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Medicine

Caracterización de una nueva técnica de cultivo de retina organotípica humana

Published: June 9, 2021 doi: 10.3791/62046
Automatic Translation
*1, 1, 1, *1
1Buchanan Ocular Therapeutics Unit, Department of Ophthalmology and the New Zealand National Eye Centre, University of Auckland
* These authors contributed equally

Summary

Este estudio tiene como objetivo desarrollar un nuevo modelo de cultivo de retina organotípico humano (HORC) que evite comprometer la integridad de la retina durante el manejo del explante. Esto se logra cultivando la retina con el vítreo resbanante y el epitelio-coroides pigmentario retiniano subyacente (RPE-coroides) y esclerótica.

Abstract

Los modelos previos de cultivo organotípico de retina (HORC) humano han utilizado retinas desprendidas; sin embargo, sin el soporte estructural conferido por el epitelio-coroide pigmentario de la retina (EPR-coroides) y la esclerótica, la integridad de la retina frágil puede verse fácilmente comprometida. El objetivo de este estudio fue desarrollar un nuevo modelo HORC que contenga la retina, la CORoides RPE y la esclerótica para mantener la integridad de la retina al cultivar explantes retinianas.

Después de cortar circunferencialmente a lo largo del limbo para eliminar el iris y el cristalino, se hicieron cuatro incisiones profundas para aplanar el ocular. A diferencia de los protocolos HORC anteriores, se utilizó una trefina para cortar no solo la retina, sino también la COROIDES y la esclerótica. Los explantes de triple capa resultantes se cultivaron durante 72 h. La tinción de hematoxilina y eosina (H&E) se utilizó para evaluar las estructuras anatómicas y los explantes retinianas se caracterizaron además por inmunohistoquímica (IHC) para la apoptosis, la integridad de las células de Müller y la inflamación de la retina. Para confirmar la posibilidad de inducción de la enfermedad, los explantes fueron expuestos a glucosa alta (HG) y citoquinas proinflamatorias (Cyt), para imitar la retinopatía diabética (RD). El ensayo de perla magnética de Luminex se utilizó para medir las citoquinas relacionadas con DR liberadas en el medio de cultivo.

La tinción de H&E reveló distintas láminas retinianas y núcleos compactos en explantes retinianas con la coroides y la esclerótica subyacentes, mientras que las retinas sin las estructuras subyacentes exhibieron un grosor reducido y una pérdida severa de núcleos. Los resultados de la IHC indicaron la ausencia de apoptosis e inflamación de la retina, así como la preservación de la integridad de las células de Müller. Los ensayos de Luminex mostraron un aumento significativo de la secreción de citoquinas proinflamatorias asociadas a DR en explantes retinianas expuestos a HG + Cyt en relación con los niveles basales a las 24 h.

Desarrollamos y caracterizamos con éxito un nuevo protocolo HORC en el que se preservó la integridad de la retina sin apoptosis ni inflamación de la retina. Además, la secreción inducida de biomarcadores proinflamatorios asociados a la RD al exponer los explantes de retina a HG + Cyt sugiere que este modelo podría usarse para estudios de enfermedad de la retina clínicamente traducibles.

Introduction

La retina es una estructura ocular altamente especializada responsable de transformar la energía de la luz entrante en señales eléctricas, que luego son procesadas por el cerebro para la percepción visual. La retina humana contiene un rango dinámico de tipos de células, altamente organizadas en una estructura lamelar única que consiste en dos capas sinápticas y tres núcleos1 (Figura 1). La homeostasis retiniana se sustenta en las intrincadas conexiones entre las células neurorretinianas, los vasos sanguíneos, los nervios, los tejidos conectivos y el RPE1. Debido a la sofisticada anatomía y fisiología de la retina, los mecanismos de muchas enfermedades de la retina siguen siendo poco conocidos2,3,4,5. Para estudiar mejor las enfermedades de la retina, se han desarrollado modelos HORC6,7,8,9. En comparación con los estudios en animales y los cultivos in vitro, los modelos HORC son ventajosos porque conservan el entorno celular dinámico y las interacciones neurovasculares complejas in situ, proporcionando un buen modelo para la traducción clínica.

Figure 1
Figura 1: Estructuras oculares posteriores del ojo humano. De anterior a posterior, las capas de la retina son: capa de fibra nerviosa (NFL), capa de células ganglionares (GCL), capa plexiforme interna (IPL), capa nuclear interna (INL), capa plexiforme externa (OPL), capa nuclear externa (ONL), segmento interno del fotorreceptor (IS) y capa externa (SO) del fotorreceptor. Las células dentro de la retina incluyen células ganglionares (azul), células amacrinas (amarillas), células bipolares (rojas), células horizontales (púrpura), fotorreceptores de bastón (rosa) y fotorreceptores de cono (verde). El vítreo se localiza antes de la retina. El RPE, la membrana de Bruch, la coroides y la esclerótica se encuentran posteriores a la retina. Tenga en cuenta que la imagen que se muestra es solo una representación esquemática de la retina y la relación entre las células y la conectividad retiniana dentro de cada capa puede no ser indicativa de la configuración in vivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los protocolos HORC previamente caracterizados6,7,8,9 han implicado separar la retina de la RPE-coroides subyacente y la esclerótica mediante una trefina quirúrgica. Sin embargo, sin el apoyo proporcionado por estas estructuras subyacentes, la retina translúcida se vuelve endeble, difícil de manejar y herramientas como los fórceps pueden interrumpir fácilmente su integridad. Además, se ha demostrado que el aislamiento de retina en cultivo sin el RPE causa apoptosis de células ganglionares y degeneración fotorreceptora10,11,12. Por lo tanto, sería útil un protocolo HORC alternativo que minimice la pérdida de integridad de la retina e imite mejor el entorno in vivo. Esto es particularmente importante cuando se estudian los mecanismos de la enfermedad de la retina, ya que la lesión física durante el manejo del explante podría introducir artefactos. Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue desarrollar un nuevo modelo HORC que incluya la RPE-coroides y la esclerótica para proteger la integridad de la retina durante el manejo y cultivo del explante.

Para lograr este objetivo, se extrajeron explantes de retina "intercalados" entre el vítreo residual y la coroides y esclerótica subyacentes. En los explantes sándwich, el vítreo pesa sobre la retina para evitar el desprendimiento y plegamiento de la retina, mientras que la esclerótica fibrosa y resistente actúa como un andamio para el soporte estructural y un punto de contacto para los pórceps. Por otra parte, modelos animales han demostrado que retener el RPE en cultivo puede prevenir la degeneración retiniana y la proliferación glial, una respuesta de las células de Müller a señales de peligro como la hipoxia y la inflamación10,11,12.

Para caracterizar el modelo, se tiñeron explantes retinianas sándwich con hematoxilina y eosina (H&E) para evaluar las estructuras anatómicas y se realizó inmunohistoquímica (IHC), marcando explantes con desoxinucleotidil transferasa terminal dUTP nick end labeling (TUNEL, un marcador de células apoptóticas), proteína ácida fibrilar glial (GFAP, una inflamación retiniana y marcador de activación celular de Müller) y vimentina, un marcador de integridad celular de Müller. Para determinar si este modelo puede ser inducido a desarrollar signos moleculares de enfermedad, los explantes fueron expuestos a glucosa alta (HG) con citoquinas proinflamatorias (Cyt), interleucina-1β (IL-1β) y factor de necrosis tumoral-α (TNF-α), un ambiente de cultivo que se ha demostrado que imita la retinopatía diabética (DR) tanto en modelos de enfermedades celulares como animales13,14,15. Los ensayos de Luminex se utilizaron en el modelo DR para medir las citoquinas liberadas en el medio de cultivo.

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Protocol

Las copas de ojos de donantes humanos se obtuvieron del Banco Nacional de Ojos de Nueva Zelanda después de la escisión corneal para trasplante y según lo aprobado por el Comité de Ética de Salud y Discapacidad de Northern B (NTX/06/19/CPD/AM07).

NOTA: El cultivo debe realizarse en un gabinete de bioseguridad de Clase II para garantizar condiciones de cultivo de tejidos estériles. Los tejidos deben cultivarse dentro de las 24 h post mortem para evitar una pérdida significativa de la integridad de la retina.

Figure 2
Figura 2: Imágenes que muestran el procedimiento para la recolección de los explantes retinianas sándwich. Para la preparación del explante, use tijeras de disección con una punta afilada y un extremo romo, con el extremo romo mirando hacia el interior del globo para reducir el daño tisular durante la incisión. También use forrcepciones con extremos romos para evitar rascarse los tejidos intraoculares durante la manipulación. Usando tijeras quirúrgicas, con el extremo romo mirando hacia el interior, corte a lo largo del limbo para eliminar el iris y la lente(A-C). El ONH se puede localizar si se mira directamente en el ocular abierto (D). Usando fórceps con puntas romas, sostenga la esclerótica para estabilizar el globo (E). Divida el globo verticalmente en dos mitades haciendo dos incisiones profundas hacia el ONH, pero no corte a través del ONH. Repita esto a lo largo del meridiano horizontal (G). Aplique fórceps romos en la esclerótica y abra suavemente el globo terráqueo en forma de trébol(H-K). Use fórceps para manipular cuidadosamente el vítreo para alisar la retina plegada, ya que el vítreo tira de la retina, pero no toque la retina directamente (I). Retire el vítreo si está causando desprendimiento de retina o plegamiento (no se muestra en la Figura 2 ya que el vítreo transparente no está bien capturado en las fotos). Localice las áreas donde la retina es plana y extraiga los explantes de retina utilizando una trefina quirúrgica (L). Aplicando fórceps en la esclerótica, transfiera cuidadosamente los explantes de retina al medio de cultivo pre-preparado (M,N). Todo el explante sándwich debe hundirse hasta el fondo del pozo debido a su peso, por lo tanto, cada explante se sumerge en el medio (O). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Extracción de los explantes retinianas sándwich del ocular

  1. Retire el iris y la lente.
    1. Coloque la copa del ojo dentro de una placa de Petri, con el iris y la lente hacia arriba y la cabeza del nervio óptico (ONH) en contacto con la placa de Petri (Figura 2A).
    2. Mantenga la copa del ojo firme en el limbo usando fórceps(Figura 2B).
    3. Separe el iris y la lente haciendo pequeños cortes circunferenciales a lo largo del borde externo del limbo(Figura 2A).
    4. Retire el iris y la lente con cuidado. Evite perturbar la retina durante la manipulación(Figura 2C).
      NOTA: La lente no caerá en la copa del ojo, ya que está unida, a través de fibras dezonula, al cuerpo ciliar.
  2. Aplana la copa del ojo.
    1. Con la copa del ojo todavía sentada en posición vertical, identifique la ONH. Esto es más fácil con una fuente de luz blanca brillante(Figura 2D).
    2. Incise en los cuatro cuadrantes hacia la ONH (Figura 2E). La placa de Petri se puede girar para facilitar su manejo. NO corte el ONH.
    3. Extienda y aplane la copa del ojo con cuidado (Figura 2E).
    4. Aplique los pórceps en la esclerótica en lugar de la retina para evitar interrumpir la integridad de la retina.
      NOTA: El desprendimiento y plegamiento de retina periférica es inevitable, ya que el peso del vítreo desbordado tirará de la retina. En estas áreas, retire el vítreo para evitar un mayor plegamiento de la retina. Recuerde dejar el vítreo residual para estabilizar la retina en la parte superior de la RPE-coroides y la esclerótica.
  3. Recolectar explantes de retina sándwich.
    1. Coloque una trefina quirúrgica en la retina en una región sin pliegues retinianas (Figura 2F).
    2. Presione con fuerza para penetrar la esclerótica, lo que debería generar un sonido de agrietamiento.
    3. Gire la trefina en 180 ° para asegurarse de que la esclerótica haya sido penetrada completamente de tal manera que el explante de retina ahora esté separado del tejido restante.
    4. Aplicar los fórceps en la esclerótica y transferir el explante retiniana sándwich al medio de cultivo (Figura 2G-I).
    5. Obtener 2-3 explantes retinianas sándwich de la retina periférica de cada cuadrante.
      NOTA: El explante de retina sándwich a veces puede quedar atrapado en la abertura de la trefina. Usando forrceps, desentraña suavemente una pequeña sección de la base de la esclerótica. Esto ocurre con más frecuencia cuando la cuchilla es roma y puede causar pérdida de la retina(Figura 3A-C).
    6. Use una nueva trefina después de cortar 1-2 explantes de retina a medida que la cuchilla se vuelve roma fácilmente (Figura 3CFigure 3
      Figura 3: Solución de problemas. Durante el proceso de extracción, el explante de retina puede quedar atrapado en la abertura de la trefina quirúrgica (A). Desentrañar suavemente el tejido de la base de la esclerótica sin tocar la retina (B). Esto puede suceder con más frecuencia si la trefina quirúrgica se utiliza para extraer más de dos explantes de retina, ya que la cuchilla puede volverse fácilmente roma (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
  4. Cultivo de los explantes de retina.
    1. Preparar el medio de cultivo que contenga la mezcla de nutrientes F-12 (DMEM-F12) de Dulbecco y una mezcla de antibióticos y antimicóticos 1x (AA, stock de 100x).
    2. Antes de la extracción del explante, coloque 500 μL de medio en los pozos de una placa de 24 pozos y equilibre en la incubadora. Esto es importante ya que agregar el medio después puede desalojar la retina.
    3. Culta los explantes retinianas sándwich a 37 °C durante un tiempo de hasta 72 h en una incubadora humidificada al 5% de CO2 en medio preparado en el paso 1.4.2.
    4. Para inducir cambios similares a la DR, culta explantes retinianas en medio que contenga DMEM-F12 con una combinación de 32,5 mM HG con Cyt, TNF-α (10 ng/mL) e IL-1β (10 ng/mL).

2. Incrustación de parafina de los explantes retinianas sándwich

  1. Arreglar los explantes retinianas sándwich.
    1. Sumergir los explantes retinianas sándwich en formalina al 10% durante al menos 24 h.
    2. Retire la solución de formalina y transfiera los explantes de retina sándwich suavemente a almohadillas de tejido y casetes.
    3. Remoje los explantes retinianas sándwich en etanol al 70% durante al menos 24 h.
    4. La retina incrustada en parafina se explanta en bloques.
    5. Corte los tejidos retinianas incrustados en parafina en secciones de 5 μm de espesor con un microtomo y colópelos en portaobjetos de vidrio. Conservar a temperatura ambiente hasta la toma de imágenes.
  2. Desparafinar secciones.
    1. Sumergir las secciones en 70% de xileno durante 5 min.
    2. Sumergir las secciones en 100% xileno durante 5 min.
    3. Rehidratar las secciones en etanol al 70% durante 5 min.
    4. Rehidratar las secciones en etanol al 100% durante 5 min.
    5. Lave las secciones con agua corriente del grifo durante 10 min.

3. Caracterización mediante H&E, IHC y un ensayo magnético de Luminex

  1. Protocolo de tinción de H&E
    1. Desparafinar las secciones mediante el paso 2.2.
    2. Hidratar las secciones en agua del grifo durante 5 min.
    3. Manche las secciones en la solución de 2 hematoxilina de Gill durante 5 min.
    4. Lave bien las secciones con agua corriente del grifo para eliminar el exceso de manchas.
    5. Diferenciar sumergiendo las secciones dos veces en alcohol ácido al 1%.
    6. Lave las secciones rápidamente con agua corriente del grifo.
    7. Se tiñe las secciones de azul sumergiéndo las seis veces en carbonato de litio al 1% (10 mg/ml).
    8. Lave bien las secciones con agua corriente del grifo durante 5 minutos para eliminar el exceso de manchas azules.
    9. Sumerja las secciones en 1% de eosina 10 veces.
    10. Lave las secciones rápidamente bajo el agua del grifo para eliminar el exceso de manchas.
    11. Deshidrata las secciones sumergiéndolas 10 veces en etanol al 100%. Haga esto dos veces.
    12. Sumerja las secciones en 70% de xileno 10 veces.
    13. Sumerja las secciones en 100% xileno 10 veces.
    14. Montaje con un recubre utilizando el medio de montaje de dibutilftalato poliestireno xileno (DPX).
    15. Tome imágenes con un microscopio de luz.
  2. Protocolo de etiquetado IHC'
    1. Desparafinar las secciones mediante el paso 2.2.
    2. Coloque los portaobjetos en una solución que contenga un tampón de citrato de sodio de 10 mM con Tween 20 al 0,05% a pH 6,0 y ejecute una recuperación de antígenos en una olla a presión automatizada a 121 °C durante 2 min.
    3. Lavar las secciones en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 5 min. Haga esto 3 veces.
    4. Bloquee las secciones con PBS que contengan 0.1% tritón X-100 y 10% de suero normal de cabra durante 1 h a temperatura ambiente.
    5. Incubar secciones durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios conjugados con anticuerpos secundarios (Tabla de Materiales).
    6. Lavar las secciones en PBS durante 5 min. Haga esto 3 veces.
    7. Teñir núcleos usando 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) durante 2 min.
    8. Lave y monte las secciones con un reactivo antidesvanección.
    9. Selle las fundas con esmalte de uñas.
    10. Tome imágenes con un microscopio de barrido láser confocal.
  3. Ensayo magnético de Luminex
    1. Transfiera 75 μL de medios de cada pozo a una placa de fondo de 96 pozos a las 24 y 72 h.
    2. Analizar el sobrenadante celular para IL-18, IL-6, IL-8 y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) después de 24 y 72 h utilizando el ensayo de citoquinas Luminex. Siga las instrucciones del fabricante para realizar el ensayo16.

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Representative Results

La integridad de la retina se conservó en este modelo HORC. La integridad retiniana se conservó en los explantes retinianas sándwich cultivados, pero se perdió en la retina cultivada sin estructuras adyacentes. H&E se llevó a cabo para examinar la integridad estructural de los explantes retiniana sándwich seccionados después de 72 h en cultivo. Los explantes retinianas sándwich mostraron integridad preservada y una estructura de láminas distinta de GCL a ONL con núcleos compactos en INL y ONL(Figura 4A). Sin embargo, se encontró integridad retiniana alterada en los bordes de la misma muestra, donde la retina se había desprendido de la CORoides y la esclerótica subyacentes, mostrando un grosor retiniana reducido y una pérdida de núcleos severos en INL y ONL(Figura 4B).

Figure 4
Figura 4:Imágenes H&E de explantes retinianas cultivadas en medio durante 72 h. A)Integridad estructural mantenida en áreas unidas a la coroides y esclerótica subyacentes, representada por la separación distinta de cada capa retiniana de GCL a ONL y núcleos compactos en INL y ONL. B)Pérdida grave de la integridad de la retina en regiones separadas de la RPE-coroides y la esclerótica, demostrada por la reducción general del grosor de la retina y la disminución del número de núcleos en INL y ONL. Barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La caracterización de los explantes de retina utilizando IHC demostró una integridad retiniana bien conservada incluso después de 72 h en cultivo. No se encontraron núcleos celulares TUNEL-positivos, que marcan la apoptosis, en explantes retinianas cultivados en condiciones basales, demostrando una viabilidad celular sostenida incluso después de 72 h (Figura 5A-C). La expresión de GFAP permaneció localizada en GCL e IPL, como se observa en los tejidos retinianas normales17,18. No hubo fibrosis glial, un signo de activación y proliferación de células de Müller en respuesta a la inflamación de la retina, que de otro modo se identificaría como expresión de GFAP regulada al alza que se extiende a la ONL10,11,12(Figura 5D-F). El etiquetado de vimentina (rojo) se expresó altamente de GCL a ONL, mostrando la integridad de las células de Müller preservadas, como se ve en los tejidos normales de la retina (Figura 5G-I).

Figure 5
Figura 5: Imágenes IHC de explantes retinianas después del cultivo en medios basales durante 72 h. La falta de tinción TUNEL-positiva (verde) sugiere que no se ha producido apoptosis celular en las capas retinianas de GCL a ONL(A-C). El etiquetado GFAP (rojo) se restringió a GCL e IPL sin fibrosis glial, que se identificaría como expresión extendida de GFAP en la ONL(D-F). La vimentina (rojo) se expresó altamente de GCL a ONL, localizando las células de Müller que atraviesan estas capas retinianas(G-I). Los núcleos celulares se tiñeron con DAPI (azul). Barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Se desarrolló un modelo de DR mediante el cultivo de explantes retinianas sándwich en HG y Cyt. HG y Cyt, IL-1β y TNF-α, aumentaron la secreción de IL-18, VEGF, IL-6 e IL-8 en relación con los niveles basales. Se utilizó un ensayo de Luminex para medir las citoquinas IL-18, VEGF, IL-6 e IL-8 secretadas por los explantes retinianas después del cultivo durante 24 y 72 h en condiciones HG + Cyt (Figura 6). Para minimizar las diferencias entre donantes, los niveles de citoquinas secretadas se compararon con los basales (indicados por la línea roja punteada), representados por los niveles de citoquinas secretadas por los explantes sándwich del mismo donante pero cultivados en medio basal (preparado en la etapa 1.4.1). Después de 24 h, los niveles secretados de IL-18, VEGF, IL-6 e IL-8 aumentaron significativamente en relación con el valor basal. Después de 72 h, solo los niveles de IL-18 y VEGF permanecieron significativamente elevados, mientras que no se encontraron diferencias significativas en los niveles de IL-6 e IL-8 en comparación con el valor inicial.

Figure 6
Figura 6: Liberación de citoquinas por los explantes retinianas sándwich cultivados en HG y Cyt, IL-1β y TNF-α, después de 24 y 72 h. Los niveles secretados de IL-18, VEGF, IL-6 e IL-8 aumentaron significativamente por encima del valor basal después de 24 h (p < 0,05). Después de 72 h, los niveles de IL-18 y VEGF permanecieron significativamente aumentados (p < 0,05), pero no se encontraron diferencias significativas en los niveles de IL-6 e IL-8, en comparación con el valor basal. La línea roja punteada indica el nivel basal, que representa los niveles de citoquinas secretadas por los explantes del mismo donante pero cultivadas en medio normal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

HORC es actualmente el modelo clínicamente más traducible en la investigación preclínica de la retina. En comparación con los modelos de cultivo celular in vitro, HORC puede representar mejor la anatomía de la retina humana in situ, a través de la retención de los tipos dinámicos de células retinianas y sus conexiones con las neuronas, las vasculaturas y el entorno extracelular19. En comparación con los modelos animales, los HORC son más ventajosos en el estudio de la fisiopatología y el diseño de tratamientos farmacéuticos para enfermedades de la retina humana debido a variaciones entre especies, como diferentes tipos de células de la retina, así como la variación de la densidad y las proporciones de los fotorreceptores, lo que podría contribuir a ensayos clínicos fallidos a pesar de los resultados positivos en modelos animales19. Sin embargo, en los protocolos HORC anteriores, la retina se separó intencionalmente de la COROIDES y la esclerótica RPE. Sin la esclerótica dura, la retina endeble es difícil de manejar y la integridad de la retina puede verse comprometida si se maneja directamente con fórceps6,7,8,9. Esto se evidencia por el hecho de que estudios previos que utilizan retinas aisladas han reportado un aumento de la activación de las células de Müller y núcleos TUNEL positivos en 72 h de cultivo. Esto contrasta con nuestros hallazgos, lo que sugiere que el método sándwich preserva mejor la integridad de la retina. En segundo lugar, se encontró un aumento de la degeneración neuronal y la proliferación glial en modelos animales de ORC en retina cultivada sin RPE, en comparación con retina cultivada con RPE10,11,12.

Para minimizar las posibilidades de comprometer la integridad de la retina, se utilizaron explantes retinianas sándwich en este nuevo protocolo HORC. A diferencia de los protocolos HORC anteriores, la trefina corta no solo la retina, sino también el RPE-vítreo y la esclerótica, de modo que el explante resultante se "intercala" y se estabiliza entre el vítreo residual y las estructuras subyacentes. El vítreo residual pesa la retina hacia abajo para evitar el plegamiento y el desprendimiento de las estructuras subyacentes, mientras que la esclerótica actúa como un andamio para apoyar la arquitectura retiniana para proteger la retina de la lesión inducida por los porórceps. Además, el cultivo de retina con RPE puede prevenir la degeneración retiniana y la proliferación glial en cultivo10,11,12.

Recuerde los siguientes puntos al extraer explantes de retina sándwich. Al cortar a lo largo del limbo, la lente pesará el iris, pero no caerá dentro de la copa del ojo, ya que está unida, a través de fibras dezonula, al cuerpo ciliar. Aplique los forrórceps en la esclerótica y evite tocar la retina para evitar interrumpir la integridad de la retina. Llene los pozos de cultivo con medio antes de colocar el explante de retina dentro de los pozos. Agregar el medio después de colocar los explantes retinianas dentro de los pozos aumenta el riesgo de desalojar la retina de la coroides rPE y la esclerótica o voltear todo el explante boca abajo. Al hacer incisiones profundas en los cuatro cuadrantes, tenga en cuenta que la retina periférica puede desprenderse debido a la fuga vítrea de la copa del ojo. Para evitar el desprendimiento o plegamiento de la retina, retire el vítreo en el área que está tirando de la retina. Aunque el punto anterior aconseja eliminar el tirón vítreo sobre la retina, dejar suficiente vítreo residual para pesar la retina sobre la RPE-coroides y la esclerótica con el fin de aumentar la estabilidad de los explantes retinianas sándwich. Al cortar a través de la esclerótica dura y fibrosa, la trefina puede volverse fácilmente roma. Como resultado, se puede requerir fuerza excesiva o la esclerótica puede no estar completamente penetrada. Use una nueva trefina por cada 1-2 explantes de retina extraídos para evitar la penetración incompleta a través de la esclerótica. La experiencia en el manejo cuidadoso es crucial para proteger la retina; por lo tanto, el entrenamiento con ojos porcinos, que son similares en tamaño y estructura al ojo humano, es aconsejable antes de usar los oculares esclerales de donante limitados disponibles.

La integridad retiniana se preservó en los explantes intercalados entre el vítreo residual y la coroides y esclerótica subyacentes. La tinción de H&E mostró una mejor integridad estructural cuando el explante retiniana cultivado se unió a RPE-coroides y esclerótica, en comparación con el cultivo de la retina sola. Apoyando este hallazgo, la falta de núcleos celulares TUNEL-positivos sugirió una ausencia de apoptosis dentro de todas las capas de la retina, demostrando la viabilidad celular preservada incluso después de 72 h. Además, el etiquetado con vimentina confirmó la integridad de las células de Müller y la expresión restringida de GFAP en GCL e INL, encontrada en la retina normal, volvió a verificar la falta de señales inflamatorias o de estrés en la retina.

El modelo HORC caracterizado en este estudio dio como resultado la estructura retiniana preservada y la integridad de las células de Müller, al tiempo que previno la inflamación de la retina y la apoptosis celular. Además, se puede utilizar para modelar enfermedades de la retina, lo que es particularmente útil para identificar las vías de la enfermedad y los mecanismos farmacéuticos. Estudios previos en animales e in vitro han demostrado que la inflamación de la RD puede ser inducida cuando la retina o las células animales están expuestas a HG y Cyt13,14,15. En este estudio HORC, al aplicar HG y Cyt a los explantes sándwich durante 24 h en cultivo, la secreción de IL-18, VEGF, IL-6 e IL-8 se elevó significativamente por encima del valor basal. Estas citoquinas son bien conocidas por aumentar en el vítreo y suero de pacientes con RD en comparación con los controles no diabéticos, validando que este modelo de DR es clínicamente traducible20,21,22,23,24,25. Aunque este estudio solo ha caracterizado la DR mediante el ensayo Magnetic Luminex, también se pueden realizar otras técnicas como Western Blotting, IHC y reacción en cadena polimerizada (PCR)26.

A pesar de las claras ventajas descritas anteriormente, este novedoso modelo HORC también tiene algunas limitaciones. Una limitación importante de este protocolo es el bajo suministro de tejido. Las copas oculares de donantes, que tienen todas las estructuras oculares excepto la córnea generalmente extirpada para trasplante, rara vez están disponibles para la investigación debido a la gran demanda de la esclerótica en procedimientos quirúrgicos como derivaciones de glaucoma, implantes orbitarios, reparación de daños en el desprendimiento de retina y cobertura de suturas expuestas. Para minimizar esta limitación, sugerimos que todos los grupos experimentales se recojan del mismo donante. Esto elimina la necesidad de tener en cuenta las variabilidades entre donantes, como la edad, la duración de la enfermedad, los niveles basales de citoquinas y otros factores que pueden contribuir a confundir las variables si se comparan entre diferentes pacientes. Además, la mayoría de los tejidos de donantes son de personas mayores, ya que es más difícil obtener muestras de grupos de edad más jóvenes, e incluso cuando están disponibles, la causa de muerte de donantes jóvenes a menudo es de naturaleza traumática que conduce a tejidos dañados que no son adecuados para el cultivo. Sin embargo, dado que la mayoría de las enfermedades crónicas de la retina ocurren en pacientes de edad avanzada, este modelo aún conserva la utilidad en el estudio de enfermedades crónicas de la retina relacionadas con la edad, como la RD y la degeneración macular relacionada con la edad.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores desean agradecer a los generosos donantes de tejidos oculares y al equipo del Banco Nacional de Ojos de Nueva Zelanda por su apoyo. Este trabajo fue apoyado financieramente por subvenciones para proyectos del Maurice and Phyllis Paykel Trust y la Auckland Medical Research Foundation (1117015). La dirección de IDR cuenta con el apoyo de la Buchanan Charitable Foundation. La beca de CK es proporcionada por el Fondo de Educación e Investigación de la Asociación de Optometristas de Nueva Zelanda (CC36812) y la beca de HHL es proporcionada por la Fundación Caritativa Buchanan.

Materials

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Disposable Biopsy Punches (5 mm) Integra York PA Inc., USA 21909-142 Referred as surgical trephines
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Human Recombinant IL-1β Peprotech, USA 200-01B Working concentration: 10 ng/mL
Human Recombinant  TNF-a Peprotech, USA 300-01A Working concentration: 10 ng/mL
DAPI (1 µg/mL) Sigma Aldrich, Germany #D9542 Nuclear stain. Working dilution 1:1000
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement Gibco, Thermofisher, Scientific Inc., USA 10565018 Dulbecco’s Modified Eagle Medium nutrient mixture F-12 containing a 1× antibiotics and antimycotics mixture (AA, 100× stock)
Fine Scissors - Sharp-Blunt Fine Science Tools (F.S.T) 14028-10 Tips: Sharp-Blunt, Cutting Edge: 27mm, Length: 10cm, Alloy/Material: Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight
Graefe Forceps Fine Science Tools (F.S.T) 11050-10 Length:10cm, Tip shape: Straight, Tips: Serrated, Tip Width: 0.8mm, Tip Dimensions:0.8 x 0.7mm, Alloy/Materials: Stainless Steel
Mouse monoclonal GFAP-Cy3 Sigma Aldrich, Germany #C9205 Primary antibody conjugated to Cy3. Working dilution 1:1000.
Mouse monoclonal Vimentin-Cy3 Sigma Aldrich, Germany #C9080 Primary antibody conjugated to Cy3. Working dilution 1:50.
Rabbit polyclonal TUNEL (In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein) Sigma Aldrich, Germany #11684795910 Primary antibody conjugated to Fluorescein-dUTP. Working dilution 1:10 with enzyme-buffer solution.

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References

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Medicina Número 172 Humano Retina Organotípico Cultivo Desarrollo de modelos Modelo de enfermedad
Caracterización de una nueva técnica de cultivo de retina organotípica humana
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Kuo, C. Y. J., Louie, H. H., Rupenthal, I. D., Mugisho, O. O. Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique. J. Vis. Exp. (172), e62046, doi:10.3791/62046 (2021).

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