Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Skøn over indholdet af plantebiomasse lignin ved hjælp af thioglykolsyre (TGA)

Published: July 24, 2021 doi: 10.3791/62055
Automatic Translation
1, 2, 2
1Department of Plant and Soil Science, Texas Tech University, 2Fiber and Biopolymer Research Institute (FBRI), Department of Plant and Soil Science, Texas Tech University

Summary

Her præsenterer vi en modificeret TGA-metode til vurdering af ligninindholdet i urteagtig plantebiomasse. Denne metode anslår ligninindholdet ved at danne specifikke tredistre obligationer med lignin og giver en fordel i forhold til Klason-metoden, da den kræver en relativt lille stikprøve til skøn over ligninindholdet.

Abstract

Lignin er en naturlig polymer, der er den næstmest rigelige polymer på Jorden efter cellulose. Lignin er hovedsageligt deponeret i plante sekundære cellevægge og er en aromatisk heteropolymer primært består af tre monolignoler med betydelig industriel betydning. Lignin spiller en vigtig rolle i plantevækst og -udvikling, beskytter mod biotiske og abiotiske belastninger og i kvaliteten af dyrefoder, træ og industrielle ligninprodukter. Et nøjagtigt skøn over ligninindholdet er afgørende for både den grundlæggende forståelse af ligninbiosyntesen og industriel anvendelse af biomasse. Thioglycolic acid (TGA)-metoden er en yderst pålidelig metode til vurdering af det samlede ligninindhold i plantebiomassen. Denne metode anslår ligninindholdet ved at danne dide med benzylalkoholgrupperne af lignin, som er opløselige under alkaliske forhold og uopløselige under sure forhold. Det samlede ligninindhold anslås ved hjælp af en standardkurve genereret fra kommerciel bambus lignin.

Introduction

Lignin er en af de vitale bærende komponenter i plantecellevægge og den næstmest rigelige polymer på Jorden1. Kemisk er lignin en krydskædet heteropolymer bestående af høj molekylvægt komplekse phenolforbindelser, der danner en naturlig vedvarende kilde til aromatiske polymerer og syntese af biomaterialer2,3. Denne naturlige polymer spiller en betydelig rolle i plantevækst, udvikling, overlevelse, mekanisk støtte, cellevæg stivhed, vandtransport, mineraltransport, logiresistens, vævs- og organudvikling, aflejring af energi og beskyttelse mod biotiske og abiotiske belastninger4,5,6,7. Lignin består primært af tre forskellige monolignoler: coniferyl, sinapyl og p-coumaryl alkoholer, der er afledt af phenyl propanoid vej8,9. Mængden af lignin og sammensætningen af monomerer varierer baseret på plantearterne, vævs-/organtypen og forskellige stadier af planteudvikling10. Lignin er bredt klassificeret i nåletræ, hårdttræ og græs lignin baseret på kilden og monolignol sammensætning. Nåletræ består primært af 95% nåletræsalkohol med 4% p-coumaryl og 1% sinapylalkoholer. Hårdttræ har nåletræ og sinapylalkoholer i lige store mængder, mens græs lignin består af forskellige proportioner af nåletræ, sinapyl og p-coumaryl alkoholer11,12. Sammensætningen af monomerer er kritisk, da den bestemmer ligninstyrken, nedbrydningen og nedbrydningen af cellevæggen samt bestemmelse af molekylær struktur, forgrening og krydsning med andre polysaccharider13,14.

Lignin forskning får stadig større betydning i fouragering, tekstilindustrien, papirindustrien, og for bioethanol, biobrændstof, og bio-produkter på grund af sine lave omkostninger og høj overflod15,16. Forskellige kemiske metoder (f.eks acetylbromid, syrevaskemidler, Klason og permanganatoxidation) sammen med instrumentale metoder (f.eks. nær infrarød (NIR) spektroskopi, nuklear magnetisk resonans (NMR) spektroskopi og ultraviolet (UV) spektrofotometri) blev anvendt til ligninkvantificering9,17. Brunkulsanalysemetoderne klassificeres generelt på grundlag af elektromagnetisk stråling, gravimetry og opløselighed. Princippet bag lignin skøn ved elektromagnetisk stråling var baseret på den kemiske egenskab af lignin, hvormed det absorberer lys ved specifikke bølgelængder. Disse resultater blev anslået ud fra princippet om, at lignin har en stærkere UV-absorbans end kulhydrater. I 1962 brugte Bolker og Somerville kaliumchloridpiller til at anslå ligninindholdet i træ18. Denne metode har imidlertid ulemper ved estimering af ligninindholdet fra urteagtige prøver på grund af tilstedeværelsen af ikke-lignin phenolforbindelser og fraværet af en passende udryddelseskoefficient. I 1970 fandt Fergus og Goring, at guaiacyl og syringyl sammensatte absorption maxima var på 280 nm og 270 nm, hvilket korrigerede udryddelseskoefficienten udstedelse af Bolker og Somerville metode19. Senere blev infrarød spektroskopi, en meget følsom teknik til karakterisering af phenolics, også brugt til lignin estimering med en lille mængde plantebiomasseprøver. Et eksempel på en sådan teknologi var diffus-reflektion Fourier transform spektrofotometri. Denne metode mangler imidlertid en ordentlig standard svarende til UV-metoden20. Senere blev ligninindholdet anslået af NIRS (nær infrarød spektroskopi) og NMR (nuklear magnetisk resonansspektroskopi). Selvom der er ulemper ved disse metoder, ændrer de ikke lignins kemiske struktur og bevarer sin renhed20.

Den gravimetriske Klason-metode er en direkte og den mest pålidelige analysemetode til ligninvurdering af træagtige stængler. Grundlaget for gravimetrisk ligninestimering er hydrolyse/opløselighed af ikke-ligninforbindelser og indsamling af uopløselig lignin til gravimetry21. I denne metode fjernes kulhydraterne ved hydrolyse af biomassen med koncentreret H2SO4 for at udtrække ligninrester20,22. Ligninindholdet, der anslås ved denne metode, kaldes syreopløselig lignin eller Klason lignin. Anvendelsen af Klason-metoden afhænger af plantearten, vævstypen og cellevægtypen. Tilstedeværelsen af variable mængder ikke-ligninkomponenter såsom tanniner, polysaccharider og proteiner resulterer i proportionale forskelle i skønnet over indholdet af syre uopløseligt/opløseligt ligninindhold. Derfor anbefales Klason-metoden kun til lignin-estimering af biomasse med højt ligninindhold , såsom træagtige stængler17,23. Opløselighedsmetoder som acetylbromid (AcBr), syreopløselig lignin og thioglykolsyre (TGA) er mest anvendte metoder til vurdering af ligninindholdet fra forskellige kilder til plantebiomasse. Kim et al. etablerede to metoder til ligninudvinding ved opløselighed. Den første metode ekstraherer lignin som en uopløselig rest ved at opløse cellulose og hemicellulose, mens den anden metode adskiller lignin i den opløselige fraktion, hvilket efterlader cellulose og hemicellulose som det uopløselige reststof24.

Lignende metoder, der anvendes i ligninestimering baseret på opløseligheden, er thioglykolsyre (TGA) og acetylsbromidmetoder (AcBr)25. Både TGA- og acetylphidmetoderne anslår ligninindholdet ved at måle absorbansen af den opløselige lignin ved 280 nm; AcBr-metoden nedbryder imidlertid xylans under processen med lignin-opløselighed og viser en falsk stigning i ligninindholdet26. Thioglycolatmetoden (TGA) er den mere pålidelige metode, da den afhænger af specifik binding med de tregående grupper af benzylalkoholgrupper af lignin med TGA. Den TGA-bundne lignin udfældes under sure forhold ved hjælp af HCl, og ligninindholdet anslås ved hjælp af dets absorbans ved 280 nm27. TGA-metoden har yderligere fordele ved mindre strukturelle ændringer, en opløselig form for ligninvurdering, mindre interferens fra ikke-ligninkomponenter og præcis vurdering af lignin på grund af specifik binding med TGA.

Denne TGA-metode ændres på grundlag af den type plantebiomasseprøve, der anvendes til skøn over ligninindholdet. Her ændrede og tilpassede vi den hurtige TGA-metode med risstrå27 til bomuldsvæv for at estimere ligninindholdet. Kort sagt blev de tørrede pulveriserede planteprøver udsat for proteinopløselighedsbuffer og methanolekstraktion for at fjerne proteiner og alkoholopløselig fraktion. Alkoholuopløselige rester blev behandlet med TGA og udfældet lignin under sure forhold. En lignin standardkurve blev genereret ved hjælp af kommerciel bambus lignin og en regressionslinje (y = mx +c) blev opnået. Værdien "x" anvender gennemsnitlige absorbansværdier for lignin ved 280 nm, mens der er indtastet "m" og "c"-værdier fra regressionslinjen for at beregne ukendt ligninkoncentration i prøver af biomasse af bomuldsanlæg. Denne metode er opdelt i fem faser: 1) fremstilling af planteprøver; 2) vask af prøverne med vand og methanol 3) behandling af pellet med TGA og syre til at udfælde lignin; 4) udfældning af lignin; og 5) standardkurveforberedelse og estimering af ligninindholdet af prøven. De to første faser er primært fokuseret på plantematerialepræparatet efterfulgt af vand, PSB (proteinopløselighedsbuffer) og methanolekstraktioner for at opnå alkoholuopløseligt materiale. Derefter blev det behandlet med TGA (thioglycolic syre) og HCl til at danne et kompleks med lignin i tredje fase. I slutningen blev HCl brugt til at udfælde lignin, som blev opløst i natriumhydroxid for at måle dets absorbans ved 280 nm28.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Udarbejdelse af planteprøver

  1. Indsamle to måneder gamle bomuldsplanter fra drivhuset (Figur 1A).
  2. Vend urtepotter forsigtigt for at adskille jord og rødder med intakte laterale rødder ved at løsne jorden omkring planten (Figur 1B).
  3. Vask de opsamlede planter grundigt i bakker fyldt med vand for at fjerne alt snavs (til rodprøver)(Figur 1C).
  4. Brug papirhåndklæder til at tørre adskilte rod-, stængel- og bladvæv, og mærk dem(Figur 1D). Lufttørre i 2 dage ved stuetemperatur for at forhindre svampeforurening(figur 1E).
  5. Prøvevæv overføres til mærkede beholdere/aluminiumsfolie og inkuberes i en temperaturreguleret inkubator ved 49 °C i 7 til 10 dage (Figur 1F).
    BEMÆRK: Højere temperaturer kan ændre ligninstrukturen. Alternativt kan en frysetørrer bruges til at tørre prøver i 1 til 2 dage uden at forårsage kemiske ændringer i plantebiomassen.
  6. Brug en kniv til at skære inkubatoren tørret væv i 5 mm størrelse stykker eller alternativt ansætte en biomasse kværn til at male plantevæv (Figur 1G, Figur 1H).
    BEMÆRK: Biomassekværnen/-klingen skal rengøres, efter at hver prøve er skåret/malet.
  7. Det udskårne væv/biomasse formalede plantemateriale overføres til slibeglas og formales til fint pulver af 1 mm størrelse ved hjælp af en frysemølle eller kryogenkværn med flydende N2.
  8. Prøverne males i tre cyklusser med en hastighed på 10 CPS (hvert cyklusspænd på 2 min.) til et ensartet pulver(figur 1I, 1J, 1K).
    BEMÆRK: Eksperimentet kan sættes på pause på dette tidspunkt, og prøver kan opbevares ved stuetemperatur i lufttætte beholdere til langtidsopbevaring.

2. Vaskeprøver med vand, PSB og methanol

  1. Mål og registrer vægten af alle tomme 2 mL mikrofugerør, der bruges til estimering af ligninindhold i laboratorienotesbogen.
  2. Der overføres 20 mg af prøvepulveret til det for vejede rør. Afveje røret med væv og væv pulver og registrere disse vægte i laboratoriet notesbog.
  3. Alle 2 mL mikrofugerør (med åbne låg) inkuberes med 20 mg vævspulver i en varmeblok eller ovn ved 60 °C i 1 time.
  4. Efter inkubation afkøles prøverne i 10 minutter ved stuetemperatur (RT).
  5. Tilsæt 1,8 mL vand til hvert mikrofugerør og bland ved hvirvelstrømning. Derefter centrifugeres ved 25.200 x g (15.000 omdr./min.) i 10 minutter ved RT og kasseres supernatanten (figur 2).
  6. Der tilsættes 1,8 mL proteinopløselighedsbuffer (PSB) (tabel 1) til hver tilbageholdt pellet og blandes ved hvirvelvæsning. Centrifuge ved 25.200 x g (15.000 omdrejninger i minuttet) i 10 min ved RT og kassér supernatanten.
  7. Gentag trin 2.6 igen for hver prøve.
  8. Tilsæt 1,8 mL vand til hver pellet, bland ved hvirvelvædder, og centrifuge ved 25.200 x g (15.000 omdrejninger i minuttet) i 10 min. Efter centrifugering skal du gemme pelleten og kassere supernatanten.
  9. Til den tilbageholdte pellet tilsættes 1,8 mL methanol og inkuberes i en 60 °C varmeblok i 20 min. Derefter centrifuge ved 25.200 x g (15.000 omdrejninger i minuttet) i 10 min på RT. Efter centrifugering kasseres supernatanten og pelleten (Figur 2).
  10. Gentag trin 2.9 igen for hver prøve.
  11. Lufttørre pellet på RT eller fortsætte straks ved vakuum tørring. Vakuumtørre ved hjælp af vakuumtørrer ved 30 °C i 2 til 3 timer, eller indtil pellet er helt tør.
    BEMÆRK: Forsøget kan sættes på pause på dette tidspunkt ved lufttørring i løbet af natten eller fortsætte ved vakuumtørring.
  12. Efter tørring vejes prøverør med den tørrede pellet, og vægten registreres ved siden af den respektive tomme rørvægt i laboratorienotesbogen. Estimer pelletvægten ved at trække de to værdier fra. Disse vægte vil blive anvendt til ligninestimering ved afslutningen af ligninudvindingsprocessen.
  13. På dette punkt af lignin udvinding, omfatter den kommercielle bambus lignin til generation af lignin standard kurven. Kommerciel bambuspernin måles i separate rør fra 0,5 mg til 5 mg i trin på 0,5 mg (0,5 mg, 1 mg, 1,5 mg, 2 mg, 3 mg, 3,5 mg, 4 mg, 4,5 mg og 5,0 mg). Mål hver koncentration tre gange for tre tekniske replikater.
    BEMÆRK: Herfra blev de standarder, der blev målt i ovenstående trin, behandlet på samme måde som prøver, der blev tørret.

3. Behandling af pellet med TGA og syre til udfælde lignin

  1. Forarbejdede prøver fra ovennævnte trin samt målte standarder til TGA-behandling (thioglycolic syre).
  2. Der tilsættes 1 mL 3 N HCl (tabel 1) og 100 μL TGA til hver pellet.
  3. Hvirvelstrøm og inkuber i en forvarmet varmeblok på 80 °C i 3 timer i en røghætte (figur 2).
    BEMÆRK: Opvarmningstrinnet ved 80 °C skal overvåges. Højtryksopbygning kan åbne lågene og kan føre til kemiske udslip. Skruehætterør anbefales, men 2 mL rør kan være løst udjævnet under dette trin som et alternativ til at forhindre sådanne spild.
  4. Efter inkubation, kølige rør på RT i 10-15 min og centrifuge ved 25.200 x g (15.000 omdrejninger) i 10 min på RT.
    BEMÆRK: Affald fra syre og organiske opløsningsmidler skal adskilles og opbevares i glasbeholdere med ventilerede hætter. Brug separate glasbeholdere til indsamling af TGA-syreaffald og syreaffald.
  5. Efter centrifugering kasseres supernatanten og pelleten bevares. Tilsæt 1 mL vand, bland ved hvirvelstrøm, og centrifuge ved 25.200 x g (15.000 omdrejninger) i 10 min ved RT.
  6. Efter centrifugering kasseres supernatanten, og pelletlen blandes i 1 N NaOH i 24 timer ved 37 °C shaker/termisk mixer ved lav hastighed (Figur 2).
    BEMÆRK: Denne inkubationstid kan reduceres til 1 timeog 7.
  7. Efter inkubation centrifugeres de 2 mL mikrofugerør ved 25.200 x g (15.000 omdrejninger i minuttet) i 10 minutter ved RT. Hold supernatanten for det følgende trin.
    BEMÆRK: Proceduren omfatter brug af stærke syrer og andre kemikalier, der er ætsende i naturen. Derfor anbefales det at bære korrekt PPE under hele processen med ligninvurdering. TGA har en stærk ubehagelig lugt og er ætsende i naturen. Derfor anbefales det kun at bruge i røghætten.

4. Nedbør af lignin

  1. Supernatanten overføres til et friskt 2 mL mikrofugerør, og der tilsættes 200 μL koncentreret HCl. Inkubat ved 4 °C i 4 timer eller natten over (figur 2).
    BEMÆRK: Udsugningsprocessen kan standses på dette tidspunkt ved at udvide køletrinnet til natten over.
  2. Centrifuge ved 25.200 x g (15.000 omdrejninger) i 10 min ved RT og opløse pellet i 1 mL af 1 N NaOH.
  3. Inkuberes i shakeren på RT i 10 minutter for at suspendere pellet helt i NaOH.
  4. Endelig måles absorbansen af prøver ved 280 nm ved hjælp af et spektrofotometer og sammenlignes med standard ligninkurven.
  5. Den ukendte koncentration af lignin måles ved hjælp af kalibreringskurvens regressionslinjeværdier og absorbanser af udvundne prøver ved 280 nm.

5. Standardkurveforberedelse og ligninestimat i prøven

  1. Behandle ligninstandarder på samme måde som eksperimentelle prøver fra TGA-behandling.
  2. Mål kommercielle bambus lignin standarder i 0,5 mg stigninger fra 0,5 mg, 1 mg, 1,5 mg, 2 mg, 2,5 mg, 3,0 mg, 3,5 mg, 4,0 mg, 4,5 mg og 5 mg. Derefter opløses processen med TGA, HCl, i 1 N NaOH efterfulgt af måling af absorbans ved 280 nm (Figur 3A).
  3. Brug værdier af ligninkoncentration og absorbansaflæsninger til at generere et spredt område af standard ligninkurve (Figur 3B).
  4. Regressionslinjen y = mx+c, der genereres i det spredte område, anvendes til vurdering af ukendt ligninindhold af tilberedte prøver ved hjælp af "x"-værdier fra gennemsnitlige absorbanser af udvundne prøver ved 280 nm- og "m" og "c"-værdier fra lignin-standardkurveregressionslinjen.
  5. Ligninindholdet divideres med den resulterende værdi med den samlede vægt af den vakuum/lufttørrede plantebiomasseprøve efter methanoludvinding i mg (ca. 15 mg) for at opnå ligninkoncentration pr. mg. Derefter multipliceres denne værdi med 100 for at beregne ligninprocent pr. mg.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

To forskellige bomuldsforsøgslinjer blev sammenlignet for forskelle i deres ligninindhold i forskellige væv. Indholdet af den udvundne lignin i hver prøve blev målt ved 280 nm og registreret dens respektive absorbansværdier. De gennemsnitlige absorbansværdier for hver biologisk replikat blev sammenlignet med regressionslinjen i ligninstandardkurven (tabel 2, figur 3C). Regressionslinjen, y = mx + c, anvendes til at beregne det ukendte ligninindhold i de udvundne forsøgslinjer, prøve 1 og prøve 2. Resultaterne af de gennemsnitlige OD-værdier blev erstattet i "x", mens "m" og "c"-værdier blev tilsluttet fra regressionslinjen i ligninstandardkurven for at opnå ligninkoncentration "y" i mg (tabel 3, figur 3B). I næste trin opdeles "y"-værdien med prøvens vægt (15 mg) efter methanolekstraktion for at beregne indholdet pr. 1 mg lignin. I det følgende trin blev værdien for y/15 ganget med 1.000 for at beregne pr. gram (= 1.000 mg). For at få % af lignin dividerer vi y/15-værdien med 1.000 og ganges med 100. Gennemsnittet af lignin % for tre biologiske replikater (for hver linje, stikprøve 1 og stikprøve 2) blev sammenlignet mellem de to forsøgslinjers stikprøve 1 (11,7%) og stikprøve 2 (10,3 %). Ligninværdierne var konsistente blandt biologiske replikater, hvilket tyder på, at TGA-metoden er en pålidelig metode og meget specifik til måling af ligninindholdet. Der blev også foretaget sammenligningsundersøgelser mellem forskellige vævstyper (rod, stængel og blade) af to eksperimentelle bomuldslinjer, og begge linjer viste et relativt lavere ligninindhold i blade (3,4%) sammenlignet med stængler (9,4 % til 9,9 %) rødder (9,4 % til 9,2 %) (Tabel 4, Figur 4).

Figure 1
Figur 1:Forberedelse af en prøve af plantebiomasse.  (A)Indsamlet bomuld plantemateriale fra green house. (B) Forsigtigt vendt potter til separate rødder. (C) Vaskes grundigt i vand for at fjerne alt snavs. d) Adskilt rod-, stængel- og bladvæv. (E)Lufttørret væv i 2 dage efter adskillelsen af vævet. f) Lufttørret væv overføres til inkubatoren ved 49 °C i 10 dage. (G) Biomassekværn blev anvendt til at male plantebiomasseprøver. (H) Jordbaserede plantebiomasseprøver af rod, stængel og blad. (I) Jordprøverne læsses i slibeglassene, anbringes i frysemøllekammeret med en hastighed på 10 CPS i 3 cyklusser. (J) Slebet hætteglas, der udviser fint formalet vævspulver efter slibning i frysemøllen. (K) Fint formalet vævspulver af rod, stilk og blad efter brug af frysemølle til slibning. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Kritiske skridt i forbindelse med TGA-medieret ligninudvinding. Strømningsdiagram over kritiske trin i udvindingen af lignin fra plantebiomasse til estimering af ligninindholdet ved hjælp af TGA-metoden: 1. Forberedelse af planteprøver ved tilstrækkelig tørring og formaling til fint pulver ved hjælp af frysemølle; 2) 20 mg vævspulver blev underkastet PSB-, methanol- og vandvask, tørret og ekstraheret alkoholuopløseligt materiale 3. Ved hjælp af TGA og syre blev lignin udfældet; 4. Fremstilling af ligninstandardkurve ved hjælp af kommerciel bambus lignin; 5. Vurdering af ligninindholdet. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Standardkurveforberedelse og ligninestimat i prøven. (B) Spredt afbildning, der er genereret med Excel-programmet ved hjælp af værdierne fra tabel A. (C) Søjlediagrammer, der repræsenterer det anslåede indhold af rodvæv lignin i prøve 1 og prøve 2. Klik her for at se en større version af dette tal.

opløsning Nødvendige lagre præparation
Proteinopløselighedsbuffer (PSB) 1 M Tris HCl pH 8,8 og 0,5 M EDTA pH 8,0 Tilberedning af 100 ml arbejdsopløsning af PSB med en endelig koncentration på 50 mM Tris, 0,5 mM EDTA og 10 % SDS tilsættes 5 ml 1 M Tris, 1 ml EDTA og 10 g SDS til 80 ml sterilt vand, blandes, opløses og udgør det endelige volumen til 100 ml med sterilt vand. Autoklave ved 121 °C, 15 psi tryk, i 30 min.
1 M Tris HCl For at forberede 100 mL af 1 M Tris tilsættes 12,1 g Tris HCl (molekylvægt = 121,14 g) i 80 mL vand. Tris HCl blandes ved omrøring på en magnetisk omrører, pH-timen justeres med NaOH til 8,8, og volumenet fyldes op til 100 mL med sterilt vand og autoklave ved 121 °C, 15 psi tryk, i 30 min.
0,5 M EDTA (Ethylendiaminmethansyre) For at forberede 100 mL af 0,5 M EDTA tilsættes 18,6 g EDTA i 70 mL vand. PH-højen justeres til 8,0 (EDTA opløses fuldstændigt ved pH 8.0) ved hjælp af natriumhydroxidpiller og udgør volumenet til 100 mL. Opløsningen skal autoklavers ved 121 °C, 15 psi tryk, i 30 min.
3 N Saltsyre (HCL) For at forberede 100 mL af 3 N HCl tilsættes 26 mL koncentreret HCL til 74 mL sterilt vand.
4 % Natriumhydroxid (NaOH) Der fremstilles 1 N natriumhydroxidopløsning, tilsættes 4 g natriumhydroxid i 90 ml sterilt vand, opløses, volumenet fyldes op til 100 ml og autoklaveres ved 121 °C, 15 psi tryk, i 30 min.

Tabel 1: Fremstilling af de i protokollen anvendte opløsninger. Tabel over udarbejdelse af forskellige løsninger, der anvendes i protokollen.

Tabel 2: Lignin-standardkurven fremstillet af 0,5 mg til 3,5 mg industriel bambus lignin. Spredt graf med regressionslinje, der viser m- og c-værdier. Klik her for at hente denne tabel.

Tabel 3: Lignin-skabelon, der anvendes til beregning af ukendt ligninindhold ved hjælp af absorbansaflæsninger af prøver ved 280 nm (som x) og standardkurveregressionslinje 'm' og 'c' værdier fra standardkurven. Klik her for at hente denne tabel.

Tabel 4: Ligninindhold fra forskellige væv (rod, stilk og blade) af bomuldsplanter efter blomstringen. Klik her for at hente denne tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Lignin spiller en væsentlig rolle i plantevækst og -udvikling og er for nylig blevet grundigt undersøgt for anvendelse af biobrændstof, bioenergi og bioprodukter. Lignin er rig på aromatiske forbindelser, der opbevares i alle vaskulære plante sekundære cellevægge. Det har flere industrielle anvendelser såsom træpanel produkter, bio dispergeringsmidler, flocculants, polyurethan skum og i harpikser af kredsløb29,30,31. Det meste af lignin fra papir- og papirmasseindustrien frigives som affald eller brændes til varmeproduktion. Hvis lignin behandles effektivt, kan det således anvendes som et alternativ til både produkter baseret på fossile brændstoffer32,33 og bioelektrisk produktion34. Derfor er præcis vurdering af ligninindhold og -sammensætning afgørende for industrielle anvendelser, da sammensætningen varierer afhængigt af plantearterne såvel som planteorgantypen. Den væsentligste begrænsning for ligninestimering er forskellen som følge af den metode , der er valgt til vurdering af ligninindhold35. Estimeringsforskellene mellem de forskellige metoder skyldes primært kontaminering med andre ikke-ligninkomponenter, variation i opløseligheden, tilsætning af nye grupper til lignin, xylanforringelse/kontaminering, oprindelige strukturelle ændringer og tab af en eller anden ligninfraktion under elimineringen af andre komponenter. Desuden er de fleste ligninprotokoller oprindeligt udviklet baseret på trækemi27. Der er derfor et kritisk behov for at fastsætte ligninprotokoller for urteagtige prøver, efterhånden som flere afgrøde-/plantearter målrettes mod biobrændstoffer og bioprodukter. TGA-metoden anslår rent ligninindhold baseret på specifik binding med TGA. Ligninestimatet fra TGA giver derfor et lavere ligninindhold sammenlignet med Klason- og acetylkafmidmetoderne35,36. Dette skyldes den specifikke binding af lignin med TGA samt tab af noget ligninindhold under ligninudfældning (uopløselig del).

Ligninindholdet, der anslås ved hjælp af TGA-metoden, er reproducerbart og konsistent. Resultaterne i denne undersøgelse var konsistente blandt de biologiske replikater og viste en betydelig forskel mellem to linjer, hvilket tyder på pålideligheden af TGA-metoden til ligninestimering. For datagen reproducerbarhed og præcis vurdering af ligninindhold er det vigtigt at følge trinnene og tage følgende forholdsregler. Medtagelse af positive kontroller i forskellige koncentrationer, der spænder fra 0,5 mg til 5 mg i tre replikater, og behandling af dem sammen med prøver fra TGA-trinnet vil undgå eksperimentelle fejl og resulterer i præcis vurdering af ligninindholdet. Standardkurven skal genereres for hvert sæt prøver, og regressionslinjestatistikken R2 skal ligge mellem 97% og 99%. Den nøjagtige vægt af det tomme rør og det tørrede methanoludvundne væv er afgørende for det nøjagtige skøn over ligninindholdet. Derudover vil forskellige faktorer såsom specifikke stadier af planter, vækstbetingelser, genotyper, vævstype og plantens alder påvirke ligninindholdet30,37,38. Derfor er det vigtigt at dyrke alle de eksperimentelle linjer i samme miljø og høste den samme type væv på samme tid. Resultaterne af den aktuelle undersøgelse viste en forventet tendens til lavere ligninindhold i bladene, højere ligninindhold i stilke og rødder og påviste anvendeligheden af denne metode på forskellige plantevæv. Desuden mindre variation blandt biologiske replikater antydede, at TGA kan estimere reproducerbare lignin indhold i alle plantevæv.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikt.

Acknowledgments

Vi takker Institut for Plant &Soil Science og Cotton Inc. for deres delvise støtte til denne undersøgelse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BioSpectrophotometer kinetic Eppendorf kinetic 6136000010 For measuring absorbance at 280 nm
Centrifuge Eppendorf 5424 For centrifuging  samples
Commercial bamboo lignin Aldrich 1002171289 Used in the preparation of the standard curve
Distilled water Fischer Scientific 16690382 Used in the protocol
Falcon tubes VWR 734-0448 Containers for solutions
Freezer mill Spex Sample Prep 68-701-15 For fine grinding of plant tissue samples
Heat block/ Thermal mixer Eppendorf 13527550 For temperature controlled steps during lignin extraction
Hotplate stirrer Walter WP1007-HS Used for preparation of solutions
Hydrochloric acid (HCL) Sigma 221677 Used in the protocol
Incubator Fisherbrand 150152633 For thorough drying of plant tissue samples
Measuring scale Mettler toledo 30243386 For measuring plant tissue weight, standards and microfuge tubes
Methanol (100 %) Fischer Scientific 67-56-1 Used in the protocol
Microfuge tubes (2 mL) Microcentrifuge Z628034-500EA Containers for extraction of lignin
Plant biomass gerinder Hanchen Amazon Used for crushing dried samples
pH meter Fisher Scientific AE150 Measuring pH for solutions prepared for lignin extraction
Temperature controlled incubator/oven Fisher Scientific 15-015-2633 Used in the protocol
Thioglycolic acid (TGA) Sigma Aldrich 68-11-1 Used in the protocol
Vacuum dryer Eppendorf 22820001 Used for drying samples
Vortex mixer Eppendorf 3340001 For proper mixing of samples

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Freudenberg, K., Neish, A. C. Constitutionand Biosynthesis of Lignin. , Springer-Verlag Inc. New York, NY. 129 (1968).
  2. Chio, C., Sain, M., Qin, W. Lignin utilization: A review of lignin depolymerization from various aspects. Renewable and Sustainable Energy Reviews. 107, 232-249 (2019).
  3. Sun, Z., Fridrich, B., de Santi, A., Elangovan, S., Barta, K. Bright Side of Lignin Depolymerization: Toward New Platform Chemicals. Chemical Reviews. 118, 614-678 (2018).
  4. Xu, F. Cereal Straw as a Resource for Sustainable Biomaterials and Biofuels. Sun, R. C. , Elsevier. 9-47 (2010).
  5. Liu, Q., Luo, L., Zheng, L. Lignins: Biosynthesis and Biological Functions in Plants. International Journal of Molecular Sciences. 19, 335 (2018).
  6. Ithal, N., et al. Developmental transcript profiling of cyst nematode feeding cells in soybean roots. Molecular Plant-Microbe Interactions. 20, 510-525 (2007).
  7. Moura, J. C. M. S., et al. Abiotic and Biotic Stresses and Changes in the Lignin Content and Composition in Plants. Journal of Integrative Plant Biology. 52, 360-376 (2010).
  8. Vanholme, R., Morreel, K., Ralph, J., Boerjan, W. Lignin engineering. Current Opinion In Plant Biology. 11, 278-285 (2008).
  9. Lupoi, J. S., Singh, S., Parthasarathi, R., Simmons, B. A., Henry, R. J. Recent innovations in analytical methods for the qualitative and quantitative assessment of lignin. Renewable and Sustainable Energy Reviews. 49, 871-906 (2015).
  10. Mendu, V., et al. Identification and thermochemical analysis of high-lignin feedstocks for biofuel and biochemical production. Biotechnology for Biofuels. 4, 43 (2011).
  11. Shrotri, A., Kobayashi, H., Fukuoka, A. Advances in Catalysis. Song, C. 60, Academic Press. 59-123 (2017).
  12. Brunow, G. Biorefineries-Industrial Processes and Products: Status Quo and Future Directions. 2, 151-163 (2008).
  13. Constant, S., et al. New insights into the structure and composition of technical lignins: a comparative characterisation study. Green Chemistry. , (2016).
  14. Shimada, N., Tsuyama, T., Kamei, I. Rapid Determination of Thioglycolic Acid Lignin for Various Biomass Samples. Mokuzai Gakkaishi. 65, 25-32 (2019).
  15. Li, X., Weng, J. K., Chapple, C. Improvement of biomass through lignin modification. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 54, 569-581 (2008).
  16. Ponnusamy, V. K., et al. A review on lignin structure, pretreatments, fermentation reactions and biorefinery potential. Bioresource Technology. 271, 462-472 (2019).
  17. Hatfield, R., Fukushima, R. S. Can Lignin Be Accurately Measured. Crop Science. 45, 832-839 (2005).
  18. Bolker, H., Somerville, N. Ultraviolet spectroscopicstudies of lignin in solid state. I. Isolated lignin preparations. Tappi Journal. 72, 826-829 (1962).
  19. Fergus, B. J., Goring, D. A. I. The distribution of lignin in birchwood as determined by ultraviolet microscopy. Holzforschung. 24, 118-124 (1970).
  20. Schultz, T. P., Templeton, M. C., McGinnis, G. D. Rapid determination of lignocellulose by diffuse reflectance Fourier transform infrared spectrometry. Analytical Chemistry. 57, 2867-2869 (1985).
  21. Dence, C. W. The Determination of Lignin. Methods in Lignin Chemistry. Lin, S. Y., Dence, C. W. , (1992).
  22. Adler, E. Lignin chemistry-past, present and future. Wood Science and Technology. 11, 169-218 (1977).
  23. Brinkmann, K., Blaschke, L., Polle, A. Comparison of different methods for lignin determination as a basis for calibration of near-infrared reflectance spectroscopy and implications of lignoproteins. Journal of Chemical Ecology. 28, 2483-2501 (2002).
  24. Pandey, M. P., Kim, C. S. Lignin Depolymerization and Conversion: A Review of Thermochemical Methods. Chemical Engineering & Technology. 34, 29-41 (2011).
  25. Moreira-Vilar, F. C., et al. The acetyl bromide method is faster, simpler and presents best recovery of lignin in different herbaceous tissues than Klason and thioglycolic acid methods. PLoS One. 9, 110000 (2014).
  26. Hatfield, R. D., Grabber, J., Ralph, J., Brei, K. Using the Acetyl Bromide Assay To Determine Lignin Concentrations in Herbaceous Plants: Some Cautionary Notes. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 47, 628-632 (1999).
  27. Suzuki, S., et al. High-throughput determination of thioglycolic acid lignin from rice. Plant Biotechnology. 26, 337-340 (2009).
  28. Nakatsubo, F., Tanahashi, M., Higuchi, T. Acidolysis of Bamboo Lignin II : Isolation and Identification of Acidolysis Products. Wood research. 53, 9-18 (1972).
  29. Aro, T., Fatehi, P. Production and Application of Lignosulfonates and Sulfonated Lignin. ChemSusChem. 10, 1861-1877 (2017).
  30. Frei, M. Lignin: Characterization of a Multifaceted Crop Component. The Scientific World Journal. 2013, 436517 (2013).
  31. Lora, J. H., Glasser, W. G. Recent Industrial Applications of Lignin: A Sustainable Alternative to Nonrenewable Materials. Journal of Polymers and the Environment. 10, 39-48 (2002).
  32. Wang, R., Zhou, B., Wang, Z. Study on the Preparation and Application of Lignin-Derived Polycarboxylic Acids. Journal of Chemistry. 2019, 5493745 (2019).
  33. Welker, C. M., et al. Engineering Plant Biomass Lignin Content and Composition for Biofuels and Bioproducts. Energies. 8, 7654-7676 (2015).
  34. Mendu, V., et al. Global bioenergy potential from high-lignin agricultural residue. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 4014-4019 (2012).
  35. Brinkmann, K., Blaschke, L., Polle, A. Comparison of Different Methods for Lignin Determination as a Basis for Calibration of Near-Infrared Reflectance Spectroscopy and Implications of Lignoproteins. Journal of Chemical Ecology. 28, 2483-2501 (2002).
  36. Moreira-Vilar, F. C., et al. The Acetyl Bromide Method Is Faster, Simpler and Presents Best Recovery of Lignin in Different Herbaceous Tissues than Klason and Thioglycolic Acid Methods. PLoS One. 9, 110000 (2014).
  37. Iwaasa, A. D., Beauchemin, K. A., Acharya, S. N., Buchanan-Smith, J. G. Effect of stage of maturity and growth cycle on shearing force and cell wall chemical constituents of alfalfa stems. Canadian Journal of Animal Science. 76, 321-328 (1996).
  38. Arai-Sanoh, Y., et al. Genotypic Variations in Non-Structural Carbohydrate and Cell-Wall Components of the Stem in Rice, Sorghum, and Sugar Vane. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. , 1105072478 (2011).

Tags

Biokemi udgave 173 Lignin monolignoler thioglykolsyre
Skøn over indholdet af plantebiomasse lignin ved hjælp af thioglykolsyre (TGA)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dampanaboina, L., Yuan, N., Mendu,… More

Dampanaboina, L., Yuan, N., Mendu, V. Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA). J. Vis. Exp. (173), e62055, doi:10.3791/62055 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter