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Biochemistry

थिओग्लिकोलिक एसिड (टीजीए) का उपयोग करके पौधे बायोमास लिग्निन सामग्री का अनुमान

Published: July 24, 2021 doi: 10.3791/62055
Automatic Translation
1, 2, 2
1Department of Plant and Soil Science, Texas Tech University, 2Fiber and Biopolymer Research Institute (FBRI), Department of Plant and Soil Science, Texas Tech University

Summary

यहां, हम जड़ी-बूटियों के पौधे बायोमास में लिग्निन सामग्री के अनुमान के लिए एक संशोधित टीजीए विधि प्रस्तुत करते हैं। यह विधि लिग्निन के साथ विशिष्ट थिओएथर बांड बनाकर लिग्निन सामग्री का अनुमान लगाता है और क्लासन विधि पर एक लाभ प्रस्तुत करता है, क्योंकि इसके लिए लिग्निन सामग्री अनुमान के लिए अपेक्षाकृत छोटे नमूने की आवश्यकता होती है।

Abstract

लिग्निन एक प्राकृतिक बहुलक है जो सेल्यूलोज के बाद पृथ्वी पर दूसरा सबसे प्रचुर मात्रा में बहुलक है। लिग्निन मुख्य रूप से पौधे माध्यमिक सेल की दीवारों में जमा किया जाता है और यह एक सुगंधित हेट्रोपॉलिमर है जो मुख्य रूप से महत्वपूर्ण औद्योगिक महत्व के साथ तीन मोनोलिग्नोल से बना है। लिग्निन पौधों के विकास और विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, बायोटिक और अजैविक तनावों से बचाता है, और पशु चारे, लकड़ी और औद्योगिक लिग्निन उत्पादों की गुणवत्ता में। लिग्निन बायोसिंथेसिस और बायोमास के औद्योगिक अनुप्रयोगों की मौलिक समझ दोनों के लिए लिग्निन सामग्री का सटीक अनुमान आवश्यक है। थिओग्लिकोलिक एसिड (टीजीए) विधि पौधे बायोमास में कुल लिग्निन सामग्री का आकलन करने की एक अत्यधिक विश्वसनीय विधि है। इस विधि लिग्निन के बेंजाइल अल्कोहल समूहों के साथ थिओएथर्स बनाकर लिग्निन सामग्री का अनुमान है, जो क्षारीय स्थितियों में घुलनशील और अम्लीय स्थितियों में अघुलनशील हैं। वाणिज्यिक बांस लिग्निन से उत्पन्न मानक वक्र का उपयोग करके कुल लिग्निन सामग्री का अनुमान लगाया गया है।

Introduction

लिग्निन संयंत्र कोशिका दीवारों के महत्वपूर्ण लोड-असर घटकों में से एक है और पृथ्वी1पर दूसरा सबसे प्रचुर मात्रा में बहुलक है। रासायनिक रूप से, लिग्निन एक क्रॉसलिंक्ड हेट्रोपॉलिमर है जो उच्च आणविक वजन जटिल फेनोलिक यौगिकों से बना होता है जो सुगंधित बहुलक का प्राकृतिक नवीकरणीय स्रोत और बायोमैटेरियल्स2,3का संश्लेषण करता है। यह प्राकृतिक बहुलक पौधों के विकास, विकास, अस्तित्व, यांत्रिक समर्थन, सेल दीवार कठोरता, जल परिवहन, खनिज परिवहन, आवास प्रतिरोध, ऊतक और अंग विकास, ऊर्जा के जमाव, और जैव और अजैविक तनाव से सुरक्षा4,5,6,7में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। लिग्निन मुख्य रूप से तीन अलग-अलग मोनोलिग्नोल से बना है: कोनिफेरिल, सिनापिल और पी-कौमेरिल अल्कोहल जो फिनाइल प्रोपेनोइड पाथवे8,9से प्राप्त होते हैं। लिग्निन की मात्रा और मोनोमर की संरचना पौधों की प्रजातियों, ऊतक/अंग प्रकार, और पौधे के विकास के विभिन्न चरणों के आधार पर भिन्न होती है10। लिग्निन को मोटे तौर पर स्रोत और मोनोलिग्नोल संरचना के आधार पर सॉफ़्टवुड, दृढ़ लकड़ी और घास लिग्निन में वर्गीकृत किया गया है। सॉफ़्टवुड मुख्य रूप से 4% पी-कौमेरिल और 1% सिनापिल अल्कोहल के साथ 95% शंकुधारी अल्कोहल से बना है। हार्डवुड में शंकुधारी और सिनेपिल अल्कोहल समान अनुपात में होते हैं, जबकि घास लिग्निन कोनिफेरिल, सिनेपिल और पी-कौमेरिल अल्कोहल11,12के विभिन्न अनुपातों से बना है। मोनोमर की संरचना महत्वपूर्ण है क्योंकि यह सेल दीवार की लिग्निन शक्ति, अपघटन और क्षरण के साथ-साथ आणविक संरचना, शाखाओं में बंटी और अन्य पॉलीसैकराइड्स13, 14के साथ क्रॉसलिंकिंग का निर्धारण करती है।

लिग्निन अनुसंधान अपनी कम लागत और उच्च बहुतायत15, 16के कारण फोर्जिंग, कपड़ा उद्योगों, कागज उद्योगों और बायोथेनॉल, जैव ईंधन और जैव-उत्पादों के लिए महत्व प्राप्त कर रहा है। विभिन्न रासायनिक तरीकों (जैसे, एसीटाइल ब्रोमाइड, एसिड डिटर्जेंट, क्लासन, और परमंगनेट ऑक्सीकरण) के साथ वाद्य तरीकों (उदाहरण के लिए, अवरक्त (एनआईआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी, परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी, और पराबैंगनी (यूवी) स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री) का उपयोग लिग्निन क्वांटिफिकेशनकेलिए किया गयाथा। लिग्निन के विश्लेषण विधियों को आम तौर पर विद्युत चुम्बकीय विकिरण, गुरुत्वाकर्षण और घुलनशीलता के आधार पर वर्गीकृत किया जाता है। विद्युत चुम्बकीय विकिरण द्वारा लिग्निन अनुमान के पीछे का सिद्धांत लिग्निन की रासायनिक संपत्ति पर आधारित था जिसके द्वारा यह विशिष्ट तरंगदैर्ध्य पर प्रकाश को अवशोषित करता है। इन परिणामों का अनुमान सिद्धांत के आधार पर लगाया गया था कि लिग्निन में कार्बोहाइड्रेट की तुलना में एक मजबूत यूवी अवशोषण है। 1 9 62 में, बोल्कर और सोमरविले ने लकड़ी18में लिग्निन सामग्री का अनुमान लगाने के लिए पोटेशियम क्लोराइड छर्रों का उपयोग किया। हालांकि, इस विधि में गैर-लिग्निन फेनोलिक यौगिकों की उपस्थिति और उचित विलुप्त होने के गुणांक के अभाव के कारण जड़ी-बूटियों के नमूनों से लिग्निन सामग्री के अनुमान में कमियां हैं। 1 9 70 में, फर्गस और गोरिंग ने पाया कि गुआसिल और सिरिंगिल यौगिक अवशोषण मैक्सिमा 280 एनएम और 270 एनएम पर थे, जिसने बोल्कर और सोमरविले विधि19के विलुप्त होने के गुणांक मुद्दे को सही किया। बाद में, फिनोलिक्स की विशेषता के लिए एक अत्यधिक संवेदनशील तकनीक अवरक्त स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग पौधे बायोमास नमूनों की थोड़ी मात्रा के साथ लिग्निन अनुमान के लिए भी किया गया था। इस तरह की तकनीक का एक उदाहरण फैलाना-परावर्तन फोरियर ट्रांसफॉर्म स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री था। हालांकि, इस विधि में यूवी विधि20के समान उचित मानक का अभाव है। बाद में, लिग्निन सामग्री का अनुमान एनआईआरएस (नियर इन्फ्रारेड स्पेक्ट्रोस्कोपी) और एनएमआर (न्यूक्लियर मैग्नेटिक रेओनेंस स्पेक्ट्रोस्कोपी) द्वारा लगाया गया था। हालांकि, इन तरीकों में नुकसान हैं, वे लिग्निन की रासायनिक संरचना को नहीं बदलते हैं, इसकी शुद्धता को बनाए रखतेहैं 20।

ग्रेविमेट्रिक क्लासन विधि वुडी उपजी के लिग्निन अनुमान के लिए एक प्रत्यक्ष और सबसे विश्वसनीय विश्लेषणात्मक विधि है। ग्रेविमेट्रिक लिग्निन अनुमान का आधार गैर-लिग्निन यौगिकों का हाइड्रोलिसिस/घुलनशीलता और ग्रेविमेट्री21के लिए अघुलनशील लिग्निन का संग्रह है । इस विधि में, कार्बोहाइड्रेट को बायोमास के हाइड्रोलिसिस द्वारा हटा दिया जाता है जिसमें केंद्रित एच 2 एसओ4 लिग्निन अवशेष20, 22निकालने के लिए कियाजाताहै। इस विधि से अनुमानित लिग्निन सामग्री को एसिड अघुलनशील लिग्निन या क्लासन लिग्निन के रूप में जाना जाता है। क्लासन विधि का अनुप्रयोग पौधों की प्रजातियों, ऊतक प्रकार और सेल दीवार प्रकार पर निर्भर करता है। टैनिन, पॉलीसैकराइड और प्रोटीन जैसे गैर-लिग्निन घटकों की चर मात्रा की उपस्थिति के परिणामस्वरूप एसिड अघुलनशील/घुलनशील लिग्निन सामग्री के अनुमान में आनुपातिक अंतर होता है । इसलिए, क्लासन विधि केवल उच्च-लिग्निन सामग्री बायोमास जैसे वुडी उपजी17,23के लिग्निन अनुमान के लिए अनुशंसित है। एसिटिल ब्रोमाइड (एसीबीआर), एसिड-अघुलनशील लिग्निन और थिओग्लिकोलिक एसिड (टीजीए) जैसे सोलुबिलिटी विधियां आमतौर पर विभिन्न पौधे बायोमास स्रोतों से लिग्निन सामग्री के अनुमान के लिए उपयोग की जाने वाली विधियां हैं। किम एट अल. घुलनशीलता द्वारा लिग्निन निष्कर्षण के लिए दो तरीकों की स्थापना की । पहली विधि सेल्यूलोज और हेमीसेल्यूलोज को घुलनशील बनाकर एक अघुलनशील अवशेषों के रूप में लिग्निन निकालती है, जबकि दूसरी विधि घुलनशील अंश में लिग्निन को अलग करती है, जिससे सेल्यूलोज और हेमीसेल्यूलोज को अघुलनशील अवशेष24के रूप में छोड़ दिया जाता है।

इसी तरह की विधिएं लिग्निन अनुमान में घुलनशीलता के आधार पर नियोजित थेओग्लिकोलिक एसिड (टीजीए) और एसिटिल ब्रोमाइड (एसीबीआर) विधियां25हैं। टीजीए और एसिटिल ब्रोमाइड दोनों तरीकों से 280 एनएम पर घुलनशील लिग्निन के अवशोषण को मापकर लिग्निन सामग्री का अनुमान है; हालांकि, AcBr विधि लिग्निन घुलनीकरण की प्रक्रिया के दौरान जाइलांस नीचा दिखाती है और लिग्निन सामग्री26में एक झूठी वृद्धि से पता चलता है . थिओग्लिकोलेट (टीजीए) विधि अधिक विश्वसनीय विधि है, क्योंकि यह टीजीए के साथ लिग्निन के बेंजिल अल्कोहल समूहों के थिओएथर समूहों के साथ विशिष्ट संबंध पर निर्भर करता है। टीजीए बाउंड लिग्निन एचसीएल का उपयोग करके अम्लीय परिस्थितियों में उपजी है, और लिग्निन सामग्री 280 एनएम27पर इसके अवशोषण का उपयोग करके अनुमानित है। टीजीए विधि में कम संरचनात्मक संशोधनों के अतिरिक्त लाभ, लिग्निन अनुमान का घुलनशील रूप, गैर-लिग्निन घटकों से कम हस्तक्षेप, और टीजीए के साथ विशिष्ट संबंध के कारण लिग्निन का सटीक अनुमान है।

इस टीजीए विधि को लिग्निन सामग्री अनुमान के लिए उपयोग किए जाने वाले पौधे बायोमास नमूने के आधार पर संशोधित किया गया है। यहां, हमने लिग्निन सामग्री का अनुमान लगाने के लिए चावल के तिनके27 की तेजी से टीजीए विधि को कपास ऊतकों में संशोधित और अनुकूलित किया। संक्षेप में, सूखे पाउडर पौधे के नमूनों को प्रोटीन घुलनशीलता बफर और मेथनॉल निष्कर्षण के अधीन किया गया था ताकि प्रोटीन और अल्कोहल घुलनशील अंश को हटाया जा सके । शराब अघुलनशील अवशेषों को टीजीए के साथ इलाज किया गया और अम्लीय परिस्थितियों में लिग्निन उपजी । वाणिज्यिक बांस लिग्निन का उपयोग करके एक लिग्निन मानक वक्र उत्पन्न किया गया था और एक प्रतिगमन रेखा (वाई = एमएक्स + सी) प्राप्त की गई थी। "एक्स" मूल्य 280 एनएम पर लिग्निन के औसत अवशोषण मूल्यों का उपयोग करता है, जबकि कपास संयंत्र बायोमास नमूनों में अज्ञात लिग्निन एकाग्रता की गणना करने के लिए प्रतिगमन रेखा से "एम" और "सी" मूल्यों में प्रवेश किया गया था। इस विधि को पांच चरणों में विभाजित किया गया है: 1) पौधों के नमूनों की तैयारी; 2) पानी और मेथनॉल के साथ नमूनों को धोना; 3) टीजीए और एसिड के साथ गोली का उपचार लिग्निन को कम करने के लिए; 4) लिग्निन की वर्षा; और 5) नमूने के मानक वक्र तैयारी और लिग्निन सामग्री अनुमान। पहले दो चरणों में मुख्य रूप से संयंत्र सामग्री की तैयारी पर ध्यान केंद्रित कर रहे है पानी, पीएसबी (प्रोटीन घुलनशीलता बफर) और मेथनॉल अर्क के बाद शराब अघुलनशील सामग्री प्राप्त करने के लिए । इसके बाद तीसरे चरण में लिग्निन के साथ कॉम्प्लेक्स बनाने के लिए टीजीए (थिओग्लाइकोलिक एसिड) और एचसीएल के साथ इसका इलाज किया गया । अंत में, एचसीएल का उपयोग लिग्निन को कम करने के लिए किया गया था, जिसे सोडियम हाइड्रोक्साइड में 280 एनएम28पर इसके अवशोषण को मापने के लिए भंग कर दिया गया था।

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Protocol

1. पौधों के नमूनों की तैयारी

  1. ग्रीनहाउस(चित्रा 1A)से दो महीने पुराने कपास के पौधों को इकट्ठा करें ।
  2. पौधे के बर्तनों को धीरे-धीरे पौधे के चारों ओर मिट्टी को ढीला करके बरकरार पार्श्व जड़ों के साथ मिट्टी और जड़ों को अलग करने के लिए फ्लिपकरें (चित्रा 1B)।
  3. एकत्र पौधों को पानी से भरी ट्रे में अच्छी तरह से धोएं ताकि सभी गंदगी (रूट नमूनों के लिए)(चित्रा 1C)को हटाया जा सके ।
  4. अलग जड़, स्टेम, और पत्ती के ऊतकों को सुखाने के लिए कागज तौलिए का उपयोग करें, और उन्हें लेबल(चित्रा 1D)। किसी भी कवक संदूषण(चित्रा 1E)को रोकने के लिए कमरे के तापमान पर 2 दिनों के लिए हवा सूखी ।
  5. 7 से 10 दिनों(चित्रा 1F)के लिए 49 डिग्री सेल्सियस पर तापमान नियंत्रित इनक्यूबेटर में लेबल कंटेनरों/एल्यूमीनियम पन्नी और इनक्यूबेटर में नमूना ऊतकों को स्थानांतरित करें।
    नोट: उच्च तापमान लिग्निन संरचना को बदल सकता है। वैकल्पिक रूप से, एक फ्रीज ड्रायर संयंत्र बायोमास के लिए किसी भी रासायनिक परिवर्तन के कारण के बिना 1 से 2 दिनों के लिए नमूनों को सुखाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  6. इनक्यूबेटर सूखे ऊतकों को 5 मिमी आकार के टुकड़ों में काटने के लिए ब्लेड का उपयोग करें या वैकल्पिक रूप से पौधे के ऊतकों(चित्रा 1G, चित्रा 1H)को पीसने के लिए बायोमास ग्राइंडर को नियोजित करें।
    नोट: प्रत्येक नमूने को काटे जाने/जमीन पर जाने के बाद बायोमास ग्राइंडर/ब्लेड को साफ किया जाना चाहिए ।
  7. कटे हुए ऊतक / बायोमास ग्राउंडेड पौधे की सामग्री को पीसने वाली शीशियों में स्थानांतरित करें और फ्रीजर मिल या क्रायोजेनिक ग्राइंडर का उपयोग करके 1 मिमी आकार के बारीक पाउडर में पीसलें।
  8. 10 सीपीएस (2 मिनट के प्रत्येक चक्र अवधि) की दर से तीन चक्रों के लिए नमूनों को एक समान पाउडर(चित्रा 1I,1J, 1K)में पीसें।
    नोट: प्रयोग इस बिंदु पर रोका जा सकता है और नमूनों को लंबी अवधि के भंडारण के लिए एयरटाइट कंटेनरों में कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है ।

2. पानी, पीएसबी और मेथनॉल के साथ नमूने धोना

  1. मापने और प्रयोगशाला नोटबुक में लिग्निन सामग्री अनुमान के लिए इस्तेमाल सभी खाली 2 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूबों के वजन रिकॉर्ड ।
  2. जमीन के नमूना पाउडर की 20 मिलीग्राम पूर्व तौला ट्यूब को स्थानांतरित करें। टिश्यू और टिश्यू पाउडर से ट्यूब का वजन करें और लैब नोटबुक में इन वजनों को रिकॉर्ड करें।
  3. सभी 2 मिलीएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब (खुले ढक्कन के साथ) एक हीट ब्लॉक या ओवन में 20 मिलीग्राम ऊतक पाउडर के साथ 1 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर।
  4. इनक्यूबेशन के बाद, कमरे के तापमान (आरटी) पर 10 मिनट के लिए शांत नमूने।
  5. प्रत्येक माइक्रोफ्यूज ट्यूब में 1.8 एमएल पानी जोड़ें और भंवर से मिलाएं। फिर, आरटी में 10 मिनट के लिए 25,200 x ग्राम (15,000 आरपीएम) पर अपकेंद्रित्र और सुपरनैंट(चित्रा 2)को त्यागें।
  6. प्रत्येक बनाए गए गोली में प्रोटीन सोल्यूबिलाइजेशन बफर (पीएसबी)(टेबल 1) का 1.8एमएल जोड़ें और भंवर से मिलाएं। आरटी में 10 मिनट के लिए 25,200 x ग्राम (15,000 आरपीएम) पर सेंट्रलाइज और सुपरनेट को त्यागें।
  7. प्रत्येक नमूने के लिए फिर से चरण 2.6 दोहराएं।
  8. प्रत्येक गोली में 1.8 एमएल पानी जोड़ें, 10 मिनट के लिए 25,200 x ग्राम (15,000 आरपीएम) पर भंवर से मिलाएं, और अपकेंद्रित्र करें। अपकेंद्रित्र के बाद, गोली को बचाएं और सुपरनेट को त्याग दें।
  9. बनाए गए गोली के लिए, 20 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस हीट ब्लॉक में मेथनॉल और इनक्यूबेट के 1.8 एमएल जोड़ें। फिर, आरटी में 10 मिनट के लिए 25,200 x ग्राम (15,000 आरपीएम) पर सेंट्रलाइज। अपकेंद्रित्र के बाद, सुपरनेट को त्यागें और गोली(चित्रा 2)को बरकरार रखें।
  10. प्रत्येक नमूने के लिए फिर से चरण 2.9 दोहराएं।
  11. हवा आरटी पर गोली सूखी या वैक्यूम सुखाने से तुरंत आगे बढ़ें। वैक्यूम सूखी सूखी 30 डिग्री सेल्सियस पर वैक्यूम सुखाने की मशीन का उपयोग 2 से 3 घंटे के लिए या जब तक गोली पूरी तरह से सूखी है।
    नोट: प्रयोग रात में हवा सुखाने या वैक्यूम सुखाने से जारी रखने के द्वारा इस बिंदु पर रोका जा सकता है ।
  12. सूखने के बाद, सूखे गोली के साथ नमूना ट्यूबों का वजन करें और प्रयोगशाला नोटबुक में संबंधित खाली ट्यूब वजन के बगल में वजन रिकॉर्ड करें। दो मूल्यों को घटाकर गोली के वजन का अनुमान लगाएं। इन वजनों का उपयोग लिग्निन निष्कर्षण प्रक्रिया के अंत में लिग्निन अनुमान के लिए किया जाएगा।
  13. लिग्निन निष्कर्षण के इस बिंदु पर, लिग्निन मानक वक्र के उत्पादन के लिए वाणिज्यिक बांस लिग्निन शामिल करें। 0.5 मिलीग्राम से लेकर 5 मिलीग्राम तक की अलग-अलग ट्यूबों में वाणिज्यिक बांस लिग्निन को मापने के लिए 0.5 मिलीग्राम वेतन वृद्धि (0.5 मिलीग्राम, 1 मिलीग्राम, 1.5 मिलीग्राम, 2 मिलीग्राम, 3 मिलीग्राम, 3.5 मिलीग्राम, 4 मिलीग्राम, 4.5 मिलीग्राम, और 5.0 मिलीग्राम)। तीन तकनीकी प्रतिकृति के लिए प्रत्येक एकाग्रता को तीन बार मापें।
    नोट: यहां से, उपरोक्त चरण में मापा मानकों को उसी तरह संसाधित किया गया था जैसे नमूने सूख गए थे।

3. लिग्निन को कम करने के लिए टीजीए और एसिड के साथ गोली का उपचार

  1. उपरोक्त चरण से विषय संसाधित नमूने, मापा मानकों के साथ, टीजीए (थिओग्लाइसोलिक एसिड) उपचार के लिए।
  2. प्रत्येक गोली में 3 एन एचसीएल(टेबल 1)और टीजीए के 100 माइक्रोन का 1 एमएल जोड़ें।
  3. भंवर और एक 80 डिग्री सेल्सियस पहले से गरम गर्मी ब्लॉक में एक धुएं हुड(चित्रा 2)में 3 घंटे के लिए incubate।
    नोट: 80 डिग्री सेल्सियस पर हीटिंग चरण की निगरानी की जानी चाहिए। उच्च दबाव बिल्डअप ढक्कन खोल सकता है और रासायनिक फैल सकता है। स्क्रू कैप ट्यूब की सिफारिश की जाती है लेकिन इस तरह के फैल को रोकने के लिए एक विकल्प के रूप में इस कदम के दौरान 2 एमएल ट्यूब शिथिल हो सकते हैं।
  4. इनक्यूबेशन के बाद, आरटी में 10-15 मिनट के लिए शांत ट्यूब और आरटी में 10 मिनट के लिए 25,200 x ग्राम (15,000 आरपीएम) पर सेंट्रलाइज।
    नोट: एसिड और कार्बनिक सॉल्वैंट्स से उत्पन्न अपशिष्ट को अलग किया जाना चाहिए और हवादार टोपियां के साथ ग्लास कंटेनरों में संग्रहीत किया जाना चाहिए। टीजीए-एसिड कचरे और एसिड कचरे के संग्रह के लिए अलग-अलग ग्लास कंटेनरों का उपयोग करें।
  5. अपकेंद्रित्र के बाद, सुपरनेट को त्यागें और गोली को बरकरार रखें। आरटी में 10 मिनट के लिए 1 मिलियन पानी जोड़ें, भंवर से मिलाएं, और 25,200 x ग्राम (15,000 आरपीएम) पर अपकेंद्रित्र करें।
  6. अपकेंद्रित्र के बाद, सुपरनेट को त्यागें और 1 एन नाओह में गोली को 24 घंटे के लिए कम गति से 37 डिग्री सेल्सियस शेखर/थर्मल मिक्सर(चित्रा 2) पर मिलाएं।
    नोट: इस इनक्यूबेशन समय को 1 घंटे7तक कम किया जा सकता है ।
  7. इनक्यूबेशन के बाद, आरटी में 10 मिनट के लिए 25,200 x g (15,000 आरपीएम) पर 2 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूबों को अपकेंद्रित्र करें। निम्नलिखित चरण के लिए सुपरनैंट बनाए रखें।
    नोट: प्रक्रिया में मजबूत एसिड और अन्य रसायनों का उपयोग शामिल है जो प्रकृति में संक्षारक हैं। इसलिए, लिग्निन अनुमान की प्रक्रिया के दौरान उचित पीपीई पहनने की सिफारिश की जाती है। टीजीए में एक मजबूत अप्रिय गंध है और प्रकृति में संक्षारक है। इसलिए, केवल धूम हुड में उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।

4. लिग्निन की वर्षा

  1. सुपरनेट को एक ताजा 2 मिलीएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और केंद्रित एचसीएल के 200 माइक्रोल जोड़ें। 4 घंटे या रात भर(चित्रा 2)के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: रेफ्रिजरेशन चरण को रात भर तक बढ़ाकर निष्कर्षण प्रक्रिया को इस बिंदु पर रोका जा सकता है।
  2. आरटी में 10 मिनट के लिए 25,200 x ग्राम (15,000 आरपीएम) पर सेंट्रलाइज और 1 एन NaOH के 1 एमएल में गोली को भंग करें।
  3. नाओएच में गोली को पूरी तरह से निलंबित करने के लिए 10 मिनट के लिए आरटी में शेखर में इनक्यूबेट ।
  4. अंत में, स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके 280 एनएम पर नमूनों के अवशोषण को मापें और मानक लिग्निन वक्र के साथ तुलना करें।
  5. अंशांकन वक्र प्रतिगमन रेखा मूल्यों का उपयोग करके लिग्निन की अज्ञात एकाग्रता को मापें, और 280 एनएम पर निकाले गए नमूनों के अवशोषण।

5. नमूने में मानक वक्र तैयारी और लिग्निन अनुमान

  1. टीजीए उपचार से प्रयोगात्मक नमूनों के समान ही लिग्निन मानकों की प्रक्रिया करें।
  2. 0.5 मिलीग्राम वेतन वृद्धि में वाणिज्यिक बांस लिग्निन मानकों को मापने से शुरू 0.5 मिलीग्राम, 1 मिलीग्राम, 1.5 मिलीग्राम, 2 मिलीग्राम, 2.5 मिलीग्राम, 3.0 मिलीग्राम, 3.5 मिलीग्राम, 4.0 मिलीग्राम, 4.5 मिलीग्राम और 5 मिलीग्राम से शुरू होता है। फिर, टीजीए, एचसीएल द्वारा प्रक्रिया, 1 एन नाओएच में भंग हो जाती है और इसके बाद 280 एनएम(चित्रा 3 ए)पर अवशोषण को मापने के बाद।
  3. मानक लिग्निन वक्र(चित्रा 3B)के बिखरे हुए भूखंड उत्पन्न करने के लिए लिग्निन एकाग्रता और अवशोषण रीडिंग के मूल्यों का उपयोग करें।
  4. 280 एनएम और लिग्निन मानक वक्र प्रतिगमन रेखा से निकाले गए नमूनों के औसत अवशोषण से "एक्स" मूल्यों का उपयोग करके तैयार नमूनों की अज्ञात लिग्निन सामग्री का उपयोग करके, बिखरे हुए भूखंड में उत्पन्न प्रतिगमन रेखा, वाई = एमएक्स + सी का उपयोग करें।
  5. एमजी (लगभग 15 मिलीग्राम) में मेथनॉल निष्कर्षण के बाद वैक्यूम/एयर सूखे पौधे बायोमास नमूने के कुल वजन के परिणामस्वरूप वाई मूल्य में लिग्निन सामग्री को विभाजित करें ताकि प्रति मिलीग्राम लिग्निन एकाग्रता प्राप्त की जा सके । फिर, प्रति मिलीग्राम लिग्निन प्रतिशत की गणना करने के लिए इस मूल्य को 100 से गुणा करें।

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Representative Results

विभिन्न ऊतकों में उनकी लिग्निन सामग्री में अंतर के लिए दो अलग-अलग कपास प्रायोगिक लाइनों की तुलना की गई थी। प्रत्येक नमूने की निकाली गई लिग्निन सामग्री को 280 एनएम मापा गया था और इसके संबंधित अवशोषण मूल्यों को दर्ज किया गया था। प्रत्येक जैविक दोहराने के औसत अवशोषण मूल्यों की तुलना लिग्निन मानक वक्र(तालिका 2, चित्र 3सी)की प्रतिगमन रेखा के खिलाफ की गई थी। प्रतिगमन लाइन, y = mx + सी, निकाले गए प्रयोगात्मक लाइनों, नमूना 1 और नमूना 2 की अज्ञात लिग्निन सामग्री की गणना करने के लिए प्रयोग किया जाता है। औसत ओडी मूल्यों के परिणामों को "एक्स" में प्रतिस्थापित किया गया था जबकि "एम" और "सी" मूल्यों को एमजी(तालिका 3, चित्रा 3बी)में लिग्निन एकाग्रता "वाई" प्राप्त करने के लिए लिग्निन मानक वक्र की प्रतिगमन रेखा से प्लग किया गया था। अगले चरण में, प्रति 1 मिलीग्राम लिग्निन सामग्री की गणना करने के लिए, मेथनॉल निष्कर्षण के बाद नमूने (15 मिलीग्राम) के वजन से "वाई" मूल्य को विभाजित करें। निम्नलिखित चरण में, प्रति ग्राम (= 1,000 मिलीग्राम) की गणना करने के लिए वाई/15 मूल्य को 1,000 से गुणा किया गया था। लिग्निन का% प्राप्त करने के लिए हम y/15 मूल्य को १,००० से विभाजित करते हैं और १०० से गुणा करते हैं । तीन जैविक प्रतिकृति (प्रत्येक पंक्ति, नमूना 1 और नमूना 2) के लिए लिग्निन% का औसत दो प्रयोगात्मक लाइनों के नमूने 1 (11.7%) और नमूना 2 (10.3%)। लिग्निन मूल्य जैविक प्रतिकृति के बीच संगत थे, जिसमें यह सुझाव दिया गया था कि टीजीए विधि एक विश्वसनीय विधि है और लिग्निन सामग्री को मापने के लिए अत्यधिक विशिष्ट है। कपास की दो प्रयोगात्मक रेखाओं के विभिन्न ऊतक प्रकार (रूट, स्टेम और पत्तियों) के बीच तुलना अध्ययन भी किए गए थे, और दोनों लाइनों ने पत्तियों में अपेक्षाकृत कम लिग्निन सामग्री (3.4%) उपजी की तुलना में (9.4% से 9.9%) और जड़ें (9.4% से 9.2%) (तालिका 4, चित्रा 4)।

Figure 1
चित्रा 1:पौधे बायोमास नमूने की तैयारी।  (ए)ग्रीन हाउस से एकत्रित कपास संयंत्र सामग्री। (ख)धीरे से जड़ों को अलग करने के लिए बर्तन फ़्लिप । (ग)सभी गंदगी को दूर करने के लिए पानी में अच्छी तरह से धोया जाता है। (घ)अलग जड़, स्टेम और पत्ती के ऊतकों । (ई)टिश्यू को अलग करने के बाद 2 दिन तक हवा में सूखे टिश्यू। (च)एयर सूखे टिश्यू को 10 दिनों के लिए 49 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में स्थानांतरित किया जाता है। (जी)बायोमास ग्राइंडर का उपयोग पौधों के बायोमास नमूनों को पीसने के लिए किया जाता था। (ज)रूट, स्टेम और पत्ती के ग्राउंड प्लांट बायोमास के नमूने। (I)जमीन के नमूनों को पीसने वाली शीशियों में लोड किया जाता है, फ्रीजर मिल चैंबर में रखा जाता है, फ्रीजर मिल में 3 चक्रों के लिए 10 सीपीएस की दर से जमीन पर आधारित है । (जम्मू)फ्रीजर मिल में पीसने के बाद बारीक जमीन टिश्यू पाउडर दिखाते हुए पीसने वाली शीशियां । }पीसनेके लिए फ्रीजर मिल का इस्तेमाल करने के बाद जड़, तना और पत्ती का बारीक जमीन टिश्यू पाउडर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:टीजीए मध्यस्थता लिग्निन निष्कर्षण में शामिल महत्वपूर्ण कदम। टीजीए विधि का उपयोग करके पौधे बायोमास से लिग्निन सामग्री अनुमान तक लिग्निन निष्कर्षण में शामिल महत्वपूर्ण चरणों का प्रवाह चार्ट: 1. पर्याप्त सुखाने और फ्रीजर मिल का उपयोग करके ठीक पाउडर में पीसकर पौधों के नमूनों की तैयारी; 2. 20 मिलीग्राम ऊतक पाउडर पीएसबी, मेथनॉल और पानी की धुलाई, सूखे और निकाले गए अल्कोहल अघुलनशील सामग्री के अधीन था; 3. टीजीए और एसिड का उपयोग करके, लिग्निन को उपजी थी; 4. वाणिज्यिक बांस लिग्निन का उपयोग करके लिग्निन मानक वक्र की तैयारी; 5. लिग्निन सामग्री का आकलन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:नमूने में मानक वक्र तैयारी और लिग्निन अनुमान। (ए)280 एनएम पर अवशोषित रीडिंग से लिग्निन मानक वक्र उत्पन्न करने के लिए उपयोग किए जाने वाले वाणिज्यिक बांस लिग्निन की विभिन्न सांद्रता दिखाने वाली तालिका। (ख)एक्सेल प्रोग्राम के साथ उत्पन्न बिखरे हुए प्लॉट में नमूना 1 और नमूना 2 की अनुमानित रूट टिश्यू लिग्निन सामग्री का प्रतिनिधित्व करने वाले टेबल ए(सी)बार ग्राफ से मूल्यों का उपयोग किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

विलयन स्टॉक्स की जरूरत तैयारी
प्रोटीन घुलनशीलता बफर (पीएसबी) 1 एम ट्रिस एचसीएल पीएच 8.8 और 0.5 एम ईडीटीए पीएच 8.0 पीएसबी के 100 एमएल कार्य समाधान को तैयार करने के लिए 50 एमएम ट्रिस, 0.5 एमएम ईडीए और 10% एसडीएस की अंतिम एकाग्रता के साथ, 1 एम ट्रिस के 5 एमएल, ईडीटीए के 1 एमएल और एसडी के 10 ग्राम को 80 एमएल बाँझ पानी, मिश्रण, भंग और अंतिम मात्रा को 100 मीटर तक बनाने के साथ पानी के साथ 100 मीटर तक। 30 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस, 15 साई दबाव पर ऑटोक्लेव।
1 एम ट्रिस एचसीएल 1 एम ट्रिस के 100 एमएल तैयार करने के लिए, 80 एमएल पानी में 12.1 ग्राम ट्रिस एचसीएल (आणविक वजन = 121.14 ग्राम) जोड़ें। एक चुंबकीय उभारकर वीएन एचसीएल को मिलाएं, नाओएच के साथ पीएच को 8.8 तक समायोजित करें और 30 मिनट के लिए बाँझ पानी और ऑटोक्लेव पर 121 डिग्री सेल्सियस, 15 साई दबाव के साथ 100 एमएल तक की मात्रा बनाएं।
0.5 एम ईडीटीए (एथिलेंडियामाइन टेट्राएसेमेटिक) 0.5 एम ईडीटीए के 100 एमएल तैयार करने के लिए 70 एमएल पानी में 18.6 ग्राम ईडीटीए जोड़ें। पीएच को 8.0 (ईडीटीए पूरी तरह से पीएच 8.0 पर भंग करता है) सोडियम हाइड्रोक्साइड छर्रों का उपयोग करके समायोजित करें और मात्रा को 100 एमएल तक बना दें। 30 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस, 15 साई दबाव पर समाधान को ऑटोक्लेव करें।
3 एन हाइड्रोक्लोरिक एसिड (एचसीएल) 3 एन एचसीएल का 100 एमएल तैयार करने के लिए, 26 एमएल केंद्रित एचसीएल को बाँझ पानी के 74 एमएल में जोड़ें।
4% सोडियम हाइड्रोक्साइड (NaOH) तैयार करें 1 एन सोडियम हाइड्रोक्साइड का घोल, 90 एमएल बाँझ पानी में 4 ग्राम सोडियम हाइड्रोक्साइड डालें, घुल जाएं, वॉल्यूम को 100 मिलीएल तक बनाएं और ऑटोक्लेव 121 डिग्री सेल्सियस पर, 15 साई प्रेशर, 30 मिनट के लिए।

तालिका 1: प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले समाधानों की तैयारी। प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले विभिन्न समाधानों की तैयारी को दिखाने वाली तालिका।

तालिका 2: लिग्निन मानक वक्र 0.5 मिलीग्राम से 3.5 मिलीग्राम औद्योगिक बांस लिग्निन से तैयार किया गया। प्रतिगमन लाइन के साथ बिखरे हुए ग्राफ एम और सी मूल्यों को दिखा रहा है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

तालिका 3: लिग्निन टेम्पलेट का उपयोग मानक वक्र से 280 एनएम (एक्स के रूप में) और मानक वक्र प्रतिगमन रेखा 'एम' और 'सी' मूल्यों पर नमूनों के अवशोषण रीडिंग का उपयोग करके अज्ञात लिग्निन सामग्री की गणना के लिए किया जाता है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

तालिका 4: पोस्ट फ्लावरिंग चरण में कपास के पौधे के विभिन्न ऊतकों (जड़, स्टेम और पत्तियों) से लिग्निन सामग्री। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

लिग्निन पौधे के विकास और विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और हाल ही में जैव ईंधन, जैव ऊर्जा और जैव उत्पादन अनुप्रयोगों के लिए बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है। लिग्निन सुगंधित यौगिकों में समृद्ध है जो सभी संवहनी पौधे माध्यमिक कोशिका दीवारों में संग्रहीत होते हैं। इसमें लकड़ी के पैनल उत्पाद, जैव फैलाव, फ्लेकुलेंट्स, पॉलीयूरेथेन फोम और सर्किटबोर्ड29,30,31के रेजिन जैसे कई औद्योगिक अनुप्रयोग हैं। कागज और लुगदी उद्योगों से उत्पन्न अधिकांश लिग्निन को अपशिष्ट के रूप में जारी किया जाता है या गर्मी उत्पादन के लिए जला दिया जाता है। इस प्रकार, यदि कुशलता से संसाधित किया जाता है, तो लिग्निन का उपयोग जीवाश्म ईंधन आधारित उत्पादों32, 33 और जैव विद्युत उत्पादन34दोनों के विकल्प के रूप में किया जा सकता है। इसलिए, औद्योगिक अनुप्रयोगों के लिए लिग्निन सामग्री और संरचना का सटीक अनुमान महत्वपूर्ण है क्योंकि संरचना पौधों की प्रजातियों के साथ-साथ पौधे के अंग प्रकार के आधार पर भिन्न होती है। लिग्निन अनुमान की प्रमुख सीमा लिग्निन सामग्री35के अनुमान के लिए चयनित विधि से उत्पन्न होने वाला अंतर है । विभिन्न तरीकों के बीच अनुमान मतभेद मुख्य रूप से अन्य गैर-लिग्निन घटकों के साथ संदूषण, घुलनशीलता में भिन्नता, लिग्निन के लिए नए समूहों के अलावा, जाइलन क्षरण/संदूषण, देशी संरचनात्मक परिवर्तन और अन्य घटकों के उन्मूलन के दौरान कुछ लिग्निन अंश की हानि के कारण होते हैं । इसके अलावा, लिग्निन प्रोटोकॉल के बहुमत मूल रूप से लकड़ी रसायन विज्ञान27के आधार पर विकसित कर रहे हैं । इसलिए, जड़ी-बूटियों के नमूनों के लिए लिग्निन प्रोटोकॉल स्थापित करने की महत्वपूर्ण आवश्यकता है क्योंकि जैव ईंधन और जैव उत्पादों के लिए अधिक फसल/पौधों की प्रजातियों को लक्षित किया जाता है । टीजीए विधि टीजीए के साथ विशिष्ट संबंध के आधार पर शुद्ध लिग्निन सामग्री का अनुमान लगाता है। इसलिए, टीजीए द्वारा लिग्निन अनुमान क्लासन और एसिटिल ब्रोमाइड विधियों की तुलना में कम लिग्निन सामग्री35,36देता है। यह टीजीए के साथ लिग्निन के विशिष्ट संबंध के साथ-साथ लिग्निन वर्षा (अघुलनशील भाग) के दौरान कुछ लिग्निन सामग्री के नुकसान के कारण है।

टीजीए विधि का उपयोग करके अनुमानित लिग्निन सामग्री प्रजनन योग्य और सुसंगत है। इस अध्ययन में प्राप्त परिणाम जैविक प्रतिकृति के बीच संगत थे और लिग्निन अनुमान के लिए टीजीए विधि की विश्वसनीयता का सुझाव देते हुए दो पंक्तियों के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर दिखाया गया। डेटा प्रजनन और लिग्निन सामग्री के सटीक अनुमान के लिए, कदमों का पालन करना और निम्नलिखित सावधानियों को लेना महत्वपूर्ण है। विभिन्न सांद्रता में सकारात्मक नियंत्रण को शामिल करना, तीन प्रतिकृति में 0.5 मिलीग्राम से 5 मिलीग्राम तक, और टीजीए चरण के नमूनों के साथ उन्हें संसाधित करने से प्रयोगात्मक त्रुटियों से बचा जा सकेगा और लिग्निन सामग्री के सटीक अनुमान में परिणाम होंगे। मानक वक्र नमूनों के प्रत्येक सेट के लिए उत्पन्न किया जाना चाहिए और प्रतिगमन लाइन आंकड़ा आर2 97% से 99% की सीमा में गिरना चाहिए। खाली ट्यूब और सूखे मेथनॉल निकाले गए ऊतक का सटीक वजन सटीक लिग्निन सामग्री अनुमान के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अतिरिक्त, पौधों के विशिष्ट चरण, बढ़ती स्थितियों, जीनोटाइप, ऊतक के प्रकार और पौधे की आयु जैसे विभिन्न कारक लिग्निन सामग्री30,37,38को प्रभावित करेंगे। इसलिए, एक ही वातावरण में सभी प्रयोगात्मक रेखाओं को विकसित करना और एक ही समय में एक ही प्रकार के ऊतकों को काटना महत्वपूर्ण है। वर्तमान अध्ययन के परिणामों ने पत्तियों में कम लिग्निन सामग्री की अपेक्षित प्रवृत्ति, उपजी और जड़ों में उच्च लिग्निन सामग्री, और विभिन्न पौधों के ऊतकों के लिए इस विधि की प्रयोज्यता का प्रदर्शन किया। इसके अलावा, जैविक प्रतिकृति के बीच कम भिन्नता का सुझाव दिया है कि टीजीए सभी संयंत्र ऊतकों में प्रजनन योग्य लिग्निन सामग्री का अनुमान लगा सकते हैं ।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

हम इस अध्ययन के आंशिक समर्थन के लिए संयंत्र और मृदा विज्ञान और कपास इंक विभाग को धन्यवाद देते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BioSpectrophotometer kinetic Eppendorf kinetic 6136000010 For measuring absorbance at 280 nm
Centrifuge Eppendorf 5424 For centrifuging  samples
Commercial bamboo lignin Aldrich 1002171289 Used in the preparation of the standard curve
Distilled water Fischer Scientific 16690382 Used in the protocol
Falcon tubes VWR 734-0448 Containers for solutions
Freezer mill Spex Sample Prep 68-701-15 For fine grinding of plant tissue samples
Heat block/ Thermal mixer Eppendorf 13527550 For temperature controlled steps during lignin extraction
Hotplate stirrer Walter WP1007-HS Used for preparation of solutions
Hydrochloric acid (HCL) Sigma 221677 Used in the protocol
Incubator Fisherbrand 150152633 For thorough drying of plant tissue samples
Measuring scale Mettler toledo 30243386 For measuring plant tissue weight, standards and microfuge tubes
Methanol (100 %) Fischer Scientific 67-56-1 Used in the protocol
Microfuge tubes (2 mL) Microcentrifuge Z628034-500EA Containers for extraction of lignin
Plant biomass gerinder Hanchen Amazon Used for crushing dried samples
pH meter Fisher Scientific AE150 Measuring pH for solutions prepared for lignin extraction
Temperature controlled incubator/oven Fisher Scientific 15-015-2633 Used in the protocol
Thioglycolic acid (TGA) Sigma Aldrich 68-11-1 Used in the protocol
Vacuum dryer Eppendorf 22820001 Used for drying samples
Vortex mixer Eppendorf 3340001 For proper mixing of samples

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References

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बायोकेमिस्ट्री अंक 173 लिग्निन मोनोलिग्नॉल थिओग्लाइकोलिक एसिड
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Dampanaboina, L., Yuan, N., Mendu, V. Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA). J. Vis. Exp. (173), e62055, doi:10.3791/62055 (2021).

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