Summary
Burada, otsu bitki biyokütlesinde lignin içeriğinin tahmin edilmesi için değiştirilmiş bir TGA yöntemi sunuyoruz. Bu yöntem lignin ile belirli tiyoether bağları oluşturarak lignin içeriğini tahmin eder ve lignin içeriği tahmini için nispeten küçük bir örnek gerektirdiğinden Klason yöntemine göre bir avantaj sunar.
Abstract
Lignin, selülozdan sonra dünya üzerindeki en bol ikinci polimer olan doğal bir polimerdir. Lignin esas olarak bitki ikincil hücre duvarlarında birikir ve öncelikle önemli endüstriyel öneme sahip üç monolignoldan oluşan aromatik bir heteropolimerdir. Lignin bitki büyümesinde ve gelişmesinde önemli bir rol oynar, biyotik ve abiyotik streslerden ve hayvan yemi, ahşap ve endüstriyel lignin ürünlerinin kalitesinde korur. Lignin içeriğinin doğru tahmini, hem lignin biyosentezinin temel anlayışı hem de biyokütlenin endüstriyel uygulamaları için gereklidir. Tiyoglikolik asit (TGA) yöntemi, bitki biyokütleslerindeki toplam lignin içeriğini tahmin etmek için son derece güvenilir bir yöntemdir. Bu yöntem, alkali koşullarda çözünür ve asidik koşullarda çözünmeyen lignin benzil alkol grupları ile tiyoetherler oluşturarak lignin içeriğini tahmin eder. Toplam lignin içeriği, ticari bambu ligninden oluşturulan standart bir eğri kullanılarak tahmin edilir.
Introduction
Lignin, bitki hücre duvarlarının hayati yük taşıyan bileşenlerinden biridir ve Dünya'daki en bol ikinci polimerdir1. Kimyasal olarak, lignin aromatik polimerlerin doğal yenilenebilir kaynağını oluşturan ve biyomalzemelerin sentezini oluşturan yüksek moleküler ağırlıklı karmaşık fenolik bileşiklerden oluşan çapraz bağlı bir heteropolimerdir2,3. Bu doğal polimer bitki büyümesi, gelişimi, hayatta kalma, mekanik destek, hücre duvarı sertliği, su taşıma, mineral taşıma, konaklama direnci, doku ve organ gelişimi, enerji birikimi ve biyotik ve abiyotik gerilmelerden korunmada önemli roller oynar4,5,6,7. Lignin öncelikle üç farklı monolignoldan oluşur: fenil propanoid yolundan elde edilen iğne yapraklı, sinapil ve p-coumaryl alkoller8,9. Lignin miktarı ve monomerlerin bileşimi bitki türlerine, doku / organ tipine ve bitki gelişiminin farklı aşamalarına göre değişir10. Lignin, kaynak ve monolignol bileşimine göre geniş ölçüde yumuşak ağaç, sertağaç ve çim lignin olarak sınıflandırılır. Softwood öncelikle% 4 p-coumaryl ve% 1 sinapil alkol ile% 95 iğne yapraklı alkolden oluşur. Sertağaç eşit oranlarda iğne yapraklı ve sinapil alkollere sahipken, çim lignin çeşitli oranlarda iğne yapraklı, sinapil ve p-coumaryl alkollerden oluşur11,12. Monomerlerin bileşimi, hücre duvarının lignin mukavemetini, ayrışmasını ve bozulmasını ve moleküler yapıyı, dallanmayı ve diğer polisakkaritlerle çapraz bağlantıyı belirlediği için kritik öneme sahiptir13,14.
Lignin araştırmaları, düşük maliyeti ve yüksek bolluğu nedeniyle yiyecek arama, tekstil endüstrileri, kağıt endüstrileri ve biyoetanol, biyoyakıt ve biyo-ürünler için önem kazanmaktadır15,16. Lignin ölçülmesi için enstrümantal yöntemler (örneğin, yakın kızılötesi (NIR) spektroskopisi, nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi ve ultraviyole (UV) spektrofotometrisi) ile birlikte çeşitli kimyasal yöntemler (örneğin, asetil bromür, asit deterjanları, Klason ve kalıcıoksidasyon)kullanılmıştır. Lignin analiz yöntemleri genellikle elektromanyetik radyasyon, gravimetri ve çözünürlük esas alınarak sınıflandırılır. Elektromanyetik radyasyonla lignin tahmininin arkasındaki prensip, belirli dalga boylarında ışığı emdiği lignin kimyasal özelliğine dayanıyordu. Bu sonuçlar lignin karbonhidratlardan daha güçlü bir UV emiciliğe sahip olduğu ilkesine dayanarak tahmin edilmiştir. 1962'de Bolker ve Somerville, ahşaptaki lignin içeriğini tahmin etmek için potasyum klorür peletleri kullandılar18. Bununla birlikte, bu yöntem, lignin olmayan fenolik bileşiklerin varlığı ve uygun bir yok olma katsayısının bulunmaması nedeniyle otsu örneklerden lignin içeriğinin tahmininde sakıncalara sahiptir. 1970 yılında Fergus ve Goring, Guaiacyl ve Şırınil bileşik emilim maksimasının 280 nm ve 270 nm'de olduğunu ve bu sayede Bolker ve Somerville yönteminin yok olma katsayısı sorununu düzelttik19. Daha sonra, fenolikleri karakterize etmek için son derece hassas bir teknik olan kızılötesi spektroskopi, az miktarda bitki biyokütle örnekleri ile lignin tahmini için de kullanılmıştır. Bu teknolojinin bir örneği, dağınık yansıtıcı Fourier dönüşüm spektrofotometrisiydi. Ancak bu yöntem, UV yöntemine benzer uygun bir standart yok20. Daha sonra lignin içeriği NIRS (kızılötesi spektroskopiye yakın) ve NMR (nükleer manyetik rezonans spektroskopisi) tarafından tahmin edildi. Bununla birlikte, bu yöntemlerde dezavantajlar vardır, lignin kimyasal yapısını değiştirmezler, saflığınıkorurlar 20.
Gravimetrik Klason yöntemi, odunsu sapların lignin tahmini için doğrudan ve en güvenilir analitik yöntemdir. Gravimetrik lignin tahmininin temeli, lignin olmayan bileşiklerin hidroliz /çözünürlüğü ve gravimetri için çözünmeyen lignintoplanmasıdır 21. Bu yöntemde, karbonhidratlar lignin kalıntısı20,22çıkarmak için konsantre H 2 SO4 ile biyokütlenin hidrolizi ileçıkarılır. Bu yöntemle tahmin edilen lignin içeriği asit çözünmeyen lignin veya Klason lignin olarak bilinir. Klason yönteminin uygulanması bitki türüne, doku tipine ve hücre duvarı tipine bağlıdır. Tanenler, polisakkaritler ve proteinler gibi lignin dışı bileşenlerin değişken miktarlarda bulunması, asit çözünmeyen / çözünür lignin içeriğinin tahmininde orantılı farklılıklara neden olur. Bu nedenle, Klason yöntemi sadece odunsu saplar17,23gibi yüksek lignin içerikli biyokütlenin lignin tahmini için önerilir. Asetil bromür (AcBr), asit çözünmeyen lignin ve tiyoglikolik asit (TGA) gibi çözünürlük yöntemleri, lignin içeriğinin çeşitli bitki biyokütle kaynaklarından tahmin edilmesi için en sık kullanılan yöntemlerdir. Kim ve arkadaşları, çözünerek lignin çıkarılması için iki yöntem belirledi. İlk yöntem lignin çözünmeyen bir kalıntı olarak çözünmeyen bir kalıntı olarak ayıklanırken, ikinci yöntem çözünür fraksiyonda lignin ayırır, çözünmeyen kalıntı olarak selüloz ve hemiselüloz bırakır24.
Çözünürlük esasına dayalı lignin tahmininde kullanılan benzer yöntemler tiyoglikolik asit (TGA) ve asetil bromür (AcBr)yöntemleridir 25. Hem TGA hem de asetil bromür yöntemleri, çözünür lignin emiciliğini 280 nm'de ölçerek lignin içeriğini tahmin ediyor; ancak, AcBr yöntemi lignin çözünürlüğü sürecinde xylans bozulur ve lignin içeriğinde yanlış bir artış gösterir26. Tiyoglikolat (TGA) yöntemi, TGA ile lignin benzil alkol gruplarının tiyoether gruplarıyla spesifik bağlanmaya bağlı olduğu için daha güvenilir bir yöntemdir. TGA bağlı lignin HCl kullanılarak asidik koşullar altında çökelmez ve lignin içeriğinin emiciliği 280 nm27olarak tahmin edilir. TGA yöntemi, daha az yapısal modifikasyon, çözünür bir lignin tahmini şekli, lignin olmayan bileşenlerden daha az parazit ve TGA ile spesifik bağlanma nedeniyle lignin kesin tahmini gibi ek avantajlara sahiptir.
Bu TGA yöntemi, lignin içerik tahmini için kullanılan bitki biyokütle örneğinin türüne göre değiştirilmiştir. Burada, lignin içeriğini tahmin etmek için hızlı TGA pirinç pipetleri27 yöntemini pamuklu dokulara modifiye ettik ve uyarladık. Kısaca, kurutulmuş toz bitki örnekleri proteinleri ve alkol çözünür fraksiyonunu çıkarmak için protein çözünürlüğü tamponuna ve metanol ekstraksiyonuna tabi tutuldu. Alkol çözünmeyen kalıntısı Asidik koşullarda TGA ve çökelme lignin ile tedavi edildi. Ticari bambu lignin kullanılarak lignin standart eğrisi oluşturulmuş ve bir regresyon çizgisi (y = mx+c) elde edildi. "x" değeri 280 nm'de lignin ortalama emiş değerlerini kullanırken, pamuk bitkisi biyokütle örneklerinde bilinmeyen lignin konsantrasyonunu hesaplamak için regresyon hattından "m" ve "c" değerleri girildi. Bu yöntem beş aşamaya ayrılmıştır: 1) bitki örneklerinin hazırlanması; 2) örnekleri su ve metanol ile yıkamak; 3) pelet TGA ve asit ile tedavi lignin çökeltmek için; 4) lignin yağışı; ve 5) numunenin standart eğri hazırlama ve lignin içeriği tahmini. İlk iki aşama öncelikle bitki malzemesi hazırlamaya ve ardından alkol çözünmeyen malzemeyi elde etmek için su, PSB (protein çözünürlüğü tamponu) ve metanol ekstraksiyonlarına odaklanır. Daha sonra TGA (tiyoglikolik asit) ve HCl ile tedavi edilerek üçüncü fazda lignin ile kompleks oluşturuldu. Sonunda, HCl, emiciliğini 280 nm28olarak ölçmek için sodyum hidroksitte çözünen lignin çökeltmek için kullanıldı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bitki örneklerinin hazırlanması
- Seradan iki aylık pamuk bitkilerini toplayın (Şekil 1A).
- Bitkinin etrafındaki toprağı gevşeterek toprağı ve kökleri sağlam yanal köklerle ayırmak için bitki saksılarını hafifçe çevirin (Şekil 1B).
- Toplanan bitkileri, tüm kiri temizlemek için suyla dolu tepsilerde iyice yıkayın (kök örnekleri için) (Şekil 1C).
- Ayrılmış kök, kök ve yaprak dokularını kurutmak ve etiketlemek için kağıt havlu kullanın (Şekil 1D). Mantar kirlenmesini önlemek için oda sıcaklığında 2 gün boyunca kuru hava (Şekil 1E).
- Örnek dokuları etiketli kaplara/alüminyum folyolara aktarın ve 7 ila 10 gün boyunca 49 °C'de sıcaklık kontrollü bir inkübatörde kuluçkayayatırın (Şekil 1F).
NOT: Daha yüksek sıcaklıklar lignin yapısını değiştirebilir. Alternatif olarak, bitki biyokütlede herhangi bir kimyasal değişikliğe neden olmadan numuneleri 1 ila 2 gün kurutmak için bir dondurarak kurutucu kullanılabilir. - İnkübatör kurutulmuş dokuyu 5 mm boyutunda parçalara kesmek için bir bıçak kullanın veya alternatif olarak bitki dokularını öğütmek için bir biyokütle öğütücü kullanın (Şekil 1G, Şekil 1H).
NOT: Biyokütle öğütücü/bıçak, her numune kesildikten/öğütüldükten sonra temizlenmelidir. - Kesilmiş doku/ biyokütle topraklanmış bitki malzemesini öğütme şişelerine aktarın ve bir dondurucu değirmeni veya sıvı N2ile kriyojenik öğütücü kullanarak 1 mm büyüklüğünde ince toz haline getirin.
- Örnekleri 10 CPS (her döngü aralığı 2 dk) oranında üç döngü boyunca tekdüze bir toz haline getirin(Şekil 1I, 1J, 1K).
NOT: Deney bu noktada duraklatılabilir ve numuneler uzun süreli depolama için hava geçirmez kaplarda oda sıcaklığında saklanabilir.
2. Numuneleri su, PSB ve metanol ile yıkamak
- Laboratuvar not defterinde lignin içeriği tahmini için kullanılan tüm boş 2 mL mikrobuge tüplerinin ağırlığını ölçün ve kaydedin.
- Zemin numune tozunun 20 mg'ını önceden tartılmış tüpe aktarın. Tüpü doku ve doku tozu ile tartın ve bu ağırlıkları laboratuvar defterine kaydedin.
- 2 mL mikrobuj tüplerinin tümünü (açık kapaklı) 20 mg doku tozu ile bir ısı bloğunda veya 60 °C'de fırında 1 saat boyunca kuluçkaya bırakın.
- Kuluçkadan sonra, numuneleri oda sıcaklığında (RT) 10 dakika soğutur.
- Her mikroyapı tüpüne 1,8 mL su ekleyin ve girdapla karıştırın. Ardından, RT'de 10 dakika boyunca 25.200 x g'da (15.000 rpm) santrifüj ve üstnatantı atın (Şekil 2).
- Tutulan her peletin içine 1,8 mL Protein Çözünme tamponu (PSB)(Tablo 1)ekleyin ve girdapla karıştırın. RT'de 10 dakika boyunca 25.200 x g'da (15.000 rpm) santrifüj ve süpernatantı atın.
- Her örnek için 2.6 adımlarını tekrarlayın.
- Her pelete 1,8 mL su ekleyin, girdapla karıştırın ve 10 dakika boyunca 25.200 x g'da (15.000 rpm) santrifüj ekleyin. Santrifüjlemeden sonra peletin tasarruf edin ve süpernatantı atın.
- Tutulan pelete 1,8 mL metanol ekleyin ve 60 °C ısı bloğunda 20 dakika kuluçkaya yatırın. Ardından, RT'de 10 dakika boyunca 25.200 x g'da (15.000 rpm) santrifüj. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı atın ve peletin muhafazası (Şekil 2).
- Her örnek için 2.9 adımlarını tekrarlayın.
- Peletin HAVASINI RT'de kurutun veya vakumla kurutarak hemen ilerleyin. Vakum kuruması, 30 °C'de vakum kurutucu kullanarak 2 ila 3 saat boyunca veya pelet tamamen kuruyana kadar kurutun.
NOT: Deney bu noktada gece boyunca hava kurutarak duraklatılabilir veya vakumla kurutularak devam edilebilir. - Kuruduktan sonra, numune tüplerini kurutulmuş peletle tartın ve laboratuvar defterindeki ilgili boş tüp ağırlığının yanındaki ağırlığı kaydedin. İki değeri çıkararak pelet ağırlığını tahmin edin. Bu ağırlıklar lignin ekstraksiyon sürecinin sonunda lignin tahmini için kullanılacaktır.
- Lignin ekstraksiyonunun bu noktasında, lignin standart eğrisinin üretimi için ticari bambu ligninini ekleyin. Ticari bambu lignin 0,5 mg artışlarla 0,5 mg ila 5 mg arasında değişen ayrı tüpler halinde ölçün (0,5 mg, 1 mg, 1,5 mg, 2 mg, 3 mg, 3,5 mg, 4 mg, 4,5 mg ve 5,0 mg). Üç teknik çoğaltma için her konsantrasyonu üç kez ölçün.
NOT: Bundan böyle yukarıdaki adımda ölçülen standartlar, kurutulan numunelerle aynı şekilde işlenmiştir.
3. Lignin çökeltmek için TGA ve asit ile pelet tedavisi
- Yukarıdaki adımdan alınan denek işlenmiş numuneler, ölçülen standartlarla birlikte TGA (tiyoglikolik asit) tedavisine kadar.
- Her peletin içine 1 mL 3 N HCl (Tablo 1) ve 100 μL TGA ekleyin.
- Vortex ve bir duman davlumbazında 3 saat boyunca önceden ısıtılmış 80 °C ısı bloğunda kuluçkaya yatırın (Şekil 2).
NOT: 80 °C'deki ısıtma adımı izlenmelidir. Yüksek basınç birikmesi kapakları açabilir ve kimyasal dökülmelere yol açabilir. Vidalı kapak tüpleri önerilir, ancak bu tür dökülmeleri önlemek için alternatif olarak bu adım sırasında 2 mL tüpler gevşek bir şekilde kaplanabilir. - Kuluçkadan sonra, RT'de 10-15 dakika ve santrifüjde 25.200 x g'da (15.000 rpm) 10 dakika RT'de tüpleri soğutur.
NOT: Asit ve organik çözücülerden elde edilen atıklar ayrıştırılmalı ve havalandırılmış kapaklı cam kaplarda saklanmalıdır. TGA-asit atıkları ve asit atıklarının toplanması için ayrı cam kaplar kullanın. - Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı atın ve peletin tutul. RT'de 10 dakika boyunca 1 mL su ekleyin, girdapla karıştırın ve 25.200 x g'da (15.000 rpm) santrifüj ekleyin.
- Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı atın ve peleti 1 N NaOH'da 37 °C çalkalayıcı / termal karıştırıcıda 24 saat boyunca düşük hızda karıştırın (Şekil 2).
NOT: Bu kuluçka süresi 1 saat7'yedüşürülebilir. - Kuluçkadan sonra, RT'de 10 dakika boyunca 25.200 x g 'da (15.000 rpm) 2 mL mikrobuj tüplerini santrifüj edin.
NOT: Prosedür, doğada aşındırıcı olan güçlü asitlerin ve diğer kimyasalların kullanımını içerir. Bu nedenle, lignin tahmini süreci boyunca uygun KKD giyilmesi önerilir. TGA güçlü hoş olmayan bir kokuya sahiptir ve doğada aşındırıcıdır. Bu nedenle, sadece duman kaputunda kullanılması önerilir.
4. Lignin yağışı
- Süpernatantı taze bir 2 mL mikrofuge tüpüne aktarın ve 4 saat veya gece boyunca 4 °C'de 200 μL konsantre HCl. Incubate ekleyin (Şekil 2).
NOT: Soğutma adımı bir geceye uzatılarak ekstraksiyon işlemi bu noktada duraklatılabilir. - RT'de 10 dakika boyunca 25.200 x g'da (15.000 rpm) santrifüj ve peleti 1 mL 1 N NaOH'da çözün.
- NaOH'da peletin tamamen askıya alınmasını sağlamak için RT'deki çalkalayıcıda 10 dakika kuluçkaya yaslanın.
- Son olarak, bir spektrofotometre kullanarak numunelerin emiciliğini 280 nm olarak ölçün ve standart lignin eğrisi ile karşılaştırın.
- Kalibrasyon eğrisi regresyon hattı değerlerini ve çıkarılan numunelerin absorbanslarını 280 nm'de kullanarak lignin bilinmeyen konsantrasyonunu ölçün.
5. Numunede standart eğri hazırlama ve lignin tahmini
- Lignin standartlarını TGA tedavisinden alınan deneysel örneklerle aynı şekilde işleyin.
- Ticari bambu lignin standartlarını 0.5 mg, 1 mg, 1.5 mg, 2 mg, 2.5 mg, 3.0 mg, 3.5 mg, 4.0 mg, 4.5 mg ve 5 mg'dan başlayarak 0.5 mg artışlarla ölçün. Daha sonra, TGA, HCl tarafından yapılan işlem, 1 N NaOH'da çözünür ve ardından absorbansı 280 nm'de ölçer (Şekil 3A).
- Standart lignin eğrisinin dağınık bir grafiğini oluşturmak için lignin konsantrasyonu ve absorbans okumalarının değerlerini kullanın (Şekil 3B).
- 280 nm'deki ayıklanmış örneklerin ortalama absorbanslarından "x" değerleri ve lignin standart eğri gerileme çizgisinden "c" değerlerini kullanarak hazırlanan örneklerin bilinmeyen lignin içeriğinin tahmin edilmesi için dağınık çizimde oluşturulan y = mx+c regresyon çizgisini kullanın.
- Mg başına lignin konsantrasyonu elde etmek için mg (yaklaşık 15 mg) metanol ekstraksiyonu sonra vakum / hava kurutulmuş bitki biyokütle örneğinin toplam ağırlığına lignin içeriğini elde edilen y değerine bölün. Ardından, mg başına lignin yüzdesini hesaplamak için bu değeri 100 ile çarpın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Farklı dokulardaki lignin içeriklerindeki farklılıklar için iki farklı pamuk deneysel çizgisi karşılaştırıldı. Her numunenin çıkarılan lignin içeriği 280 nm olarak ölçüldü ve ilgili absorbans değerleri kaydedildi. Her biyolojik yinelemenin ortalama absorbans değerleri lignin standart eğrisinin regresyon çizgisi ile karşılaştırıldı (Tablo 2, Şekil 3C). Regresyon çizgisi, y = mx + c, çıkarılan deneysel çizgilerin bilinmeyen lignin içeriğini hesaplamak için kullanılır, örnek 1 ve örnek 2. Ortalama OD değerlerinin sonuçları "x" olarak değiştirilirken, "m" ve "c" değerleri mg'da lignin konsantrasyonu "y" elde etmek için lignin standart eğrisinin regresyon çizgisinden takıldı (Tablo 3, Şekil 3B). Bir sonraki adımda, 1 mg lignin içeriği başına hesaplamak için, metanol ekstraksiyonu sonrası "y" değerini numunenin ağırlığına (15 mg) bölün. Aşağıdaki adımda, gram başına hesaplamak için (= 1.000 mg) y/15 değeri 1.000 ile çarpılmış. Lignin % 'sini almak için y/15 değerini 1.000'e böleriz ve 100 ile çarparız. Üç biyolojik replik için lignin % ortalaması (her satır, örnek 1 ve örnek 2) iki deneysel çizgi örnek 1 (%11,7) arasında karşılaştırıldı. ve örnek 2 (%10,3). Lignin değerleri, TGA yönteminin güvenilir bir yöntem olduğunu ve lignin içeriğini ölçmek için son derece spesifik olduğunu öne süren biyolojik çoğalmalar arasında tutarlıydı. İki deneysel pamuk hattının farklı doku tipleri (kök, kök ve yapraklar) arasında karşılaştırma çalışmaları da yapıldı ve her iki çizgi de yapraklarda nispeten daha düşük lignin içeriği gösterdi (%3.4) saplarla karşılaştırıldığında (%9,4 ila %9,9) ve kökler (%9,4 ila %9,2) (Tablo 4, Şekil 4).
Şekil 1: Bitki biyokütle örneğinin hazırlanması. (A) Yeşil evden pamuk bitki malzemesi topladı. (B) Kökleri ayırmak için yavaşça tencereleri çevirdi. (C) Tüm kiri temizlemek için suda iyice yıkanır. (D) Ayrılmış kök, kök ve yaprak dokuları. (E) Dokuyu ayırdıktan sonra 2 gün boyunca havayla kurutulmuş doku. (F) Hava kurutulmuş doku 10 gün boyunca 49 °C'de inkübatöre aktarılır. (G) Bitki biyokütle örneklerini öğütmek için biyokütle öğütücü kullanılmıştır. (H) Zemin bitkisi biyokütle kök, kök ve yaprak örnekleri. (I) Öğütme şişelerine öğütme numuneleri yüklenir, dondurucu değirmen odasına yerleştirilir, dondurucu değirmeninde 3 döngü boyunca 10 CPS oranında topraklanır. (J) Dondurucu değirmeninde öğütüldükten sonra ince öğütülmüş doku tozu gösteren öğütülmüş şişeler. (K) Öğütme için dondurucu değirmeni kullandıktan sonra kök, kök ve yaprak doku tozunun ince öğütülmesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: TGA aracılı lignin ekstraksiyonunda yer alan kritik adımlar. TGA yöntemi kullanılarak bitki biyokütlesinden lignin ekstraksiyonuna ve lignin içeriği tahminine kadar kritik adımların akış şeması: 1. Bitki örneklerinin yeterli kurutma ve dondurucu değirmeni kullanılarak ince toz haline getirilerek hazırlanması; 2. 20 mg doku tozu PSB, metanol ve su yıkama, kurutulmuş ve çıkarılmış alkol çözünmeyen malzemeye tabi tutuldu; 3. TGA ve asit kullanılarak lignin çökelme; 4. Ticari bambu lignin kullanılarak lignin standart eğrisinin hazırlanması; 5. Lignin içeriğinin tahmini. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Numunede standart eğri hazırlama ve lignin tahmini. (A) 280 nm'de absorbans okumalarından lignin standart eğrisi üretmek için kullanılan farklı konsantrasyonlarda ticari bambu lignin gösteren tablo. (B) Tablo A. (C) Örnek 1 ve örnek 2'nin tahmini kök doku lignin içeriğini temsil eden çubuk grafikler kullanılarak Excel programı ile oluşturulan dağınık çizim. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| çözüm | Gerekli hisse senetleri | hazırlık | ||
| Protein çözünürlüğü tamponu (PSB) | 1 M Tris HCl pH 8.8 ve 0.5 M EDTA pH 8.0 | Psb'nin 50 mM Tris, 0,5 mM EDTA ve %10 SDS konsantrasyonuna sahip 100 mL çalışma çözümü hazırlamak için, 80 mL steril suya 5 mL 1 M Tris, 1 mL EDTA ve 10 g SDS ekleyin, karıştırın, çözün ve steril su ile 100 mL'ye kadar son hacmi yapın. 30 dakika boyunca 121 °C, 15 psi basınçta otoklav. | ||
| 1 M Tris HCl | 1 M Tris'in 100 mL'lik kısmını hazırlamak için, 80 mL suya 12,1 g Tris HCl (moleküler ağırlık = 121,14 g) ekleyin. Manyetik bir karıştırıcı üzerinde karıştırarak Tris HCl'yi karıştırın, pH'ı NaOH ile 8,8'e ayarlayın ve hacmi 30 dakika boyunca 121 °C, 15 psi basınçta steril su ve otoklav ile 100 mL'ye ayarlayın. | |||
| 0,5 M EDTA (Etilenediamin tetraasetik) | 100 mL 0,5 M EDTA hazırlamak için 70 mL suya 18,6 g EDTA ekleyin. Sodyum hidroksit peletler kullanarak pH'ı 8,0'a ayarlayın (EDTA pH 8.0'da tamamen çözülür) ve hacmi 100 mL'ye kadar ayarlayın. Çözeltiyi 121 °C, 15 psi basınçta 30 dakika boyunca otoklavlavlayın. | |||
| 3 N Hidroklorik asit (HCL) | 3 N HCl'nin 100 mL'lik kısmını hazırlamak için 74 mL steril suya 26 mL konsantre HCL ekleyin. | |||
| % 4 Sodyum hidroksit (NaOH) | 1 N sodyum hidroksit çözeltisi hazırlayın, 90 mL steril suya 4 g sodyum hidroksit ekleyin, çözün, hacmi 100 mL'ye kadar yapın ve 30 dakika boyunca 121 °C, 15 psi basınçta otoklav yapın. | |||
Tablo 1: Protokolde kullanılan çözümlerin hazırlanması. Protokolde kullanılan farklı çözümlerin hazırlanmasını gösteren tablo.
Tablo 2: Lignin standart eğrisi 0.5 mg ila 3.5 mg endüstriyel bambu lignin arasında hazırlanmıştır. M ve c değerlerini gösteren regresyon çizgisine sahip dağınık grafik. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 3: 280 nm 'de (x olarak) örneklerin absorbans okumaları ve standart eğri eğrisinden 'm' ve 'c' değerleri kullanılarak bilinmeyen lignin içeriğinin hesaplanmasında kullanılan Lignin şablonu. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 4: Çiçek açma sonrası aşamada pamuk bitkisinin farklı dokularından (kök, kök ve yapraklar) lignin içeriği. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lignin bitki büyümesinde ve gelişmesinde önemli bir rol oynamaktadır ve son zamanlarda biyoyakıt, biyoenerji ve biyoürün uygulamaları için kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. Lignin, tüm vasküler bitki ikincil hücre duvarlarında depolanan aromatik bileşikler bakımından zengindir. Ahşap panel ürünleri, biyo dispersantlar, flokülantlar, poliüretan köpükler ve devrekartları reçinelerinde29,30,31gibi çeşitli endüstriyel uygulamalara sahiptir. Kağıt ve kağıt hamuru endüstrilerinden üretilen lignin çoğu atık olarak salınır veya ısı üretimi için yakılır. Böylece verimli bir şekilde işlenirse lignin hem fosil yakıt bazlı ürünlere alternatif olarak kullanılabileceği32,33 hem de biyoelektrik üretimi34. Bu nedenle, lignin içeriğinin ve bileşiminin kesin tahmini, bileşim bitki türlerine ve bitki organ tipine göre değiştiğinden endüstriyel uygulamalar için kritik öneme sahiptir. Lignin tahmini için ana sınırlama, lignin içeriğinin tahmini için seçilen yöntemden kaynaklananfarktır 35. Farklı yöntemler arasındaki tahmin farklılıkları öncelikle diğer lignin olmayan bileşenlerle kontaminasyon, çözünürlükteki değişim, lignin'e yeni grupların eklenmesi, ksiylan bozulması / kirlenmesi, yerel yapısal değişiklikler ve diğer bileşenlerin ortadan kaldırılması sırasında bazı lignin fraksiyonlarının kaybından kaynaklanmaktadır. Ayrıca, lignin protokollerinin çoğu başlangıçta ahşap kimyasına dayanarak geliştirilmiştir27. Bu nedenle, biyoyakıtlar ve biyo ürünler için daha fazla mahsul / bitki türü hedeflendikçe otsu numuneler için lignin protokolleri oluşturulmasına kritik bir ihtiyaç vardır. TGA yöntemi, TGA ile belirli bir bağa dayanarak saf lignin içeriğini tahmin ediyor. Bu nedenle, TGA tarafından lignin tahmini, Klason ve asetil bromür yöntemleri35,36ile karşılaştırıldığında daha düşük lignin içeriği sağlar. Bunun nedeni, lignin TGA ile özel olarak bağlanmasının yanı sıra lignin yağışı sırasında bazı lignin içeriğinin kaybolmasıdır (çözünmeyen kısım).
TGA yöntemi kullanılarak tahmin edilen lignin içeriği tekrarlanabilir ve tutarlıdır. Bu çalışmada elde edilen sonuçlar biyolojik çoğalmalar arasında tutarlıydı ve iki satır arasında önemli bir fark olduğunu göstererek lignin tahmini için TGA yönteminin güvenilirliğini düşündürmektedir. Verilerin tekrarlanabilirliği ve lignin içeriğinin kesin tahmini için, adımları takip etmek ve aşağıdaki önlemleri almak önemlidir. Pozitif kontrollerin üç kopyada 0,5 mg ila 5 mg arasında değişen farklı konsantrasyonlara dahil edilmesi ve TGA adımından alınan örneklerle birlikte işlenmesi deneysel hataları önleyecek ve lignin içeriğinin kesin olarak tahmin edilmesine neden olacaktır. Standart eğri her numune kümesi için oluşturulmalı ve regresyon çizgisi istatistiği R2% 97 ila% 99 aralığında düşmelidir. Boş tüpün ve kurutulmuş metanol çıkarılan dokunun tam ağırlığı, tam lignin içeriği tahmini için kritik öneme sahiptir. Ek olarak, bitkilerin spesifik aşaması, yetiştirme koşulları, genotipler, doku tipi ve bitkinin yaşı gibi çeşitli faktörler lignin içeriğini etkileyecektir30,37,38. Bu nedenle, tüm deneysel çizgilerin aynı ortamda yetiştirin ve aynı anda aynı tür dokuları hasat etmek önemlidir. Mevcut çalışmanın sonuçları, yapraklarda beklenen daha düşük lignin içeriği, saplarda ve köklerde daha yüksek lignin içeriği eğilimi göstermiş ve bu yöntemin çeşitli bitki dokularına uygulanabilirliğini göstermiştir. Ayrıca, biyolojik çoğalmalar arasında daha az varyasyon, TGA'nın tüm bitki dokularında tekrarlanabilir lignin içeriğini tahmin edebildiğine dair önermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bitki ve Toprak Bilimi Bölümü ve Pamuk A.Ş.'ye bu çalışmaya verdikleri kısmi destek için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioSpectrophotometer kinetic | Eppendorf kinetic | 6136000010 | For measuring absorbance at 280 nm |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | For centrifuging samples |
| Commercial bamboo lignin | Aldrich | 1002171289 | Used in the preparation of the standard curve |
| Distilled water | Fischer Scientific | 16690382 | Used in the protocol |
| Falcon tubes | VWR | 734-0448 | Containers for solutions |
| Freezer mill | Spex Sample Prep | 68-701-15 | For fine grinding of plant tissue samples |
| Heat block/ Thermal mixer | Eppendorf | 13527550 | For temperature controlled steps during lignin extraction |
| Hotplate stirrer | Walter | WP1007-HS | Used for preparation of solutions |
| Hydrochloric acid (HCL) | Sigma | 221677 | Used in the protocol |
| Incubator | Fisherbrand | 150152633 | For thorough drying of plant tissue samples |
| Measuring scale | Mettler toledo | 30243386 | For measuring plant tissue weight, standards and microfuge tubes |
| Methanol (100 %) | Fischer Scientific | 67-56-1 | Used in the protocol |
| Microfuge tubes (2 mL) | Microcentrifuge | Z628034-500EA | Containers for extraction of lignin |
| Plant biomass gerinder | Hanchen | Amazon | Used for crushing dried samples |
| pH meter | Fisher Scientific | AE150 | Measuring pH for solutions prepared for lignin extraction |
| Temperature controlled incubator/oven | Fisher Scientific | 15-015-2633 | Used in the protocol |
| Thioglycolic acid (TGA) | Sigma Aldrich | 68-11-1 | Used in the protocol |
| Vacuum dryer | Eppendorf | 22820001 | Used for drying samples |
| Vortex mixer | Eppendorf | 3340001 | For proper mixing of samples |
References
- Freudenberg, K., Neish, A. C. Constitutionand Biosynthesis of Lignin. , Springer-Verlag Inc. New York, NY. 129 (1968).
- Chio, C., Sain, M., Qin, W. Lignin utilization: A review of lignin depolymerization from various aspects. Renewable and Sustainable Energy Reviews. 107, 232-249 (2019).
- Sun, Z., Fridrich, B., de Santi, A., Elangovan, S., Barta, K. Bright Side of Lignin Depolymerization: Toward New Platform Chemicals. Chemical Reviews. 118, 614-678 (2018).
- Xu, F. Cereal Straw as a Resource for Sustainable Biomaterials and Biofuels. Sun, R. C. , Elsevier. 9-47 (2010).
- Liu, Q., Luo, L., Zheng, L. Lignins: Biosynthesis and Biological Functions in Plants. International Journal of Molecular Sciences. 19, 335 (2018).
- Ithal, N., et al. Developmental transcript profiling of cyst nematode feeding cells in soybean roots. Molecular Plant-Microbe Interactions. 20, 510-525 (2007).
- Moura, J. C. M. S., et al. Abiotic and Biotic Stresses and Changes in the Lignin Content and Composition in Plants. Journal of Integrative Plant Biology. 52, 360-376 (2010).
- Vanholme, R., Morreel, K., Ralph, J., Boerjan, W.
- Lupoi, J. S., Singh, S., Parthasarathi, R., Simmons, B. A., Henry, R. J. Recent innovations in analytical methods for the qualitative and quantitative assessment of lignin. Renewable and Sustainable Energy Reviews. 49, 871-906 (2015).
- Mendu, V., et al. Identification and thermochemical analysis of high-lignin feedstocks for biofuel and biochemical production. Biotechnology for Biofuels. 4, 43 (2011).
- Shrotri, A., Kobayashi, H., Fukuoka, A. Advances in Catalysis. Song, C. 60, Academic Press. 59-123 (2017).
- Brunow, G. Biorefineries-Industrial Processes and Products: Status Quo and Future Directions. 2, 151-163 (2008).
- Constant, S., et al. New insights into the structure and composition of technical lignins: a comparative characterisation study. Green Chemistry. , (2016).
- Shimada, N., Tsuyama, T., Kamei, I. Rapid Determination of Thioglycolic Acid Lignin for Various Biomass Samples. Mokuzai Gakkaishi. 65, 25-32 (2019).
- Li, X., Weng, J. K., Chapple, C.
- Ponnusamy, V. K., et al. A review on lignin structure, pretreatments, fermentation reactions and biorefinery potential. Bioresource Technology. 271, 462-472 (2019).
- Hatfield, R., Fukushima, R. S.
- Bolker, H., Somerville, N. Ultraviolet spectroscopicstudies of lignin in solid state. I. Isolated lignin preparations. Tappi Journal. 72, 826-829 (1962).
- Fergus, B. J., Goring, D. A. I. The distribution of lignin in birchwood as determined by ultraviolet microscopy. Holzforschung. 24, 118-124 (1970).
- Schultz, T. P., Templeton, M. C., McGinnis, G. D. Rapid determination of lignocellulose by diffuse reflectance Fourier transform infrared spectrometry. Analytical Chemistry. 57, 2867-2869 (1985).
- Dence, C. W. The Determination of Lignin. Methods in Lignin Chemistry. Lin, S. Y., Dence, C. W. , (1992).
- Adler, E.
- Brinkmann, K., Blaschke, L., Polle, A. Comparison of different methods for lignin determination as a basis for calibration of near-infrared reflectance spectroscopy and implications of lignoproteins. Journal of Chemical Ecology. 28, 2483-2501 (2002).
- Pandey, M. P., Kim, C. S. Lignin Depolymerization and Conversion: A Review of Thermochemical Methods. Chemical Engineering & Technology. 34, 29-41 (2011).
- Moreira-Vilar, F. C., et al. The acetyl bromide method is faster, simpler and presents best recovery of lignin in different herbaceous tissues than Klason and thioglycolic acid methods. PLoS One. 9, 110000 (2014).
- Hatfield, R. D., Grabber, J., Ralph, J., Brei, K. Using the Acetyl Bromide Assay To Determine Lignin Concentrations in Herbaceous Plants: Some Cautionary Notes. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 47, 628-632 (1999).
- Suzuki, S., et al. High-throughput determination of thioglycolic acid lignin from rice. Plant Biotechnology. 26, 337-340 (2009).
- Nakatsubo, F., Tanahashi, M., Higuchi, T. Acidolysis of Bamboo Lignin II : Isolation and Identification of Acidolysis Products. Wood research. 53, 9-18 (1972).
- Aro, T., Fatehi, P. Production and Application of Lignosulfonates and Sulfonated Lignin. ChemSusChem. 10, 1861-1877 (2017).
- Frei, M. Lignin: Characterization of a Multifaceted Crop Component. The Scientific World Journal. 2013, 436517 (2013).
- Lora, J. H., Glasser, W. G. Recent Industrial Applications of Lignin: A Sustainable Alternative to Nonrenewable Materials. Journal of Polymers and the Environment. 10, 39-48 (2002).
- Wang, R., Zhou, B., Wang, Z. Study on the Preparation and Application of Lignin-Derived Polycarboxylic Acids. Journal of Chemistry. 2019, 5493745 (2019).
- Welker, C. M., et al. Engineering Plant Biomass Lignin Content and Composition for Biofuels and Bioproducts. Energies. 8, 7654-7676 (2015).
- Mendu, V., et al. Global bioenergy potential from high-lignin agricultural residue. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 4014-4019 (2012).
- Brinkmann, K., Blaschke, L., Polle, A. Comparison of Different Methods for Lignin Determination as a Basis for Calibration of Near-Infrared Reflectance Spectroscopy and Implications of Lignoproteins. Journal of Chemical Ecology. 28, 2483-2501 (2002).
- Moreira-Vilar, F. C., et al. The Acetyl Bromide Method Is Faster, Simpler and Presents Best Recovery of Lignin in Different Herbaceous Tissues than Klason and Thioglycolic Acid Methods. PLoS One. 9, 110000 (2014).
- Iwaasa, A. D., Beauchemin, K. A., Acharya, S. N., Buchanan-Smith, J. G. Effect of stage of maturity and growth cycle on shearing force and cell wall chemical constituents of alfalfa stems. Canadian Journal of Animal Science. 76, 321-328 (1996).
- Arai-Sanoh, Y., et al. Genotypic Variations in Non-Structural Carbohydrate and Cell-Wall Components of the Stem in Rice, Sorghum, and Sugar Vane. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. , 1105072478 (2011).
