Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Karakterisering av en ny human organotypisk retinal kulturteknikk

Published: June 9, 2021 doi: 10.3791/62046
Automatic Translation
*1, 1, 1, *1
1Buchanan Ocular Therapeutics Unit, Department of Ophthalmology and the New Zealand National Eye Centre, University of Auckland
* These authors contributed equally

Summary

Denne studien tar sikte på å utvikle en ny human organotypisk retinal kultur (HORC) modell som forhindrer kompromitterende retinal integritet under explant håndtering. Dette oppnås ved å dyrke netthinnen med det overliggende glasslegemet og det underliggende netthinnen pigment epitel-choroid (RPE-choroid) og sclera.

Abstract

Tidligere humane organotypiske retinal kultur (HORC) modeller har brukt frittliggende netthinner; Men uten strukturell støtte gitt av retinal pigment epitel-choroid (RPE-choroid) og sclera, kan integriteten til den skjøre netthinnen lett bli kompromittert. Målet med denne studien var å utvikle en ny HORC-modell som inneholder netthinnen, RPE-choroiden og sclera for å opprettholde netthinneintegritet når man dyrker retinal explants.

Etter å ha kuttet omkrets langs limbussen for å fjerne iris og linse, ble det laget fire dype snitt for å flate ut øyemusken. I motsetning til tidligere HORC-protokoller ble en trefin brukt til å skjære gjennom ikke bare netthinnen, men også RPE-choroid og sclera. De resulterende trelags explants ble dyrket i 72 timer. Hematoksylin og Eosinfarging (H&E) ble brukt til å vurdere anatomiske strukturer og retinal explants ble ytterligere preget av immunhiistokjemi (IHC) for apoptose, Müller celleintegritet og retinal betennelse. For å bekrefte muligheten for sykdomsinduksjon ble explants utsatt for høy glukose (HG) og proinflammatoriske cytokiner (Cyt), for å etterligne diabetisk retinopati (DR). Luminex magnetiske perleanalyse ble brukt til å måle DR-relaterte cytokiner som slippes ut i kulturmediet.

H&E-farging avdekket distinkte retinal lameller og kompakte kjerner i retinal explants med underliggende RPE-choroid og sclera, mens netthinner uten underliggende strukturer viste redusert tykkelse og alvorlig nuklei tap. IHC-resultatene indikerte fravær av apoptose og retinal betennelse samt bevart Müller celleintegritet. Luminex-analysene viste signifikant økt sekresjon av DR-assosierte proinflammatoriske cytokiner i retinal explants eksponert for HG + Cyt i forhold til baseline nivåer ved 24 timer.

Vi utviklet og karakteriserte en ny HORC-protokoll der netthinneintegritet ble bevart uten apoptose eller retinal betennelse. Videre antyder den induserte sekresjonen av DR-assosierte proinflammatoriske biomarkører når de utsetter retinal explants til HG + Cyt at denne modellen kan brukes til klinisk overførbare retinal sykdomsstudier.

Introduction

Netthinnen er en høyt spesialisert okulær struktur som er ansvarlig for å transformere innkommende lysenergi til elektriske signaler, som deretter behandles av hjernen for visuell oppfatning. Den menneskelige netthinnen inneholder et dynamisk utvalg av celletyper, høyt organisert i en unik lamellstruktur som består av to synaptiske og tre nukleilag1 (figur 1). Retinal homeostase opprettholdes av de intrikate forbindelsene mellom nevroretinale celler, blodkar, nerver, bindevev og RPE1. På grunn av den sofistikerte retinal anatomien og fysiologien forblir mekanismer for mange netthinnesykdommer fortsatt dårlig forstått2,3,4,5. For bedre å studere netthinnesykdommer er HORC-modeller utviklet6,7,8,9. Sammenlignet med dyrestudier og in vitrokulturer, er HORC-modeller fordelaktige fordi de beholder det dynamiske cellulære miljøet og komplekse nevrovaskulære interaksjoner in situ, noe som gir en god modell for klinisk oversettelse.

Figure 1
Figur 1: Bakre okulære strukturer i det menneskelige øye. Fremre til bakre, retinal lag er: nerve fiber lag (NFL), ganglion cellelag (GCL), indre plexiform lag (IPL), indre kjernefysisk lag (INL), ytre plexiform lag (OPL), ytre kjernefysisk lag (ONL), fotoreseptor indre segment (IS), og photoreceptor ytre lag (OS). Celler i netthinnen inkluderer ganglionceller (blå), amacrine celler (gul), bipolare celler (rød), horisontale celler (lilla), stang fotoreseptorer (rosa) og kjegle fotoreseptorer (grønn). Glasslegemet ligger fremre til netthinnen. RPE, Bruchs membran, choroid og sclera ligger bakre til netthinnen. Vær oppmerksom på at bildet som vises, bare er en skjematisk representasjon av netthinnen, og forholdet mellom celler/netthinnetilkobling i hvert lag er kanskje ikke en indikasjon på in vivo-innstillingen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tidligere karakteriserte HORC protokoller6,7,8,9 har involvert å skille netthinnen fra underliggende RPE-choroid og sclera ved hjelp av en kirurgisk trefin. Men uten støtten fra disse underliggende strukturene blir den gjennomsiktige netthinnen spinkel, vanskelig å håndtere og verktøy som tang kan lett forstyrre integriteten. Videre isolerer netthinnen i kulturen uten RPE har vist seg å forårsake ganglion celle apoptose og fotoreseptor degenerasjon10,11,12. Dermed vil en alternativ HORC-protokoll som minimerer tap av netthinneintegritet og bedre etterligner in vivo-miljøet være nyttig. Dette er spesielt viktig når du studerer retinal sykdomsmekanismer, da fysisk skade under utvisende håndtering kan introdusere artefakter. Derfor var målet med denne studien å utvikle en ny HORC-modell som inkluderer RPE-choroid og sclera for å beskytte netthinneintegritet under utvisende håndtering og kultur.

For å oppnå dette målet ble retinal explants "sandwiched" mellom gjenværende glasslegeme og underliggende RPE-choroid og sclera ekstrahert. I smørbrødet veier glasslegemet ned netthinnen for å forhindre netthinneavløsning og folding, mens den tøffe, fibrøse scleraen fungerer som både et stillas for strukturell støtte og et kontaktpunkt for tang. Videre har dyremodeller vist at å beholde RPE i kulturen kan forhindre retinal degenerasjon og glial spredning, et svar fra Müller-celler til faresignaler som hypoksi og betennelse10,11,12.

For å karakterisere modellen ble sandwich retinal explants farget med Hematoxylin og Eosin (H&E) for å vurdere anatomiske strukturer og immunhiistokjemi (IHC) ble utført, merking explants med terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end merking (TUNEL, en apoptotisk cellemarkør), glial fibrillary surt protein (GFAP, en retinal betennelse og Müller celleaktivering markør), og vimentin, en markør for Müller celleintegritet. For å avgjøre om denne modellen kan induseres for å utvikle molekylære sykdomstegn, explants ble utsatt for høy glukose (HG) med proinflammatoriske cytokiner (Cyt), interleukin-1β (IL-1β) og tumornekrosefaktor-α (TNF-α), et kultiverende miljø som har vist seg å etterligne diabetisk retinopati (DR) i både celle- og dyresykdomsmodeller13,14,15. Luminex-analyser ble brukt i DR-modellen for å måle cytokiner som slippes ut i kulturmediet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Human donor øye kopper ble hentet fra New Zealand National Eye Bank etter hornhinnen eksisjon for transplantasjon og som godkjent av Northern B Health and Disability Ethics Committee (NTX/06/19/CPD/AM07).

MERK: Kulturen bør gjøres i et biosikkerhetsskap i klasse II for å sikre sterile vevskulturforhold. Vevet må dyrkes innen 24 timer etter mortem for å unngå betydelig tap av retinal integritet.

Figure 2
Figur 2: Bilder som viser prosedyren for innsamling av sandwich retinal explants. For eklant forberedelse, bruk dissekering saks med en skarp spiss og en stump ende, med den stumpe enden vendt mot innsiden av kloden for å redusere vevsskader under snitt. Bruk også tang med stumpe ender for å unngå riper i det intraokulære vevet under håndtering. Bruk kirurgisk saks, med den stumpe enden vendt mot innsiden, kutt langs limbusen for å fjerne iris og linse (A-C). ONH kan plasseres hvis du ser rett inn i den åpne øyemusjen (D). Bruk tang med stumpe spisser, hold sclera for å stabilisere kloden (E). Del kloden vertikalt i to halvdeler ved å lage to dype snitt mot ONH, men ikke skjær gjennom ONH. Gjenta dette langs den horisontale meridianen (G). Påfør stumpe tang på scleraen og åpne globusen forsiktig til en kløverform (H-K). Bruk tang til å forsiktig manipulere glasslegemet for å glatte ut den brettede netthinnen, da glasslegemet sleper på netthinnen, men ikke rør netthinnen direkte (I). Fjern glasslegemet hvis det forårsaker netthinneavløsning eller folding (ikke vist i figur 2, da det gjennomsiktige glasslegemet ikke er godt tatt på bilder). Finn områder der netthinnen er flat og trekk ut retinal explants ved hjelp av en kirurgisk trefin (L). Påføring av tang på sclera, overfør forsiktig retinal explants inn i det forberedte kulturmediet (M, N). Hele smørbrødet skal synke til bunnen av brønnen på grunn av vekten, derfor er hver utvisning nedsenket i mediet (O). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

1. Ekstraksjon av sandwich retinal explants fra eyecup

  1. Fjern iris og linse.
    1. Plasser øyekoppen inne i en Petri-tallerken, med iris og linse vendt oppover og synsnervehodet (ONH) som kommer i kontakt med Petri-parabolen (Figur 2A).
    2. Hold øyekoppen stødig ved lemmen med tang (Figur 2B).
    3. Løsne iris og linse ved å lage små kutt omkrets langs ytterkanten av limbussen (Figur 2A).
    4. Fjern iris og linse nøye. Unngå å forstyrre netthinnen under manipulering (Figur 2C).
      MERK: Linsen vil ikke falle inn i øyekoppen, da den er festet, via zonule fibre, til ciliary kroppen.
  2. Flat øyekoppen.
    1. Mens øyekoppen fortsatt sitter oppreist, må du identifisere ONH. Dette er enklere med en lys hvit lyskilde (Figur 2D).
    2. Øk ved de fire kvadrantene mot ONH (figur 2E). Petri-retten kan roteres for enklere håndtering. IKKE kutt ONH.
    3. Spred og flat øyekoppen forsiktig (Figur 2E).
    4. Påfør tangene på scleraen i stedet for netthinnen for å unngå å forstyrre netthinnens integritet.
      MERK: Perifer netthinneavløsning og folding er uunngåelig, da vekten av det overfylte glasslegemet vil trekke på netthinnen. I disse områdene, fjern glasslegemet for å forhindre ytterligere retinal folding. Husk å la gjenværende glasslegemet stabilisere netthinnen på toppen av RPE-choroid og sclera.
  3. Samle sandwich retinal explants.
    1. Plasser en kirurgisk trefin på netthinnen i en region uten netthinnefolder (Figur 2F).
    2. Trykk hardt for å trenge inn i scleraen, som skal generere en sprekklyd.
    3. Vri trefinen med 180° for å sikre at scleraen er penetrert fullt ut slik at retinal explant nå er skilt fra det gjenværende vevet.
    4. Påfør tangene på scleraen og overfør sandwich retinal explant til kulturmediet (Figur 2G-I).
    5. Få 2-3 sandwich retinal explants fra perifer netthinnen i hver kvadrant.
      MERK: Sandwich retinal explant kan noen ganger være fanget i åpningen av trefin. Bruk tang, forsiktig erte ut en liten del av bunnen av sclera. Dette skjer oftere når bladet er sløvt og kan føre til tap av netthinnen (Figur 3A-C).
    6. Bruk en ny trefin etter å ha kuttet ut 1-2 retinal explants som bladet blir sløvt lett (Figur 3CFigure 3
      Figur 3: Feilsøking. Under ekstraksjonsprosessen kan retinal explant være fanget ved åpningen av kirurgisk trefin (A). Ert forsiktig ut vevet fra bunnen av scleraen uten å berøre netthinnen (B). Dette kan skje oftere hvis kirurgisk trefin brukes til å trekke ut mer enn to retinal explants, da bladet lett kan bli sløvt (C). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
  4. Kultur retinal explants.
    1. Forbered kulturmediet som inneholder Dulbeccos Modified Eagle Medium næringsblanding F-12 (DMEM-F12) og en 1x antibiotika- og antimykotikkblanding (AA, 100x lager).
    2. Før ekspansjonsutvinning, plasser 500 μL medium i brønnene på en 24-brønns plate og likevekt i inkubatoren. Dette er viktig som å legge til mediet etterpå kan løsne netthinnen.
    3. Kultur sandwich retinal explants ved 37 °C i opptil 72 timer i en fuktet 5% CO2 inkubator i medium tilberedt i trinn 1.4.2.
    4. For å indusere DR-lignende endringer, eksplanterer kulturen i medium som inneholder DMEM-F12 med en kombinasjon av 32,5 mM HG med Cyt, TNF-α (10 ng/ml) og IL-1β (10 ng/ml).

2. Paraffin-innebygging av sandwich retinal explants

  1. Fest sandwich retinal explants.
    1. Senk sandwich retinal explants i 10% formalin i minst 24 timer.
    2. Fjern formalinoppløsningen og overfør sandwich retinal explants forsiktig inn i vevsputer og kassetter.
    3. Bløtlegg sandwich retinal explants i 70% etanol i minst 24 timer.
    4. Paraffin-embed retinal explants i blokker.
    5. Skjær parafinin innebygd retinal vev i 5 μm tykke seksjoner ved hjelp av en mikrotom og monter på glasssklier. Oppbevars ved romtemperatur til avbildning.
  2. Deparaffiniser seksjoner.
    1. Senk seksjonene i 70% xylen i 5 min.
    2. Senk seksjonene i 100% xylen i 5 min.
    3. Rehydrer seksjonene i 70% etanol i 5 min.
    4. Rehydrer seksjonene i 100% etanol i 5 min.
    5. Vask seksjonene under rennende vann fra springen i 10 min.

3. Karakterisering ved hjelp av H&E, IHC og en magnetisk Luminex-analyse

  1. H&E-flekkingsprotokoll
    1. Deparaffiniser delene ved hjelp av trinn 2.2.
    2. Hydrater seksjonene i vann fra springen i 5 min.
    3. Flekk seksjonene i Gills 2 hematoksylinoppløsning i 5 min.
    4. Vask seksjonene grundig under rennende vann fra springen for å fjerne overflødig flekk.
    5. Differensier ved å dyppe seksjonene to ganger i 1% syrealkohol.
    6. Vask seksjonene raskt under rennende vann fra springen.
    7. Flekk seksjonene blå ved å dyppe seks ganger i 1% litiumkarbonat (10 mg / ml).
    8. Vask seksjonene grundig under rennende vann fra springen i 5 minutter for å fjerne overflødig blå flekk.
    9. Dypp seksjonene i 1% eosin 10 ganger.
    10. Vask seksjonene raskt under vann fra springen for å fjerne overflødig flekk.
    11. Dehydrer seksjonene ved å dyppe dem 10 ganger i 100% etanol. Gjør dette to ganger.
    12. Dypp seksjonene i 70% xylen 10 ganger.
    13. Dypp seksjonene i 100% xylen 10 ganger.
    14. Monter med en dekslelip ved hjelp av dibutylphthalate polystyren xylen (DPX) monteringsmedium.
    15. Ta bilder ved hjelp av et lett mikroskop.
  2. IHC-merkingsprotokoll'
    1. Deparaffiniser delene ved hjelp av trinn 2.2.
    2. Plasser lysbildene i en oppløsning som inneholder 10 mM natriumsitratbuffer med 0,05% Tween 20 ved pH 6.0 og kjør en antigengjenvinning i en trykkkomfyr automatisert ved 121 °C i 2 minutter.
    3. Vask seksjoner i fosfatbufret saltvann (PBS) i 5 min. Gjør dette 3 ganger.
    4. Blokker seksjonene med PBS som inneholder 0,1% Triton X-100 og 10% normalt geitserum i 1 time ved romtemperatur.
    5. Inkuber seksjoner over natten ved 4 °C med primære antistoffer som er konjugert mot sekundære antistoffer (Materialfortegnelse).
    6. Vask seksjoner i PBS i 5 min. Gjør dette 3 ganger.
    7. Flekkkjerner med 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) i 2 min.
    8. Vask og monter seksjoner ved hjelp av et anti-fade reagens.
    9. Tetningsdeksler med neglelakk.
    10. Ta bilder ved hjelp av et konfokalt laserskanningsmikroskop.
  3. Magnetisk Luminex-analyse
    1. Overfør 75 μL medier fra hver brønn til en 96-brønn-u-bunnplate ved 24 og 72 timer.
    2. Analyser cellen supernatant for IL-18, IL-6, IL-8 og vaskulær endotel vekstfaktor (VEGF) etter 24 og 72 timer ved hjelp av Luminex cytokinanalyse. Følg produsentens instruksjoner for å utføre analysen16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Netthinneintegritet ble bevart i denne HORC-modellen. Retinal integritet ble bevart i de kultiverte sandwich retinal explants, men gikk tapt i netthinnen dyrket uten tilstøtende strukturer. H&E ble gjennomført for å undersøke den strukturelle integriteten til seksjonerte sandwich retinal explants etter 72 timer i kultur. Sandwich retinal explants viste bevart integritet og en distinkt lamellstruktur fra GCL til ONL med kompakte kjerner i INL og ONL (Figur 4A). Imidlertid ble forstyrret retinal integritet funnet på kantene av samme prøve, hvor netthinnen hadde løsnet fra den underliggende RPE-choroid og sclera, som viste redusert retinal tykkelse og tap av kjerner i INL og ONL (Figur 4B).

Figure 4
Figur 4: H&E-bilder av retinal explants dyrket i medium i 72 timer. A) Strukturell integritet opprettholdt i områder festet til den underliggende RPE-choroid og sclera, avbildet av den distinkte separasjonen av hvert retinal lag fra GCL til ONL og kompakte kjerner i INL og ONL. B) Alvorlig tap i retinal integritet i regioner frittliggende fra RPE-choroid og sclera, vist ved den totale retinal tykkelse reduksjon og redusert antall kjerner i INL og ONL. Skalalinje = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Karakterisering av retinal explants ved hjelp av IHC viste godt bevart retinal integritet selv etter 72 timer i kultur. Ingen TUNEL-positive cellekjerner, som markerer apoptose, ble funnet i retinal explants dyrket i basale forhold, noe som demonstrerer vedvarende celle levedyktighet selv etter 72 timer (Figur 5A-C). GFAP-uttrykk forble lokalisert i GCL og IPL, sett i normalt retinal vev17,18. Det var ingen glial fibrose, et tegn på Müller celleaktivering og spredning som svar på retinal betennelse, som ellers ville bli identifisert som oppregulert GFAP-uttrykk som strekker seg inn i ONL10,11,12( Figur5D-F). Vimentinmerking (rød) ble sterkt uttrykt fra GCL til ONL, og viste bevart Müller celleintegritet, sett i normalt retinal vev (Figur 5G-I).

Figure 5
Figur 5: IHC-bilder av retinal explants etter kulturing i basale medier i 72 timer. Mangelen på TUNEL-positiv farging (grønn) antyder at ingen cellulær apoptose har skjedd i retinallagene fra GCL til ONL (A-C). GFAP-merking (rød) var begrenset til GCL og IPL uten glial fibrose, som ville bli identifisert som utvidet uttrykk for GFAP i ONL (D-F). Vimentin (rød) ble sterkt uttrykt fra GCL til ONL, og fant Müller-cellene som spenner gjennom disse retinallagene (G-I). Cellekjerner ble farget med DAPI (blå). Skalalinje = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

En DR-modell ble utviklet ved å dyrke sandwich retinal explants i HG og Cyt. HG og Cyt, IL-1β og TNF-α økte sekresjonen av IL-18, VEGF, IL-6 og IL-8 i forhold til baseline nivåer. En Luminex-analyse ble brukt til å måle cytokinene IL-18, VEGF, IL-6 og IL-8 utskilt av retinal explants etter kultivering i 24 og 72 timer under HG + Cyt-forhold (figur 6). For å minimere forskjeller mellom donorer ble utskilte cytokinnivåer sammenlignet med baseline (indikert av den prikkede røde linjen), representert ved cytokinnivåer utskilt av smørbrødets utvisninger fra samme donor, men dyrket i basalmedium (utarbeidet i trinn 1.4.1). Etter 24 timer økte utskilte IL-18-, VEGF-, IL-6- og IL-8-nivåer betydelig i forhold til baseline. Etter 72 timer var det bare IL-18- og VEGF-nivåene som var betydelig forhøyet, mens det ikke ble funnet noen signifikant forskjell i IL-6- og IL-8-nivåer sammenlignet med baseline.

Figure 6
Figur 6: Cytokiner frigjøres av sandwich retinal explants dyrket i HG og Cyt, IL-1β og TNF-α, etter 24 og 72 h. De utskilte nivåene IL-18, VEGF, IL-6 og IL-8 økte betydelig over baseline etter 24 timer (p < 0,05). Etter 72 timer var IL-18- og VEGF-nivåene betydelig høyere (p < 0,05), men det ble ikke funnet noen signifikant forskjell i IL-6- og IL-8-nivåer sammenlignet med baseline. Den prikkete røde linjen indikerer baseline-nivået, som representerer cytokinnivåer utskilt av utvisningene fra samme donor, men dyrket i normalt medium. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

HORC er for tiden den mest klinisk overførbare modellen i preklinisk retinal forskning. Sammenlignet med in vitro cellekulturmodeller, kan HORC bedre representere anatomien til den menneskelige netthinnen in situ, gjennom å beholde de dynamiske netthinnecelletypene og deres forbindelser med nevroner, vaskulaturer og det ekstracellulære miljøet19. Sammenlignet med dyremodeller er HORC mer fordelaktige i å studere patofysiologien til og designe farmasøytiske behandlinger for menneskelige netthinnesykdommer på grunn av variasjoner mellom arter, for eksempel forskjellige retinalcelletyper, samt varierende fotoreseptortetthet og proporsjoner, noe som kan bidra til mislykkede kliniske studier til tross for positive resultater i dyremodeller19. Men i tidligere HORC-protokoller ble netthinnen med vilje løsrevet fra RPE-choroid og sclera. Uten den tøffe scleraen er den spinkle netthinnen vanskelig å håndtere, og netthinneintegritet kan kompromitteres hvis den håndteres direkte av tang6,7,8,9. Dette fremgår av det faktum at tidligere studier med isolerte netthinner har rapportert økt Müller celleaktivering og TUNEL-positive kjerner med 72 h kultur. Dette står i kontrast til våre funn, noe som tyder på at sandwichmetoden bedre bevarer netthinneintegritet. For det andre ble økt nevronal degenerasjon og glial spredning funnet i dyr ORC-modeller i netthinne dyrket uten RPE, sammenlignet med netthinne dyrket med RPE10,11,12.

For å minimere sjansene for å kompromittere netthinneintegriteten, ble sandwich retinal explants brukt i denne nye HORC-protokollen. I motsetning til tidligere HORC-protokoller skjærer trefinen gjennom ikke bare netthinnen, men også RPE-glasslegemet og scleraen, slik at den resulterende explanten er "sandwiched" og stabilisert mellom gjenværende glasslegeme og underliggende strukturer. Den gjenværende glasslegemet veier netthinnen ned for å forhindre folding og løsrivelse fra de underliggende strukturene, mens sclera fungerer som et stillas for å støtte netthinnearkitekturen for å beskytte netthinnen mot tangindusert skade. Videre kan culturing netthinne med RPE forhindre retinal degenerasjon og glial spredning i kultur10,11,12.

Husk følgende punkter når du trekker ut sandwich retinal explants. Når du skjærer langs limbussen, vil linsen veie ned iris, men vil ikke falle inne i øyekoppen som den er festet, via zonule fibre, til ciliary kroppen. Påfør tangene på scleraen og unngå å berøre netthinnen for å forhindre forstyrrende netthinneintegritet. Fyll de dyrkbare brønnene med medium før du plasserer netthinneutløpet inne i brønnene. Hvis du legger til mediet etter at retinal explants er plassert inne i brønnene, øker risikoen for å løsne netthinnen fra RPE-choroiden og sclera eller snu hele ekslanten opp ned. Når du gjør dype snitt på de fire kvadrantene, vær oppmerksom på at den perifere netthinnen kan løsne på grunn av glasslegemet som lekker ut av øyekoppen. For å forhindre løsrivelse eller folding av netthinnen, fjern glasslegemet i området som trekker i netthinnen. Selv om det forrige punktet anbefaler å fjerne glasslegemet trekke på netthinnen, la tilstrekkelig gjenværende glasslegemet til å veie netthinnen på toppen av RPE-choroid og sclera for å øke stabiliteten til sandwich retinal explants. Når du skjærer gjennom den tøffe, fibrøse scleraen, kan trefinen lett bli stump. Som et resultat kan det være nødvendig med overdreven kraft, eller scleraen kan ikke trenges helt inn. Bruk en ny trefin for hver 1-2 ekstraherte retinal explants for å unngå ufullstendig penetrasjon gjennom sclera. Erfaring med forsiktig håndtering er avgjørende for å beskytte netthinnen; Derfor er trening med svineøyne, som er like i størrelse og struktur til det menneskelige øye, tilrådelig før du bruker de begrensede donor scleral eyecups tilgjengelig.

Retinal integritet ble bevart i explants sandwiched mellom gjenværende glasslegemet og underliggende RPE-choroid og sclera. H&E-farging viste bedre strukturell integritet når den kultiverte netthinnen ble festet til RPE-choroid og sclera, sammenlignet med å dyrke netthinnen alene. Ved å støtte dette funnet foreslo mangelen på TUNEL-positive cellekjerner et fravær av apoptose i alle retinallag, noe som viste bevart cellulær levedyktighet selv etter 72 timer. Videre bekreftet vimentinmerking Müller celleintegritet og det begrensede GFAP-uttrykket i GCL og INL, som finnes i normal netthinne, igjen bekreftet mangelen på inflammatoriske eller stresssignaler i netthinnen.

HORC-modellen karakterisert i denne studien resulterte i bevart retinal struktur og Müller celleintegritet samtidig som den forhindret retinal betennelse og cellulær apoptose. Videre kan den brukes til å modellere netthinnesykdommer, noe som er spesielt nyttig for å identifisere sykdomsveier og farmasøytiske mekanismer. Tidligere dyre- og in vitro-studier har vist at DR-betennelse kan induseres når dyre netthinnen eller cellene blir utsatt for HG og Cyt13,14,15. I denne HORC-studien, ved å bruke HG og Cyt på smørbrødet i 24 timer i kultur, ble sekresjon av IL-18, VEGF, IL-6 og IL-8 betydelig forhøyet over baseline. Disse cytokinene er kjent for å øke i glasslegemet og serumet til pasienter med DR sammenlignet med ikke-diabetikerkontroller, og validerer at denne DR-modellen er klinisk overførbar20,21,22,23,24,25. Selv om denne studien bare har karakterisert DR ved hjelp av Magnetic Luminex-analyse, kan andre teknikker som Western Blotting, IHC og polymerisert kjedereaksjon (PCR) også utføres26.

Til tross for de klare fordelene som er skissert ovenfor, har denne nye HORC-modellen også noen begrensninger. En stor begrensning av denne protokollen er lav tilførsel av vev. Donor øyekopper, som har alle okulære strukturer, men hornhinnen generelt fjernet for transplantasjon, er sjelden tilgjengelig for forskning på grunn av den store etterspørselen etter sclera i kirurgiske prosedyrer som glaukom shunts, orbital implantater, skade reparasjon i netthinneavløsning og dekning av utsatte suturer. For å minimere denne begrensningen foreslår vi at alle eksperimentelle grupper samles inn fra samme giver. Dette fjerner behovet for å ta høyde for inter-donor-variabilities, for eksempel alder, varighet av sykdom, baseline cytokinnivåer og andre faktorer som kan bidra til forvirrende variabler hvis man sammenligner mellom forskjellige pasienter. Også de fleste donorvev er fra eldre mennesker, da det er vanskeligere å få prøver fra yngre aldersgrupper, og selv når det er tilgjengelig, er dødsårsaken til unge donorer ofte traumatisk i naturen som fører til skadet vev som er uegnet for kultur. Likevel, gitt at de fleste kroniske netthinnesykdommer forekommer hos eldre pasienter, beholder denne modellen fortsatt nytte for å studere aldersrelaterte kroniske netthinnesykdommer som DR og aldersrelatert makuladegenerasjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil takke de sjenerøse donorene av øyevev og teamet fra New Zealand National Eye Bank for deres støtte. Dette arbeidet ble økonomisk støttet av prosjektstipend fra Maurice and Phyllis Paykel Trust og Auckland Medical Research Foundation (1117015). IDRs styreverv støttes av Buchanan Charitable Foundation. CK sitt stipend er gitt av New Zealand Association of Optometrists Education and Research Fund (CC36812) og HHL sitt stipend er levert av Buchanan Charitable Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Disposable Biopsy Punches (5 mm) Integra York PA Inc., USA 21909-142 Referred as surgical trephines
in this article
Human Recombinant IL-1β Peprotech, USA 200-01B Working concentration: 10 ng/mL
Human Recombinant  TNF-a Peprotech, USA 300-01A Working concentration: 10 ng/mL
DAPI (1 µg/mL) Sigma Aldrich, Germany #D9542 Nuclear stain. Working dilution 1:1000
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement Gibco, Thermofisher, Scientific Inc., USA 10565018 Dulbecco’s Modified Eagle Medium nutrient mixture F-12 containing a 1× antibiotics and antimycotics mixture (AA, 100× stock)
Fine Scissors - Sharp-Blunt Fine Science Tools (F.S.T) 14028-10 Tips: Sharp-Blunt, Cutting Edge: 27mm, Length: 10cm, Alloy/Material: Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight
Graefe Forceps Fine Science Tools (F.S.T) 11050-10 Length:10cm, Tip shape: Straight, Tips: Serrated, Tip Width: 0.8mm, Tip Dimensions:0.8 x 0.7mm, Alloy/Materials: Stainless Steel
Mouse monoclonal GFAP-Cy3 Sigma Aldrich, Germany #C9205 Primary antibody conjugated to Cy3. Working dilution 1:1000.
Mouse monoclonal Vimentin-Cy3 Sigma Aldrich, Germany #C9080 Primary antibody conjugated to Cy3. Working dilution 1:50.
Rabbit polyclonal TUNEL (In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein) Sigma Aldrich, Germany #11684795910 Primary antibody conjugated to Fluorescein-dUTP. Working dilution 1:10 with enzyme-buffer solution.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kolb, H., Fernandez, E., Nelson, R. Facts and Figures Concerning the Human Retina. Webvision-The Organization of the Retina and Visual System. , Internet (2005).
  2. Gemenetzi, M., De Salvo, G., Lotery, A. Central serous chorioretinopathy: an update on pathogenesis and treatment. Eye. 24 (12), 1743-1756 (2010).
  3. Buschini, E., Piras, A., Nuzzi, R., Vercelli, A. Age related macular degeneration and drusen: neuroinflammation in the retina. Progress in Neurobiology. 95 (1), 14-25 (2011).
  4. Chen, S. -Y., et al. Current concepts regarding developmental mechanisms in diabetic retinopathy in Taiwan. Biomedicine. 6 (2), (2016).
  5. Kaaja, R., Loukovaara, S. Progression of retinopathy in type 1 diabetic women during pregnancy. Current Diabetes Reviews. 3 (2), 85-93 (2007).
  6. Azizzadeh Pormehr, L., et al. Human organotypic retinal flat-mount culture (HORFC) as a model for retinitis pigmentosa11. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (8), 6775-6783 (2018).
  7. Fernandez-Bueno, I., et al. Time course modifications in organotypic culture of human neuroretina. Experimental Eye Research. 104, 26-38 (2012).
  8. Niyadurupola, N., Sidaway, P., Osborne, A., Broadway, D. C., Sanderson, J. The development of human organotypic retinal cultures (HORCs) to study retinal neurodegeneration. British Journal of Ophthalmology. 95 (5), 720-726 (2011).
  9. Osborne, A., Hopes, M., Wright, P., Broadway, D. C., Sanderson, J. Human organotypic retinal cultures (HORCs) as a chronic experimental model for investigation of retinal ganglion cell degeneration. Experimental Eye Research. 143, 28-38 (2016).
  10. Caffe, A., Visser, H., Jansen, H., Sanyal, S. Histotypic differentiation of neonatal mouse retina in organ culture. Current Eye Research. 8 (10), 1083-1092 (1989).
  11. Kaempf, S., Walter, P., Salz, A. K., Thumann, G. Novel organotypic culture model of adult mammalian neurosensory retina in co-culture with retinal pigment epithelium. Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 47-58 (2008).
  12. Liu, L., Cheng, S. -H., Jiang, L. -Z., Hansmann, G., Layer, P. G. The pigmented epithelium sustains cell growth and tissue differentiation of chicken retinal explants in vitro. Experimental Eye Research. 46 (5), 801-812 (1988).
  13. Kuo, C., Green, C. R., Rupenthal, I. D., Mugisho, O. O. Connexin43 hemichannel block protects against retinal pigment epithelial cell barrier breakdown. Acta Diabetologica. 57 (1), 13-22 (2020).
  14. Mugisho, O. O., et al. The inflammasome pathway is amplified and perpetuated in an autocrine manner through connexin43 hemichannel mediated ATP release. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. 1862 (3), 385-393 (2018).
  15. Mugisho, O. O., et al. Intravitreal pro-inflammatory cytokines in non-obese diabetic mice: Modelling signs of diabetic retinopathy. PLoS ONE. 13 (8), 0202156 (2018).
  16. R&D Systems, I. , Available from: https://www.rndsystems.com/protocol-types/luminex (2020).
  17. Nakazawa, T., et al. Attenuated glial reactions and photoreceptor degeneration after retinal detachment in mice deficient in glial fibrillary acidic protein and vimentin. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 48 (6), 2760-2768 (2007).
  18. Okada, M., Matsumura, M., Ogino, N., Honda, Y. Müller cells in detached human retina express glial fibrillary acidic protein and vimentin. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 228 (5), 467-474 (1990).
  19. Murali, A., Ramlogan-Steel, C. A., Andrzejewski, S., Steel, J. C., Layton, C. J. Retinal explant culture: A platform to investigate human neuro-retina. Clinical & Experimental Ophthalmology. 47 (2), 274-285 (2019).
  20. Koleva-Georgieva, D. N., Sivkova, N. P., Terzieva, D. Serum inflammatory cytokines IL-1beta, IL-6, TNF-alpha and VEGF have influence on the development of diabetic retinopathy. Folia Medica (Plovdiv). 53 (2), 44-50 (2011).
  21. Lee, J. -H., et al. Cytokine profile of peripheral blood in type 2 diabetes mellitus patients with diabetic retinopathy. Annals of Clinical & Laboratory Science. 38 (4), 361-367 (2008).
  22. Chorostowska-Wynimko, J., et al. In vitro angiomodulatory activity of sera from type 2 diabetic patients with background retinopathy. Journal of Physiology and Pharmacology: An Official Journal of the Polish Physiological Society. 56, 65-70 (2005).
  23. Khalifa, R. A., Khalef, N., Moemen, L. A., Labib, H. M. The role interleukin 12 (IL-12), interferon-inducible protein 10 (IP-10) and Interleukin 18 (IL-18) in the angiogenic activity of diabetic retinopathy. Research Journal of Medicine and Medical Sciences. 4, 510-514 (2009).
  24. Zhou, J., Wang, S., Xia, X. Role of intravitreal inflammatory cytokines and angiogenic factors in proliferative diabetic retinopathy. Current Eye Research. 37 (5), 416-420 (2012).
  25. Song, Z., et al. Increased intravitreous interleukin-18 correlated to vascular endothelial growth factor in patients with active proliferative diabetic retinopathy. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 252 (8), 1229-1234 (2014).
  26. Louie, H. H., Shome, A., Kuo, C. Y. J., Rupenthal, I. D., Green, C. R., Mugisho, O. O. Connexin43 hemichannel block inhibits NLRP3 inflammasome activation in a human retinal explant model of diabetic retinopathy. Experimental Eye Research. , (2020).

Tags

Medisin Utgave 172 Human Retina Organotypic Kultur Modellutvikling Sykdomsmodell
Karakterisering av en ny human organotypisk retinal kulturteknikk
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kuo, C. Y. J., Louie, H. H.,… More

Kuo, C. Y. J., Louie, H. H., Rupenthal, I. D., Mugisho, O. O. Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique. J. Vis. Exp. (172), e62046, doi:10.3791/62046 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter