新型人类组织特征视网膜培养技术的特征

Summary

这项研究旨在开发一种新的人体组织性视网膜培养（HORC）模型，防止在外植过程中损害视网膜的完整性。这是通过培养视网膜与过度的四肢和底层视网膜色素上皮-胆碱（RPE-胆碱）和硬膜。

Abstract

以前的人类组织状视网膜培养（HORC）模型已经利用了分离视网膜：然而，如果没有视网膜色素上皮-胆碱（RPE-胆碱）和硬化物的结构支持，脆弱的视网膜的完整性很容易受到损害。这项研究的目的是开发一个新的HORC模型，其中含有视网膜，RPE胆碱和硬膜，以保持视网膜的完整性，当培养视网膜外植。

沿着豪华巴士进行割礼以去除虹膜和透镜后，制作了四个深切口来平整眼罩。与以前的 HORC 协议不同，不仅用于切开视网膜，还用于切开 RPE 胆碱和硬化物。由此产生的三层外植培养为72小时。血氧林和Eosin染色（H&E）用于评估解剖结构，视网膜外植进一步的特点是免疫造血化学（IHC）的凋亡，穆勒细胞完整性和视网膜炎症。为了确认疾病诱导的可能性，外生植物暴露于高血糖（HG）和促炎细胞因子（Cyt），以模仿糖尿病视网膜病变（DR）。Luminex 磁珠检测用于测量释放到培养介质中的 DR 相关细胞因子。

H&E染色揭示了视网膜拉梅拉和紧凑的细胞核在视网膜外植与底层RPE-胆碱和硬化，而视网膜没有基础结构表现出减少厚度和严重的核损失。IHC结果显示，没有凋亡和视网膜炎症，以及保存的穆勒细胞完整性。Luminex 检测显示，与 24 小时的基线水平相比，暴露在 HG 和 Cyt 的视网膜外植体中与 DR 相关的亲炎细胞因子的分泌显著增加。

我们成功地开发并定性了一种新的HORC协议，其中视网膜完整性被保留，没有凋亡或视网膜炎症。此外，当视网膜外植物暴露在HG + Cyt中时，DR相关亲炎症生物标志物的诱导分泌表明，该模型可用于临床可翻译视网膜疾病研究。

Introduction

视网膜是一种高度专业化的眼部结构，负责将传入的光能转化为电信号，然后由大脑处理，以进行视觉感知。人类视网膜包含一系列动态的细胞类型，高度组织在一个独特的拉梅拉结构，包括两个突触和三个核层^1（图1）。视网膜平衡是由神经视网膜细胞、血管、神经、结缔组织和RPE¹之间的复杂连接维持的。由于复杂的视网膜解剖学和生理学，许多视网膜疾病的机制仍然缺乏了解^{2，3，4，5。}为了更好地研究视网膜疾病，已经开发了^{6，7，8，9}的HORC模型。与动物研究和体外培养相比，HORC模型具有优势，因为它们保留了动态细胞环境和复杂的神经血管相互作用，为临床翻译提供了良好的模型。

图1：人眼的后眼结构。前后视网膜层为：神经纤维层（NFL）、结节细胞层（GCL）、内丛状层（IPL）、内核层（INL）、外丛状层（OPL）、外核层（ONL）、光受体内段（IS）和光受体外层（OS）。视网膜内的细胞包括结节细胞（蓝色）、阿马林细胞（黄色）、双极细胞（红色）、水平细胞（紫色）、棒光受体（粉红色）和锥体光受体（绿色）。视网膜位于前。RPE，布鲁奇的膜，胆囊和硬膜位于视网膜的后。请注意，显示的图像只是视网膜的示意图，每个层内细胞/视网膜连接的比例可能不表示体内设置。请单击此处查看此图的较大版本。

先前的荷尔克协议6，7，8，9涉及使用手术颤音将视网膜从底层RPE-胆碱和硬化物中分离出来。然而，如果没有这些基础结构的支持，半透明视网膜变得脆弱，难以处理，诸如钳子等工具很容易破坏其完整性。此外，在没有RPE的情况下分离视网膜已证明会导致结核细胞凋亡和光受体退化^{10，11，12。}因此，一个替代的HORC协议，尽量减少视网膜完整性的损失，并更好地模仿体内环境将是有用的。这在研究视网膜疾病机制时尤其重要，因为外植过程中的身体损伤可能会引入人工制品。因此，本研究的目的是开发一种新的HORC模型，其中包括RPE-巧克力和硬皮，以保护视网膜的完整性，在外植物处理和文化。

为了实现这一目标，在残余的病毒和底层的RPE-胆囊和硬化物之间"夹"出视网膜外植物。在三明治外植物中，视网膜压低，以防止视网膜分离和折叠，而坚韧、纤维状硬化的硬化物既充当结构支撑的脚手架，又充当钳子的接触点。此外，动物模型已经表明，在培养中保留RPE可以防止视网膜退化和胶质增殖，这是穆勒细胞对缺氧和炎症等危险信号的反应，10，11，12。

为了描述模型的特点，三明治视网膜外植物被染色了血氧林和Eosin（H&E），以评估解剖结构和免疫造血化学（IHC）的进行， 标记外生植物与终端脱氧核苷酸转移酶dUTP尼克结束标签（TUNEL，凋亡细胞标记），胶质纤维酸性蛋白（GFAP，视网膜炎症和穆勒细胞激活标记），和维他命，穆勒细胞完整性的标志。为了确定该模型是否可以诱导形成分子疾病迹象， 这些外生植物暴露在高血糖（HG）与亲炎细胞因子（Cyt），白细胞素介素-1+（IL-1+）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α），一种培养环境，已被证明模仿糖尿病视网膜病变（DR）在细胞和动物疾病模型13，14，15。在DR模型中使用了Luminex检测来测量释放到培养基中的细胞因子。

Protocol

人体捐赠眼杯是在角膜切除后从新西兰国家眼库获得的，并经北B健康和残疾伦理委员会（NTX/06/19/CPD/AM07）批准。

注：该培养物应在 II 类生物安全柜中进行，以确保无菌组织培养条件。组织必须在24小时验尸后培养，以避免严重的视网膜完整性损失。

图2：显示收集三明治视网膜外植程序的图片。对于外植制剂，使用一个锋利的尖端和一个钝端的解剖剪刀，钝端面向地球内部，以减少切口过程中的组织损伤。还要使用带钝端的钳子，以避免在处理过程中划伤眼内组织。使用手术剪刀，钝端朝内，沿着豪华巴士切割，以去除虹膜和镜头（A-C）。如果直接观察打开的眼罩（D），则可以找到 ONH。使用带有钝尖的钳子，握住硬囊以稳定地球（E）。通过向 ONH 进行两个深切口，将地球垂直分成两半，但不会穿过 ONH。沿着水平子午线（G）重复上述步骤。在硬囊上涂抹钝钳，轻轻地将地球打开到三叶草形状（H-K）。使用钳子小心地操纵视网膜，以平滑折叠的视网膜，作为视网膜拖拉到视网膜上，但不要直接触摸视网膜（I）。如果导致视网膜分离或折叠（图2中未显示透明四肢未在照片上拍摄良好），则将其移除）。定位视网膜平坦的区域，使用手术颤栗（L）提取视网膜外植物。在硬囊中施用钳子，小心地将视网膜外植物转移到预先准备的培养介质（M，N）中。由于重量的原因，整个三明治外植物应该沉入井底，因此每个外植物都浸入中等（O）中。请单击此处查看此图的较大版本。

1. 从眼杯中提取三明治视网膜外植物

1. 取出虹膜和镜头。
   1. 将眼杯放在培养皿内，虹膜和镜头朝上，视神经头（ONH）接触培养皿（图2A）。
   2. 用钳子将眼杯稳定地握在利姆布斯（图2B）。
   3. 沿着小巴的外缘（图2A）进行小切口，分离虹膜和透镜。
   4. 小心地取出虹膜和镜头。避免在操作过程中干扰视网膜（图2C）。
      注：镜头不会落入眼杯，因为它通过佐纳纤维连接到辅助身体。
2. 把眼杯压扁。
   1. 眼杯仍然直立坐着，识别 ONH 。这更容易与明亮的白色光源（图2D）。
   2. 在四个象限向 ONH （图2E） 。培养皿可以旋转，以便于处理。 不要 切断 ONH。
   3. 小心地将眼杯展开并压扁（图2E）。
   4. 将钳子涂在硬膜上，而不是视网膜上，以避免破坏视网膜的完整性。
      注：外周视网膜分离和折叠是不可避免的，因为溢出的四肢的重量将拉到视网膜上。在这些区域，去除视网膜以防止进一步视网膜折叠。记得留下残余的静脉，以稳定视网膜在RPE胆囊和硬化物的顶部。
3. 收集三明治视网膜外植。
   1. 在没有视网膜褶皱的区域，在视网膜上放置手术颤音（图2F）。
   2. 用力压击以穿透硬膜，这会产生裂开的声音。
   3. 将肌酸扭曲 180°，以确保硬化层已完全穿透，使视网膜外植现在从剩余的组织中分离出来。
   4. 将钳子涂抹在硬囊中，将三明治视网膜除植物转移到培养介质（图2G-I）。
   5. 从每个象限的外周视网膜获得2-3个三明治视网膜外植物。
      注：三明治视网膜外植有时可能被困在三叶虫的开口。使用钳子，轻轻地挑出硬盘底部的一小部分。当刀片钝化并可能导致视网膜损失时，这种情况会更频繁发生（图 3A-C）。
   6. 切出 1-2 种视网膜除植物后使用新的肌肽，因为刀片很容易变钝 （图 3C）
      图3：故障排除。在提取过程中，视网膜外植可能被困在手术的开口（A）。轻轻地从硬皮纸底部调出组织，而不接触视网膜（B）。如果手术肌肽用于提取两种以上的视网膜外植，这种情况会更频繁发生，因为刀片很容易变钝（C）。请单击此处查看此图的较大版本。
4. 培养视网膜外植。
   1. 准备含有杜尔贝科改良鹰中等营养混合物F-12（DMEM-F12）和1倍抗生素和抗菌剂混合物（AA，100x库存）的文化介质。
   2. 在外植提取之前，将 500 μL 的介质放在 24 井板的井中，并在孵化器中平滑。这很重要，因为添加介质后可以脱落视网膜。
   3. 培养三明治视网膜除植物在37°C高达72小时在潮湿的5%CO₂ 孵化器在中等准备步骤1.4.2。
   4. 为了诱导类似DR的变化，含有DMEM-F12的介质培养视网膜外植物与Cyt、TNF-α（10 ng/mL）和IL-1+（10 ng/mL）相结合，具有32.5mM HG的组合。

2. 三明治视网膜外植的石蜡嵌入

1. 修复三明治视网膜外植。
   1. 将三明治视网膜除植物浸入 10% 正式植物中至少 24 小时。
   2. 取出正蛋白溶液，将三明治视网膜除植物轻轻地转移到纸巾和盒式磁带中。
   3. 将三明治视网膜除植物浸泡在 70% 乙醇中至少 24 小时。
   4. 石蜡嵌入视网膜外植成块。
   5. 使用微原子将石蜡嵌入的视网膜组织切成 5μm 厚的部分，并安装在玻璃滑梯上。在室温下储存，直到成像。
2. 去帕拉菲因化部分。
   1. 将部分浸入 70% 二甲苯中 5 分钟。
   2. 将部分浸入 100% 二甲苯中 5 分钟。
   3. 将 70% 乙醇中的部分补充水分 5 分钟。
   4. 将部分100%乙醇补水5分钟。
   5. 将自来水下的部分清洗10分钟。

3. 使用 H&E、IHC 和磁性发光检测进行特征分析

1. H&E 染色协议
   1. 使用步骤 2.2 对部分进行除以。
   2. 将部分水合在自来水中5分钟。
   3. 将吉尔的 2 血氧林溶液中的部分弄脏 5 分钟。
   4. 在自来水下彻底清洗部分，以去除多余的污渍。
   5. 区分通过浸渍两次在1%酸酒精。
   6. 在自来水下快速清洗部分。
   7. 将部分涂成蓝色，在 1% 碳酸锂（10 毫克/毫升）中浸渍六次。
   8. 在自来水下彻底清洗部分5分钟，去除多余的蓝色污渍。
   9. 将部分浸入 1% eosin 10 次。
   10. 在自来水下快速清洗部分，以去除多余的污渍。
   11. 脱水部分浸渍10次在100%乙醇。做两次。
   12. 将部分浸入 70% 二甲苯 10 次。
   13. 将部分浸入 100% 二甲苯 10 次。
   14. 使用二丁二甲酸酯聚苯乙烯 （DPX） 安装介质安装覆盖唇。
   15. 使用光显微镜拍摄图像。
2. IHC 标签协议 '
   1. 使用步骤 2.2 对部分进行除以。
   2. 将幻灯片放入包含 10 mM 柠檬酸钠缓冲液的溶液中，在 pH 6.0 时将 0.05% Tween 20 置于溶液中，并在 121 °C 自动压力锅中运行抗原检索，持续 2 分钟。
   3. 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中的洗涤部分 5 分钟。这样做3次。
   4. 在室温下，用含有 0.1% Triton X-100 和 10% 正常山羊血清的 PBS 将部分阻断 1 小时。
   5. 在 4 °C 下隔夜孵育部分，初级抗体与二级抗体（材料表）结合。
   6. 在 PBS 中清洗部分 5 分钟。这样做3次。
   7. 污渍核使用 4+，6-迪亚米迪诺-2-苯丙氨酸酯 （DAPI） 2 分钟。
   8. 使用防褪色试剂清洗和安装部分。
   9. 用指甲油密封盖片。
   10. 使用聚焦激光扫描显微镜拍摄图像。
3. 磁性发光检测
   1. 在 24 小时和 72 小时将 75 μL 的介质从每口井转移到 96 井 U 底板。
   2. 使用 Luminex 细胞因子检测分析 IL-18、IL-6、IL-8 和血管内皮生长因子 （VEGF） 的细胞超高分子。按照制造商的指示进行检测^16。

Representative Results

视网膜完整性保留在这个HORC模型。 视网膜完整性保留在培养的三明治视网膜外植中，但在没有相邻结构的视网膜培养中丢失。H&E 进行了研究，以检查 72 小时后分片三明治视网膜外植的结构完整性。三明治视网膜外植显示出保存的完整性和独特的跛脚结构，从GCL到 ONL与紧凑的核在 INL 和 ONL （图4A）。然而，在同一样本的边缘发现视网膜完整性中断，视网膜已脱离底层RPE-胆碱和硬化，显示视网膜厚度降低和NAL和ONL（图4B）的细胞核流失。

图4：在介质中培养的视网膜外植的H&E图像为72小时。A） 结构完整性在附着在底层 RPE 胆碱和硬皮的区域保持，由每个视网膜层从 GCL 到 ONL 的明显分离以及 INL 和 ONL 中的紧凑核所描绘。B） 与RPE-胆碱和硬骨分离的区域视网膜完整性严重丧失，这表现为整体视网膜厚度降低和 INL 和 ONL 核数的减少。缩放栏 = 50 μm.请单击此处查看此图的较大版本。

使用 IHC 对视网膜外植的特征表明，即使在培养 72 小时后，视网膜的完整性也得到很好的保存。在基础条件下培养的视网膜外植中，没有发现标记凋亡的 TUNEL 阳性细胞核，即使在 72h （图 5A-C）之后，也显示出持续的细胞生存能力。GFAP表达在GCL和IPL中保持本地化，如正常视网膜组织^17，18。没有胶质纤维化，Müller细胞激活和增殖的迹象，以回应视网膜炎症，否则将被确定为向上调节的GFAP表达，延伸到OFL 10，11，12（图5D-F）。维门汀标签（红色）从GCL到OML都表现了高度，显示出保存下来的穆勒细胞完整性，如正常视网膜组织（图5G-I）。

图5：在基底介质中培养72小时后视网膜外植的IHC图像。缺乏 TUNEL 阳性染色（绿色）表明，从 GCL 到 ONL（A-C）的视网膜层中未发生细胞凋亡。GFAP 标签（红色）仅限于 GCL 和 IPL，无需胶质纤维化，这将被确定为 GFAP 在 ONL（D-F）中的扩展表达。维门汀（红色）从GCL到 ONL 表达强烈，定位跨越这些视网膜层（G-I） 的穆勒细胞。细胞核被DAPI（蓝色）染色。缩放栏 = 50 μm.请单击此处查看此图的较大版本。

DR 模型由在 HG 和 Cyt 中培养三明治视网膜外植剂开发。 HG 和 Cyt、IL-1+ 和 TNF-α相对于基线水平增加了 IL-18、VEGF、IL-6 和 IL-8 的分泌。Luminex 检测用于测量在 HG + Cyt 条件下培养 24 和 72 h 后由视网膜外植物分泌的细胞因子 IL-18、VEGF、IL-6 和IL-8（图 6）。为了尽量减少供体间差异，将分泌的细胞因子水平与基线（由虚红线表示）进行比较，基线由同一捐赠者的三明治植芽分泌的细胞因子水平表示，但以基底介质培养（以第 1.4.1 步准备）。24小时后，分泌的IL-18、VEGF、IL-6和IL-8水平相对于基线显著增加。72小时后，只有IL-18和VEGF水平保持显著升高，而IL-6和IL-8水平与基线相比没有显著差异。

图6：24小时和72小时后，在HG和Cyt、IL-1+和TNF-α培养的三明治视网膜外生植物释放的细胞因子。分泌的 IL-18、VEGF、IL-6 和 IL-8 水平在 24 小时后显著高于基线（p < 0.05）。72小时后，IL-18 和 VEGF 水平仍显著提高（p < 0.05），但与基线相比，IL-6 和 IL-8 水平没有显著差异。虚红线表示基线水平，该水平表示由来自同一捐赠者的植种物分泌但以正常介质培养的细胞因子水平。请单击此处查看此图的较大版本。

Discussion

HORC是目前临床前视网膜研究中最临床可翻译的模型。与体外细胞培养模型相比，HORC可以通过保留动态视网膜细胞类型及其与神经元、血管和细胞^外环境的连接，更好地在原地代表人类视网膜的解剖学。与动物模型相比，HORC在研究人类视网膜疾病的病理生理学和设计药物治疗方面更有利，因为物种间的变化，如不同的视网膜细胞类型以及不同的光受体密度和比例，尽管动物模型¹⁹取得了积极成果，但可能有助于临床试验的失败。然而，在以前的HORC协议中，视网膜被故意从RPE胆囊和硬化物中分离。如果没有坚硬的硬囊，脆弱的视网膜是难以处理和视网膜的完整性可能会受到损害，如果直接处理钳子^{6，7，8，9。}这一点的证明是，以前使用分离视网膜的研究报告，Müller细胞活化和TUNML阳性核增加72h培养。这与我们的发现形成鲜明对比，表明三明治方法可以更好地保持视网膜的完整性。其次，在没有RPE的视网膜培养的动物ORC模型中发现神经元退化和胶质增殖增加，而视网膜培养与RPE^{10，11，12。}

为了尽量减少损害视网膜完整性的机会，在这部小说的HORC协议中使用了三明治视网膜外植物。与以前的 HORC 协议相比，肌酸不仅切入视网膜，而且切开 RPE-vitre 和硬化物，因此产生的外生植物被"夹住"，稳定在残余的病毒和底层结构之间。残余的视网膜将视网膜压低，以防止折叠和脱离底层结构，而硬化物充当脚手架，以支持视网膜结构，以保护视网膜免受钳子引起的伤害。此外，用RPE培养视网膜可以防止视网膜退化和胶质增殖在培养10，11，12。

提取三明治视网膜外植时记得以下几点。沿着 limbus 切割时，镜头会压低虹膜，但不会落入眼杯内，因为它通过 zonule 纤维连接到辅助身体。将钳子涂在硬囊上，避免接触视网膜，以防止破坏视网膜的完整性。在将视网膜除植物放入井中之前，先用介质填充栽培井。将视网膜除植物放入井中后加入介质会增加将视网膜从 RPE 胆碱和硬化剂中排出或翻转整个外植物倒置的风险。在四个象限进行深度切口时，请注意，周围视网膜可能会因眼杯的四肢泄漏而分离。要防止视网膜分离或折叠，请移除拉扯视网膜的区域中的四肢。虽然前一点建议去除视网膜上的静脉拉力，留下足够的残余的静脉，以称重视网膜在RPE胆碱和硬膜的顶部，以提高三明治视网膜外植的稳定性。当穿过坚韧、纤维状的硬囊时，肌颤音很容易变得钝。因此，可能需要过度的力，或者硬囊可能无法完全穿透。每1-2个提取视网膜外植物使用一个新的三苯丙酸，以避免通过硬化层的不完全渗透。小心处理的经验对于保护视网膜至关重要：因此，在使用有限的捐赠者硬皮眼罩之前，建议使用与人眼大小和结构相似的猪眼训练。

视网膜完整性被保存在夹在残余的病毒和潜在的RPE胆囊和硬骨之间的外生植物中。与单独培养视网膜相比，当培养的视网膜除菌剂附着在RPE-巧克力和硬膜上时，H&E染色表现出更好的结构完整性。支持这一发现，缺乏TUNEL阳性细胞核表明，所有视网膜层中均缺乏凋亡，表明即使在72小时后，细胞的生存能力仍然得到保留。此外，维他汀标签证实了Müller细胞的完整性和GCL和INL中受限的GFAP表达，在正常视网膜中发现，再次验证了视网膜中缺乏炎症或应激信号。

本研究中的HORC模型在预防视网膜炎症和细胞凋亡的同时，保持了视网膜结构和穆勒细胞完整性。此外，它可用于模拟视网膜疾病，这对于确定疾病途径和药物机制特别有用。先前的动物和体外研究表明，当动物视网膜或细胞暴露于HG和Cyt^13、14、15时^，可以诱发DR炎症。在这项 HORC 研究中，通过将 HG 和 Cyt 应用于培养中 24 小时的三明治外植，IL-18、VEGF、IL-6 和 IL-8 的分泌显著高于基线。与非糖尿病对照组相比，这些细胞因子在DR患者的血清和血清中明显增加，验证了这种DR模型在临床上可翻译20、21、22、23、24、25。虽然这项研究只使用磁性发光检测的DR，其他技术，如西式印迹，IHC和聚合链反应（PCR）也可以执行^26。

尽管上面列出了明显的优点，但这种新颖的HORC模型也有一定的局限性。此协议的一个主要限制是组织供应不足。捐赠者眼杯，有所有的眼部结构，但角膜一般被移除移植，很少可用于研究，因为大量的需求，在外科手术，如青光眼分流，轨道植入物，视网膜分离损伤修复和暴露缝合线的覆盖。为了尽量减少这一限制，我们建议从同一捐助者那里收集所有实验组。这消除了考虑供体间变异的需要，例如年龄、疾病持续时间、基线细胞因子水平，以及如果在不同患者之间进行比较，可能导致变量混淆的其他因素。此外，大多数捐赠者组织来自老年人，因为很难从年轻年龄组获得样本，即使有，年轻捐赠者的死因也常常是创伤性的，导致不适合培养的受损组织。然而，鉴于大多数慢性视网膜疾病发生在老年患者身上，该模型在研究与年龄相关的慢性视网膜疾病（如DR和与年龄相关的黄斑变性）方面仍然具有用处。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Disposable Biopsy Punches (5 mm)	Integra York PA Inc., USA	21909-142	Referred as surgical trephines in this article
Human Recombinant IL-1β	Peprotech, USA	200-01B	Working concentration: 10 ng/mL
Human Recombinant  TNF-a	Peprotech, USA	300-01A	Working concentration: 10 ng/mL
DAPI (1 µg/mL)	Sigma Aldrich, Germany	#D9542	Nuclear stain. Working dilution 1:1000
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement	Gibco, Thermofisher, Scientific Inc., USA	10565018	Dulbecco’s Modified Eagle Medium nutrient mixture F-12 containing a 1× antibiotics and antimycotics mixture (AA, 100× stock)
Fine Scissors - Sharp-Blunt	Fine Science Tools (F.S.T)	14028-10	Tips: Sharp-Blunt, Cutting Edge: 27mm, Length: 10cm, Alloy/Material: Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight
Graefe Forceps	Fine Science Tools (F.S.T)	11050-10	Length:10cm, Tip shape: Straight, Tips: Serrated, Tip Width: 0.8mm, Tip Dimensions:0.8 x 0.7mm, Alloy/Materials: Stainless Steel
Mouse monoclonal GFAP-Cy3	Sigma Aldrich, Germany	#C9205	Primary antibody conjugated to Cy3. Working dilution 1:1000.
Mouse monoclonal Vimentin-Cy3	Sigma Aldrich, Germany	#C9080	Primary antibody conjugated to Cy3. Working dilution 1:50.
Rabbit polyclonal TUNEL (In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein)	Sigma Aldrich, Germany	#11684795910	Primary antibody conjugated to Fluorescein-dUTP. Working dilution 1:10 with enzyme-buffer solution.