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Biochemistry

Estimation de la teneur en lignine de la biomasse végétale à l’aide de l’acide thioglycolique (TGA)

Published: July 24, 2021 doi: 10.3791/62055
Automatic Translation
1, 2, 2
1Department of Plant and Soil Science, Texas Tech University, 2Fiber and Biopolymer Research Institute (FBRI), Department of Plant and Soil Science, Texas Tech University

Summary

Ici, nous présentons une méthode TGA modifiée pour l’estimation de la teneur en lignine dans la biomasse végétale herbacée. Cette méthode estime la teneur en lignine en formant des liaisons thioéther spécifiques avec la lignine et présente un avantage par rapport à la méthode Klason, car elle nécessite un échantillon relativement petit pour l’estimation de la teneur en lignine.

Abstract

La lignine est un polymère naturel qui est le deuxième polymère le plus abondant sur Terre après la cellulose. La lignine est principalement déposée dans les parois cellulaires secondaires des plantes et est un hétéropolymère aromatique principalement composé de trois monolignols d’importance industrielle significative. La lignine joue un rôle important dans la croissance et le développement des plantes, protège des stress biotiques et abiotiques et de la qualité des aliments pour animaux, du bois et des produits industriels à base de lignine. Une estimation précise de la teneur en lignine est essentielle à la fois pour une compréhension fondamentale de la biosynthèse de la lignine et pour les applications industrielles de la biomasse. La méthode de l’acide thioglycolique (TGA) est une méthode très fiable d’estimation de la teneur totale en lignine dans la biomasse végétale. Cette méthode estime la teneur en lignine en formant des thioéthers avec les groupes alcool benzylique de la lignine, qui sont solubles dans des conditions alcalines et insolubles dans des conditions acides. La teneur totale en lignine est estimée à l’aide d’une courbe standard générée à partir de la lignine de bambou commerciale.

Introduction

La lignine est l’un des composants porteurs vitaux des parois cellulaires végétales et le deuxième polymère le plus abondant sur Terre1. Chimiquement, la lignine est un hétéropolymère réticulé constitué de composés phénoliques complexes de haut poids moléculaire qui forment une source naturelle renouvelable de polymères aromatiques et de synthèse de biomatériaux2,3. Ce polymère naturel joue un rôle important dans la croissance, le développement, la survie, le support mécanique, la rigidité de la paroi cellulaire, le transport de l’eau, le transport des minéraux, la résistance à la verse, le développement des tissus et des organes, le dépôt d’énergie et la protection contre les stress biotiques et abiotiques4,5,6,7. La lignine est principalement composée de trois monolignols différents : les alcools coniféryle, sinapyle et p-coumaryle qui sont dérivés de la voie phényl propanoïde8,9. La quantité de lignine et la composition des monomères varient en fonction de l’espèce végétale, du type de tissu/organe et des différents stades de développement de la plante10. La lignine est généralement classée en résineux, bois dur et lignine de gramin en fonction de la source et de la composition du monolignol. Le résineux est principalement composé de 95 % d’alcool de conifère avec 4 % d’alcools de p-coumaryl et 1 % d’alcools sinapyliques. Le bois dur contient des alcools conifères et sinapyliques dans des proportions égales, tandis que la lignine herbinée est composée de diverses proportions d’alcools conifères, sinapyle et p-coumaryle11,12. La composition des monomères est critique car elle détermine la force de la lignine, la décomposition et la dégradation de la paroi cellulaire ainsi que la détermination de la structure moléculaire, de la ramification et de la réticulation avec d’autres polysaccharides13,14.

La recherche sur la lignine gagne en importance dans les industries de la recherche de nourriture, du textile, du papier et du bioéthanol, des biocarburants et des bioproduits en raison de son faible coût et de son abondance élevée15,16. Diverses méthodes chimiques (p. ex. bromure d’acétyle, détergents acides, Klason et oxydation du permanganate) ainsi que des méthodes instrumentales (p. ex. spectroscopie proche infrarouge (NIR), spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) et spectrophotométrie ultraviolette (UV)) ont été utilisées pour la quantification de la lignine9,17. Les méthodes d’analyse de la lignine sont généralement classées en fonction du rayonnement électromagnétique, de la gravimétrie et de la solubilité. Le principe de l’estimation de la lignine par rayonnement électromagnétique était basé sur la propriété chimique de la lignine par laquelle elle absorbe la lumière à des longueurs d’onde spécifiques. Ces résultats ont été estimés sur la base du principe que la lignine a une absorbance UV plus forte que les glucides. En 1962, Bolker et Somerville ont utilisé des granulés de chlorure de potassium pour estimer la teneur en lignine du bois18. Cependant, cette méthode présente des inconvénients dans l’estimation de la teneur en lignine à partir d’échantillons herbacés en raison de la présence de composés phénoliques autres que la lignine et de l’absence d’un coefficient d’extinction approprié. En 1970, Fergus et Goring ont constaté que les maxima d’absorption des composés guaiacyle et syringyle étaient à 280 nm et 270 nm, ce qui corrigeait la question du coefficient d’extinction de la méthode de Bolker et Somerville19. Plus tard, la spectroscopie infrarouge, une technique très sensible pour caractériser les composés phénoliques, a également été utilisée pour l’estimation de la lignine avec une petite quantité d’échantillons de biomasse végétale. Un exemple d’une telle technologie était la spectrophotométrie à transformée de Fourier à réflectance diffuse. Cette méthode, cependant, manque d’une norme appropriée similaire à la méthode UV20. Plus tard, la teneur en lignine a été estimée par NIRS (spectroscopie proche infrarouge) et RMN (spectroscopie par résonance magnétique nucléaire). Bien qu’il y ait des inconvénients dans ces méthodes, elles ne modifient pas la structure chimique de la lignine, conservant sa pureté20.

La méthode gravimétrique Klason est une méthode analytique directe et la plus fiable pour l’estimation de la lignine des tiges ligneuses. La base de l’estimation gravimétrique de la lignine est l’hydrolyse/solubilisation de composés non-lignine et la collecte de lignine insoluble pour la gravimétrie21. Dans ce procédé, les glucides sont éliminés par hydrolyse de la biomasse avec le concentréH2SO4pour extraire le résidu de lignine20,22. La teneur en lignine estimée par cette méthode est connue sous le nom de lignine insoluble acide ou de lignine Klason. L’application de la méthode Klason dépend de l’espèce végétale, du type de tissu et du type de paroi cellulaire. La présence de quantités variables de composants non lignins tels que les tanins, les polysaccharides et les protéines entraîne des différences proportionnelles dans l’estimation des teneurs en lignine insolubles/solubles dans l’acide. Par conséquent, la méthode Klason n’est recommandée que pour l’estimation de la lignine de la biomasse à forte teneur en lignine telle que les tiges ligneuses17,23. Les méthodes de solubilité telles que le bromure d’acétyle (AcBr), la lignine insoluble dans l’acide et l’acide thioglycolique (TGA) sont les méthodes les plus couramment utilisées pour estimer la teneur en lignine de diverses sources de biomasse végétale. Kim et coll. ont établi deux méthodes pour l’extraction de la lignine par solubilisation. La première méthode extrait la lignine comme résidu insoluble en solubilisant la cellulose et l’hémicellulose, tandis que la seconde méthode sépare la lignine dans la fraction soluble, laissant la cellulose et l’hémicellulose comme résidu insoluble24.

Les méthodes similaires utilisées dans l’estimation de la lignine sur la base de la solubilité sont l’acide thioglycolique (TGA) et le bromure d’acétyle (AcBr)25. Les méthodes de TGA et de bromure d’acétyle estiment la teneur en lignine en mesurant l’absorbance de la lignine solubilisée à 280 nm; cependant, la méthode AcBr dégrade les xylanes au cours du processus de solubilisation de la lignine et montre une fausse augmentation de la teneur en lignine26. La méthode du thioglycolate (TGA) est la méthode la plus fiable, car elle dépend d’une liaison spécifique avec les groupes thioéther des groupes alcool benzylique de la lignine avec TGA. La lignine liée au TGA est précipitée dans des conditions acides à l’aide de HCl, et la teneur en lignine est estimée en utilisant son absorbance à 280nm27. La méthode TGA présente des avantages supplémentaires de moins de modifications structurelles, d’une forme soluble d’estimation de la lignine, de moins d’interférence des composants non-lignine et d’une estimation précise de la lignine en raison d’une liaison spécifique avec la TGA.

Cette méthode TGA est modifiée en fonction du type d’échantillon de biomasse végétale utilisé pour l’estimation de la teneur en lignine. Ici, nous avons modifié et adapté la méthode TGA rapide des pailles de riz27 aux tissus de coton pour estimer la teneur en lignine. En bref, les échantillons de plantes en poudre séchées ont été soumis à un tampon de solubilisation des protéines et à une extraction au méthanol pour éliminer les protéines et la fraction soluble dans l’alcool. Le résidu insoluble dans l’alcool a été traité avec de la TGA et a précipité de la lignine dans des conditions acides. Une courbe standard de lignine a été générée utilisant la lignine commerciale de bambou et une droite de régression (y = mx+c) a été obtenue. La valeur « x » utilise des valeurs moyennes d’absorbance de la lignine à 280 nm, tandis que les valeurs « m » et « c » ont été entrées à partir de la droite de régression pour calculer la concentration inconnue de lignine dans des échantillons de biomasse de plantes cotonnières. Cette méthode est divisée en cinq phases: 1) préparation des échantillons de plantes; 2) laver les échantillons avec de l’eau et du méthanol; 3) traitement de la pastille avec de la TGA et de l’acide pour précipiter la lignine; 4) précipitation de la lignine; et 5) la préparation de la courbe standard et l’estimation de la teneur en lignine de l’échantillon. Les deux premières phases sont principalement axées sur la préparation du matériel végétal suivie de l’eau, du PSB (tampon de solubilisation des protéines) et des extractions de méthanol pour obtenir la matière insoluble dans l’alcool. Ensuite, il a été traité avec de la TGA (acide thioglycolique) et du HCl pour former un complexe avec de la lignine dans la troisième phase. A la fin, HCl a été utilisé pour précipiter la lignine, qui a été dissoute dans de l’hydroxyde de sodium pour mesurer son absorbance à 280 nm28.

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Protocol

1. Préparation des échantillons de plantes

  1. Recueillir des plants de coton âgés de deux mois dans la serre (Figure 1A).
  2. Retournez doucement les pots de plantes pour séparer le sol et les racines avec des racines latérales intactes en assouplissant le sol autour de la plante(Figure 1B).
  3. Lavez soigneusement les plantes collectées dans des plateaux remplis d’eau pour enlever toute la saleté (pour les échantillons de racines) (Figure 1C).
  4. Utilisez des essuie-tout pour sécher les racines, les tiges et les feuilles séparées et étiquetez-les (Figure 1D). Sécher à l’air pendant 2 jours à température ambiante pour éviter toute contamination fongique (Figure 1E).
  5. Transférer les tissus de l’échantillon dans des contenants ou des feuilles d’aluminium étiquetés et incuber dans un incubateur à température contrôlée à 49 °C pendant 7 à 10 jours(figure 1F).
    REMARQUE: Des températures plus élevées peuvent modifier la structure de la lignine. Alternativement, un lyophilisateur peut être utilisé pour sécher les échantillons pendant 1 à 2 jours sans causer de modifications chimiques à la biomasse végétale.
  6. Utilisez une lame pour couper le tissu séché de l’incubateur en morceaux de taille 5 mm ou utilisez un broyeur à biomasse pour broyer les tissus végétaux(figure 1G, figure 1H).
    NOTA : Le broyeur ou la lame de biomasse doit être nettoyé après la coupe ou la broyage de chaque échantillon.
  7. Transférer le matériel végétal broyé par les tissus coupés/biomasse dans des flacons de broyage et broyer dans une poudre fine de taille 1 mm à l’aide d’un broyeur congélateur ou d’un broyeur cryogénique avec du liquideN2.
  8. Broyer des échantillons pendant trois cycles à raison de 10 CPS (chaque cycle de 2 min) dans une poudre uniforme(Figure 1I,1J, 1K).
    REMARQUE: L’expérience peut être suspendue à ce stade et les échantillons peuvent être stockés à température ambiante dans des conteneurs hermétiques pour un stockage à long terme.

2. Lavage des échantillons avec de l’eau, du PSB et du méthanol

  1. Mesurer et enregistrer le poids de tous les tubes de microfuges vides de 2 mL utilisés pour l’estimation de la teneur en lignine dans le cahier de laboratoire.
  2. Transférer 20 mg de la poudre de l’échantillon broyé dans le tube pré-pesé. Pesez le tube avec des tissus et de la poudre tissulaire et notez ces poids dans le cahier de laboratoire.
  3. Incuber tous les tubes de microfuges de 2 mL (avec couvercles ouverts) avec 20 mg de poudre tissulaire dans un bloc chauffant ou un four à 60 °C pendant 1 heure.
  4. Après incubation, refroidir les échantillons pendant 10 min à température ambiante (RT).
  5. Ajouter 1,8 mL d’eau à chaque tube de microfuge et mélanger par vortex. Ensuite, centrifuger à 25 200 x g (15 000 tr/min) pendant 10 min à TA et jeter le surnageant(figure 2).
  6. Ajouter 1,8 mL de tampon de solubilisation des protéines (PSB)(tableau 1)à chaque pastille retenue et mélanger par vortex. Centrifuger à 25 200 x g (15 000 tr/min) pendant 10 min à TA et jeter le surnageant.
  7. Répétez l’étape 2.6 pour chaque échantillon.
  8. Ajouter 1,8 mL d’eau à chaque pastille, mélanger par vortex et centrifuger à 25 200 x g (15 000 tr/min) pendant 10 min. Après centrifugation, conservez le granulé et jetez le surnageant.
  9. Ajouter à la pastille retenue, ajouter 1,8 mL de méthanol et incuber dans un bloc thermique à 60 °C pendant 20 min. Ensuite, centrifuger à 25 200 x g (15 000 tr/min) pendant 10 min à TA. Après centrifugation, jeter le surnageant et conserver le culot (Figure 2).
  10. Répétez l’étape 2.9 pour chaque échantillon.
  11. Sécher à l’air le culot à RT ou procéder immédiatement par séchage sous vide. Sécher sous vide à l’aide d’un séchoir à vide à 30 °C pendant 2 à 3 heures ou jusqu’à ce que le culot soit complètement sec.
    REMARQUE: L’expérience peut être suspendue à ce stade par séchage à l’air pendant la nuit ou se poursuivre par séchage sous vide.
  12. Après séchage, pesez les tubes de l’échantillon avec la pastille séchée et enregistrez le poids à côté du poids du tube vide respectif dans le cahier de laboratoire. Estimez le poids de la pastille en soustrayant les deux valeurs. Ces poids seront utilisés pour l’estimation de la lignine à la fin du processus d’extraction de la lignine.
  13. À ce stade de l’extraction de la lignine, inclure la lignine de bambou commerciale pour la génération de la courbe standard de la lignine. Mesurer la lignine de bambou commerciale dans des tubes séparés allant de 0,5 mg à 5 mg par incréments de 0,5 mg (0,5 mg, 1 mg, 1,5 mg, 2 mg, 3 mg, 3,5 mg, 4 mg, 4,5 mg et 5,0 mg). Mesurer chaque concentration trois fois pour trois répétitions techniques.
    REMARQUE: À partir de là, les étalons mesurés à l’étape ci-dessus ont été traités de la même manière que les échantillons séchés.

3. Traitement des granulés avec de la TGA et de l’acide pour précipiter la lignine

  1. Le sujet a traité des échantillons de l’étape ci-dessus, ainsi que des étalons mesurés, au traitement TGA (acide thioglycolique).
  2. Ajouter 1 mL de 3 N HCl(tableau 1)et 100 μL de TGA à chaque pastille.
  3. Vortex et incuber dans un bloc thermique préchauffé à 80 °C pendant 3 heures dans une hotte(figure 2).
    NOTA : L’étape de chauffage à 80 °C doit être surveillée. L’accumulation de haute pression peut ouvrir les couvercles et entraîner des déversements de produits chimiques. Les tubes à bouchon à vis sont recommandés, mais les tubes de 2 mL peuvent être faiblement bouchés au cours de cette étape comme alternative pour prévenir de tels déversements.
  4. Après incubation, refroidir les tubes à TA pendant 10-15 min et centrifuger à 25 200 x g (15 000 tr/min) pendant 10 min à TA.
    NOTA : Les déchets produits à partir de solvants acides et organiques doivent être séparés et entreposés dans des contenants en verre munis de bouchons ventilés. Utilisez des contenants en verre séparés pour la collecte des déchets acides TGA et des déchets acides.
  5. Après centrifugation, jetez le surnageant et conservez le granulé. Ajouter 1 mL d’eau, mélanger par vortex et centrifuger à 25 200 x g (15 000 tr/min) pendant 10 min à TA.
  6. Après centrifugation, jeter le surnageant et mélanger la pastille dans 1 N NaOH pendant 24 h à 37 °C shaker/mélangeur thermique à basse vitesse(Figure 2).
    REMARQUE: Ce temps d’incubation peut être réduit à 1 heure7.
  7. Après incubation, centrifuger les tubes de microfuges de 2 mL à 25 200 x g (15 000 tr/min) pendant 10 min à TA. Conserver le surnageant pour l’étape suivante.
    NOTA : La procédure implique l’utilisation d’acides forts et d’autres produits chimiques de nature corrosive. Par conséquent, le port d’un EPI approprié est recommandé tout au long du processus d’estimation de la lignine. Le TGA a une forte odeur désagréable et est de nature corrosive. Par conséquent, il est recommandé de ne l’utiliser que dans la hotte.

4. Précipitation de la lignine

  1. Transférer le surnageant dans un tube de microfuges frais de 2 mL et ajouter 200 μL de HCl concentré Incuber à 4 °C pendant 4 heures ou pendant la nuit(figure 2).
    REMARQUE: Le processus d’extraction peut être suspendu à ce stade en prolongeant l’étape de réfrigération à la nuit.
  2. Centrifuger à 25 200 x g (15 000 tr/min) pendant 10 min à TA et dissoudre le culot dans 1 mL de 1 N NaOH.
  3. Incuber dans le shaker à RT pendant 10 min pour suspendre complètement le culot dans NaOH.
  4. Enfin, mesurer l’absorbance des échantillons à 280 nm à l’aide d’un spectrophotomètre et comparer avec la courbe de lignine standard.
  5. Mesurer la concentration inconnue de lignine à l’aide des valeurs de la droite de régression de la courbe d’étalonnage et des absorbances des échantillons extraits à 280 nm.

5. Préparation de la courbe standard et estimation de la lignine dans l’échantillon

  1. Traiter les étalons de lignine de la même manière que les échantillons expérimentaux du traitement par TGA.
  2. Mesurer les normes commerciales de lignine de bambou par incréments de 0,5 mg à partir de 0,5 mg, 1 mg, 1,5 mg, 2 mg, 2,5 mg, 3,0 mg, 3,5 mg, 4,0 mg, 4,5 mg et 5 mg. Ensuite, procédé par TGA, HCl, dissoudre en NaOH 1 N suivi d’une mesure de l’absorbance à 280 nm(figure 3A).
  3. Utilisez les valeurs de la concentration de lignine et les lectures d’absorbance pour générer un diagramme dispersé de la courbe standard de lignine (Figure 3B).
  4. Utilisez la droite de régression, y = mx+c générée dans le diagramme dispersé, pour l’estimation de la teneur inconnue en lignine des échantillons préparés en utilisant les valeurs « x » des absorbances moyennes des échantillons extraits à 280 nm et les valeurs « m » et « c » de la droite de régression de la courbe standard de lignine.
  5. Diviser la teneur en lignine dans la valeur y résultante par le poids total de l’échantillon de biomasse végétale séchée sous vide/séché à l’air après extraction au méthanol en mg (environ 15 mg) pour obtenir la concentration de lignine par mg. Ensuite, multipliez cette valeur par 100 pour calculer le pourcentage de lignine par mg.

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Representative Results

Deux lignées expérimentales de coton différentes ont été comparées pour des différences dans leurs teneurs en lignine dans différents tissus. La teneur en lignine extraite de chaque échantillon a été mesurée à 280 nm et a enregistré ses valeurs d’absorbance respectives. Les valeurs moyennes d’absorbance de chaque répétition biologique ont été comparées à la droite de régression de la courbe standard de lalignine (tableau 2, figure 3C). La droite de régression, y = mx + c, est utilisée pour calculer la teneur inconnue en lignine des raies expérimentales extraites, échantillon 1 et échantillon 2. Les résultats des valeurs moyennes de DO ont été substitués en « x » tandis que les valeurs « m » et « c » ont été bouchées à partir de la droite de régression de la courbe standard de lignine pour obtenir la concentration de lignine « y » en mg(tableau 3, figure 3B). À l’étape suivante, pour calculer par 1 mg de teneur en lignine, diviser la valeur « y » par le poids de l’échantillon (15 mg) après extraction au méthanol. À l’étape suivante, pour calculer par gramme (= 1 000 mg), la valeur y/15 a été multipliée par 1 000. Pour obtenir % de lignine, nous divisons la valeur y/15 par 1 000 et multiplions par 100. La moyenne du pourcentage de lignine pour trois répétitions biologiques (de chaque lignée, échantillon 1 et échantillon 2) a été comparée entre les deux lignées expérimentales échantillon 1 (11,7 %) et l’échantillon 2 (10,3 %). Les valeurs de lignine étaient cohérentes parmi les répétitions biologiques, ce qui suggère que la méthode TGA est une méthode fiable et très spécifique pour mesurer la teneur en lignine. Des études comparatives ont également été faites entre différents types de tissus (racine, tige et feuilles) de deux lignées expérimentales de coton, et les deux lignées ont montré une teneur en lignine relativement plus faible dans les feuilles (3,4 %) comparativement aux tiges (9,4 % à 9,9 %) et les racines (9,4 % à 9,2 %) (Tableau 4, Figure 4).

Figure 1
Figure 1: Préparation de l’échantillon de biomasse végétale.  (A) Matériel végétal de coton collecté à partir de green house. (B) Pots doucement retournés pour séparer les racines. (C) Soigneusement lavé à l’eau pour enlever toute la saleté. (D) Tissus racinaires, de tiges et de feuilles séparés. (E) Tissu séché à l’air pendant 2 jours après la séparation du tissu. (F) Les tissus séchés à l’air sont transférés dans l’incubateur à 49 °C pendant 10 jours. ( G )Lebroyeur à biomasse a été utilisé pour broyer des échantillons de biomasse végétale. (H) Échantillons de biomasse de plantes moulues de racines, de tiges et de feuilles. (I) Les échantillons broyés sont chargés dans les flacons de broyage, placés dans la chambre du laminoir congélateur, mis à la terre dans le laminoir congélateur à raison de 10 CPS pendant 3 cycles. (J) Flacons broyés montrant de la poudre de tissu finement broyée après broyage dans le congélateur. (K) Poudre de tissu finement broyée de racine, de tige et de feuille après utilisation d’un broyeur congélateur pour le broyage. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Étapes critiques impliquées dans l’extraction de la lignine médiée par le TGA. Organigramme des étapes critiques impliquées dans l’extraction de la lignine de la biomasse végétale à l’estimation de la teneur en lignine à l’aide de la méthode TGA: 1. Préparation d’échantillons de plantes par séchage et broyage suffisants en poudre fine à l’aide d’un congélateur; 2. 20 mg de poudre tissulaire ont été soumis à des lavages à l’eau, au psb, au méthanol et à l’eau, séchés et extraits de matières insolubles dans l’alcool; 3. En utilisant la TGA et l’acide, la lignine a été précipitée; 4. Préparation de la courbe standard de la lignine à l’aide de lignine de bambou commerciale; 5. Estimation de la teneur en lignine. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Préparation de la courbe standard et estimation de la lignine dans l’échantillon. (A)Tableau montrant différentes concentrations de lignine de bambou commerciale utilisée pour générer la courbe standard de la lignine à partir de lectures d’absorbance à 280 nm. (B) Graphique dispersé généré avec le programme Excel à l’aide des valeurs du tableau A. (C) Graphiques à barres représentant les teneurs estimées en lignine des tissus racinaires de l’échantillon 1 et de l’échantillon 2. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

solution Stocks nécessaires préparation
Tampon de solubilisation des protéines (PSB) 1 M Tris HCl pH 8,8 et 0,5 M EDTA pH 8,0 Préparer 100 mL de solution de travail de PSB avec une concentration finale de 50 mM Tris, 0,5 mM d’EDTA et 10 % de SDS, ajouter 5 mL de 1 M Tris, 1 mL d’EDTA et 10 g de SDS à 80 mL d’eau stérile, mélanger, dissoudre et compléter le volume final à 100 mL avec de l’eau stérile. Autoclave à 121 °C, pression de 15 psi, pendant 30 min.
1 M Tris HCl Pour préparer 100 mL de Tris 1 M, ajouter 12,1 g de Tris HCl (poids moléculaire = 121,14 g) dans 80 mL d’eau. Mélanger tris HCl en agitant sur un agitateur magnétique, régler le pH avec NaOH à 8,8 et porter le volume à 100 mL avec de l’eau stérile et autoclaver à 121 °C, pression de 15 psi, pendant 30 min.
0,5 M EDTA (Éthylènediamine tétraacétiqueacide) Pour préparer 100 mL d’EDTA de 0,5 M, ajouter 18,6 g d’EDTA dans 70 mL d’eau. Ajuster le pH à 8,0 (l’EDTA se dissout complètement à un pH de 8,0) à l’aide de pastilles d’hydroxyde de sodium et porter le volume à 100 mL. Autoclaver la solution à 121 °C, pression de 15 psi, pendant 30 min.
3 N Acide chlorhydrique (HCL) Pour préparer 100 mL de 3 N HCl, ajouter 26 mL de HCL concentré à 74 mL d’eau stérile.
4 % Hydroxyde de sodium (NaOH) Préparer 1 N solution d’hydroxyde de sodium, ajouter 4 g d’hydroxyde de sodium dans 90 mL d’eau stérile, dissoudre, compléter le volume à 100 mL et autoclaver à 121 °C, pression de 15 psi, pendant 30 min.

Tableau 1 : Préparation des solutions utilisées dans le protocole. Tableau montrant la préparation des différentes solutions utilisées dans le protocole.

Tableau 2 : Courbe standard de lignine préparée de 0,5 mg à 3,5 mg de lignine de bambou industrielle. Graphique en nuages avec une droite de régression montrant les valeurs m et c. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 3 : Modèle de lignine utilisé pour le calcul de la teneur inconnue en lignine à l’aide des lectures d’absorbance des échantillons à 280 nm (sous forme x) et des valeurs de régression de la courbe standard « m » et « c » de la courbe standard. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 4: Teneur en lignine de différents tissus (racine, tige et feuilles) du cotonnier au stade post-floraison. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

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Discussion

La lignine joue un rôle important dans la croissance et le développement des plantes et a récemment fait l’objet d’études approfondies pour des applications de biocarburants, de bioénergie et de bioproduits. La lignine est riche en composés aromatiques qui sont stockés dans toutes les parois cellulaires secondaires des plantes vasculaires. Il a plusieurs applications industrielles telles que les panneaux de bois, les bio dispersants, les floculants, les mousses de polyuréthane et dans les résines de circuitsimprimés 29,30,31. La majeure partie de la lignine produite par les industries du papier et de la pâte à papier est rejetée sous forme de déchets ou brûlée pour la production de chaleur. Ainsi, si elle est traitée efficacement, la lignine peut être utilisée comme alternative à la fois aux produits à base de combustiblesfossiles 32,33 et à la production de bioélectricité34. Par conséquent, une estimation précise de la teneur et de la composition de la lignine est essentielle pour les applications industrielles, car la composition varie en fonction de l’espèce végétale ainsi que du type d’organe végétal. La principale limite pour l’estimation de la lignine est la différence résultant de la méthode choisie pour l’estimation de la teneur en lignine35. Les différences d’estimation entre les différentes méthodes sont principalement attribuables à la contamination par d’autres composants autres que la lignine, à la variation de la solubilité, à l’ajout de nouveaux groupes à la lignine, à la dégradation/contamination du xylane, aux changements structurels natifs et à la perte d’une certaine fraction de lignine lors de l’élimination d’autres composants. De plus, la majorité des protocoles de lignine sont élaborés à l’origine sur la base de la chimie du bois27. Par conséquent, il est essentiel d’établir des protocoles de lignine pour les échantillons herbacés, car de plus en plus d’espèces de cultures et de plantes sont ciblées pour les biocarburants et les bioproduits. La méthode TGA estime la teneur en lignine pure en fonction de la liaison spécifique avec la TGA. Par conséquent, l’estimation de la lignine par TGA donne une teneur en lignine plus faible par rapport aux méthodes Klason et bromure d’acétyle35,36. Cela est dû à la liaison spécifique de la lignine avec le TGA ainsi qu’à la perte d’une certaine teneur en lignine pendant la précipitation de la lignine (partie insoluble).

La teneur en lignine estimée à l’aide de la méthode TGA est reproductible et cohérente. Les résultats obtenus dans cette étude étaient cohérents parmi les répétitions biologiques et ont montré une différence significative entre deux lignées, ce qui suggère la fiabilité de la méthode TGA pour l’estimation de la lignine. Pour la reproductibilité des données et l’estimation précise de la teneur en lignine, il est important de suivre les étapes et de prendre les précautions suivantes. L’inclusion de témoins positifs à différentes concentrations, allant de 0,5 mg à 5 mg dans trois répétitions, et leur traitement avec des échantillons de l’étape TGA permettra d’éviter les erreurs expérimentales et d’obtenir une estimation précise de la teneur en lignine. La courbe standard doit être générée pour chaque ensemble d’échantillons et la statistique de droite de régression R2 doit se situer entre 97 % et 99 %. Le poids exact du tube vide et du tissu extrait de méthanol séché est critique pour l’estimation exacte de la teneur en lignine. En outre, divers facteurs tels que le stade spécifique des plantes, les conditions de croissance, les génotypes, le type de tissu et l’âge de la plante affecteront la teneur en lignine30,37,38. Par conséquent, il est important de cultiver toutes les lignées expérimentales dans le même environnement et de récolter le même type de tissus en même temps. Les résultats de la présente étude ont montré une tendance attendue à une teneur plus faible en lignine dans les feuilles, à une teneur plus élevée en lignine dans les tiges et les racines, et ont démontré l’applicabilité de cette méthode à divers tissus végétaux. De plus, une variation moindre entre les répétitions biologiques suggère que la TGA peut estimer la teneur en lignine reproductible dans tous les tissus végétaux.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils ne sont pas en conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Nous remercions le Département des sciences des plantes et des sols et Cotton Inc. pour leur soutien partiel à cette étude.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BioSpectrophotometer kinetic Eppendorf kinetic 6136000010 For measuring absorbance at 280 nm
Centrifuge Eppendorf 5424 For centrifuging  samples
Commercial bamboo lignin Aldrich 1002171289 Used in the preparation of the standard curve
Distilled water Fischer Scientific 16690382 Used in the protocol
Falcon tubes VWR 734-0448 Containers for solutions
Freezer mill Spex Sample Prep 68-701-15 For fine grinding of plant tissue samples
Heat block/ Thermal mixer Eppendorf 13527550 For temperature controlled steps during lignin extraction
Hotplate stirrer Walter WP1007-HS Used for preparation of solutions
Hydrochloric acid (HCL) Sigma 221677 Used in the protocol
Incubator Fisherbrand 150152633 For thorough drying of plant tissue samples
Measuring scale Mettler toledo 30243386 For measuring plant tissue weight, standards and microfuge tubes
Methanol (100 %) Fischer Scientific 67-56-1 Used in the protocol
Microfuge tubes (2 mL) Microcentrifuge Z628034-500EA Containers for extraction of lignin
Plant biomass gerinder Hanchen Amazon Used for crushing dried samples
pH meter Fisher Scientific AE150 Measuring pH for solutions prepared for lignin extraction
Temperature controlled incubator/oven Fisher Scientific 15-015-2633 Used in the protocol
Thioglycolic acid (TGA) Sigma Aldrich 68-11-1 Used in the protocol
Vacuum dryer Eppendorf 22820001 Used for drying samples
Vortex mixer Eppendorf 3340001 For proper mixing of samples

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Biochimie Numéro 173 Lignine monolignols Acide thioglycolique
Estimation de la teneur en lignine de la biomasse végétale à l’aide de l’acide thioglycolique (TGA)
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Dampanaboina, L., Yuan, N., Mendu, V. Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA). J. Vis. Exp. (173), e62055, doi:10.3791/62055 (2021).

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