Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Karakterisering af en ny human organotypic retinal kultur teknik

Published: June 9, 2021 doi: 10.3791/62046
Automatic Translation
*1, 1, 1, *1
1Buchanan Ocular Therapeutics Unit, Department of Ophthalmology and the New Zealand National Eye Centre, University of Auckland
* These authors contributed equally

Summary

Denne undersøgelse har til formål at udvikle en ny human organotypic retinal kultur (HORC) model, der forhindrer kompromittere retinal integritet under explant håndtering. Dette opnås ved at dyrke nethinden med den overliggende glaslegeme og det underliggende retinale pigment epitel-choroid (RPE-choroid) og sclera.

Abstract

Tidligere humane organotypic retinal kultur (HORC) modeller har udnyttet løsrevne nethinder; men uden den strukturelle støtte, som retinale pigment epitel-choroid (RPE-choroid) og sclera, integriteten af den skrøbelige nethinden let kan kompromitteres. Formålet med denne undersøgelse var at udvikle en ny HORC model, der indeholder nethinden, RPE-choroid og sclera at opretholde retinal integritet, når dyrkning retinale explants.

Efter at have skåret omkredsligt langs limbus for at fjerne iris og linse, fire dybe snit blev foretaget for at flade øjet. I modsætning til tidligere HORC protokoller, en trephin blev brugt til at skære igennem ikke kun nethinden, men også RPE-choroid og sclera. De resulterende triple-lag explants blev kultiveret i 72 timer. Hæmatoxylin og Eosin farvning (H&E) blev brugt til at vurdere anatomiske strukturer og retinale explants var yderligere karakteriseret ved immunohistochemistry (IHC) for apoptose, Müller celle integritet og retinal betændelse. For at bekræfte muligheden for sygdom induktion, explants blev udsat for høj glukose (HG) og pro-inflammatoriske cytokiner (Cyt), at efterligne diabetisk retinopati (DR). Luminex magnetiske perle assay blev brugt til at måle DR-relaterede cytokiner frigivet i kulturmediet.

H &E farvning afslørede forskellige retinale lameller og kompakte kerner i retinale explants med den underliggende RPE-choroid og sclera, mens nethinder uden de underliggende strukturer udviste reduceret tykkelse og alvorlige kerner tab. IHC-resultater indikerede fravær af apoptose og retinal inflammation samt bevaret Müller celleintegritet. Luminex-analyserne viste signifikant øget udskillelse af DR-associerede proinflammatoriske cytokiner i retinale explants, der blev eksponeret for HG + Cyt i forhold til baselineniveauer ved 24 timer.

Vi har med succes udviklet og karakteriseret en ny HORC-protokol, hvor retinal integritet blev bevaret uden apoptose eller retinal betændelse. Desuden tyder den inducerede udskillelse af DR-associerede proinflammatoriske biomarkører, når de udsætter retinale explants for HG + Cyt, at denne model kan bruges til klinisk oversættelige retinale sygdomsundersøgelser.

Introduction

Nethinden er en højt specialiseret okulær struktur, der er ansvarlig for at omdanne indgående lysenergi til elektriske signaler, som derefter behandles af hjernen for visuel opfattelse. Den menneskelige nethinde indeholder et dynamisk område af celletyper, velorganiseret i en unik lamellar struktur bestående af to synaptiske og tre kerner lag1 (Figur 1). Retinal homøostase opretholdes af de indviklede forbindelser mellem neuroretinale celler, blodkar, nerver, bindevæv og RPE1. På grund af den sofistikerede retinale anatomi og fysiologi forbliver mekanismer af mange retinale sygdomme stadig dårligt forstået2,3,4,5. For bedre at kunne studere retinale sygdomme er HORC-modeller udviklet6,7,8,9. Sammenlignet med dyreforsøg og in vitro-kulturer er HORC-modeller fordelagtige, fordi de bevarer det dynamiske cellulære miljø og komplekse neurovaskulære interaktioner in situ, hvilket giver en god model til klinisk oversættelse.

Figure 1
Figur 1: Bageste okulære strukturer i det menneskelige øje. Forreste til posterior, retinale lag er: nerve fiber lag (NFL), ganglion cellelag (GCL), indre plexiform lag (IPL), indre nukleare lag (INL), ydre plexiform lag (OPL), ydre nukleare lag (ONL), fotoreceptor indre segment (IS), og photoreceptor ydre lag (OS). Celler i nethinden omfatter ganglion celler (blå), amakrine celler (gul), bipolare celler (rød), vandrette celler (lilla), stang photoreceptorer (pink) og kegle fotoreceptorer (grøn). Glaslegemet er placeret forreste til nethinden. RPE, Bruchs membran, choroid og sclera er placeret posterior til nethinden. Bemærk, at det viste billede kun er en skematisk repræsentation af nethinden, og forholdet mellem celler/retinale tilslutningsmuligheder inden for hvert lag er muligvis ikke tegn på in vivo-indstillingen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Tidligere karakteriseret HORC protokoller6,7,8,9 har involveret adskille nethinden fra den underliggende RPE-choroid og sclera ved hjælp af en kirurgisk trephin. Men uden den støtte, som disse underliggende strukturer, den gennemskinnelige nethinde bliver spinkel, vanskeligt at håndtere og værktøjer såsom sammenkramper kan nemt forstyrre dens integritet. Desuden har isolerende nethinden i kultur uden RPE vist sig at forårsage ganglion celle apoptose og fotoreceptor degeneration10,11,12. Således ville en alternativ HORC-protokol, der minimerer tabet af retinal integritet og bedre efterligner in vivo-miljøet, være nyttig. Dette er især vigtigt, når man studerer retinale sygdomsmekanismer, da fysisk skade under explanthåndtering kan introducere artefakter. Derfor var formålet med denne undersøgelse at udvikle en ny HORC-model, der omfatter RPE-choroid og sclera for at beskytte retinal integritet under explanthåndtering og kultur.

For at nå dette mål blev retinale explants "klemt" mellem de resterende glaslegemer og den underliggende RPE-choroid og sclera ekstraheret. I sandwich explants, glaslegeme vejer ned nethinden for at forhindre nethinde løsrivelse og foldning, mens den hårde, fibrøse sclera fungerer som både et stillads for strukturel støtte og et kontaktpunkt for sammentøvler. Desuden har dyremodeller vist, at bevare RPE i kultur kan forhindre retinal degeneration og glial spredning, en reaktion af Müller celler til faresignaler såsom hypoxi og betændelse10,11,12.

For at karakterisere modellen blev der udført sandwich retinale explants med Hematoxylin og Eosin (H&E) for at vurdere anatomiske strukturer og immunohistochemistry (IHC), mærkning af explants med terminal deoxynukleotidyl transferase dUTP nick end mærkning (TUNEL, en apoptotisk cellemarkør), glial fibrillalsyresyreprotein (GFAP, en retinal betændelse og Müller celleaktiveringsmarkør) og vimentin, en markør for Müller celleintegritet. For at afgøre, om denne model kan induceres til at udvikle molekylære sygdomstegn, blev explants udsat for høj glukose (HG) med proinflammatoriske cytokiner (Cyt), interleukin-1β (IL-1β) og tumornekrosefaktor-α (TNF-α), et kulterende miljø, der har vist sig at efterligne diabetisk retinopati (DR) i både celle- og dyresygdomsmodeller13,14,15. Luminex-analyser blev anvendt i DR-modellen til at måle cytokiner, der blev frigivet til kulturmediet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Human donor øjenkopper blev opnået fra New Zealand National Eye Bank efter hornhinde excision for transplantation og som godkendt af Northern B Health and Disability Ethics Committee (NTX/06/19/CPD/AM07).

BEMÆRK: Kulturen skal ske i et klasse II biosikkerhedskab for at sikre sterile vævskulturforhold. Vævene skal dyrkes inden for 24 timer post mortem for at undgå betydelige retinal integritet tab.

Figure 2
Figur 2: Billeder, der viser proceduren for indsamling af sandwich retinale explants. Til explant forberedelse, bruge dissekere saks med en skarp spids og en stump ende, med den stumpe ende vender indersiden af kloden for at reducere vævsskader under snit. Brug også sammentrækninger med stumpe ender for at undgå at ridse det intraokulære væv under håndtering. Brug kirurgisk saks, med den stumpe ende vender indersiden, skære langs limbus at fjerne iris og linse (A-C). ONH kan placeres, hvis man kigger direkte ind i det åbne øjekop(D). Brug sammentak med stumpe spidser, hold scleraen for at stabilisere kloden (E). Del kloden lodret i to halvdele ved at lave to dybe snit mod ONH, men skær ikke gennem ONH. Gentag dette langs den vandrette meridian (G). Påfør stumpe sammentypninger på sclera og forsigtigt åbne kloden til en kløver form (H-K). Brug kraften til omhyggeligt at manipulere glaslegemet for at glatte den foldede nethinde, da de glasagtige slæbebåde på nethinden, men rør ikke nethinden direkte (I). Fjern glaslegemet, hvis det forårsager nethindemontering eller foldning (ikke vist i figur 2, da den gennemsigtige glaslegeme ikke er godt fanget på fotos). Find områder, hvor nethinden er flad og udtrække retinale explants ved hjælp af en kirurgisk trephin (L). Anvendelse af sammenkakter på sclera, forsigtigt overføre retinale explants i præ-forberedt kultur medium (M,N). Hele sandwich explant skal synke til bunden af brønden på grund af sin vægt, derfor er hver explant nedsænket i mediet (O). Klik her for at se en større version af dette tal.

1. Udvinding af sandwich retinale explants fra øjekoppen

  1. Fjern iris og linse.
    1. Placer øje kop inde i en Petri parabol, med iris og linse vender opad og synsnerven hovedet (ONH) kontakte Petri parabol (Figur 2A).
    2. Hold øjekoppen stabil ved limbus ved hjælp af sammentak (Figur 2B).
    3. Fjern iris og linse ved at foretage små snitsår omkredsligt langs yderkanten af limbus (Figur 2A).
    4. Fjern iris og linse forsigtigt. Undgå at forstyrre nethinden under manipulation (Figur 2C).
      BEMÆRK: Linsen vil ikke falde i øjet kop, da det er knyttet, via zonule fibre, til ciliary kroppen.
  2. Flad øje kop.
    1. Med øjet kop stadig sidder oprejst, identificere ONH. Dette er lettere med en lys hvid lyskilde (Figur 2D).
    2. Incise på de fire kvadranter mod ONH (figur 2E). Petriskålen kan drejes for lettere håndtering. Skær IKKE ONH.'
    3. Spred og flad øje kop omhyggeligt (Figur 2E).
    4. Påfør sammentrækninger på sclera i stedet for nethinden for at undgå at forstyrre retinal integritet.
      BEMÆRK: Perifer nethindemontering og foldning er uundgåelig, da vægten af den overfyldte glaslegeme vil trække på nethinden. I disse områder skal du fjerne glaslegemet for at forhindre yderligere nethindefoldning. Husk at forlade resterende glaslegemer for at stabilisere nethinden oven på RPE-choroid og sclera.
  3. Saml sandwich retinale explants.
    1. Placer en kirurgisk trephin på nethinden i et område uden retinale folder (Figur 2F).
    2. Tryk hårdt for at trænge ind i scleraen, som skal generere en revnende lyd.
    3. Drej trephin med 180 ° for at sikre, at sclera er blevet gennemtrængt fuldt ud således, at nethinden explant er nu adskilt fra det resterende væv.
    4. Påfør sammenknene på sclera og overføre sandwich retinal explant til kulturmediet (Figur 2G-I).
    5. Få 2-3 sandwich retinale explants fra den perifere nethinde af hver kvadrant.
      BEMÆRK: Sandwich retinal explant kan undertiden være fanget i åbningen af trephin. Ved hjælp af sammenkæd, forsigtigt drille en lille del af bunden af sclera. Dette sker oftere, når klingen er stump og kan forårsage tab af nethinden (Figur 3A-C).
    6. Brug en ny trephin efter at skære ud 1-2 retinale explants som bladet bliver stump nemt (Figur 3CFigure 3
      Figur 3: Fejlfinding. Under udvindingsprocessen kan nethindens explant være fanget ved åbningen af den kirurgiske trephin (A). Teaser forsigtigt vævet ud fra bunden af scleraen uden at røre nethinden(B). Dette kan ske oftere, hvis den kirurgiske trephin bruges til at udtrække mere end to retinale explants, da bladet let kan blive stump (C). Klik her for at se en større version af dette tal.
  4. Kultur retinale explants.
    1. Forbered kulturmediet, der indeholder Dulbeccos Modified Eagle Medium næringsblanding F-12 (DMEM-F12) og en 1x antibiotika og antimykotikablanding (AA, 100x lager).
    2. Før explantudvinding placeres 500 μL medium i brøndene på en 24-brøndsplade og ekvilibrere i inkubatoren. Dette er vigtigt, da tilføje mediet bagefter kan løsne nethinden.
    3. Kultur sandwich retinal explants ved 37 °C i op til 72 timer i en befugtet 5% CO2 inkubator i medium fremstillet i trin 1.4.2.
    4. For at fremkalde DR-lignende ændringer, kultur retinale explants i medium, der indeholder DMEM-F12 med en kombination af 32,5 mM HG med Cyt, TNF-α (10 ng/mL) og IL-1β (10 ng/mL).

2. Paraffin-indlejring af sandwich retinale explants

  1. Fix sandwich retinal explants.
    1. Fordyb sandwich retinal explants i 10% formalin i mindst 24 timer.
    2. Fjern formalinopløsningen og overfør sandwich retinale explants forsigtigt i vævspuder og kassetter.
    3. Soak sandwich retinale explants i 70% ethanol i mindst 24 timer.
    4. Paraffin-integrere retinale explants i blokke.
    5. Skær paraffin-indlejret retinal væv i 5 μm tykke sektioner ved hjælp af en mikrotom og montere på glas dias. Opbevar ved stuetemperatur indtil billeddannelse.
  2. Deparaffinize sektioner.
    1. Fordyb sektionerne i 70% xylen i 5 min.
    2. Fordyb sektionerne i 100% xylen i 5 min.
    3. Rehydrere sektionerne i 70% ethanol i 5 min.
    4. Rehydrere sektionerne i 100% ethanol i 5 min.
    5. Vask sektionerne under rindende vand fra hanen i 10 min.

3. Karakterisering ved hjælp af H&E, IHC og en magnetisk Luminex-analyse

  1. H&E-farvningsprotokol
    1. Deparaffiner sektionerne ved hjælp af trin 2.2.
    2. Hydrat sektionerne i postevand i 5 min.
    3. Plet sektionerne i Gills 2 hæmatoxylinopløsning i 5 min.
    4. Vask sektionerne grundigt under rindende vand fra hanen for at fjerne overskydende plet.
    5. Differentiere ved at dyppe sektionerne to gange i 1% syrealkohol.
    6. Vask sektionerne hurtigt under rindende vand fra hanen.
    7. Plette sektionerne blå ved at dyppe seks gange i 1% lithiumcarbonat (10 mg/mL).
    8. Vask sektionerne grundigt under rindende vand fra hanen i 5 minutter for at fjerne overskydende blå plet.
    9. Dyp sektionerne i 1% eosin 10 gange.
    10. Vask sektionerne hurtigt under vand fra hanen for at fjerne overskydende plet.
    11. Dehydrere sektionerne ved at dyppe dem 10 gange i 100% ethanol. Gør det to gange.
    12. Dyp sektionerne i 70% xylen 10 gange.
    13. Dyp sektionerne i 100% xylen 10 gange.
    14. Monter med en coverlip ved hjælp af dibutylphthalat polystyren xylen (DPX) montering medium.
    15. Tag billeder ved hjælp af et let mikroskop.
  2. IHC-mærkningsprotokol«
    1. Deparaffiner sektionerne ved hjælp af trin 2.2.
    2. Rutsjebanerne placeres i en opløsning, der indeholder 10 mM natriumcitratbuffer med 0,05 % Mellem 20 ved pH 6,0, og kør en antigenudtagning i en trykkoger, der er automatiseret ved 121 °C i 2 min.
    3. Vaskesektioner i fosfatbufferet saltvand (PBS) i 5 min. Gør det 3 gange.
    4. Bloker sektionerne med PBS indeholdende 0,1% Triton X-100 og 10% normalt gedeserum i 1 time ved stuetemperatur.
    5. Inkuber sektioner natten over ved 4 °C med primære antistoffer, der er konjugeret til sekundære antistoffer (Materialetabel).
    6. Vaskesektioner i PBS i 5 min. Gør det 3 gange.
    7. Stain kerner ved hjælp af 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) i 2 min.
    8. Vask og monter sektioner ved hjælp af et anti-fade reagens.
    9. Seal coverlips med neglelak.
    10. Tag billeder ved hjælp af et konfokalt laserscanningsmikroskop.
  3. Magnetisk Luminex-analyse
    1. Overfør 75 μL medier fra hver brønd til en 96-godt-u-bundplade ved 24 og 72 timer.
    2. Analysere cellen supernatant for IL-18, IL-6, IL-8 og vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) efter 24 og 72 timer ved hjælp af Luminex cytokin assay. Følg producentens anvisninger for at udføre analysen16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Retinal integritet blev bevaret i denne HORC-model. Retinal integritet blev bevaret i de kultiverede sandwich retinale explants, men gik tabt i nethinden dyrkes uden tilstødende strukturer. H &E blev gennemført for at undersøge den strukturelle integritet af sektionsopdelte sandwich retinale explants efter 72 timer i kultur. Sandwich retinal explants viste bevaret integritet og en særskilt lameller struktur fra GCL til ONL med kompakte kerner i INL og ONL (Figur 4A). Imidlertid blev forstyrret retinal integritet fundet ved kanterne af den samme prøve, hvor nethinden havde løsrevet sig fra den underliggende RPE-choroid og sclera, der viser reduceret retinal tykkelse og sever tab af kerner i INL og ONL (Figur 4B).

Figure 4
Figur 4: H&E billeder af retinale explants dyrkes i medium i 72 timer. A) Strukturel integritet opretholdes i områder, der er fastgjort til den underliggende RPE-choroid og sclera, afbildet ved den særskilte adskillelse af hvert retinal lag fra GCL til ONL og kompakte kerner i INL og ONL. B) Alvorligt tab i retinal integritet i regioner, der er løsrevet fra RPE-choroid og sclera, vist ved den samlede reduktion af nethindens tykkelse og nedsat antal kerner i INL og ONL. Skalalinje = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Karakterisering af retinale explants ved hjælp af IHC demonstreret velbevaret retinal integritet selv efter 72 timer i kultur. Ingen TUNEL-positive cellekerner, som markerer apoptose, blev fundet i retinale explants, der dyrkes under basale forhold, hvilket viser vedvarende celle levedygtighed selv efter 72 timer (Figur 5A-C). GFAP udtryk forblev lokaliseret i GCL og IPL, som det ses i normale retinale væv17,18. Der var ingen glial fibrose, et tegn på Müller celleaktivering og spredning som reaktion på retinal betændelse, som ellers ville blive identificeret som upreguleret GFAP-udtryk, der strækker sig ind i ONL10,11,12( Figur5D-F). Vimentinmærkning (rød) var stærkt udtrykt fra GCL til ONL, der viser bevaret Müller celleintegritet, som det ses i normale retinale væv (Figur 5G-I).

Figure 5
Figur 5: IHC billeder af retinale explants efter dyrkning i basal medier i 72 timer. Manglen på TUNEL-positiv farvning (grøn) tyder på, at der ikke er forekommet cellulær apoptose i nethinden lag fra GCL til ONL (A-C). GFAP-mærkning (rød) var begrænset til GCL og IPL uden glial fibrose, som ville blive identificeret som udvidet udtryk for GFAP i ONL (D-F). Vimentin (rød) var stærkt udtrykt fra GCL til ONL, lokalisere Müller celler, der spænder gennem disse retinale lag (G-I). Cellekerner blev plettet med DAPI (blå). Skalalinje = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

En DR-model blev udviklet ved at dyrke sandwich retinale explants i HG og Cyt. HG og Cyt, IL-1β og TNF-α, øgede udskillelsen af IL-18, VEGF, IL-6 og IL-8 i forhold til baseline niveauer. En Luminex-analyse blev brugt til at måle cytokiner IL-18, VEGF, IL-6 og IL-8 udskilles af retinale explants efter dyrkning i 24 og 72 timer under HG + Cyt betingelser (Figur 6). For at minimere forskelle mellem donorer blev udskillede cytokinniveauer sammenlignet med baseline (angivet med den stiplede røde linje), repræsenteret ved cytokinniveauer, der udskilles af sandwicheksplanterne fra samme donor, men dyrkes i basalmedie (fremstillet i trin 1.4.1). Efter 24 timer steg udskilles IL-18, VEGF, IL-6 og IL-8 niveauer betydeligt i forhold til baseline. Efter 72 timer forblev kun IL-18- og VEGF-niveauerne betydeligt forhøjede, mens der ikke blev fundet nogen signifikant forskel i IL-6- og IL-8-niveauerne sammenlignet med baseline.

Figure 6
Figur 6: Cytokiner frigives af sandwich retinale explants dyrkes i HG og Cyt, IL-1β og TNF-α, efter 24 og 72 timer. De udskilte IL-18, VEGF, IL-6 og IL-8 niveauer steg betydeligt over baseline efter 24 timer (p < 0,05). Efter 72 h forblev IL-18- og VEGF-niveauerne signifikant forhøjet (p < 0,05), men der blev ikke fundet nogen signifikant forskel i IL-6- og IL-8-niveauerne sammenlignet med baseline. Den stiplede røde linje angiver det oprindelige niveau, som repræsenterer cytokinniveauer, der udskilles af explants fra den samme donor, men dyrkes i normalt medium. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

HORC er i øjeblikket den mest klinisk oversættelige model i præklinisk retinal forskning. Sammenlignet med in vitro celle kultur modeller, horc kan bedre repræsentere anatomien af den menneskelige nethinden in situ, ved at bevare de dynamiske retinale celletyper og deres forbindelser med neuroner, vasulater og ekstracellulære miljø19. Sammenlignet med dyremodeller er HORC mere fordelagtige i at studere patofysiologien af og designe farmaceutiske behandlinger for humane retinale sygdomme på grund af variationer mellem arter, såsom forskellige retinale celletyper samt varierende fotoreceptortæthed og proportioner, hvilket kan bidrage til mislykkede kliniske forsøg på trods af positive resultater i dyremodeller19. Men i tidligere HORC protokoller, nethinden var bevidst løsrevet fra RPE-choroid og sclera. Uden den hårde sclera er den spinkle nethinde vanskelig at håndtere, og retinal integritet kan kompromitteres, hvis den håndteres direkte af sammenkangninger6,7,8,9. Dette fremgår af det faktum, at tidligere undersøgelser ved hjælp af isolerede nethinder har rapporteret øget Müller celle aktivering og TUNEL-positive kerner med 72 timers kultur. Dette er i modsætning til vores resultater, hvilket tyder på, at sandwichmetoden bedre bevarer retinal integritet. For det andet blev der fundet øget neuronal degeneration og glial spredning i dyre ORC-modeller i nethinden, der dyrkes uden RPE, sammenlignet med nethinden, der dyrkes med RPE10,11,12.

For at minimere chancerne for at kompromittere retinal integritet, sandwich retinale explants blev udnyttet i denne nye HORC protokol. I modsætning til tidligere HORC protokoller, trephin skære gennem ikke kun nethinden, men også RPE-glaslegeme og sclera, således at den resulterende explant er "klemt" og stabiliseret mellem de resterende glaslegemer og de underliggende strukturer. Den resterende glaslegeme vejer nethinden ned for at forhindre foldning og løsrivelse fra de underliggende strukturer, mens sclera fungerer som et stillads til at støtte retinal arkitektur for at beskytte nethinden mod forceps-induceret skade. Desuden kan dyrkning af nethinden med RPE forhindre retinal degeneration og glial spredning i kultur10,11,12.

Husk følgende punkter, når du udvinder sandwich retinale explants. Når du skærer langs limbus, linsen vil veje ned iris, men vil ikke falde inde i øjet kop, som det er knyttet, via zonule fibre, til ciliary kroppen. Påfør sammentrækninger på sclera og undgå at røre nethinden for at forhindre forstyrre retinal integritet. Fyld de dyrkende brønde med medium, før du placerer nethinden explant inde i brøndene. Tilføjelse af mediet i efter at placere retinale explants inde i brøndene øger risikoen for at løsne nethinden fra RPE-choroid og sclera eller spejlvende hele explant på hovedet. Når du foretager dybe snit på de fire kvadranter, være opmærksom på, at den perifere nethinde kan løsne sig på grund af glaslegeme utætte ud af øjet kop. For at forhindre løsrivelse eller foldning af nethinden, fjerne glaslegeme i det område, der trækker på nethinden. Selv om det foregående punkt anbefaler at fjerne glaslegeme trække på nethinden, efterlade tilstrækkelig resterende glaslegeme til at veje nethinden på toppen af RPE-choroid og sclera for at øge stabiliteten af sandwich retinale explants. Når man skærer gennem den hårde, fibrøse sclera, kan trephin nemt blive stump. Som følge heraf kan overdreven kraft være påkrævet, eller scleraen må ikke være fuldt gennemtrængt. Brug en ny trephin for hver 1-2 ekstraheret retinale explants at undgå ufuldstændig penetration gennem sclera. Erfaring i omhyggelig håndtering er afgørende for at beskytte nethinden; derfor er træning med porcine øjne, som er ens i størrelse og struktur til det menneskelige øje, tilrådeligt, før du bruger de begrænsede donor scleral eyecups til rådighed.

Retinal integritet blev bevaret i explants klemt inde mellem resterende glaslegemer og den underliggende RPE-choroid og sclera. H &E farvning viste bedre strukturel integritet, når den kultiverede retinale explant var knyttet til RPE-choroid og sclera, sammenlignet med dyrkning af nethinden alene. Støtte denne konstatering, manglen på TUNEL-positive celle kerner foreslog en mangel på apoptose inden for alle retinale lag, der viser bevaret cellulær levedygtighed selv efter 72 timer. Desuden bekræftede vimentinmærkning Müller-celleintegritet og det begrænsede GFAP-udtryk i GCL og INL, der findes i normal nethinde, verificerede igen manglen på inflammatoriske eller stresssignaler i nethinden.

HORC-modellen karakteriseret i denne undersøgelse resulterede i bevaret retinal struktur og Müller celleintegritet, samtidig med at der blev forhindret retinal betændelse og cellulær apoptose. Desuden kan det bruges til at modellere retinale sygdomme, hvilket er særligt nyttigt at identificere sygdomsforløb og farmaceutiske mekanismer. Tidligere dyre- og in vitro-undersøgelser har vist , at DR-betændelse kan fremkaldes, når dyre nethinden eller cellerne udsættes for HG og Cyt13,14,15. I denne HORC-undersøgelse blev udskillelsen af IL-18, VEGF, IL-6 og IL-8 betydeligt forhøjet over baseline ved at anvende HG og Cyt på sandwicheksplanterne i 24 timer i kultur. Disse cytokiner er velkendte for at stige i glaslegemer og serum hos patienter med DR i forhold til ikke-diabetisk kontrol, der bekræfter, at denne DR-model er klinisk oversættes20,21,22,23,24,25. Selv om denne undersøgelse kun har karakteriseret DR ved hjælp af Magnetic Luminex assay, andre teknikker såsom Western Blotting, IHC og polymeriseret kædereaktion (PCR) kan også udføres26.

På trods af de klare fordele, der er skitseret ovenfor, har denne nye HORC-model også nogle begrænsninger. En væsentlig begrænsning af denne protokol er den lave forsyning af væv. Donor øjenkopper, som har alle okulære strukturer, men hornhinden generelt fjernet til transplantation, er sjældent tilgængelige for forskning på grund af den store efterspørgsel efter sclera i kirurgiske procedurer såsom grøn stær shunts, orbital implantater, skader reparation i retinal løsrivelse og dækning af udsatte suturer. For at minimere denne begrænsning foreslår vi, at alle eksperimentelle grupper indsamles fra den samme donor. Dette fjerner behovet for at tage højde for inter-donor-variabilities, såsom alder, varighed af sygdom, baseline cytokin niveauer, og andre faktorer, der kan bidrage til at forvirre variabler, hvis man sammenligner mellem forskellige patienter. De fleste donorvæv er også fra ældre mennesker, da det er sværere at få prøver fra yngre aldersgrupper, og selv når det er tilgængeligt, er dødsårsagen for unge donorer ofte traumatisk af natur, der fører til beskadiget væv, der er uegnede til kultur. Ikke desto mindre, i betragtning af at de fleste kroniske retinale sygdomme forekommer hos ældre patienter, bevarer denne model stadig nytten i studiet af aldersrelaterede kroniske retinale sygdomme som DR og aldersrelateret makuladegeneration.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke de generøse donorer af øjenvæv og holdet fra New Zealand National Eye Bank for deres støtte. Dette arbejde blev økonomisk støttet af projekttilskud fra Maurice og Phyllis Paykel Trust og Auckland Medical Research Foundation (1117015). IDR's bestyrelsespost er støttet af Buchanan Charitable Foundation. CK's stipendium er leveret af New Zealand Association of Optometrists Education and Research Fund (CC36812) og HHL's stipendium er leveret af Buchanan Charitable Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Disposable Biopsy Punches (5 mm) Integra York PA Inc., USA 21909-142 Referred as surgical trephines
in this article
Human Recombinant IL-1β Peprotech, USA 200-01B Working concentration: 10 ng/mL
Human Recombinant  TNF-a Peprotech, USA 300-01A Working concentration: 10 ng/mL
DAPI (1 µg/mL) Sigma Aldrich, Germany #D9542 Nuclear stain. Working dilution 1:1000
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement Gibco, Thermofisher, Scientific Inc., USA 10565018 Dulbecco’s Modified Eagle Medium nutrient mixture F-12 containing a 1× antibiotics and antimycotics mixture (AA, 100× stock)
Fine Scissors - Sharp-Blunt Fine Science Tools (F.S.T) 14028-10 Tips: Sharp-Blunt, Cutting Edge: 27mm, Length: 10cm, Alloy/Material: Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight
Graefe Forceps Fine Science Tools (F.S.T) 11050-10 Length:10cm, Tip shape: Straight, Tips: Serrated, Tip Width: 0.8mm, Tip Dimensions:0.8 x 0.7mm, Alloy/Materials: Stainless Steel
Mouse monoclonal GFAP-Cy3 Sigma Aldrich, Germany #C9205 Primary antibody conjugated to Cy3. Working dilution 1:1000.
Mouse monoclonal Vimentin-Cy3 Sigma Aldrich, Germany #C9080 Primary antibody conjugated to Cy3. Working dilution 1:50.
Rabbit polyclonal TUNEL (In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein) Sigma Aldrich, Germany #11684795910 Primary antibody conjugated to Fluorescein-dUTP. Working dilution 1:10 with enzyme-buffer solution.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kolb, H., Fernandez, E., Nelson, R. Facts and Figures Concerning the Human Retina. Webvision-The Organization of the Retina and Visual System. , Internet (2005).
  2. Gemenetzi, M., De Salvo, G., Lotery, A. Central serous chorioretinopathy: an update on pathogenesis and treatment. Eye. 24 (12), 1743-1756 (2010).
  3. Buschini, E., Piras, A., Nuzzi, R., Vercelli, A. Age related macular degeneration and drusen: neuroinflammation in the retina. Progress in Neurobiology. 95 (1), 14-25 (2011).
  4. Chen, S. -Y., et al. Current concepts regarding developmental mechanisms in diabetic retinopathy in Taiwan. Biomedicine. 6 (2), (2016).
  5. Kaaja, R., Loukovaara, S. Progression of retinopathy in type 1 diabetic women during pregnancy. Current Diabetes Reviews. 3 (2), 85-93 (2007).
  6. Azizzadeh Pormehr, L., et al. Human organotypic retinal flat-mount culture (HORFC) as a model for retinitis pigmentosa11. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (8), 6775-6783 (2018).
  7. Fernandez-Bueno, I., et al. Time course modifications in organotypic culture of human neuroretina. Experimental Eye Research. 104, 26-38 (2012).
  8. Niyadurupola, N., Sidaway, P., Osborne, A., Broadway, D. C., Sanderson, J. The development of human organotypic retinal cultures (HORCs) to study retinal neurodegeneration. British Journal of Ophthalmology. 95 (5), 720-726 (2011).
  9. Osborne, A., Hopes, M., Wright, P., Broadway, D. C., Sanderson, J. Human organotypic retinal cultures (HORCs) as a chronic experimental model for investigation of retinal ganglion cell degeneration. Experimental Eye Research. 143, 28-38 (2016).
  10. Caffe, A., Visser, H., Jansen, H., Sanyal, S. Histotypic differentiation of neonatal mouse retina in organ culture. Current Eye Research. 8 (10), 1083-1092 (1989).
  11. Kaempf, S., Walter, P., Salz, A. K., Thumann, G. Novel organotypic culture model of adult mammalian neurosensory retina in co-culture with retinal pigment epithelium. Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 47-58 (2008).
  12. Liu, L., Cheng, S. -H., Jiang, L. -Z., Hansmann, G., Layer, P. G. The pigmented epithelium sustains cell growth and tissue differentiation of chicken retinal explants in vitro. Experimental Eye Research. 46 (5), 801-812 (1988).
  13. Kuo, C., Green, C. R., Rupenthal, I. D., Mugisho, O. O. Connexin43 hemichannel block protects against retinal pigment epithelial cell barrier breakdown. Acta Diabetologica. 57 (1), 13-22 (2020).
  14. Mugisho, O. O., et al. The inflammasome pathway is amplified and perpetuated in an autocrine manner through connexin43 hemichannel mediated ATP release. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. 1862 (3), 385-393 (2018).
  15. Mugisho, O. O., et al. Intravitreal pro-inflammatory cytokines in non-obese diabetic mice: Modelling signs of diabetic retinopathy. PLoS ONE. 13 (8), 0202156 (2018).
  16. R&D Systems, I. , Available from: https://www.rndsystems.com/protocol-types/luminex (2020).
  17. Nakazawa, T., et al. Attenuated glial reactions and photoreceptor degeneration after retinal detachment in mice deficient in glial fibrillary acidic protein and vimentin. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 48 (6), 2760-2768 (2007).
  18. Okada, M., Matsumura, M., Ogino, N., Honda, Y. Müller cells in detached human retina express glial fibrillary acidic protein and vimentin. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 228 (5), 467-474 (1990).
  19. Murali, A., Ramlogan-Steel, C. A., Andrzejewski, S., Steel, J. C., Layton, C. J. Retinal explant culture: A platform to investigate human neuro-retina. Clinical & Experimental Ophthalmology. 47 (2), 274-285 (2019).
  20. Koleva-Georgieva, D. N., Sivkova, N. P., Terzieva, D. Serum inflammatory cytokines IL-1beta, IL-6, TNF-alpha and VEGF have influence on the development of diabetic retinopathy. Folia Medica (Plovdiv). 53 (2), 44-50 (2011).
  21. Lee, J. -H., et al. Cytokine profile of peripheral blood in type 2 diabetes mellitus patients with diabetic retinopathy. Annals of Clinical & Laboratory Science. 38 (4), 361-367 (2008).
  22. Chorostowska-Wynimko, J., et al. In vitro angiomodulatory activity of sera from type 2 diabetic patients with background retinopathy. Journal of Physiology and Pharmacology: An Official Journal of the Polish Physiological Society. 56, 65-70 (2005).
  23. Khalifa, R. A., Khalef, N., Moemen, L. A., Labib, H. M. The role interleukin 12 (IL-12), interferon-inducible protein 10 (IP-10) and Interleukin 18 (IL-18) in the angiogenic activity of diabetic retinopathy. Research Journal of Medicine and Medical Sciences. 4, 510-514 (2009).
  24. Zhou, J., Wang, S., Xia, X. Role of intravitreal inflammatory cytokines and angiogenic factors in proliferative diabetic retinopathy. Current Eye Research. 37 (5), 416-420 (2012).
  25. Song, Z., et al. Increased intravitreous interleukin-18 correlated to vascular endothelial growth factor in patients with active proliferative diabetic retinopathy. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 252 (8), 1229-1234 (2014).
  26. Louie, H. H., Shome, A., Kuo, C. Y. J., Rupenthal, I. D., Green, C. R., Mugisho, O. O. Connexin43 hemichannel block inhibits NLRP3 inflammasome activation in a human retinal explant model of diabetic retinopathy. Experimental Eye Research. , (2020).

Tags

Medicin Udgave 172 Human Retina Organotypic Kultur Model udvikling Sygdom model
Karakterisering af en ny human organotypic retinal kultur teknik
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kuo, C. Y. J., Louie, H. H.,… More

Kuo, C. Y. J., Louie, H. H., Rupenthal, I. D., Mugisho, O. O. Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique. J. Vis. Exp. (172), e62046, doi:10.3791/62046 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter