Summary
כאן, אנו מציגים שיטת TGA שונה להערכת תוכן ליגנין בביומסה צמחית עשבוני. שיטה זו מעריכה את תוכן ה-lignin על ידי יצירת קשרים תיותרים ספציפיים עם ליגנין ומציגה יתרון על פני שיטת קלסון, שכן היא דורשת מדגם קטן יחסית להערכת תוכן ליגנין.
Abstract
ליגנין הוא פולימר טבעי שהוא הפולימר השני בשכיחותו על פני כדור הארץ לאחר תאית. ליגנין מופקד בעיקר בקירות תאים משניים צמחיים והוא הטרופולימר ארומטי המורכב בעיקר משלושה מונוליגנולים בעלי חשיבות תעשייתית משמעותית. ליגנין ממלא תפקיד חשוב בצמיחה והתפתחות של צמחים, מגן מפני לחצים ביוטיים ואביוטיים, ובאיכות מספוא לבעלי חיים, עץ ומוצרי ליגנין תעשייתיים. הערכה מדויקת של תוכן ליגנין חיונית הן להבנה בסיסית של הביוסינתזה של ליגנין והן ליישומים תעשייתיים של ביומסה. שיטת החומצה התיוגליקולית (TGA) היא שיטה אמינה ביותר להערכת תכולת הליגנין הכוללת בביומסה הצמחית. שיטה זו מעריכה את התוכן ליגנין על ידי יצירת thioethers עם קבוצות אלכוהול בנזיל של ליגנין, אשר מסיסים בתנאים אלקליין בלתי מסיס בתנאים חומציים. תוכן ליגנין הכולל מוערך באמצעות עקומה סטנדרטית שנוצרה מלינין במבוק מסחרי.
Introduction
ליגנין הוא אחד המרכיבים החיוניים לשאת עומס של קירות תא הצמח ואת הפולימר השני הנפוץ ביותר על פני כדור הארץ1. מבחינה כימית, ליגנין הוא הטרופולימר מקושר המורכב מתרכובות פנוליות מורכבות משקל מולקולרי גבוה היוצרות מקור מתחדש טבעי של פולימרים ארומטיים וסינתזה של ביו-חומרים2,3. פולימר טבעי זה ממלא תפקידים משמעותיים בצמיחת הצמח, פיתוח, הישרדות, תמיכה מכנית, קשיחות דופן התא, הובלת מים, הובלת מינרלים, עמידות ללינה, פיתוח רקמות ואיברים, תצהיר אנרגיה והגנה מפני לחצים ביוטיים ואביוטיים4,5,6,7. ליגנין מורכב בעיקר משלושה מונוליגנולים שונים: מחט, סינפיל ואלכוהול p-coumaryl הנגזרים ממסלול פניל פרופנואיד8,9. כמות ליגנין ואת הרכב של מונומרים להשתנות בהתאם למין הצמח, סוג הרקמה / איבר, ושלבים שונים של התפתחות הצמח10. ליגנין מסווג באופן נרחב לעץ רך, עץ קשה, ודשא ליגנין מבוסס על הרכב המקור מונוליניול. עץ רך מורכב בעיקר מ-95% אלכוהול מחטני עם 4% p-coumaryl ו-1% אלכוהול סינפיל. בעץ יש אלכוהול מחט וסינפיל בפרופורציות שוות, ואילו ליגנין דשא מורכב מממדים שונים של מחט, סינפיל ואלכוהול p-coumaryl11,12. ההרכב של מונומרים הוא קריטי כפי שהוא קובע את כוח ליגנין, פירוק, השפלה של דופן התא, כמו גם קביעת מבנה מולקולרי, הסתעפות, הצלבה עם פוליסכרידים אחרים13,14.
מחקר ליגנין הוא צובר חשיבות ליקוט, תעשיות טקסטיל, תעשיות נייר, עבור bioethanol, דלק ביולוגי, ביו מוצרים בשל עלות נמוכה שלה שפע גבוה15,16. שיטות כימיות שונות (למשל, אצטיל ברומיד, חומרי ניקוי חומצה, קלסון, חמצון פרמנגנט) יחד עם שיטות אינסטרומנטליות (למשל, ליד אינפרא אדום (NIR) ספקטרוסקופיה, תהודה מגנטית גרעינית (NMR) ספקטרוסקופיה, ו ספקטרופוטומיה אולטרה סגולה (UV) שימשו לכימות ליגנין9,17. שיטות הניתוח של ליגנין מסווגות בדרך כלל בהתבסס על קרינה אלקטרומגנטית, כבידה, ומסיסות. העיקרון מאחורי הערכת ליגנין על ידי קרינה אלקטרומגנטית התבסס על המאפיין הכימי של ליגנין שבאמצעותו הוא סופג אור באורכי גל ספציפיים. תוצאות אלו הוערכו בהתבסס על העיקרון כי ליגנין יש ספיגת UV חזקה יותר מאשר פחמימות. בשנת 1962, בולקר וסומרוויל השתמשו כדורי אשלגן כלורי כדי להעריך את תכולת ליגנין בעץ18. עם זאת, שיטה זו יש חסרונות בהערכת תוכן ליגנין מדגימות עשבוניות בשל נוכחותם של תרכובות פנוליות שאינן ליגנין והיעדר מקדם הכחדה מתאים. בשנת 1970, פרגוס וגרינג מצאו כי גואיאצ'יל ומתחם סירינגיל ספיגת מקסימום היו ב 280 ננומטר ו 270 ננומטר, אשר תיקן את נושא מקדם ההכחדה של שיטת בולקר וסומרוויל19. מאוחר יותר, ספקטרוסקופיית אינפרא אדום, טכניקה רגישה מאוד לאפיון פנולים, שימש גם להערכת ליגנין עם כמות קטנה של דגימות ביומסה צמחית. דוגמה אחת לטכנולוגיה כזו הייתה ספקטרופוטומיית שינוי פורייה מפוזרת. שיטה זו, לעומת זאת, חסר תקן מתאים דומה לשיטת UV20. מאוחר יותר, התוכן ליגנין הוערך על ידי NIRS (ליד ספקטרוסקופיה אינפרא אדום) ו NMR (ספקטרוסקופיה תהודה מגנטית גרעינית). אמנם, ישנם חסרונות בשיטות אלה, הם לא משנים את המבנה הכימי של ליגנין, שמירה עלטוהר שלה 20.
שיטת קלאסון הכבידתית היא שיטה אנליטית ישירה ואמינה ביותר להערכת ליגנין של גבעולים עציים. הבסיס להערכת ליגנין כבידתי הוא הידרוליזה / solubilization של תרכובות שאינן ליגנין ואוסף של ליגנין מסיסים עבור gravimetry21. בשיטה זו, הפחמימות מוסרות על ידי הידרוליזה של ביומסה עם מרוכז H2SO4 כדי לחלץ שאריות ליגנין20,22. תכולת הינין המוערכת בשיטה זו ידועה בשם ליגנין בלתי מסיס חומצי או ליגנין קלסון. היישום של שיטת קלסון תלוי במיני הצמחים, בסוג הרקמה ובסוג דופן התא. נוכחות של כמויות משתנות של רכיבים שאינם ליגנין כגון טאנינים, פוליסכרידים וחלבונים, גורמת להבדלים פרופורציונליים בהערכת תכולת ליגנין מסיס/מסיס בחומצה. לפיכך, שיטת קלסון מומלץ רק להערכת ליגנין של ביומסה תוכן ליגנין גבוהה כגון גבעולים וודי17,23. שיטות מסיסות כגון אצטיל ברומיד (AcBr), ליגנין מסיס בחומצה, וחומצה תיוגליקולית (TGA) הן השיטות הנפוצות ביותר להערכת תכולת הליגנין ממקורות ביומסה צמחיים שונים. קים ואח ' הקימו שתי שיטות להפקת ליגנין על ידי solubilization. השיטה הראשונה מחלצת ליגנין כשאריות בלתי מסיסות על ידי תאית solubilizing ו hemicellulose, בעוד השיטה השנייה מפרידה ליגנין בשבר מסיס, משאיר תאית hemicellulose כמו שאריותמסיסים 24.
שיטות דומות המשמשות להערכת ליגנין המבוססות על המסיסות הן חומצה תיוגליקולית (TGA) ושיטות אצטיל ברומיד (AcBr)25. שתי שיטות TGA ואצטיל ברומיד להעריך את התוכן ליגנין על ידי מדידת הספיגה של ליגנין solubilized ב 280 ננומטר; עם זאת, שיטת AcBr משפילה xylans במהלך תהליך של ליגנין solubilization ומראה עלייה כוזבת בתוכן ליגנין26. שיטת thioglycolate (TGA) היא השיטה האמינה יותר, שכן היא תלויה מליטה ספציפית עם קבוצות thioether של קבוצות אלכוהול בנזיל של ליגנין עם TGA. ליגנין TGA מאוגד הוא זירז בתנאים חומציים באמצעות HCl, ואת התוכן ליגנין מוערך באמצעות ספיגה שלה ב 280 ננומטר27. לשיטת TGA יתרונות נוספים של פחות שינויים מבניים, צורה מסיסת של הערכת ליגנין, פחות הפרעות מרכיבים שאינם ליגנין, והערכת ליגנין מדויקת עקב מליטה ספציפית עם TGA.
שיטת TGA זו משתנה בהתבסס על סוג של מדגם ביומסה צמח המשמש להערכת תוכן ליגנין. כאן, שינינו והתאמנו את שיטת TGA המהירה של קשיות אורז27 לרקמות כותנה כדי להעריך את תכולת הליגינין. בקצרה, דגימות הצמח אבקת מיובשים היו נתונים מאגר solubilization חלבון מיצוי מתנול כדי להסיר חלבונים ואת החלק מסיס אלכוהול. שאריות אלכוהול מסיסות טופלו עם TGA ו lignin מזורז בתנאים חומציים. עקומת תקן ליגנין נוצרה באמצעות ליגנין במבוק מסחרי וקו רגרסיה (y = mx +c) הושג. הערך "x" משתמש בערכי ספיגה ממוצעים של ליגנין ב- 280 ננומטר, בעוד שערכי "m" ו- "c" הוזנו מקו הרגרסיה כדי לחשב ריכוז ליגנין לא ידוע בדגימות ביומסה של צמח כותנה. שיטה זו מחולקת לחמישה שלבים: 1) הכנת דגימות צמחים; 2) לשטוף את הדגימות עם מים ומתנול; 3) טיפול של גלולה עם TGA וחומצה כדי לזרז ליגנין; 4) משקעים של ליגנין; ו -5) הכנת העקומה הסטנדרטית והערכת תוכן ליגנין של המדגם. שני השלבים הראשונים מתמקדים בעיקר בהכנת חומר צמחי ואחריו מים, PSB (חיץ סולוביליזציה של חלבונים) ועקירות מתנול כדי להשיג את החומר מסיס באלכוהול. לאחר מכן, הוא טופל עם TGA (חומצה תיוגליקולית) ו HCl כדי ליצור קומפלקס עם ליגנין בשלב השלישי. בסוף, HCl שימש לזרז ליגנין, אשר מומס נתרן הידרוקסיד כדי למדוד את ספיגתו ב 280 ננומטר28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת דגימות צמחים
- אספו מהחממה צמחי כותנה בני חודשיים (איור 1A).
- הופכים את עציצי הצמח בעדינות כדי להפריד בין אדמה לשורשים עם שורשים לרוחב שלמים על ידי שחרור האדמה סביב הצמח(איור 1B).
- שטפו את הצמחים שנאספו ביסודיות במגשים מלאים במים כדי להסיר את כל הלכלוך (לדגימות שורש)(איור 1C).
- השתמשו במגבות נייר לייבוש רקמות השורש, הגבעול והעלים המופרדות, ותייגו אותן (איור 1D). אוויר יבש במשך יומיים בטמפרטורת החדר כדי למנוע זיהום פטרייתי (איור 1E).
- מעבירים רקמות מדגמיות למיכלים/רדיד אלומיניום מסומנים ומדגרים באינקובטור מבוקר טמפרטורה בטמפרטורה של 49 מעלות צלזיוס למשך 7 עד 10 ימים(איור 1F).
הערה: טמפרטורות גבוהות יותר עשויות לשנות את מבנה הignin. לחלופין, מייבש הקפאה יכול לשמש לייבוש דגימות במשך יום עד יומיים מבלי לגרום לשינויים כימיים בביומסה של הצמח. - השתמשו בלהב כדי לחתוך את הרקמה המיובשת של החממה לחתיכות בגודל 5 מ"מ או לחילופין להשתמש במטחנת ביומסה כדי לטחון את רקמות הצמח(איור 1G, איור 1H).
הערה: יש לנקות את מטחנת הביומסה/להב לאחר שכל דגימה נחתכה/הוטחנה. - מעבירים את הרקמה החתוכה /ביומסה חומר צמחי מקורקע לתוך בקבוקונים שחיקה לטחון לתוך אבקה עדינה בגודל 1 מ"מ באמצעות טחנת מקפיא או מטחנת קריוגני עם נוזלי N2.
- טוחנים דגימות במשך שלושה מחזורים בקצב של 10 CPS (כל מחזור של 2 דקות) לאבקה אחידה(איור 1I, 1J, 1K).
הערה: ניתן להשהות את הניסוי בשלב זה וניתן לאחסן דגימות בטמפרטורת החדר במיכלים אטומים לאחסון לטווח ארוך.
2. דגימות כביסה עם מים, PSB ומתנול
- למדוד ולתעד את המשקל של כל צינורות ריקים 2 מ"ל microfuge המשמש להערכת תוכן ליגנין במחברת המעבדה.
- מעבירים 20 מ"ג של אבקת דגימת הקרקע לצינור שקל מראש. לשקול את הצינור עם אבקת רקמה ורקמות ולהקליט משקולות אלה במחברת המעבדה.
- דגירה כל 2 צינורות microfuge מ"ל (עם מכסים פתוחים) עם 20 מ"ג של אבקת רקמה בגוש חום או תנור ב 60 מעלות צלזיוס במשך 1 שעה.
- לאחר הדגירה, מגניב דגימות במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
- מוסיפים 1.8 מ"ל מים לכל צינור מיקרופוגה ומערבבים על ידי מערבולת. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 25,200 x g (15,000 סל"ד) במשך 10 דקות ב RT ולהשליך את supernatant(איור 2).
- הוסף 1.8 מ"ל של מאגר סולובליזציה של חלבון (PSB) (טבלה 1) לכל גלולה שמורה ומערבבים על ידי מערבולת. צנטריפוגה ב 25,200 x g (15,000 סל"ד) במשך 10 דקות ב RT ולהשליך את supernatant.
- חזור שוב על שלב 2.6 עבור כל דגימה.
- מוסיפים 1.8 מ"ל מים לכל גלולה, מערבבים על ידי מערבולת, וצנטריפוגה ב 25,200 x גרם (15,000 סל"ד) במשך 10 דקות. לאחר צנטריפוגה, לשמור את גלולה ולזרוק את supernatant.
- לכדור השמור, הוסיפו 1.8 מ"ל של מתנול ודגרה בגוש חום של 60 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 25,200 x g (15,000 סל"ד) במשך 10 דקות ב RT. לאחר הצנטריפוגה, השליכו את הסופרנט ושמרו על גלולה (איור 2).
- חזור שוב על שלב 2.9 עבור כל דגימה.
- אוויר לייבש את גלולה ב RT או להמשיך מיד על ידי ייבוש ואקום. ואקום יבש באמצעות מייבש ואקום ב 30 מעלות צלזיוס במשך 2 עד 3 שעות או עד גלולה יבשה לחלוטין.
הערה: ניתן להשהות את הניסוי בשלב זה על ידי ייבוש אוויר במשך הלילה או להמשיך בייבוש ואקום. - לאחר הייבוש, לשקול צינורות מדגם עם גלולה מיובשת להקליט את המשקל ליד משקל הצינור הריק בהתאמה במחברת המעבדה. להעריך את משקל גלולה על ידי חיסור שני הערכים. משקולות אלה ישמשו להערכת ליגנין בסוף תהליך מיצוי ליגנין.
- בשלב זה של מיצוי ליגנין, כוללים את ליגנין במבוק מסחרי לייצור עקומת תקן ליגנין. למדוד ליגנין במבוק מסחרי לתוך צינורות נפרדים החל 0.5 מ"ג ל 5 מ"ג במרווחים 0.5 מ"ג (0.5 מ"ג, 1 מ"ג, 1.5 מ"ג, 2 מ"ג, 3 מ"ג, 3.5 מ"ג, 4 מ"ג, 5.0 מ"ג). מדוד כל ריכוז שלוש פעמים עבור שלושה משכפלים טכניים.
הערה: מעתה, הסטנדרטים שנמדדו בשלב לעיל עובדו באותו אופן כמו דגימות שהיו מיובשות.
3. טיפול גלולה עם TGA וחומצה כדי לזרז ליגנין
- דגימות מעובדות נושא מהשלב לעיל, יחד עם סטנדרטים נמדדים, לטיפול TGA (חומצה תיוגליקולית).
- הוסף 1 מ"ל של 3 N HCl(טבלה 1)ו 100 μL של TGA לכל גלולה.
- וורטקס ודגרת בבלוק חום שחומם מראש ב-80 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות במכסה המנוע(איור 2).
הערה: יש לפקח על שלב החימום ב-80°C. הצטברות בלחץ גבוה עלולה לפתוח את העפעפיים ועלולה להוביל לשפיכות כימיות. צינורות כובע בורג מומלץ אבל 2 צינורות מ"ל ניתן לכסות באופן רופף במהלך שלב זה כחלופה כדי למנוע שפיכות כאלה. - לאחר הדגירה, צינורות קרירים ב- RT במשך 10-15 דקות וצנטריפוגה ב 25,200 x g (15,000 סל"ד) במשך 10 דקות ב RT.
הערה: פסולת המופקת מחומצה וממסים אורגניים חייבת להיות מופרדת ומאוחסנת במיכלי זכוכית עם כובעים מאווררים. השתמש במיכלי זכוכית נפרדים לאיסוף פסולת חומצת TGA ופסולת חומצה. - לאחר צנטריפוגה, להשליך את supernatant ולשמור על גלולה. הוסף 1 מ"ל של מים, לערבב על ידי מערבולת, וצנטריפוגה ב 25,200 x g (15,000 סל"ד) במשך 10 דקות ב RT.
- לאחר צנטריפוגה, השליכו את הסופרנט וערבבו את גלולת ה-N NaOH ב-1 N למשך 24 שעות במהירות של 37 מעלות צלזיוס/ מערבל תרמי במהירות נמוכה(איור 2).
הערה: זמן דגירה זה יכול להיות מופחת ל 1 שעה7. - לאחר הדגירה, צנטריפוגה 2 צינורות microfuge מ"ל ב 25,200 x g (15,000 סל"ד) במשך 10 דקות ב RT. שמור על supernatant לשלב הבא.
הערה: ההליך כרוך בשימוש בחומצות חזקות וכימיקלים אחרים המאכלים בטבעם. לפיכך, לובש PPE הנכון מומלץ לאורך כל התהליך של הערכת ליגנין. TGA יש ריח לא נעים חזק והוא מאכל בטבע. לפיכך, מומלץ להשתמש רק במכסה המנוע אדים.
4. משקעים של ליגנין
- מעבירים את ה-supernatant לצינור מיקרו-פוגה טרי של 2 מ"ל ומוסיפים 200 μL של דגירה מרוכזת של HCl. ב-4°C למשך 4 שעות או לילה(איור 2).
הערה: ניתן להשהות את תהליך החילוץ בשלב זה על ידי הארכת שלב הקירור ללילה. - צנטריפוגה ב 25,200 x g (15,000 סל"ד) במשך 10 דקות ב RT ולמסות את גלולה ב 1 מ"ל של 1 N NaOH.
- דגירה בשייקר ב RT במשך 10 דקות כדי להשעות את גלולה לחלוטין NaOH.
- לבסוף, למדוד את ספיגת הדגימות ב 280 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר ולהשוות עם עקומת ליגנין סטנדרטית.
- למדוד את הריכוז הלא ידוע של ליגנין באמצעות ערכי קו רגרסיה עקומת כיול, וספיגות של דגימות שחולצו ב 280 ננומטר.
5. הכנת עקומה סטנדרטית והערכת ליגנין במדגם
- תהליך ליגנין סטנדרטים באותו אופן כמו דגימות ניסיוניות מטיפול TGA.
- מדוד תקני במבוק ליגנין מסחריים במרווחים של 0.5 מ"ג החל מ-0.5 מ"ג, 1 מ"ג, 1.5 מ"ג, 2 מ"ג, 2.5 מ"ג, 3.0 מ"ג, 3.5 מ"ג, 4.0 מ"ג, 4.5 מ"ג ו-5 מ"ג. לאחר מכן, תהליך על ידי TGA, HCl, להתמוסס 1 N NaOH ואחריו מדידת ספיגה ב 280 ננומטר (איור 3A).
- השתמש בערכים של קריאות ריכוז וספיגה של ליגנין כדי ליצור חלקה מפוזרת של עקומת ליגנין סטנדרטית(איור 3B).
- השתמש בקו הרגרסיה, y = mx+c שנוצר בחלקה המפוזרת, להערכת תוכן ליגנין לא ידוע של דגימות מוכנות באמצעות ערכי "x" מספיגות ממוצעות של דגימות שחולצו ב- 280 ננומטר וערכי "m" ו- "c" מקו רגרסיה של עקומה סטנדרטית של ליגנין.
- מחלקים את תכולת הליגנין בערך y וכתוצאה מכך לפי המשקל הכולל של דגימת ביומסה צמחית מיובשת ואקום/אוויר לאחר מיצוי מתנול במ"ג (כ -15 מ"ג) כדי להשיג ריכוז ליגנין לכל מ"ג. לאחר מכן, הכפל ערך זה ב- 100 כדי לחשב אחוז ליגנין לכל מ"ג.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שני קווים ניסיוניים שונים כותנה הושוו להבדלים בתכולת הינין שלהם ברקמות שונות. תכולת הליגינין שחולצה מכל מדגם נמדדה ב-280 ננומטר ורשמה את ערכי הספיגה המתאימים לה. ערכי הספיגה הממוצעים של כל משכפל ביולוגי הושוו לקו הרגרסיה של עקומת תקן ליגנין(טבלה 2, איור 3C). קו הרגרסיה, y = mx + c, משמש לחישוב תוכן הליגנין הלא ידוע של קווי הניסוי שחולצו, מדגם 1 ודגימה 2. התוצאות של ערכי OD ממוצעים הוחלפו ב- "x" בעוד שערכי "m" ו- "c" היו מחוברים מקו הרגרסיה של עקומת תקן ליגנין כדי להשיג ריכוז ליגנין "y" ב- mg (טבלה 3, איור 3B). בשלב הבא, כדי לחשב לכל 1 מ"ג של תוכן ליגנין, לחלק את הערך "y" על ידי המשקל של המדגם (15 מ"ג) לאחר מיצוי מתנול. בשלב הבא, כדי לחשב לגרם (= 1,000 מ"ג) הערך y/15 הוכפל ב- 1,000. כדי לקבל % של ליגנין אנו מחלקים ערך y/15 ב- 1,000 ומכפילים ב- 100. הממוצע של ליגנין % עבור שלושה משכפלים ביולוגיים (של כל שורה, מדגם 1 ומדגם 2) הושווה בין שני קווי הניסוי מדגם 1 (11.7%) ולדגום 2 (10.3%). ערכי הליגינין היו עקביים בין משכפלים ביולוגיים המצביעים על כך ששיטת TGA היא שיטה אמינה וספציפית מאוד למדידת תכולת הליגינין. מחקרי השוואה נעשו גם בין סוגי רקמות שונים (שורש, גזע ועלים) של שני קווים ניסיוניים של כותנה, ושני הקווים הראו תכולת ליגנין נמוכה יחסית בעלים (3.4%) לעומת גבעולים (9.4% עד 9.9%) ושורשים (9.4% עד 9.2%) (לוח4, איור 4).
איור 1: הכנת דגימת ביומסה צמחית. (A)אסף חומר צמח כותנה מהבית הירוק. (B)סירים הפוכים בעדינות לשורשים נפרדים. (ג)נשטף ביסודיות במים כדי להסיר את כל הלכלוך. (ד)רקמות שורש, גזע ועלים מופרדות. (ה)רקמה מיובשת באוויר במשך יומיים לאחר הפרדת הרקמה. (F)רקמה מיובשת אוויר מועברת לאינקובטור ב 49 °C (69 °F) במשך 10 ימים. מטחנתביומסה שימשה לטחינת דגימות ביומסה צמחיות. (H)דגימות ביומסה צמחית טחונים של שורש, גזע ועלה. (I)דגימות קרקע נטענות לתוך בקבוקוני השחיקה, ממוקמים בתא טחנת המקפיא, מקורקעים בטחנת המקפיא בקצב של 10 CPS במשך 3 מחזורים. (J)בקבוקונים טחונים המציגים אבקת רקמת קרקע דק לאחר שחיקה בטחנת המקפיא. (K)אבקת רקמת טחון דק של שורש, גזע ועלה לאחר שימוש טחנת מקפיא לטחינה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: צעדים קריטיים המעורבים בחילוץ ליגנין בתיווך TGA. תרשים זרימה של צעדים קריטיים המעורבים בהפקת ליגנין מביומסה צמחית להערכת תוכן ליגנין בשיטת TGA: 1. הכנת דגימות צמחים על ידי ייבוש וטחינה מספקים לאבקה דקה באמצעות טחנת מקפיא; 2. 20 מ"ג של אבקת רקמות היה נתון PSB, מתנול ושטיפת מים, חומר מסיס אלכוהול מיובש ומופק; 3. באמצעות TGA וחומצה, ליגנין היה זירז; 4. הכנת עקומת תקן ליגנין באמצעות ליגנין במבוק מסחרי; 5. הערכת תוכן ליגנין. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הכנת עקומה סטנדרטית והערכת ליגנין במדגם. (A) טבלה המציגה ריכוזים שונים של ליגנין במבוק מסחרי המשמש ליצירת עקומת תקן ליגנין מקריאות ספיגה ב- 280 ננומטר. (B) התוויה מפוזרת שנוצרה באמצעות תוכנית Excel באמצעות הערכים מטבלה A. (C) תרשימי עמודות המייצגים את תוכן lignin של רקמת השורש המשוערת של מדגם 1 ודוגמה 2. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| תמיסה | מניות דרושות | הכנה | ||
| מאגר סולובליזציה של חלבונים (PSB) | 1 M טריס HCl pH 8.8 ו 0.5 M אדטה pH 8.0 | כדי להכין 100 מ"ל של פתרון עבודה של PSB עם ריכוז סופי של 50 mM Tris, 0.5 mM EDTA ו 10 % SDS, להוסיף 5 מ"ל של 1 M Tris, 1 מ"ל של EDTA ו 10 גרם של SDS ל 80 מ"ל מים סטריליים, לערבב, להמיס ולהכין את הנפח הסופי ל 100 מ"ל עם מים סטריליים. אוטוקלאב ב 121 מעלות צלזיוס, 15 psi לחץ, במשך 30 דקות. | ||
| 1 M טריס HCl | כדי להכין 100 מ"ל של 1 M Tris, להוסיף 12.1 גרם של Tris HCl (משקל מולקולרי = 121.14 גרם) ב 80 מ"ל של מים. מערבבים את Tris HCl על ידי ערבוב על מערבל מגנטי, להתאים את ה- pH עם NaOH ל 8.8 ולהרכיב את עוצמת הקול ל 100 מ"ל עם מים סטריליים אוטוקלאב ב 121 °C (60 °F), 15 psi לחץ, במשך 30 דקות. | |||
| 0.5 M EDTA (אתילנדיאמין טטראאצטיקה) | כדי להכין 100 מ"ל של 0.5 M EDTA להוסיף 18.6 גרם של EDTA ב 70 מ"ל מים. כוונן את ה- pH ל- 8.0 (EDTA מתמוסס לחלוטין ב- pH 8.0) באמצעות כדורי נתרן הידרוקסידי והגדל את עוצמת הקול ל- 100 מ"ל. אוטוקלאב הפתרון ב 121 °C (60 °F), 15 psi לחץ, במשך 30 דקות. | |||
| 3 N חומצה הידרוכלורית (HCL) | כדי להכין 100 מ"ל של 3 N HCl, להוסיף 26 מ"ל של HCL מרוכז ל 74 מ"ל של מים סטריליים. | |||
| 4 % נתרן הידרוקסידי (NaOH) | הכן 1 N פתרון נתרן הידרוקסידי, להוסיף 4 גרם של נתרן הידרוקסיד ב 90 מ"ל של מים סטריליים, להתמוסס, לפצות את הנפח ל 100 מ"ל אוטוקלאב ב 121 °C (60 °F), 15 psi לחץ, במשך 30 דקות. | |||
טבלה 1: הכנת פתרונות המשמשים בפרוטוקול. טבלה המציגה הכנת פתרונות שונים המשמשים בפרוטוקול.
טבלה 2: עקומת תקן ליגנין מוכנה מ-0.5 מ"ג ל-3.5 מ"ג ליגנין במבוק תעשייתי. גרף מפוזר עם קו רגרסיה המציג ערכי m ו- c. לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 3: תבנית Lignin המשמשת לחישוב תוכן ליגנין לא ידוע באמצעות קריאות ספיגה של דגימות ב- 280 ננומטר (כ- x) וערכי רגרסיה בעקומה סטנדרטית 'm' ו- 'c' מהעקומה הסטנדרטית. לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 4: תוכן ליגנין מרקמות שונות (שורש, גזע ועלים) של צמח כותנה בשלב פריחה פוסט. לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ליגנין ממלא תפקיד משמעותי בצמיחה ופיתוח של צמחים ולאחרונה נחקר בהרחבה עבור יישומי דלק ביולוגי, ביו-אלרגיה וביו-פרוצרציה. ליגנין עשיר בתרכובות ארומטיות המאוחסנות בכל קירות התא המשני של צמח כלי הדם. יש לו מספר יישומים תעשייתיים כגון מוצרי לוח עץ, פיזור ביו, flocculants, קצף פוליאוריתן בשרפים של לוחות מעגלים29,30,31. רוב הלינגינין שנוצר מתעשיות נייר ועיסת משתחרר כפסולת או נשרף לייצור חום. לכן, אם מעובד ביעילות, ליגנין יכול להיות מנוצל כחלופה הן דלק מאובנים מבוסס מוצרים32,33 וייצור ביואלקטריות34. לפיכך, הערכה מדויקת של תוכן ליגנין והרכב הם קריטיים עבור יישומים תעשייתיים כמו הרכב משתנה בהתבסס על מיני הצמח, כמו גם סוג איבר הצמח. המגבלה העיקרית להערכת ליגנין היא ההבדל הנובע מהשיטה שנבחרה להערכת תוכן ליגנין35. הבדלי ההערכה בין שיטות שונות נובעים בעיקר מהזיהום עם רכיבים אחרים שאינם ליגנין, וריאציה במסיסות, תוספת של קבוצות חדשות לליגנין, השפלה/זיהום קסילאן, שינויים מבניים מקומיים ואובדן שבר ליגנין כלשהו במהלך חיסול רכיבים אחרים. יתר על כן, רוב פרוטוקולי ליגנין מפותחים במקור מבוסס על כימיהעץ 27. לפיכך, יש צורך קריטי להקמת פרוטוקולי ליגנין עבור דגימות עשבובי כמו יותר יבול / מינים צמחיים מיועדים דלק ביולוגי ומוצרים ביולוגיים. שיטת TGA מעריכה תוכן ליגנין טהור המבוסס על מליטה ספציפית עם TGA. לכן, הערכת ליגנין על ידי TGA מניב תוכן ליגנין נמוך יותר בהשוואה לקלסון ושיטות ברומידאצטיל 35,36. הסיבה לכך היא מליטה ספציפית של ליגנין עם TGA, כמו גם אובדן של תוכן ליגנין כלשהו במהלך משקעים ליגנין (חלק בלתי מסיס).
תוכן הליגנין המוערך בשיטת TGA ניתן לשחזור ועקבי. התוצאות שהתקבלו במחקר זה היו עקביות בין השכפולים הביולוגיים והראו הבדל משמעותי בין שני קווים, מה שמרמז על האמינות של שיטת TGA להערכת ליגנין. לשחזור נתונים ולהערכת תוכן ליגנין מדויקת, חשוב לבצע את השלבים ולנקוט באמצעי זהירות הבאים. הכללה של פקדים חיוביים בריכוזים שונים, החל 0.5 מ"ג ל 5 מ"ג בשלושה שכפולים, ועיבוד אותם יחד עם דגימות משלב TGA ימנע שגיאות ניסיוניות ותוצאות הערכה מדויקת של תוכן ליגנין. יש ליצור את העקומה הסטנדרטית עבור כל קבוצה של דגימות וסטטיסטיקת קו רגרסיה R2 חייבת ליפול בטווח של 97% עד 99%. המשקל המדויק של הצינור הריק והרקמה המיובשת המופקת מתנול הוא קריטי להערכת תוכן ליגנין מדויקת. בנוסף, גורמים שונים כגון שלב מסוים של צמחים, תנאי גידול, גנוטיפים, סוג הרקמה וגיל הצמח ישפיעו על תוכן ליגנין30,37,38. לפיכך, חשוב לגדל את כל קווי הניסוי באותה סביבה ולקצור את אותו סוג של רקמות בו זמנית. תוצאות המחקר הנוכחי הראו מגמה צפויה של תוכן ליגנין נמוך יותר בעלים, תוכן ליגנין גבוה יותר גבעולים ושורשים, והדגים את הישימות של שיטה זו לרקמות צמחיות שונות. יתר על כן, וריאציה פחות בין משכפלים ביולוגיים הציע כי TGA יכול להעריך תוכן ליגנין לשחזור בכל רקמות הצמח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם ניגוד עניינים.
Acknowledgments
אנו מודים למחלקה למדעי הקרקע והכותנה בע"מ על תמיכתם החלקית במחקר זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioSpectrophotometer kinetic | Eppendorf kinetic | 6136000010 | For measuring absorbance at 280 nm |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | For centrifuging samples |
| Commercial bamboo lignin | Aldrich | 1002171289 | Used in the preparation of the standard curve |
| Distilled water | Fischer Scientific | 16690382 | Used in the protocol |
| Falcon tubes | VWR | 734-0448 | Containers for solutions |
| Freezer mill | Spex Sample Prep | 68-701-15 | For fine grinding of plant tissue samples |
| Heat block/ Thermal mixer | Eppendorf | 13527550 | For temperature controlled steps during lignin extraction |
| Hotplate stirrer | Walter | WP1007-HS | Used for preparation of solutions |
| Hydrochloric acid (HCL) | Sigma | 221677 | Used in the protocol |
| Incubator | Fisherbrand | 150152633 | For thorough drying of plant tissue samples |
| Measuring scale | Mettler toledo | 30243386 | For measuring plant tissue weight, standards and microfuge tubes |
| Methanol (100 %) | Fischer Scientific | 67-56-1 | Used in the protocol |
| Microfuge tubes (2 mL) | Microcentrifuge | Z628034-500EA | Containers for extraction of lignin |
| Plant biomass gerinder | Hanchen | Amazon | Used for crushing dried samples |
| pH meter | Fisher Scientific | AE150 | Measuring pH for solutions prepared for lignin extraction |
| Temperature controlled incubator/oven | Fisher Scientific | 15-015-2633 | Used in the protocol |
| Thioglycolic acid (TGA) | Sigma Aldrich | 68-11-1 | Used in the protocol |
| Vacuum dryer | Eppendorf | 22820001 | Used for drying samples |
| Vortex mixer | Eppendorf | 3340001 | For proper mixing of samples |
References
- Freudenberg, K., Neish, A. C. Constitutionand Biosynthesis of Lignin. , Springer-Verlag Inc. New York, NY. 129 (1968).
- Chio, C., Sain, M., Qin, W. Lignin utilization: A review of lignin depolymerization from various aspects. Renewable and Sustainable Energy Reviews. 107, 232-249 (2019).
- Sun, Z., Fridrich, B., de Santi, A., Elangovan, S., Barta, K. Bright Side of Lignin Depolymerization: Toward New Platform Chemicals. Chemical Reviews. 118, 614-678 (2018).
- Xu, F. Cereal Straw as a Resource for Sustainable Biomaterials and Biofuels. Sun, R. C. , Elsevier. 9-47 (2010).
- Liu, Q., Luo, L., Zheng, L. Lignins: Biosynthesis and Biological Functions in Plants. International Journal of Molecular Sciences. 19, 335 (2018).
- Ithal, N., et al. Developmental transcript profiling of cyst nematode feeding cells in soybean roots. Molecular Plant-Microbe Interactions. 20, 510-525 (2007).
- Moura, J. C. M. S., et al. Abiotic and Biotic Stresses and Changes in the Lignin Content and Composition in Plants. Journal of Integrative Plant Biology. 52, 360-376 (2010).
- Vanholme, R., Morreel, K., Ralph, J., Boerjan, W.
- Lupoi, J. S., Singh, S., Parthasarathi, R., Simmons, B. A., Henry, R. J. Recent innovations in analytical methods for the qualitative and quantitative assessment of lignin. Renewable and Sustainable Energy Reviews. 49, 871-906 (2015).
- Mendu, V., et al. Identification and thermochemical analysis of high-lignin feedstocks for biofuel and biochemical production. Biotechnology for Biofuels. 4, 43 (2011).
- Shrotri, A., Kobayashi, H., Fukuoka, A. Advances in Catalysis. Song, C. 60, Academic Press. 59-123 (2017).
- Brunow, G. Biorefineries-Industrial Processes and Products: Status Quo and Future Directions. 2, 151-163 (2008).
- Constant, S., et al. New insights into the structure and composition of technical lignins: a comparative characterisation study. Green Chemistry. , (2016).
- Shimada, N., Tsuyama, T., Kamei, I. Rapid Determination of Thioglycolic Acid Lignin for Various Biomass Samples. Mokuzai Gakkaishi. 65, 25-32 (2019).
- Li, X., Weng, J. K., Chapple, C.
- Ponnusamy, V. K., et al. A review on lignin structure, pretreatments, fermentation reactions and biorefinery potential. Bioresource Technology. 271, 462-472 (2019).
- Hatfield, R., Fukushima, R. S.
- Bolker, H., Somerville, N. Ultraviolet spectroscopicstudies of lignin in solid state. I. Isolated lignin preparations. Tappi Journal. 72, 826-829 (1962).
- Fergus, B. J., Goring, D. A. I. The distribution of lignin in birchwood as determined by ultraviolet microscopy. Holzforschung. 24, 118-124 (1970).
- Schultz, T. P., Templeton, M. C., McGinnis, G. D. Rapid determination of lignocellulose by diffuse reflectance Fourier transform infrared spectrometry. Analytical Chemistry. 57, 2867-2869 (1985).
- Dence, C. W. The Determination of Lignin. Methods in Lignin Chemistry. Lin, S. Y., Dence, C. W. , (1992).
- Adler, E.
- Brinkmann, K., Blaschke, L., Polle, A. Comparison of different methods for lignin determination as a basis for calibration of near-infrared reflectance spectroscopy and implications of lignoproteins. Journal of Chemical Ecology. 28, 2483-2501 (2002).
- Pandey, M. P., Kim, C. S. Lignin Depolymerization and Conversion: A Review of Thermochemical Methods. Chemical Engineering & Technology. 34, 29-41 (2011).
- Moreira-Vilar, F. C., et al. The acetyl bromide method is faster, simpler and presents best recovery of lignin in different herbaceous tissues than Klason and thioglycolic acid methods. PLoS One. 9, 110000 (2014).
- Hatfield, R. D., Grabber, J., Ralph, J., Brei, K. Using the Acetyl Bromide Assay To Determine Lignin Concentrations in Herbaceous Plants: Some Cautionary Notes. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 47, 628-632 (1999).
- Suzuki, S., et al. High-throughput determination of thioglycolic acid lignin from rice. Plant Biotechnology. 26, 337-340 (2009).
- Nakatsubo, F., Tanahashi, M., Higuchi, T. Acidolysis of Bamboo Lignin II : Isolation and Identification of Acidolysis Products. Wood research. 53, 9-18 (1972).
- Aro, T., Fatehi, P. Production and Application of Lignosulfonates and Sulfonated Lignin. ChemSusChem. 10, 1861-1877 (2017).
- Frei, M. Lignin: Characterization of a Multifaceted Crop Component. The Scientific World Journal. 2013, 436517 (2013).
- Lora, J. H., Glasser, W. G. Recent Industrial Applications of Lignin: A Sustainable Alternative to Nonrenewable Materials. Journal of Polymers and the Environment. 10, 39-48 (2002).
- Wang, R., Zhou, B., Wang, Z. Study on the Preparation and Application of Lignin-Derived Polycarboxylic Acids. Journal of Chemistry. 2019, 5493745 (2019).
- Welker, C. M., et al. Engineering Plant Biomass Lignin Content and Composition for Biofuels and Bioproducts. Energies. 8, 7654-7676 (2015).
- Mendu, V., et al. Global bioenergy potential from high-lignin agricultural residue. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 4014-4019 (2012).
- Brinkmann, K., Blaschke, L., Polle, A. Comparison of Different Methods for Lignin Determination as a Basis for Calibration of Near-Infrared Reflectance Spectroscopy and Implications of Lignoproteins. Journal of Chemical Ecology. 28, 2483-2501 (2002).
- Moreira-Vilar, F. C., et al. The Acetyl Bromide Method Is Faster, Simpler and Presents Best Recovery of Lignin in Different Herbaceous Tissues than Klason and Thioglycolic Acid Methods. PLoS One. 9, 110000 (2014).
- Iwaasa, A. D., Beauchemin, K. A., Acharya, S. N., Buchanan-Smith, J. G. Effect of stage of maturity and growth cycle on shearing force and cell wall chemical constituents of alfalfa stems. Canadian Journal of Animal Science. 76, 321-328 (1996).
- Arai-Sanoh, Y., et al. Genotypic Variations in Non-Structural Carbohydrate and Cell-Wall Components of the Stem in Rice, Sorghum, and Sugar Vane. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. , 1105072478 (2011).
