Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

אפיון טכניקה חדשנית של תרבות רשתית אורגניוטיפית אנושית

Published: June 9, 2021 doi: 10.3791/62046
Automatic Translation
*1, 1, 1, *1
1Buchanan Ocular Therapeutics Unit, Department of Ophthalmology and the New Zealand National Eye Centre, University of Auckland
* These authors contributed equally

Summary

מחקר זה נועד לפתח מודל תרבות רשתית אורגניוטיפית אנושית חדשנית (HORC) המונעת פגיעה בשלמות הרשתית במהלך טיפול בהסבר. זה מושגת על ידי פולחן הרשתית עם הזגוזית יתר על המידה ואת אפיתל הפיגמנט ברשתית הבסיסית-choroid (RPE-choroid) ו sclera.

Abstract

דגמי תרבות הרשתית האורגנוטיפית האנושית הקודמת (HORC) השתמשו ברשתיות מנותקות; עם זאת, ללא התמיכה המבנית המוענקת על ידי אפיתל פיגמנט רשתית-choroid (RPE-choroid) ו sclera, השלמות של הרשתית שבירה יכול בקלות להיות בסכנה. מטרת המחקר הזה הייתה לפתח מודל HORC חדשני המכיל את הרשתית, RPE-choroid ו sclera כדי לשמור על שלמות הרשתית בעת פולחן explants רשתית.

לאחר חיתוך היקפי לאורך הלימבוס כדי להסיר קשתית ועדשה, ארבעה חתכים עמוקים נעשו כדי לשטח את העין. בניגוד לפרוטוקולים קודמים של HORC, נעשה שימוש בטרפין כדי לחתוך לא רק את הרשתית אלא גם את RPE-choroid ו sclera. המהדורות המשולשות שהתקבלו היו בתרבית במשך 72 שעות. ההמטוקסילין והכתמת אאוזין (H&E) שימשו להערכת מבנים אנטומיים ו explants ברשתית התאפיינו עוד יותר על ידי אימונוהיסטוכימיה (IHC) עבור אפופטוזיס, שלמות התא מולר ודלקת ברשתית. כדי לאשר את האפשרות של אינדוקציה המחלה, explants נחשפו גלוקוז גבוה (HG) וציטוקינים פרו דלקתיים (Cyt), כדי לחקות רטינופתיה סוכרתית (DR). חרוזים מגנטיים Luminex שימש למדידת ציטוקינים הקשורים DR שוחרר לתוך המדיום התרבותי.

כתמי H&E חשפו לאמלי רשתית ברורה וגרפיעים קומפקטיים בגרשי רשתית עם RPE-choroid ו sclera הבסיסיים, בעוד רשתיות ללא המבנים הבסיסיים הציגו עובי מופחת ואובדן גרעינים חמור. תוצאות IHC הצביעו על היעדר אפופטוזיס ודלקת ברשתית, כמו גם על שלמות תאי מולר שנשמרה. בדיקות Luminex הראו הפרשה מוגברת באופן משמעותי של ציטוקינים פרו דלקתיים הקשורים DR ב explants ברשתית שנחשפו HG + Cyt ביחס לרמות הבסיס ב 24 שעות.

פיתחנו ואיפיינו בהצלחה פרוטוקול HORC חדשני שבו שלמות הרשתית נשמרה ללא אפופטוזיס או דלקת ברשתית. יתר על כן, הפרשה המושרה של סמנים ביולוגיים פרו דלקתיים הקשורים DR בעת חשיפת explants רשתית HG + Cyt מציע כי מודל זה יכול לשמש למחקרי מחלות רשתית לתרגום קליני.

Introduction

הרשתית היא מבנה עיני מיוחד מאוד האחראי על הפיכת אנרגיית אור נכנסת לאותות חשמליים, אשר מעובדים לאחר מכן על ידי המוח לתפיסה חזותית. הרשתית האנושית מכילה מגוון דינמי של סוגי תאים, מאורגן מאוד במבנה lamellar ייחודי המורכב משתישכבות סינפטיות ושלוש גרעינים 1 (איור 1). הומאוסטזיס ברשתית מתקיים על ידי הקשרים המורכבים בין תאים עצביים, כלי דם, עצבים, רקמות חיבור ו RPE1. בשל האנטומיה והפיזיולוגיה המתוחכמות של הרשתית, מנגנונים של מחלות רשתית רבות עדיין נשארים מובנים היטב2,3,4,5. כדי לחקור טוב יותר מחלות רשתית, מודלים HORC פותחו6,7,8,9. בהשוואה למחקרים בבעלי חיים ותרבויות במבחנה, מודלים HORC הם יתרון כי הם שומרים על הסביבה התאית הדינמית ואינטראקציות נוירווסקולריות מורכבות במקום, מתן מודל טוב לתרגום קליני.

Figure 1
איור 1: מבנים עיניים אחוריים של העין האנושית. שכבות הרשתית הקדמיות הקדמיות הן: שכבת סיבי עצב (NFL), שכבת תא גנגליון (GCL), שכבת plexiform פנימית (IPL), שכבה גרעינית פנימית (INL), שכבת plexiform חיצונית (OPL), שכבה גרעינית חיצונית (ONL), קטע פנימי של קולטן פוטו (IS) ושכבה חיצונית פוטורצפטור (OS). תאים בתוך הרשתית כוללים תאי גנגליון (כחול), תאי אמקרין (צהוב), תאים דו קוטביים (אדום), תאים אופקיים (סגול), קולטני מוט (ורוד) ופוטרצפטורים חרוט (ירוק). הזגית ממוקמת כמטרית לרשית. RPE, הממברנה של ברוך, choroid ו sclera ממוקמים אחוריים הרשתית. שים לב שהתמונה המוצגת היא רק ייצוג סכמטי של הרשתית והיחס בין התאים/קישוריות הרשתית בתוך כל שכבה עשוי שלא להעיד על ההגדרה in vivo. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

בעבר אפיינו פרוטוקולי HORC6,7,8,9 מעורבים בהפרדת הרשתית מן RPE-choroid הבסיסי ו sclera באמצעות טרפין כירורגי. עם זאת, ללא התמיכה שמספקים מבנים בסיסיים אלה, הרשתית השקוף הופכת דקיקה, קשה לטיפול וכלים כגון מלקחיים יכולים בקלות לשבש את שלמותה. יתר על כן, בידוד רשתית בתרבות ללא RPE הוכח לגרום אפופטוזיס תא גנגליון ניוון פוטורצפטור10,11,12. לכן, פרוטוקול HORC חלופי שממזער את אובדן שלמות הרשתית ומחקה טוב יותר את סביבת in vivo יהיה שימושי. זה חשוב במיוחד כאשר לומדים מנגנוני מחלת הרשתית, כמו פגיעה גופנית במהלך טיפול explant יכול להציג חפצים. לכן, מטרת המחקר הזה הייתה לפתח מודל HORC חדשני הכולל את RPE-choroid ו sclera על מנת להגן על שלמות הרשתית במהלך טיפול explant ותרבות.

על מנת להשיג מטרה זו, explants רשתית "סנדוויץ'" בין הזגוזית שיורית ואת הבסיסי RPE-choroid ו sclera חולצו. בגולשי הכריך, הזגוכית מכבידה על הרשתית כדי למנוע ניתוק רשתית וקיפול, ואילו הסקלרה הקשוחה והסיבית משמשת גם כפיגומים לתמיכה מבנית וגם כנקודת מגע למלקחיים. יתר על כן, מודלים בעלי חיים הראו כי שמירה על RPE בתרבות יכול למנוע ניוון רשתית והתפשטות גליה, תגובה של תאי מולר לאותות סכנה כגון היפוקסיה ודלקת10,11,12.

כדי לאפיין את המודל, בוצעו explants רשתית כריך עם תיוג קצה ניק dematoxylin ו- Eosin (H&E) כדי להעריך מבנים אנטומיים וחיסון חיסוני (IHC), תיוג explants עם מסוף deoxynucleotidyl transferase dUTP ניק סוף תיוג (TUNEL, סמן תא אפופוטוטי), חלבון חומצי סיביה (GFAP, דלקת רשתית וסמן הפעלת תא מולר), ו vimentin, סמן של שלמות התא מולר. כדי לקבוע אם מודל זה יכול להיות מושרה לפתח סימני מחלה מולקולרית, explants נחשפו גלוקוז גבוה (HG) עם ציטוקינים פרו דלקתיים (Cyt), אינטרלוקין-1β (IL-1β) וגורם נמק הגידול α (TNF-α), סביבת פולחן שהוכח לחקות רטינופתיה סוכרתית (DR) במודלים של מחלות תאים ובעלי חיים13,14,15. מבדקי Luminex שימשו במודל DR למדידת ציטוקינים ששוחררו למדיום התרבותי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כוסות עיניים של תורמים אנושיים התקבלו מבנק העיניים הלאומי של ניו זילנד לאחר כריתת קרנית להשתלה וכפי שאושר על ידי ועדת האתיקה לבריאות ונכות צפון B (NTX/06/19/CPD/AM07).

הערה: התרבות צריכה להיעשות בארון בטיחות ביולוגית Class II כדי להבטיח תנאי תרבית רקמות סטריליים. הרקמות חייבות להיות בתרבית בתוך 24 שעות לאחר המוות כדי למנוע אובדן שלמות רשתית משמעותי.

Figure 2
איור 2: תמונות המציגות את הליך איסוף רשתית הכריכים. להכנת explant, השתמש במספריים לנתח עם קצה חד אחד וקצה קהה אחד, עם הקצה הקהה מול החלק הפנימי של כדור הארץ כדי להפחית את הנזק לרקמות במהלך החתירה. גם להשתמש במלקחיים עם קצוות קהים כדי למנוע גירוד הרקמות התוך עיניות במהלך הטיפול. באמצעות מספריים כירורגיים, עם הקצה הקהה פונה פנימה, לחתוך לאורך הלימבוס כדי להסיר את הקשתית ואת העדשה (A-C). ניתן לאתר את ה- ONH אם מסתכלים ישר לתוך העין הפתוחה(D). באמצעות מלקחיים עם קצות קהים, להחזיק את הסקלרה כדי לייצב את כדור הארץ (E). חלק את כדור הארץ אנכית לשני חצאים על ידי ביצוע שני חתכים עמוקים לכיוון ONH אבל לא לחתוך דרך ONH. חזור על זה לאורך מרידיאן האופקי (G). החל מלקחיים קהים על הסקלרה ופתח בעדינות את כדור הארץ לצורת תלתן (H-K). השתמש במלקחיים כדי לתפעל בזהירות את הזגג כדי להחליק את הרשתית המקופלת, כמו הזגג מושך על הרשתית, אבל לא לגעת הרשתית ישירות(אני). הסר את הזגג אם הוא גורם לניתוק רשתית או קיפול (לא מוצג באיור 2 מכיוון שהמצח זג זג;לא נלכד היטב בתמונות). אתר אזורים שבהם הרשתית שטוחה ולחלץ explants רשתית באמצעות טרפין כירורגי (L). החלת מלקחיים על sclera, בזהירות להעביר את explants הרשתית לתוך מדיום התרבות מוכן מראש (M,N). כל מסלק הכריך צריך לשקוע לתחתית הבאר בשל משקלו, ולכן כל explant שקוע במדיום(O). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

1. מיצוי של סנדוויץ ' רשתית explants מן העין

  1. הסר את הקשתית והעדשה.
    1. מניחים את העין בתוך צלחת פטרי, עם הקשתית והעדשה הפונה כלפי מעלה וראש עצב הראייה (ONH) יוצר קשר עם צלחת הפטרי(איור 2A).
    2. החזק את העין יציבה בלימבוס באמצעות מלקחיים(איור 2B).
    3. נתק את הקשתית והעדשה על-ידי ביצוע חתכים קטנים בהיקף לאורך הקצה החיצוני של הלימבוס(איור 2A).
    4. הסר את הקשתית ואת העדשה בזהירות. הימנעו מלהפריע ל רשתית במהלך מניפולציה (איור 2C).
      הערה: העדשה לא תיפול לתוך העין כפי שהוא מחובר, באמצעות סיבי zonule, לגוף ciliary.
  2. תשטח את העין.
    1. עם העין עדיין יושב זקוף, לזהות את ONH. זה קל יותר עם מקור אור לבן בהיר(איור 2D).
    2. יש להסית בארבעת הרביעים לכיוון ה-ONH (איור 2E). ניתן לסובב את צלחת הפטרי לטיפול קל יותר. אל תחתוך את ה- ONH.
    3. מורחים ומשטחים את העין בזהירות(איור 2E).
    4. החל את המלקחיים על sclera במקום הרשתית כדי למנוע שיבוש שלמות הרשתית.
      הערה: ניתוק רשתית היקפית וקיפול הוא בלתי נמנע, כמו המשקל של הזגזלת עולה על גדותיו ימשוך על הרשתית. באזורים אלה, להסיר את הזע על הגחלת כדי למנוע קיפול רשתית נוסף. זכור להשאיר זג זג כדי לייצב את הרשתית על גבי RPE-choroid ו sclera.
  3. לאסוף explants רשתית כריך.
    1. הניחו טרפין כירורגי על הרשתית באזור ללא קפלי רשתית(איור 2F).
    2. לחץ חזק כדי לחדור את sclera, אשר אמור ליצור צליל פיצוח.
    3. סובבו את הטרפין ב-180° כדי להבטיח שהסקלרה תיחדר במלואה, כך שזרוע הרשתית יופרד כעת מהרקמה הנותרת.
    4. החל את המלקחיים בסקלרה והעביר את רשתית הכריך למדיום התרבותי(איור 2G-I).
    5. להשיג 2-3 סנדוויץ 'explal explants מהרשתית ההיקפית של כל רבע.
      הערה: לעתים ניתן ללכוד את מגרש רשתית הכריכים בפתיחת הטרפין. בעזרת מלקחיים, מתגרה בעדינות בחלק קטן מבסיס הסקלרה. מצב זה מתרחש לעתים קרובות יותר כאשר הלהב קהה ועלולה לגרום לאובדן הרשתית(איור 3A-C).
    6. השתמש בטרפין חדש לאחר חיתוך 1-2 explants רשתית כמו הלהב הופך בוטה בקלות (איור 3CFigure 3
      איור 3: פתרון בעיות. במהלך תהליך החילוץ, המסלק ברשתית עשוי להיות לכוד בפתיחת הטרפין הכירורגי (A). להקניט בעדינות את הרקמה מבסיס הסקלרה מבלי לגעת ברשתית (B). זה יכול לקרות לעתים קרובות יותר אם טרפין כירורגי משמש לחילוץ יותר משני explants רשתית, כמו הלהב יכול בקלות להיות בוטה (C). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
  4. תרבות, מגרשי הרשתית.
    1. הכן את המדיום התרבותי המכיל את תערובת החומרים המזינים הבינוניים של Dulbecco F-12 (DMEM-F12) ותערובת אנטיביוטיקה ואנטי-מיקוטיקה פי 1 (AA, מלאי 100x).
    2. לפני מיצוי explant, למקם 500 μL של בינוני בבארות של צלחת 24-well וישקול באינקובטור. זה חשוב כמו הוספת המדיום לאחר מכן יכול להפיץ את הרשתית.
    3. תרבות רשתית הכריך explants ב 37 °C (72 שעות) בחממה 5% CO2 לח בינוני מוכן בשלב 1.4.2.
    4. כדי לגרום לשינויים דמויי DR, רשתית תרבות explants בינוני המכיל DMEM-F12 עם שילוב של 32.5 מ"מ HG עם Cyt, TNF-α (10 ng/ mL) ו IL-1β (10 ננוגרם / מ"ל).

2. הטמעת פרפין של תוחמי רשתית הכריך

  1. תקן את מגרשי רשתית הכריכים.
    1. לטבול את explants רשתית כריך ב 10% פורמלין לפחות 24 שעות.
    2. מוציאים את תמיסת הפורמלין ומעבירים בעדינות את רשתית הכריך לרפידות רקמות וקלטות.
    3. משרים את רשתית הכריך ב-70% אתנול לפחות 24 שעות.
    4. מסלקי רשתית הטמעת פרפין לתוך בלוקים.
    5. חותכים רקמות רשתית מוטבעות פרפין לחלקים בעובי 5 מיקרומטר באמצעות מיקרוטום ומורכבים על מגלשות זכוכית. יש לאחסן בטמפרטורת החדר עד להדמיה.
  2. תפענח מקטעים.
    1. לטבול את החלקים ב 70% קסילן במשך 5 דקות.
    2. לטבול את המקטעים ב 100% קסילן במשך 5 דקות.
    3. Rehydrate את החלקים ב 70% אתנול במשך 5 דקות.
    4. Rehydrate את החלקים ב 100% אתנול במשך 5 דקות.
    5. לשטוף את החלקים תחת מי ברז זורמים במשך 10 דקות.

3. אפיון באמצעות H&E, IHC ובוחן לומינקס מגנטי

  1. פרוטוקול הכתמת H&E
    1. להפוך את המקטעים לפיגומים באמצעות שלב 2.2.
    2. לחות את החלקים במי ברז במשך 5 דקות.
    3. כתים את החלקים בפתרון המטוקסילין 2 של גיל במשך 5 דקות.
    4. לשטוף את החלקים ביסודיות תחת מי ברז זורמים כדי להסיר כתם עודף.
    5. להבדיל על ידי טבילת החלקים פעמיים ב 1% אלכוהול חומצה.
    6. לשטוף את החלקים במהירות תחת מי ברז זורמים.
    7. מכתים את החלקים בכחול על ידי טבילה שש פעמים ב-1% ליתיום קרבונט (10 מ"ג/מ"ל).
    8. לשטוף את החלקים ביסודיות תחת מי ברז זורמים במשך 5 דקות כדי להסיר כתם כחול עודף.
    9. טובלים את המקטעים ב-1% אאוזין 10 פעמים.
    10. לשטוף את החלקים במהירות תחת מי ברז כדי להסיר כתם עודף.
    11. לייבש את החלקים על ידי טבילת אותם 10 פעמים ב 100% אתנול. תעשה את זה פעמיים.
    12. טובלים את החלקים ב-70% קסילן 10 פעמים.
    13. טובלים את המקטעים ב-100% קסילן 10 פעמים.
    14. הר עם כיסוי באמצעות דיבוטילפתלט פוליסטירן קסילן (DPX) הרכבה בינונית.
    15. צמו תמונות באמצעות מיקרוסקופ אור.
  2. פרוטוקול תיוג IHC'
    1. להפוך את המקטעים לפיגומים באמצעות שלב 2.2.
    2. מניחים את השקופיות לתוך פתרון המכיל 10 mM נתרן סיטראט חוצץ עם 0.05% Tween 20 ב pH 6.0 ולהפעיל אחזור אנטיגן בסיר לחץ אוטומטי ב 121 °C (2 דקות).
    3. לשטוף חלקים מלוחים חוצץ פוספט (PBS) במשך 5 דקות. תעשה את זה 3 פעמים.
    4. חסמו את המקטעים עם PBS המכיל 0.1% טריטון X-100 ו 10% סרום עזים רגיל במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
    5. מקטעי דגירה בלילה ב 4 °C (55 °F) עם נוגדנים ראשוניים מצומדים נוגדנים משניים (טבלה של חומרים).
    6. לשטוף קטעים PBS במשך 5 דקות. תעשה את זה 3 פעמים.
    7. גרעיני כתמים באמצעות 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) למשך 2 דקות.
    8. יש לשטוף ולהרכיב מקטעים באמצעות ריאגנט נגד עמעום.
    9. חותם מכסה עם לק.
    10. צלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי.
  3. מאמץ מגנטי של לומינקס
    1. העבר 75 μL של מדיה מכל באר ללוח 96-טוב u-התחתון ב 24 ו 72 שעות.
    2. נתחו את חומר-העל של התא עבור IL-18, IL-6, IL-8 ומקדם גדילה אנדותל וסקולרי (VEGF) לאחר 24 ו-72 שעות באמצעות לבדיקת ציטוקינים של Luminex. בצע את הוראות היצרן כדי לבצע את ה- assay16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שלמות הרשתית נשמרה במודל HORC זה. שלמות הרשתית נשמרה ברשתית הכריכים התרבותית אך אבדה ברשתית בתרבית ללא מבנים סמוכים. H&E נערך כדי לבחון את השלמות המבנית של explants רשתית כריך חתך לאחר 72 שעות בתרבות. מגרשי רשתית הכריכים הראו שלמות משומרת ומבנה lamellae מובחן מ- GCL ל- ONL עם גרעינים קומפקטיים ב- INL ו- ONL (איור 4A). עם זאת, שלמות הרשתית משובשת נמצאה בשולי אותה דגימה, שם הרשתית התנתקה מה- RPE-choroid והסקלרה הבסיסיים, והראתה עובי רשתית מופחת ואובדן גרעין ב- INL וב- ONL (איור 4B).

Figure 4
איור 4: תמונות H&E של explants רשתית בתרבית בינונית במשך 72 שעות. A) שלמות מבנית נשמרת באזורים המחוברים ל- RPE-choroid ו- sclera הבסיסיים, המתוארים על ידי ההפרדה המובהקת של כל שכבה ברשתית מ- GCL ל- ONL וגרפיעים קומפקטיים ב- INL ו- ONL. B) אובדן חמור בשלמות הרשתית באזורים מנותקים RPE-choroid ו sclera, מוצג על ידי הפחתת עובי הרשתית הכוללת וירידה במספרים של גרעינים INL ו ONL. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

אפיון של explants רשתית באמצעות IHC הפגין שלמות רשתית השתמר היטב גם לאחר 72 שעות בתרבות. לא נמצאו גרעיני תאים חיוביים TUNEL, המסמנים אפופטוזיס, ב explants ברשתית מתורבתים בתנאים בסיסיים, מדגימים כדאיות תאים מתמשכת גם לאחר 72 שעות(איור 5A-C). ביטוי GFAP נשאר מקומי ב- GCL ו- IPL, כפי שניתן לראות ברקמות רשתית רגילות17,18. לא היה פיברוזיס גליה, סימן של הפעלת תא מולר והתפשטות בתגובה דלקת רשתית, אשר אחרת היה מזוהה כביטוי GFAP upregulated המשתרע לתוך ONL10,11,12(איור 5D-F). תיוג Vimentin (אדום) התבטא מאוד מ- GCL ל- ONL, והראה שלמות תאי מולר שמורה, כפי שניתן לראות ברקמות רשתית רגילות (איור 5G-I).

Figure 5
איור 5: תמונות IHC של מגרשי רשתית לאחר פולחן בתקשורת בזאלית במשך 72 שעות. היעדר כתמים חיוביים TUNEL (ירוק) עולה כי לא אפופטוזיס הסלולר התרחש בשכבות הרשתית מ- GCL ל- ONL (A-C). תיוג GFAP (אדום) הוגבל ל- GCL ו- IPL ללא פיברוזיס גליה, אשר יזוהה כביטוי מורחב של GFAP לתוך ONL (D-F). Vimentin (אדום) התבטא מאוד מ- GCL ל- ONL, איתור תאי מולר המשתרעים דרך שכבות רשתית אלה (G-I). גרעיני תאים היו מוכתמים ב- DAPI (כחול). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

מודל DR פותח על ידי פולחן סנדוויץ ' רשתות explal HG ו Cyt. HG ו-Cyt, IL-1β ו-TNF-α, הגבירו את הפרשת IL-18, VEGF, IL-6 ו-IL-8 ביחס לרמות הבסיס. נעשה שימוש בבדיקת לומינקס למדידת הציטוקינים IL-18, VEGF, IL-6 ו-IL-8 שהופרשו על ידי מגרשי רשתית לאחר 24 ו-72 שעות בתנאי HG + Cyt(איור 6). כדי למזער את ההבדלים בין התורמים, רמות הציטוקינים המופרשות הושוו לקו הבסיס (המצוין על ידי הקו האדום המקווקו), המיוצג על ידי רמות ציטוקינים המופרשות על ידי explants הכריך מאותו תורם אך מתורבתים במדיום בזאלי (מוכן בשלב 1.4.1). לאחר 24 שעות, רמות IL-18, VEGF, IL-6 ו-IL-8 עלו משמעותית ביחס לקו הבסיס. לאחר 72 שעות, רק רמות IL-18 ו-VEGF נותרו גבוהות משמעותית, בעוד שלא נמצא הבדל משמעותי ברמות IL-6 ו-IL-8 בהשוואה לקו הבסיס.

Figure 6
איור 6: ציטוקינים משחררים את רשתית הכריכים ב-HG וב-Cyt, IL-1β ו-TNF-α, אחרי 24 ו-72 שעות. רמות IL-18, VEGF, IL-6 ו-IL-8 המופרשות עלו משמעותית מעל קו הבסיס לאחר 24 שעות (עמ' < 0.05). לאחר 72 שעות, רמות IL-18 ו-VEGF נותרו גבוהות משמעותית (עמ' < 0.05), אך לא נמצא הבדל משמעותי ברמות IL-6 ו-IL-8, בהשוואה לקו הבסיס. הקו האדום המקווקו מציין את רמת הבסיס, המייצגת רמות ציטוקינים המופרשות על ידי המסלקים מאותו תורם אך מתורבתות במדיום רגיל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

HORC הוא כיום המודל הניתן לתרגום קליני ביותר במחקר רשתית פרה-קלינית. בהשוואה למודלים של תרבית תאי הפריה, HORC יכול לייצג טוב יותר את האנטומיה של הרשתית האנושית במקום, באמצעות שמירה על סוגי תאי הרשתית הדינמיים והקשרים שלהם עם נוירונים, כלי דם והסביבה החוץ תאית19. בהשוואה למודלים של בעלי חיים, HORC הם יתרון גדול יותר בחקר הפתופיזיולוגיה של ועיצוב טיפולים תרופתיים למחלות רשתית אנושית בשל וריאציות בין מינים, כגון סוגי תאים ברשתית שונים, כמו גם צפיפות פוטורצפטור שונים ופרופורציות, אשר יכול לתרום לניסויים קליניים לא מוצלחים למרות תוצאות חיוביות במודלים בעלי חיים19. עם זאת, בפרוטוקולים קודמים HORC, הרשתית הייתה מנותקת בכוונה מן RPE-choroid ו sclera. ללא הסקלרה הקשוחה, הרשתית הדקיקה קשה להתמודד עם שלמות הרשתית יכולה להיפגע אם מטופל ישירות על ידי מלקחיים6,7,8,9. עדות לכך היא העובדה שמחקרים קודמים באמצעות רשתיות מבודדות דיווחו על הפעלה מוגברת של תאי מולר ועל גרעינים חיוביים של TUNEL ב-72 שעות של תרבות. זאת בניגוד לממצאים שלנו, מה שמצביע על כך ששיטת הכריך שומרת טוב יותר על שלמות הרשתית. שנית, ניוון עצבי מוגבר והתפשטות גליה נמצאו במודלים של ORC בעלי חיים ב- RPE, בהשוואה לרשת עם RPE10,11,12.

כדי למזער את הסיכויים להתפשר על שלמות הרשתית, נעשה שימוש ברשתית סנדוויץ' בפרוטוקול HORC החדש הזה. בניגוד לפרוטוקולים קודמים של HORC, הטרפין חתך לא רק את הרשתית, אלא גם את זחת RPE ואת הסקלרה, כך שההפקה הנובעת מכך "נדחקת" ומיוצבת בין הזגג השיורי למבנים הבסיסיים. הזגוגית השיורית מכבידה על הרשתית כדי למנוע קיפול וניתוק מהמבנים הבסיסיים, בעוד הסקלרה משמשת כפיגומים כדי לתמוך בארכיטקטורת הרשתית כדי להגן על הרשתית מפני פגיעה הנגרמת על ידי מלקחיים. יתר על כן, רשתית פולחנית עם RPE יכולה למנוע ניוון רשתית והתפשטות גליה בתרבות10,11,12.

זכור את הנקודות הבאות בעת חילוץ explants רשתית כריך. בעת חיתוך לאורך הלימבוס, העדשה תכביד על הקשתית אך לא תיפול בתוך העין כפי שהיא מחוברת, באמצעות סיבי זונול, לגוף הציפורן. החל את המלקחיים על הסקלרה ולהימנע מלגעת ברשתית כדי למנוע שיבוש שלמות הרשתית. ממלאים את בארות הפולחן במדיום לפני שמניחים את רשתית הגירוש בתוך הבארות. הוספת המדיום לאחר הצבת explants הרשתית בתוך הבארות מגביר את הסיכון של פירוק הרשתית מן RPE-choroid ו sclera או להפוך את כל explant הפוך. בעת ביצוע חתכים עמוקים בארבעת הרבעים, שים לב שהרשתית ההיקפית עלולה להתנתק עקב הזגג הדולפת מכוס העין. כדי למנוע ניתוק או קיפול של הרשתית, להסיר את הזכוך באזור כי הוא מושך על הרשתית. למרות הנקודה הקודמת מייעצת להסיר את הזגג מושך על הרשתית, להשאיר מספיק זגג שיורית לשקול את הרשתית על גבי RPE-choroid ו sclera על מנת להגביר את היציבות של explants רשתית כריך. כאשר חותכים דרך הסקלרה הקשוחה והסיבית, הטרפין יכול בקלות להיות בוטה. כתוצאה מכך, ייתכן שיידרש כוח מופרז או שהסקלרה לא תחדור במלואה. השתמש טרפין חדש עבור כל 1-2 explants רשתית שחולצו כדי למנוע חדירה חלקית דרך sclera. ניסיון בטיפול זהיר הוא חיוני כדי להגן על הרשתית; לכן, אימון עם עיני חזיר, הדומות בגודלם ובמבנהן לעין האנושית, מומלץ לפני השימוש במחשופי הסקלרל המוגבלים הזמינים.

שלמות הרשתית נשמרה ב explants שנדחפו בין זג זלעפת שיורית לבין RPE-choroid וסקלרה הבסיסיים. כתמי H&E הראו שלמות מבנית טובה יותר כאשר explant רשתית תרבותית היה מחובר RPE-choroid ו sclera, לעומת culturing הרשתית לבד. תמיכה בממצא זה, היעדר גרעיני תאים חיוביים TUNEL הציע היעדר אפופטוזיס בתוך כל שכבות הרשתית, הדגמת הכדאיות התאית השתמרה גם לאחר 72 שעות. יתר על כן, תיוג vimentin אישר שלמות תא מולר ואת הביטוי GFAP מוגבל ב- GCL ו INL, נמצא רשתית רגילה, שוב אימת את חוסר אותות דלקתיים או מתח ברשתית.

מודל HORC המאופיין במחקר זה הביא למבנה רשתית שמור ושלמות תאי מולר תוך מניעת דלקת רשתית ואפופטוזיס תאי. יתר על כן, זה יכול לשמש מודל מחלות רשתית, אשר שימושי במיוחד כדי לזהות מסלולי מחלות ומנגנונים פרמצבטיים. מחקרים קודמים בבעלי חיים ובמכינה הראו כי דלקת DR יכולה להיגרם כאשר רשתית בעלי חיים או תאים נחשפים HG ו Cyt13,14,15. במחקר HORC זה, על ידי החלת HG ו- Cyt על explants כריך עבור 24 שעות בתרבות, הפרשת IL-18, VEGF, IL-6 ו- IL-8 היה גבוה באופן משמעותי מעל הבסיס. ציטוקינים אלה ידועים להגדיל את הזגוגית ואת הסרום של חולים עם DR לעומת בקרות שאינן סוכרתיות, אימות כי מודל DR זה מתורגם קלינית20,21,22,23,24,25. למרות מחקר זה איפיין רק DR באמצעות בדיקת Luminex מגנטי, טכניקות אחרות כגון סופג מערבי, IHC ותגובת שרשרת פילמרית (PCR) יכול להתבצע גם26.

למרות היתרונות הברורים שתוארו לעיל, מודל HORC רומן זה יש גם כמה מגבלות. מגבלה מרכזית של פרוטוקול זה היא האספקה הנמוכה של רקמות. כוסות עיניים תורם, אשר יש את כל מבני העין אבל הקרנית בדרך כלל הוסרה להשתלה, זמינים לעתים רחוקות למחקר בשל הביקוש הגדול sclera בהליכים כירורגיים כגון דלפי גלאוקומה, שתלים מסלולית, תיקון נזק ניתוק הרשתית וכיסוי של תפרים חשופים. על מנת למזער מגבלה זו, אנו מציעים שכל קבוצות הניסוי ייאספו מאותו תורם. זה מסיר את הצורך להסביר בין-תורם-variabilities, כגון גיל, משך המחלה, רמות ציטוקינים בסיסי, וגורמים אחרים שיכולים לתרום משתנים מבלבלים אם להשוות בין חולים שונים. כמו כן, רוב רקמות התורמים הן מקשישים מכיוון שקשה יותר להשיג דגימות מקבוצות גיל צעירות יותר, וגם כאשר הן זמינות, סיבת המוות של תורמים צעירים היא לעתים קרובות טראומטית בטבע המובילה לרקמות פגומות שאינן מתאימות לתרבות. עם זאת, בהתחשב בכך שרוב מחלות הרשתית הכרוניות מתרחשות בחולים בגיל מבוגר, מודל זה עדיין שומר על תועלת בחקר מחלות רשתית כרוניות הקשורות לגיל כגון DR וניוון מקולרי הקשור לגיל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

המחברים רוצים להודות לתורמים הנדיבים של רקמות עיניים ולצוות מבנק העיניים הלאומי של ניו זילנד על תמיכתם. עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי מענקי פרויקטים מקרן מוריס ופיליס פיקל וקרן המחקר הרפואי של אוקלנד (1117015). הדירקטוריון של IDR נתמך על ידי קרן הצדקה ביוקנן. המלגה של CK ניתנת על ידי האגודה הניו זילנדית לחינוך ומחקר של האופטומטריסטים (CC36812) והמלגה של HHL ניתנת על ידי קרן הצדקה ביוקנן.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Disposable Biopsy Punches (5 mm) Integra York PA Inc., USA 21909-142 Referred as surgical trephines
in this article
Human Recombinant IL-1β Peprotech, USA 200-01B Working concentration: 10 ng/mL
Human Recombinant  TNF-a Peprotech, USA 300-01A Working concentration: 10 ng/mL
DAPI (1 µg/mL) Sigma Aldrich, Germany #D9542 Nuclear stain. Working dilution 1:1000
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement Gibco, Thermofisher, Scientific Inc., USA 10565018 Dulbecco’s Modified Eagle Medium nutrient mixture F-12 containing a 1× antibiotics and antimycotics mixture (AA, 100× stock)
Fine Scissors - Sharp-Blunt Fine Science Tools (F.S.T) 14028-10 Tips: Sharp-Blunt, Cutting Edge: 27mm, Length: 10cm, Alloy/Material: Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight
Graefe Forceps Fine Science Tools (F.S.T) 11050-10 Length:10cm, Tip shape: Straight, Tips: Serrated, Tip Width: 0.8mm, Tip Dimensions:0.8 x 0.7mm, Alloy/Materials: Stainless Steel
Mouse monoclonal GFAP-Cy3 Sigma Aldrich, Germany #C9205 Primary antibody conjugated to Cy3. Working dilution 1:1000.
Mouse monoclonal Vimentin-Cy3 Sigma Aldrich, Germany #C9080 Primary antibody conjugated to Cy3. Working dilution 1:50.
Rabbit polyclonal TUNEL (In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein) Sigma Aldrich, Germany #11684795910 Primary antibody conjugated to Fluorescein-dUTP. Working dilution 1:10 with enzyme-buffer solution.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kolb, H., Fernandez, E., Nelson, R. Facts and Figures Concerning the Human Retina. Webvision-The Organization of the Retina and Visual System. , Internet (2005).
  2. Gemenetzi, M., De Salvo, G., Lotery, A. Central serous chorioretinopathy: an update on pathogenesis and treatment. Eye. 24 (12), 1743-1756 (2010).
  3. Buschini, E., Piras, A., Nuzzi, R., Vercelli, A. Age related macular degeneration and drusen: neuroinflammation in the retina. Progress in Neurobiology. 95 (1), 14-25 (2011).
  4. Chen, S. -Y., et al. Current concepts regarding developmental mechanisms in diabetic retinopathy in Taiwan. Biomedicine. 6 (2), (2016).
  5. Kaaja, R., Loukovaara, S. Progression of retinopathy in type 1 diabetic women during pregnancy. Current Diabetes Reviews. 3 (2), 85-93 (2007).
  6. Azizzadeh Pormehr, L., et al. Human organotypic retinal flat-mount culture (HORFC) as a model for retinitis pigmentosa11. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (8), 6775-6783 (2018).
  7. Fernandez-Bueno, I., et al. Time course modifications in organotypic culture of human neuroretina. Experimental Eye Research. 104, 26-38 (2012).
  8. Niyadurupola, N., Sidaway, P., Osborne, A., Broadway, D. C., Sanderson, J. The development of human organotypic retinal cultures (HORCs) to study retinal neurodegeneration. British Journal of Ophthalmology. 95 (5), 720-726 (2011).
  9. Osborne, A., Hopes, M., Wright, P., Broadway, D. C., Sanderson, J. Human organotypic retinal cultures (HORCs) as a chronic experimental model for investigation of retinal ganglion cell degeneration. Experimental Eye Research. 143, 28-38 (2016).
  10. Caffe, A., Visser, H., Jansen, H., Sanyal, S. Histotypic differentiation of neonatal mouse retina in organ culture. Current Eye Research. 8 (10), 1083-1092 (1989).
  11. Kaempf, S., Walter, P., Salz, A. K., Thumann, G. Novel organotypic culture model of adult mammalian neurosensory retina in co-culture with retinal pigment epithelium. Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 47-58 (2008).
  12. Liu, L., Cheng, S. -H., Jiang, L. -Z., Hansmann, G., Layer, P. G. The pigmented epithelium sustains cell growth and tissue differentiation of chicken retinal explants in vitro. Experimental Eye Research. 46 (5), 801-812 (1988).
  13. Kuo, C., Green, C. R., Rupenthal, I. D., Mugisho, O. O. Connexin43 hemichannel block protects against retinal pigment epithelial cell barrier breakdown. Acta Diabetologica. 57 (1), 13-22 (2020).
  14. Mugisho, O. O., et al. The inflammasome pathway is amplified and perpetuated in an autocrine manner through connexin43 hemichannel mediated ATP release. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. 1862 (3), 385-393 (2018).
  15. Mugisho, O. O., et al. Intravitreal pro-inflammatory cytokines in non-obese diabetic mice: Modelling signs of diabetic retinopathy. PLoS ONE. 13 (8), 0202156 (2018).
  16. R&D Systems, I. , Available from: https://www.rndsystems.com/protocol-types/luminex (2020).
  17. Nakazawa, T., et al. Attenuated glial reactions and photoreceptor degeneration after retinal detachment in mice deficient in glial fibrillary acidic protein and vimentin. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 48 (6), 2760-2768 (2007).
  18. Okada, M., Matsumura, M., Ogino, N., Honda, Y. Müller cells in detached human retina express glial fibrillary acidic protein and vimentin. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 228 (5), 467-474 (1990).
  19. Murali, A., Ramlogan-Steel, C. A., Andrzejewski, S., Steel, J. C., Layton, C. J. Retinal explant culture: A platform to investigate human neuro-retina. Clinical & Experimental Ophthalmology. 47 (2), 274-285 (2019).
  20. Koleva-Georgieva, D. N., Sivkova, N. P., Terzieva, D. Serum inflammatory cytokines IL-1beta, IL-6, TNF-alpha and VEGF have influence on the development of diabetic retinopathy. Folia Medica (Plovdiv). 53 (2), 44-50 (2011).
  21. Lee, J. -H., et al. Cytokine profile of peripheral blood in type 2 diabetes mellitus patients with diabetic retinopathy. Annals of Clinical & Laboratory Science. 38 (4), 361-367 (2008).
  22. Chorostowska-Wynimko, J., et al. In vitro angiomodulatory activity of sera from type 2 diabetic patients with background retinopathy. Journal of Physiology and Pharmacology: An Official Journal of the Polish Physiological Society. 56, 65-70 (2005).
  23. Khalifa, R. A., Khalef, N., Moemen, L. A., Labib, H. M. The role interleukin 12 (IL-12), interferon-inducible protein 10 (IP-10) and Interleukin 18 (IL-18) in the angiogenic activity of diabetic retinopathy. Research Journal of Medicine and Medical Sciences. 4, 510-514 (2009).
  24. Zhou, J., Wang, S., Xia, X. Role of intravitreal inflammatory cytokines and angiogenic factors in proliferative diabetic retinopathy. Current Eye Research. 37 (5), 416-420 (2012).
  25. Song, Z., et al. Increased intravitreous interleukin-18 correlated to vascular endothelial growth factor in patients with active proliferative diabetic retinopathy. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 252 (8), 1229-1234 (2014).
  26. Louie, H. H., Shome, A., Kuo, C. Y. J., Rupenthal, I. D., Green, C. R., Mugisho, O. O. Connexin43 hemichannel block inhibits NLRP3 inflammasome activation in a human retinal explant model of diabetic retinopathy. Experimental Eye Research. , (2020).

Tags

רפואה גיליון 172 אדם רשתית אורגנוטיפיק תרבות פיתוח מודל מודל מחלות
אפיון טכניקה חדשנית של תרבות רשתית אורגניוטיפית אנושית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kuo, C. Y. J., Louie, H. H.,… More

Kuo, C. Y. J., Louie, H. H., Rupenthal, I. D., Mugisho, O. O. Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique. J. Vis. Exp. (172), e62046, doi:10.3791/62046 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter