan worden gebruikt voor klinisch vertaalbare retinale ziektestudies.
Introduction
Het netvlies is een zeer gespecialiseerde oculaire structuur die verantwoordelijk is voor het transformeren van inkomende lichtenergie naar elektrische signalen, die vervolgens door de hersenen worden verwerkt voor visuele waarneming. Het menselijk netvlies bevat een dynamisch bereik van celtypen, sterk georganiseerd in een unieke lamellaire structuur bestaande uit twee synaptische en drie kernlagen1 (Figuur 1). Retinale homeostase wordt ondersteund door de ingewikkelde verbindingen tussen neuroretinale cellen, bloedvaten, zenuwen, bindweefsels en de RPE1. Vanwege de geavanceerde retinale anatomie en fysiologie blijven de mechanismen van veel netvliesaandoeningen nog steeds slecht begrepen2,3,4,5. Om netvliesaandoeningen beter te bestuderen, zijn HORC-modellen ontwikkeld6,7,8,9. In vergelijking met dierstudies en in vitro culturen zijn HORC-modellen voordelig omdat ze de dynamische cellulaire omgeving en complexe neurovasculaire interacties in situ behouden, wat een goed model biedt voor klinische translatie.
Figuur 1: Posterieure oculaire structuren van het menselijk oog. De retinale lagen van voor naar achteren zijn: zenuwvezellaag (NFL), ganglioncellaag (GCL), binnenste plexiforme laag (IPL), binnenste nucleaire laag (INL), buitenste plexiforme laag (OPL), buitenste nucleaire laag (ONL), fotoreceptor binnenste segment (IS) en fotoreceptor buitenste laag (OS). Cellen in het netvlies omvatten ganglioncellen (blauw), amacrinecellen (geel), bipolaire cellen (rood), horizontale cellen (paars), staaffotoreceptoren (roze) en kegelfotoreceptoren (groen). Het glasvocht bevindt zich anterieur aan het netvlies. De RPE, bruch's membraan, vaatvlies en sclera bevinden zich achter het netvlies. Merk op dat de getoonde afbeelding slechts een schematische weergave is van het netvlies en dat de verhouding tussen cellen en retinale connectiviteit binnen elke laag mogelijk niet indicatief is voor de in vivo setting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Eerder gekarakteriseerde HORC-protocollen6,7,8,9 hebben betrekking op het scheiden van het netvlies van het onderliggende RPE-vaatvlies en sclera met behulp van een chirurgische trephine. Zonder de ondersteuning van deze onderliggende structuren wordt het doorschijnende netvlies echter dun, moeilijk te hanteren en kunnen hulpmiddelen zoals een tang de integriteit ervan gemakkelijk verstoren. Bovendien is aangetoond dat het isoleren van het netvlies in cultuur zonder de RPE ganglioncelapoptose en fotoreceptordegeneratie10,11,12veroorzaakt. Een alternatief HORC-protocol dat het verlies van retinale integriteit minimaliseert en de in vivo omgeving beter nabootst, zou dus nuttig zijn. Dit is vooral belangrijk bij het bestuderen van retinale ziektemechanismen, omdat lichamelijk letsel tijdens explantbehandeling artefacten kan introduceren. Daarom was het doel van deze studie om een nieuw HORC-model te ontwikkelen dat het RPE-vaatvlies en sclera omvat om de retinale integriteit te beschermen tijdens explantbehandeling en kweek.
Om dit doel te bereiken, werden retinale explantaten "ingeklemd" tussen het resterende glasvocht en het onderliggende RPE-vaatvlies en sclera geëxtraheerd. In de sandwich explanteert het glasvocht het netvlies om netvliesloslating en vouwen te voorkomen, terwijl de taaie, vezelige sclera fungeert als zowel een steiger voor structurele ondersteuning als een contactpunt voor een tang. Bovendien hebben diermodellen aangetoond dat het behouden van de RPE in cultuur retinale degeneratie en gliale proliferatie kan voorkomen, een reactie van Müller-cellen op gevaarsignalen zoals hypoxie en ontsteking10,11,12.
Om het model te karakteriseren, werden sandwich retinale explantaten gekleurd met Hematoxyline en Eosine (H & E) om anatomische structuren te beoordelen en immunohistochemie (IHC) werd uitgevoerd, waarbij explantaten werden gelabeld met terminale deoxynucleotidyltransferase dUTP nick end labeling (TUNEL, een apoptotische celmarker), glial fibrillair zuur eiwit (GFAP, een retinale ontsteking en Müller-celactiveringsmarker) en vimentine, een marker van Müller-celintegriteit. Om te bepalen of dit model kan worden geïnduceerd om moleculaire ziekteverschijnselen te ontwikkelen, werden de explantaten blootgesteld aan hoge glucose (HG) met pro-inflammatoire cytokines (Cyt), interleukine-1β (IL-1β) en tumornecrosefactor-α (TNF-α), een kweekomgeving waarvan is aangetoond dat deze diabetische retinopathie (DR) nabootst in zowel cel- als dierziektemodellen13,14,15. Luminex-assays werden gebruikt in het DR-model om cytokines te meten die vrijkomen in het kweekmedium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Menselijke donoroogcups werden verkregen van de Nieuw-Zeelandse National Eye Bank na cornea-excisie voor transplantatie en zoals goedgekeurd door de Northern B Health and Disability Ethics Committee (NTX/06/19/CPD/AM07).
OPMERKING: De kweek moet worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast van klasse II om steriele weefselkweekomstandigheden te garanderen. De weefsels moeten binnen 24 uur postmortem worden gekweekt om significant verlies van retinale integriteit te voorkomen.
Figuur 2: Afbeeldingen van de procedure voor het verzamelen van de sandwich retinale explantaten. Gebruik voor de voorbereiding van de explant een ontleedschaar met één scherpe punt en één stomp uiteinde, waarbij het stompe uiteinde naar de binnenkant van de wereldbol is gericht om weefselschade tijdens de incisie te verminderen. Gebruik ook een tang met stompe uiteinden om krassen op de intraoculaire weefsels tijdens het hanteren te voorkomen. Met behulp van een chirurgische schaar, met het stompe uiteinde naar binnen gericht, knipt u langs de limbus om de iris en lens te verwijderen(A-C). De ONH kan worden gelokaliseerd als u recht in de geopende oogschelp(D)kijkt. Gebruik een tang met stompe uiteinden en houd de sclera vast om de wereldbol(E)te stabiliseren. Verdeel de bol verticaal in twee helften door twee diepe incisies naar de ONH te maken, maar snijd niet door de ONH. Herhaal dit langs de horizontale meridiaan (G). Breng stompe tang aan op de sclera en open de wereldbol voorzichtig naar een klavervorm(H-K). Gebruik een tang om het glasvocht zorgvuldig te manipuleren om het gevouwen netvlies glad te maken, omdat het glasvocht aan het netvlies trekt, maar raak het netvlies niet direct aan (I). Verwijder het glasvocht als het netvliesloslating of vouwen veroorzaakt (niet weergegeven in figuur 2 omdat het transparante glasvocht niet goed is vastgelegd op foto's). Zoek gebieden waar het netvlies plat is en extraheer retinale explantaten met behulp van een chirurgische trephine(L). Breng een tang aan op de sclera en breng de retinale explantaten voorzichtig over in het vooraf bereide kweekmedium (M, N). De hele sandwich explant moet naar de bodem van de put zinken vanwege het gewicht, daarom wordt elke explant ondergedompeld in het medium (O). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
1. Extractie van de sandwich retinale explantaten uit de oogschelp
- Verwijder de iris en lens.
- Plaats de oogschelp in een petrischaal, met de iris en lens naar boven gericht en de oogzenuwkop (ONH) in contact met de petrischaal(figuur 2A).
- Houd de oogschelp stabiel bij de limbus met behulp van een tang(figuur 2B).
- Maak de iris en lens los door kleine sneden te maken langs de buitenrand van de limbus (figuur 2A).
- Verwijder de iris en lens voorzichtig. Vermijd verstoring van het netvlies tijdens manipulatie(figuur 2C).
OPMERKING: De lens zal niet in de oogschelp vallen omdat deze via zonulevezels aan het ciliaire lichaam is bevestigd.
- Druk de oogschelp plat.
- Met de oogschelp nog steeds rechtop zittend, identificeert u de ONH. Dit is gemakkelijker met een helderwitte lichtbron(Figuur 2D).
- Insnijden bij de vier kwadranten naar de ONH (Figuur 2E). De petrischaal kan worden gedraaid voor eenvoudiger gebruik. Knip de ONH NIET door.
- Verdeel en vlak de oogschelp voorzichtig uit (figuur 2E).
- Breng de tang aan op de sclera in plaats van op het netvlies om te voorkomen dat de integriteit van het netvlies wordt verstoord.
OPMERKING: Perifere netvliesloslating en plooiing is onvermijdelijk, omdat het gewicht van het overvolle glasvocht aan het netvlies zal trekken. Verwijder in deze gebieden het glasvocht om verdere netvliesplooiing te voorkomen. Vergeet niet om resterend glasvocht te laten om het netvlies bovenop het RPE-vaatvlies en sclera te stabiliseren.
- Verzamel sandwich retinale explantaten.
- Plaats een chirurgische trephine op het netvlies in een gebied zonder retinale plooien (figuur 2F).
- Druk hard om de sclera binnen te dringen, wat een krakend geluid zou moeten genereren.
- Draai de trephine met 180° om ervoor te zorgen dat de sclera volledig is doordrongen, zodat de retinale explant nu wordt gescheiden van het resterende weefsel.
- Breng de tang aan op de sclera en breng de sandwich retinale explant over naar het kweekmedium (Figuur 2G-I).
- Verkrijg 2-3 sandwich retinale explantaten uit het perifere netvlies van elk kwadrant.
OPMERKING: De sandwich retinale explant kan soms vastzitten in de opening van de trephine. Gebruik een tang om voorzichtig een klein deel van de basis van de sclera uit te pluizen. Dit gebeurt vaker wanneer het mes stomp is en verlies van het netvlies kan veroorzaken(figuur 3A-C). - Gebruik een nieuwe trephine na het uitsnijden van 1-2 retinale explants omdat het mes gemakkelijk bot wordt(Figuur 3C
Figuur 3: Problemen oplossen. Tijdens het extractieproces kan de retinale explant worden gevangen bij de opening van de chirurgische trephine(A). Plaag het weefsel voorzichtig uit de basis van de sclera zonder het netvlies aan te raken(B). Dit kan vaker gebeuren als de chirurgische trephine wordt gebruikt voor het extraheren van meer dan twee retinale explantaten, omdat het mes gemakkelijk stomp(C)kan worden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Kweek de retinale explantaten.
- Bereid het kweekmedium met Dulbecco's Modified Eagle Medium voedingsmengsel F-12 (DMEM-F12) en een 1x antibiotica- en antimycoticamengsel (AA, 100x bouillon).
- Plaats voorafgaand aan de explantextractie 500 μL medium in de putten van een 24-well plaat en equilibrate in de incubator. Dit is belangrijk omdat het toevoegen van het medium daarna het netvlies kan losmaken.
- Kweek de sandwich retinale explantaten bij 37 °C gedurende maximaal 72 uur in een bevochtigde 5% CO2-incubator in medium bereid in stap 1.4.2.
- Om DR-achtige veranderingen te induceren, kweek retinale explantaten in medium dat DMEM-F12 bevat met een combinatie van 32,5 mM HG met Cyt, TNF-α (10 ng / ml) en IL-1β (10 ng / ml).
2. Paraffine-inbedding van de sandwich retinale explantaten
- Fixeer de sandwich retinale explants.
- Dompel de sandwich retinale explantaten onder in 10% formaline gedurende ten minste 24 uur.
- Verwijder de formaline-oplossing en breng de retinale explantaties van de sandwich voorzichtig over in tissuepads en cassettes.
- Week de sandwich retinale explants minstens 24 uur in 70% ethanol.
- Paraffine-embed retinale explantaten in blokken.
- Snijd paraffine-ingebedde retinale weefsels in 5 μm dikke secties met behulp van een microtoom en monteer op glazen dia's. Bewaren bij kamertemperatuur totdat het wordt afbeeld.
- Deparaffinize secties.
- Dompel de secties gedurende 5 minuten onder in 70% xyleen.
- Dompel de secties gedurende 5 minuten onder in 100% xyleen.
- Rehydrateer de secties in 70% ethanol gedurende 5 min.
- Rehydrateer de secties in 100% ethanol gedurende 5 minuten.
- Was de secties gedurende 10 minuten onder stromend leidingwater.
3. Karakterisering met behulp van H & E, IHC en een magnetische Luminex-test
- H & E-kleuringsprotocol
- Deparaffiniseer de secties met stap 2.2.
- Hydrateer de secties in leidingwater gedurende 5 minuten.
- Kleur de secties in Gill's 2 hematoxyline-oplossing gedurende 5 minuten.
- Was de secties grondig onder stromend leidingwater om overtollige vlekken te verwijderen.
- Onderscheid door de secties twee keer in 1% zure alcohol te dippen.
- Was de delen snel onder stromend leidingwater.
- Kleur de secties blauw door zes keer in 1% lithiumcarbonaat (10 mg / ml) te dopen.
- Was de secties grondig onder stromend leidingwater gedurende 5 minuten om overtollige blauwe vlekken te verwijderen.
- Dompel de secties 10 keer in 1% eosine.
- Was de secties snel onder leidingwater om overtollige vlekken te verwijderen.
- Hydrateer de secties door ze 10 keer te dopen in 100% ethanol. Doe dit twee keer.
- Doop de secties 10 keer in 70% xyleen.
- Doop de secties 10 keer in 100% xyleen.
- Monteer met een coverslip met behulp van dibutylftalaat polystyreen xyleen (DPX) montagemedium.
- Maak foto's met een lichtmicroscoop.
- IHC etiketteringsprotocol"
- Deparaffiniseer de secties met stap 2.2.
- Plaats de glaasjes in een oplossing met een natriumcitraatbuffer van 10 mM met 0,05% Tween 20 bij pH 6,0 en laat gedurende 2 minuten een antigeen ophalen in een snelkookpan die geautomatiseerd is bij 121 °C.
- Was secties in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 5 minuten. Doe dit 3 keer.
- Blokkeer de secties met PBS met 0,1% Triton X-100 en 10% normaal geitenserum gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Incubeer secties 's nachts bij 4 °C met primaire antilichamen geconjugeerd aan secundaire antilichamen (Tabel van materialen).
- Was secties in PBS gedurende 5 min. Doe dit 3 keer.
- Kleurkernen met 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) gedurende 2 min.
- Was en monteer secties met behulp van een anti-fade reagens.
- Seal coverslips af met nagellak.
- Maak foto's met een confocale laserscanmicroscoop.
- Magnetische Luminex test
- Breng 75 μL media van elke put over naar een 96-well-u-bottom plaat op 24 en 72 h.
- Analyseer het celsupernatant voor IL-18, IL-6, IL-8 en vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) na 24 en 72 uur met behulp van Luminex cytokine assay. Volg de instructies van de fabrikant om de test16uit te voeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Retinale integriteit werd bewaard in dit HORC-model. Retinale integriteit bleef behouden in de gekweekte sandwich retinale explantaten, maar ging verloren in het netvlies gekweekt zonder aangrenzende structuren. H&E werd uitgevoerd om de structurele integriteit van gesegmenteerde sandwich retinale explantaten na 72 h in cultuur te onderzoeken. De sandwich retinale explantaten vertoonden een behouden integriteit en een duidelijke lamellenstructuur van GCL tot ONL met compacte kernen in INL en ONL(figuur 4A). Verstoorde retinale integriteit werd echter gevonden aan de randen van hetzelfde monster, waar het netvlies zich had losgemaakt van het onderliggende RPE-vaatvlies en sclera, met verminderde retinale dikte en ernstig verlies van kernen in INL en ONL (figuur 4B).
Figuur 4: H&E-beelden van retinale explantaten gekweekt in medium gedurende 72 h. A)Structurele integriteit gehandhaafd in gebieden die zijn bevestigd aan het onderliggende RPE-vaatvlies en sclera, weergegeven door de afzonderlijke scheiding van elke retinale laag van GCL naar ONL en compacte kernen in INL en ONL. B)Ernstig verlies van retinale integriteit in gebieden die losstaan van het RPE-vaatvlies en sclera, aangetoond door de algehele vermindering van de retinale dikte en het verminderde aantal kernen in INL en ONL. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Karakterisering van retinale explantaten met behulp van IHC toonde goed bewaarde retinale integriteit, zelfs na 72 uur in cultuur. Er werden geen TUNEL-positieve celkernen, die apoptose markeren, gevonden in retinale explantaten gekweekt in basale omstandigheden, wat een aanhoudende levensvatbaarheid van de cel aantoont, zelfs na 72 uur (figuur 5A-C). GFAP-expressie bleef gelokaliseerd in GCL en IPL, zoals gezien in normale retinale weefsels17,18. Er was geen gliale fibrose, een teken van Müller-celactivering en proliferatie als reactie op retinale ontsteking, die anders zou worden geïdentificeerd als upregulated GFAP-expressie die zich uitstrekt tot in de ONL10,11,12( Figuur5D-F). Vimentine-etikettering (rood) werd sterk uitgedrukt van GCL tot ONL, met behoud van Müller-celintegriteit, zoals te zien in normale retinale weefsels (Figuur 5G-I).
Figuur 5: IHC-beelden van retinale explantaten na kweek in basale media gedurende 72 uur. Het ontbreken van TUNEL-positieve kleuring (groen) suggereert dat er geen cellulaire apoptose is opgetreden in de retinale lagen van GCL tot ONL(A-C). GFAP-etikettering (rood) was beperkt tot GCL en IPL zonder gliale fibrose, die zou worden geïdentificeerd als uitgebreide expressie van GFAP in de ONL(D-F). Vimentine (rood) kwam sterk tot expressie van GCL tot ONL, waarbij de Müller-cellen werden gelokaliseerd die zich door deze retinale lagen(G-I)uitstrekken. Celkernen werden gekleurd met DAPI (blauw). Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Een DR-model werd ontwikkeld door sandwich retinale explantaten in HG en Cyt te kweken. HG en Cyt, IL-1β en TNF-α, verhoogden de secretie van IL-18, VEGF, IL-6 en IL-8 ten opzichte van de uitgangswaarden. Een Luminex-test werd gebruikt om de cytokines IL-18, VEGF, IL-6 en IL-8 te meten die door retinale explantaten werden uitgescheiden na het kweken gedurende 24 en 72 uur onder HG + Cyt-omstandigheden(figuur 6). Om verschillen tussen donoren te minimaliseren, werden uitgescheiden cytokinespiegels vergeleken met baseline (aangegeven door de rode lijn met stippel), vertegenwoordigd door cytokineniveaus die worden uitgescheiden door de sandwich explantaten van dezelfde donor, maar gekweekt in basaal medium (bereid in stap 1.4.1). Na 24 uur namen de uitgescheiden IL-18-, VEGF-, IL-6- en IL-8-niveaus significant toe ten opzichte van de uitgangswaarde. Na 72 uur bleven alleen IL-18- en VEGF-niveaus significant verhoogd, terwijl er geen significant verschil werd gevonden in IL-6- en IL-8-niveaus in vergelijking met baseline.
Figuur 6: Cytokines afgeven door de sandwich retinale explantaten gekweekt in HG en Cyt, IL-1β en TNF-α, na 24 en 72 h. De uitgescheiden IL-18, VEGF, IL-6 en IL-8 niveaus stegen significant boven baseline na 24 uur (p < 0,05). Na 72 uur bleven de IL-18- en VEGF-niveaus significant verhoogd (p < 0,05), maar er werd geen significant verschil gevonden in IL-6- en IL-8-niveaus in vergelijking met de uitgangswaarde. De gestippelde rode lijn geeft het basisniveau aan, dat cytokineniveaus vertegenwoordigt die worden uitgescheiden door de explantaten van dezelfde donor, maar gekweekt in normaal medium. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HORC is momenteel het meest klinisch vertaalbare model in preklinisch retinaal onderzoek. In vergelijking met in vitro celkweekmodellen kan HORC de anatomie van het menselijk netvlies in situ beter weergeven, door de dynamische retinale celtypen en hun verbindingen met neuronen, vasculaturen en de extracellulaire omgeving te behouden19. In vergelijking met diermodellen is HORC voordeliger bij het bestuderen van de pathofysiologie van en het ontwerpen van farmaceutische behandelingen voor menselijke netvliesaandoeningen als gevolg van variaties tussen soorten, zoals verschillende retinale celtypen en variërende fotoreceptordichtheid en verhoudingen, wat zou kunnen bijdragen aan mislukte klinische onderzoeken ondanks positieve resultaten in diermodellen19. In eerdere HORC-protocollen werd het netvlies echter opzettelijk losgemaakt van het RPE-vaatvlies en sclera. Zonder de taaie sclera is het dunne netvlies moeilijk te hanteren en kan de integriteit van het netvlies worden aangetast als het direct wordt behandeld door een tang6,7,8,9. Dit blijkt uit het feit dat eerdere studies met geïsoleerde netvliezen een verhoogde Müller-celactivatie en TUNEL-positieve kernen hebben gemeld met 72 uur cultuur. Dit in tegenstelling tot onze bevindingen, wat suggereert dat de sandwichmethode de retinale integriteit beter behoudt. Ten tweede werden verhoogde neuronale degeneratie en gliale proliferatie gevonden in dierlijke ORC-modellen in retina gekweekt zonder RPE, vergeleken met retina gekweekt met RPE10,11,12.
Om de kans op het in gevaar brengen van de retinale integriteit te minimaliseren, werden sandwich retinale explantaten gebruikt in dit nieuwe HORC-protocol. In tegenstelling tot eerdere HORC-protocollen sneed de trephine niet alleen door het netvlies, maar ook door het RPE-glasvocht en de sclera, zodat de resulterende explant wordt "ingeklemd" en gestabiliseerd tussen het resterende glasvocht en de onderliggende structuren. Het resterende glasvocht weegt het netvlies om vouwing en loslating van de onderliggende structuren te voorkomen, terwijl de sclera fungeert als een steiger om de retinale architectuur te ondersteunen om het netvlies te beschermen tegen door een tang geïnduceerde verwonding. Bovendien kan het kweken van retina met RPE retinale degeneratie en gliale proliferatie in cultuurvoorkomen 10,11,12.
Onthoud de volgende punten bij het extraheren van sandwich retinale explantaten. Bij het snijden langs de limbus zal de lens de iris verzwaren, maar zal deze niet in de oogschelp vallen omdat deze via zonulevezels aan het ciliaire lichaam is bevestigd. Breng de tang aan op de sclera en vermijd het aanraken van het netvlies om verstoring van de integriteit van het netvlies te voorkomen. Vul de kweekputten met medium voordat u de retinale explant in de putten plaatst. Het toevoegen van het medium na het plaatsen van de retinale explants in de putten verhoogt het risico op het loskoppelen van het netvlies van het RPE-vaatvlies en sclera of het omdraaien van de hele explant ondersteboven. Houd er bij het maken van diepe incisies in de vier kwadranten rekening mee dat het perifere netvlies kan loskomen als gevolg van het glasvocht dat uit de oogschelp lekt. Om loslating of plooiing van het netvlies te voorkomen, verwijdert u het glasvocht in het gebied dat aan het netvlies trekt. Hoewel het vorige punt adviseert om het glasvocht op het netvlies te verwijderen, laat voldoende restant glasvocht over om het netvlies bovenop het RPE-vaatvlies en sclera te wegen om de stabiliteit van de sandwich retinale explantaten te vergroten. Bij het doorsnijden van de taaie, vezelige sclera kan de trephine gemakkelijk bot worden. Als gevolg hiervan kan overmatige kracht nodig zijn of kan de sclera niet volledig worden gepenetreerd. Gebruik een nieuwe trephine voor elke 1-2 geëxtraheerde retinale explantaten om onvolledige penetratie door de sclera te voorkomen. Ervaring in zorgvuldige behandeling is cruciaal om het netvlies te beschermen; daarom is training met varkensogen, die qua grootte en structuur vergelijkbaar zijn met het menselijk oog, raadzaam voordat de beperkte beschikbare donorsclerale oogschelpen worden gebruikt.
Retinale integriteit werd bewaard in de explantaten ingeklemd tussen restant glasvocht en het onderliggende RPE-vaatvlies en sclera. H&E-kleuring vertoonde een betere structurele integriteit wanneer de gekweekte retinale explant was bevestigd aan RPE-vaatvlies en sclera, vergeleken met het kweken van het netvlies alleen. Ter ondersteuning van deze bevinding suggereerde het ontbreken van TUNEL-positieve celkernen een afwezigheid van apoptose in alle retinale lagen, wat een behouden cellulaire levensvatbaarheid aantoont, zelfs na 72 uur. Bovendien bevestigde vimentine-etikettering de integriteit van Müller-cellen en de beperkte GFAP-expressie in GCL en INL, gevonden in normaal netvlies, verifieerde opnieuw het gebrek aan ontstekings- of stresssignalen in het netvlies.
Het HORC-model dat in deze studie werd gekenmerkt, resulteerde in een bewaarde retinale structuur en Müller-celintegriteit, terwijl retinale ontsteking en cellulaire apoptose werd voorkomen. Bovendien kan het worden gebruikt om retinale ziekten te modelleren, wat bijzonder nuttig is om ziekteroutes en farmaceutische mechanismen te identificeren. Eerdere dier- en in vitro studies hebben aangetoond dat DR-ontsteking kan worden geïnduceerd wanneer dierlijke netvlies of cellen worden blootgesteld aan HG en Cyt13,14,15. In deze HORC-studie, door HG en Cyt toe te passen op de sandwich explantaten gedurende 24 uur in cultuur, was de secretie van IL-18, VEGF, IL-6 en IL-8 significant verhoogd boven de uitgangswaarde. Van deze cytokines is bekend dat ze toenemen in het glasvocht en serum van patiënten met DR in vergelijking met niet-diabetische controles, wat valideert dat dit DR-model klinisch vertaalbaar is20,21,22,23,24,25. Hoewel deze studie dr alleen heeft gekarakteriseerd met behulp van magnetische luminex-assay, kunnen ook andere technieken zoals Western Blotting, IHC en gepolymeriseerde kettingreactie (PCR) worden uitgevoerd26.
Ondanks de duidelijke voordelen die hierboven zijn beschreven, heeft dit nieuwe HORC-model ook enkele beperkingen. Een belangrijke beperking van dit protocol is de lage toevoer van weefsel. Donoroogcups, die alle oculaire structuren hebben, maar het hoornvlies over het algemeen wordt verwijderd voor transplantatie, zijn zelden beschikbaar voor onderzoek vanwege de grote vraag naar de sclera bij chirurgische procedures zoals glaucoomshunts, orbitale implantaten, schadeherstel bij netvliesloslating en dekking van blootgestelde hechtingen. Om deze beperking te minimaliseren, stellen we voor dat alle experimentele groepen worden verzameld van dezelfde donor. Dit elimineert de noodzaak om rekening te houden met interdonorvariabiliteit, zoals leeftijd, duur van de ziekte, baseline cytokineniveaus en andere factoren die kunnen bijdragen aan verstorende variabelen bij vergelijking tussen verschillende patiënten. Ook zijn de meeste donorweefsels van ouderen, omdat het moeilijker is om monsters van jongere leeftijdsgroepen te verkrijgen, en zelfs wanneer beschikbaar, is de doodsoorzaak van jonge donoren vaak traumatisch van aard, wat leidt tot beschadigde weefsels die ongeschikt zijn voor cultuur. Niettemin, gezien het feit dat de meeste chronische retinale ziekten voorkomen bij oudere patiënten, behoudt dit model nog steeds het nut bij het bestuderen van leeftijdsgebonden chronische retinale ziekten zoals DR en leeftijdsgebonden maculaire degeneratie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen de gulle gevers van oogweefsels en het team van de Nieuw-Zeelandse National Eye Bank bedanken voor hun steun. Dit werk werd financieel ondersteund door projectsubsidies van de Maurice and Phyllis Paykel Trust en de Auckland Medical Research Foundation (1117015). Het directeurschap van IDR wordt ondersteund door de Buchanan Charitable Foundation. De beurs van CK wordt verstrekt door de New Zealand Association of Optometrists Education and Research Fund (CC36812) en de beurs van HHL wordt verstrekt door de Buchanan Charitable Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposable Biopsy Punches (5 mm) | Integra York PA Inc., USA | 21909-142 | Referred as surgical trephines in this article |
| Human Recombinant IL-1β | Peprotech, USA | 200-01B | Working concentration: 10 ng/mL |
| Human Recombinant TNF-a | Peprotech, USA | 300-01A | Working concentration: 10 ng/mL |
| DAPI (1 µg/mL) | Sigma Aldrich, Germany | #D9542 | Nuclear stain. Working dilution 1:1000 |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco, Thermofisher, Scientific Inc., USA | 10565018 | Dulbecco’s Modified Eagle Medium nutrient mixture F-12 containing a 1× antibiotics and antimycotics mixture (AA, 100× stock) |
| Fine Scissors - Sharp-Blunt | Fine Science Tools (F.S.T) | 14028-10 | Tips: Sharp-Blunt, Cutting Edge: 27mm, Length: 10cm, Alloy/Material: Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools (F.S.T) | 11050-10 | Length:10cm, Tip shape: Straight, Tips: Serrated, Tip Width: 0.8mm, Tip Dimensions:0.8 x 0.7mm, Alloy/Materials: Stainless Steel |
| Mouse monoclonal GFAP-Cy3 | Sigma Aldrich, Germany | #C9205 | Primary antibody conjugated to Cy3. Working dilution 1:1000. |
| Mouse monoclonal Vimentin-Cy3 | Sigma Aldrich, Germany | #C9080 | Primary antibody conjugated to Cy3. Working dilution 1:50. |
| Rabbit polyclonal TUNEL (In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein) | Sigma Aldrich, Germany | #11684795910 | Primary antibody conjugated to Fluorescein-dUTP. Working dilution 1:10 with enzyme-buffer solution. |
References
- Kolb, H., Fernandez, E., Nelson, R. Facts and Figures Concerning the Human Retina. Webvision-The Organization of the Retina and Visual System. , Internet (2005).
- Gemenetzi, M., De Salvo, G., Lotery, A. Central serous chorioretinopathy: an update on pathogenesis and treatment. Eye. 24 (12), 1743-1756 (2010).
- Buschini, E., Piras, A., Nuzzi, R., Vercelli, A. Age related macular degeneration and drusen: neuroinflammation in the retina. Progress in Neurobiology. 95 (1), 14-25 (2011).
- Chen, S. -Y., et al. Current concepts regarding developmental mechanisms in diabetic retinopathy in Taiwan. Biomedicine. 6 (2), (2016).
- Kaaja, R., Loukovaara, S. Progression of retinopathy in type 1 diabetic women during pregnancy. Current Diabetes Reviews. 3 (2), 85-93 (2007).
- Azizzadeh Pormehr, L., et al. Human organotypic retinal flat-mount culture (HORFC) as a model for retinitis pigmentosa11. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (8), 6775-6783 (2018).
- Fernandez-Bueno, I., et al. Time course modifications in organotypic culture of human neuroretina. Experimental Eye Research. 104, 26-38 (2012).
- Niyadurupola, N., Sidaway, P., Osborne, A., Broadway, D. C., Sanderson, J. The development of human organotypic retinal cultures (HORCs) to study retinal neurodegeneration. British Journal of Ophthalmology. 95 (5), 720-726 (2011).
- Osborne, A., Hopes, M., Wright, P., Broadway, D. C., Sanderson, J. Human organotypic retinal cultures (HORCs) as a chronic experimental model for investigation of retinal ganglion cell degeneration. Experimental Eye Research. 143, 28-38 (2016).
- Caffe, A., Visser, H., Jansen, H., Sanyal, S. Histotypic differentiation of neonatal mouse retina in organ culture. Current Eye Research. 8 (10), 1083-1092 (1989).
- Kaempf, S., Walter, P., Salz, A. K., Thumann, G. Novel organotypic culture model of adult mammalian neurosensory retina in co-culture with retinal pigment epithelium. Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 47-58 (2008).
- Liu, L., Cheng, S. -H., Jiang, L. -Z., Hansmann, G., Layer, P. G. The pigmented epithelium sustains cell growth and tissue differentiation of chicken retinal explants in vitro. Experimental Eye Research. 46 (5), 801-812 (1988).
- Kuo, C., Green, C. R., Rupenthal, I. D., Mugisho, O. O. Connexin43 hemichannel block protects against retinal pigment epithelial cell barrier breakdown. Acta Diabetologica. 57 (1), 13-22 (2020).
- Mugisho, O. O., et al. The inflammasome pathway is amplified and perpetuated in an autocrine manner through connexin43 hemichannel mediated ATP release. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. 1862 (3), 385-393 (2018).
- Mugisho, O. O., et al. Intravitreal pro-inflammatory cytokines in non-obese diabetic mice: Modelling signs of diabetic retinopathy. PLoS ONE. 13 (8), 0202156 (2018).
- R&D Systems, I. , Available from: https://www.rndsystems.com/protocol-types/luminex (2020).
- Nakazawa, T., et al. Attenuated glial reactions and photoreceptor degeneration after retinal detachment in mice deficient in glial fibrillary acidic protein and vimentin. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 48 (6), 2760-2768 (2007).
- Okada, M., Matsumura, M., Ogino, N., Honda, Y. Müller cells in detached human retina express glial fibrillary acidic protein and vimentin. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 228 (5), 467-474 (1990).
- Murali, A., Ramlogan-Steel, C. A., Andrzejewski, S., Steel, J. C., Layton, C. J. Retinal explant culture: A platform to investigate human neuro-retina. Clinical & Experimental Ophthalmology. 47 (2), 274-285 (2019).
- Koleva-Georgieva, D. N., Sivkova, N. P., Terzieva, D. Serum inflammatory cytokines IL-1beta, IL-6, TNF-alpha and VEGF have influence on the development of diabetic retinopathy. Folia Medica (Plovdiv). 53 (2), 44-50 (2011).
- Lee, J. -H., et al. Cytokine profile of peripheral blood in type 2 diabetes mellitus patients with diabetic retinopathy. Annals of Clinical & Laboratory Science. 38 (4), 361-367 (2008).
- Chorostowska-Wynimko, J., et al. In vitro angiomodulatory activity of sera from type 2 diabetic patients with background retinopathy. Journal of Physiology and Pharmacology: An Official Journal of the Polish Physiological Society. 56, 65-70 (2005).
- Khalifa, R. A., Khalef, N., Moemen, L. A., Labib, H. M. The role interleukin 12 (IL-12), interferon-inducible protein 10 (IP-10) and Interleukin 18 (IL-18) in the angiogenic activity of diabetic retinopathy. Research Journal of Medicine and Medical Sciences. 4, 510-514 (2009).
- Zhou, J., Wang, S., Xia, X. Role of intravitreal inflammatory cytokines and angiogenic factors in proliferative diabetic retinopathy. Current Eye Research. 37 (5), 416-420 (2012).
- Song, Z., et al. Increased intravitreous interleukin-18 correlated to vascular endothelial growth factor in patients with active proliferative diabetic retinopathy. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 252 (8), 1229-1234 (2014).
- Louie, H. H., Shome, A., Kuo, C. Y. J., Rupenthal, I. D., Green, C. R., Mugisho, O. O. Connexin43 hemichannel block inhibits NLRP3 inflammasome activation in a human retinal explant model of diabetic retinopathy. Experimental Eye Research. , (2020).
