Summary
Hier presenteren we een aangepaste TGA-methode voor het schatten van het ligninegehalte in kruidachtige plantaardige biomassa. Deze methode schat het ligninegehalte door specifieke thioetherbindingen met lignine te vormen en biedt een voordeel ten opzichte van de Klason-methode, omdat het een relatief klein monster vereist voor de schatting van het ligninegehalte.
Abstract
Lignine is een natuurlijk polymeer dat na cellulose het op één na meest voorkomende polymeer op aarde is. Lignine wordt voornamelijk afgezet in secundaire celwanden van planten en is een aromatisch heteropolymeer dat voornamelijk bestaat uit drie monolignolen met een aanzienlijk industrieel belang. Lignine speelt een belangrijke rol in de groei en ontwikkeling van planten, beschermt tegen biotische en abiotische spanningen en in de kwaliteit van veevoer, het hout en industriële lignineproducten. Een nauwkeurige schatting van het ligninegehalte is essentieel voor zowel fundamenteel begrip van de ligninebiosynthese als industriële toepassingen van biomassa. De thioglycolzuurmethode (TGA) is een zeer betrouwbare methode om het totale ligninegehalte in de plantaardige biomassa te schatten. Deze methode schat het ligninegehalte door thioethers te vormen met de benzylalcoholgroepen lignine, die oplosbaar zijn in alkalische omstandigheden en onoplosbaar in zure omstandigheden. Het totale ligninegehalte wordt geschat met behulp van een standaardcurve die wordt gegenereerd uit commerciële bamboelignine.
Introduction
Lignine is een van de vitale dragende componenten van plantencelwanden en het op een na meest voorkomende polymeer op aarde1. Chemisch is lignine een gekruist heteropolymeer dat bestaat uit complexe fenolverbindingen met een hoog molecuulgewicht die een natuurlijke hernieuwbare bron vormen van aromatische polymeren en synthese van biomaterialen2,3. Dit natuurlijke polymeer speelt een belangrijke rol in plantengroei, ontwikkeling, overleving, mechanische ondersteuning, stijfheid van de celwand, watertransport, mineraaltransport, verblijfsweerstand, weefsel- en orgaanontwikkeling, afzetting van energie en bescherming tegen biotische en abiotischespanningen 4,5,6,7. Lignine bestaat voornamelijk uit drie verschillende monolignolen: coniferyl, sinapyl en p-coumarylalcoholen die zijn afgeleid van de fenyl propanoïde route8,9. De hoeveelheid lignine en de samenstelling van monomeren variëren afhankelijk van de plantensoort, het weefsel/orgaantype en verschillende stadia van plantenontwikkeling10. Lignine is grofweg ingedeeld in zachthout, hardhout en graslignine op basis van de samenstelling van de bron en monolignol. Zachthout bestaat voornamelijk uit 95% coniferylalcohol met 4% p-coumaryl en 1% sinapylalcoholen. Hardhout heeft coniferyl- en sinapylalcoholen in gelijke verhoudingen, terwijl graslignine bestaat uit verschillende verhoudingen coniferyl-, sinapyl- en p-coumarylalcoholen11,12. De samenstelling van monomeren is van cruciaal belang omdat het de ligninesterkte, afbraak en afbraak van de celwand bepaalt, evenals het bepalen van de moleculaire structuur, vertakking en kruiskoppeling met andere polysachariden13,14.
Lignine onderzoek wint aan belang in foerageren, textielindustrieën, papierindustrieën, en voor bio-ethanol, biobrandstof, en bio-producten als gevolg van de lage kosten en hoge overvloed15,16. Verschillende chemische methoden (bijv. acetylbromide, zure detergenten, Klason en permanganaatoxidatie) samen met instrumentele methoden (bijv. near infrared (NIR) spectroscopie, nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopie en ultraviolette (UV) spectrofotometrie) werden gebruikt voor ligninekwantificering9,17. De analysemethoden van lignine worden over het algemeen geclassificeerd op basis van elektromagnetische straling, gravimetrie en oplosbaarheid. Het principe achter lignine schatting door elektromagnetische straling was gebaseerd op de chemische eigenschap van lignine waarmee het licht absorbeert op specifieke golflengten. Deze resultaten werden geschat op basis van het principe dat lignine een sterkere UV-absorptie heeft dan koolhydraten. In 1962 gebruikten Bolker en Somerville kaliumchloridekorrels om het ligninegehalte in hout te schatten18. Deze methode heeft echter nadelen bij de schatting van het ligninegehalte uit kruidachtige monsters als gevolg van de aanwezigheid van fenolverbindingen zonder lignine en het ontbreken van een geschikte extinctiecoëfficiënt. In 1970 ontdekten Fergus en Goring dat de absorptiemaxima van guaiacyl en syringylverbinding 280 nm en 270 nm bedroegen, wat de uitstervingscoëfficiënt van de Bolker- en Somerville-methode19corrigeerde. Later werd infraroodspectroscopie, een zeer gevoelige techniek voor het karakteriseren van fenolen, ook gebruikt voor lignineschatting met een kleine hoeveelheid biomassamonsters van planten. Een voorbeeld van dergelijke technologie was diffuse reflectie Fourier transform spectrofotometrie. Deze methode mist echter een goede standaard die vergelijkbaar is met de UV-methode20. Later werd het ligninegehalte geschat door NIRS (near infrared spectroscopy) en NMR (nuclear magnetic resonance spectroscopy). Hoewel er nadelen zijn aan deze methoden, veranderen ze de chemische structuur van lignine niet, met behoud van de zuiverheid20.
De gravimetrische Klason-methode is een directe en de meest betrouwbare analysemethode voor lignineschatting van houtachtige stengels. De basis voor gravimetrische lignineschatting is de hydrolyse/solubilisatie van niet-lignineverbindingen en de verzameling van onoplosbare lignine voor gravimetrie21. Bij deze methode worden de koolhydraten verwijderd door hydrolyse van de biomassa met geconcentreerd H2SO4 om lignineresidu20,22te extraheren . Het ligninegehalte dat met deze methode wordt geschat, staat bekend als zure onoplosbare lignine of Klason lignine. De toepassing van de Klason-methode hangt af van de plantensoort, het weefseltype en het celwandtype. De aanwezigheid van variabele hoeveelheden niet-ligninecomponenten zoals tannines, polysachariden en eiwitten resulteert in proportionele verschillen in de schatting van het gehalte aan zure onoplosbare/oplosbare lignine. Daarom wordt de Klason-methode alleen aanbevolen voor lignineschatting van biomassa met een hoog ligninegehalte, zoals houtachtige stengels17,23. Oplosbaarheidsmethoden zoals acetylbromide (AcBr), zuuroplosbare lignine en thioglycolzuur (TGA) zijn de meest gebruikte methoden voor het schatten van het ligninegehalte uit verschillende plantaardige biomassabronnen. Kim et al. stelden twee methoden vast voor lignine-extractie door solubilisatie. De eerste methode extraheert lignine als onoplosbaar residu door cellulose en hemicellulose te oplosbaar te maken, terwijl de tweede methode lignine in de oplosbare fractie scheidt, waardoor cellulose en hemicellulose als onoplosbaar residuachterblijven 24.
Vergelijkbare methoden die worden gebruikt bij de schatting van lignine op basis van de oplosbaarheid zijn thioglycolzuur (TGA) en acetylbromide (AcBr) methoden25. Zowel TGA- als acetylbromidemethoden schatten het ligninegehalte door de absorptie van de solubiliseerde lignine te meten op 280 nm; de AcBr-methode degradeert echter xylanen tijdens het proces van lignine-solubilisatie en vertoont een valse toename van het ligninegehalte26. De thioglycolaatmethode (TGA) is de betrouwbaardere methode, omdat deze afhankelijk is van specifieke binding met de thioethergroepen van benzylalcoholgroepen lignine met TGA. De TGA-gebonden lignine wordt onder zure omstandigheden neergeslagen met behulp van HCl en het ligninegehalte wordt geschat met behulp van zijn absorptie op 280 nm27. De TGA-methode heeft extra voordelen van minder structurele modificaties, een oplosbare vorm van lignineschatting, minder interferentie van niet-ligninecomponenten en nauwkeurige schatting van lignine als gevolg van specifieke binding met TGA.
Deze TGA-methode wordt gewijzigd op basis van het soort biomassamonster van de installatie dat wordt gebruikt voor de schatting van het ligninegehalte. Hier hebben we de snelle TGA-methode van rijststro's27 aangepast aan katoenweefsels om het ligninegehalte te schatten. Kortom, de gedroogde gepoederde plantenmonsters werden onderworpen aan eiwitoplosbaarheidsbuffer en methanolextractie om eiwitten en de op alcohol oplosbare fractie te verwijderen. Het alcoholonoplosbare residu werd behandeld met TGA en geprecipiteerde lignine onder zure omstandigheden. Een lignine standaard curve werd gegenereerd met behulp van commerciële bamboe lignine en een regressie lijn (y = mx+c) werd verkregen. De "x"-waarde gebruikt gemiddelde absorptiewaarden van lignine bij 280 nm, terwijl "m" en "c"-waarden werden ingevoerd uit de regressielijn om de onbekende lignineconcentratie in biomassamonsters van katoenfabrieken te berekenen. Deze methode is verdeeld in vijf fasen: 1) bereiding van plantenmonsters; 2) het wassen van de monsters met water en methanol; 3) behandeling van de pellet met TGA en zuur om lignine neer te doen; 4) neerslag van lignine; en 5) de standaardcurvevoorbereiding en de schatting van het ligninegehalte van het monster. De eerste twee fasen zijn voornamelijk gericht op de bereiding van plantaardig materiaal, gevolgd door water, PSB (eiwitoplosbaarheidsbuffer) en methanolextracties om het onoplosbare alcoholmateriaal te verkrijgen. Vervolgens werd het behandeld met TGA (thioglycolzuur) en HCl om in de derde fase een complex met lignine te vormen. Aan het einde werd HCl gebruikt om lignine neer te doen, dat werd opgelost in natriumhydroxide om de absorptie ervan te meten bij 280 nm28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van plantenmonsters
- Verzamel twee maanden oude katoenplanten uit de kas (figuur 1A).
- Draai plantenpotten voorzichtig om grond en wortels met intacte zijwortels te scheiden door de grond rond de plant los te maken (figuur 1B).
- Was de verzamelde planten grondig in trays gevuld met water om al het vuil te verwijderen (voor wortelmonsters) (Figuur 1C).
- Gebruik papieren handdoeken om gescheiden wortel-, stengel- en bladweefsels te drogen en label ze (figuur 1D). 2 dagen aan de lucht drogen bij kamertemperatuur om schimmelbesmetting te voorkomen (figuur 1E).
- Breng monsterweefsels over in gelabelde recipiënten/aluminiumfolies en incubeer gedurende 7 tot 10 dagen in een temperatuurgecontroleerde incubator bij 49 °C (figuur 1F).
OPMERKING: Hogere temperaturen kunnen de ligninestructuur veranderen. Als alternatief kan een vriesdroger worden gebruikt om monsters gedurende 1 tot 2 dagen te drogen zonder chemische veranderingen in de biomassa van de installatie te veroorzaken. - Gebruik een mes om het incubator gedroogde weefsel in stukken van 5 mm te snijden of gebruik een biomassamolen om de plantenweefsels te malen (figuur 1G, figuur 1H).
OPMERKING: De biomassamolen/mes moet worden gereinigd nadat elk monster is gesneden/gemalen. - Breng het geslepen weefsel/biomassa geaard plantaardig materiaal over in maalflacons en maal tot fijn poeder van 1 mm met behulp van een vriesmolen of cryogene molen met vloeistof N2.
- Maal monsters gedurende drie cycli met een snelheid van 10 CPS (elke cyclusperiode van 2 min) tot een uniform poeder(figuur 1I,1J, 1K).
OPMERKING: Het experiment kan op dit punt worden onderbroken en monsters kunnen bij kamertemperatuur worden opgeslagen in luchtdichte containers voor langdurige opslag.
2. Wasmonsters met water, PSB en methanol
- Meet en noteer het gewicht van alle lege 2 ml microfuge buizen die worden gebruikt voor de schatting van de lignine-inhoud in het labnotitieboekje.
- Breng 20 mg van het gemalen monsterpoeder over op de voorgewogen buis. Weeg de buis met weefsel en weefselpoeder en noteer deze gewichten in het labnotitieboekje.
- Incubeer alle 2 ml microfuge tubes (met open deksels) met 20 mg tissuepoeder in een hitteblok of oven bij 60 °C gedurende 1 uur.
- Koel na incubatie de monsters gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT).
- Voeg 1,8 ml water toe aan elke microfugebuis en meng door vortexen. Centrifugeer vervolgens bij 25.200 x g (15.000 tpm) gedurende 10 minuten bij RT en gooi het supernatant weg (figuur 2).
- Voeg 1,8 ml eiwitslubilisatiebuffer (PSB) (tabel 1) toe aan elke vastgehouden pellet en meng door vortexen. Centrifugeer bij RT 25.200 x g (15.000 tpm) en gooi het supernatant weg.
- Herhaal stap 2.6 nogmaals voor elk monster.
- Voeg 1,8 ml water toe aan elke pellet, meng door vortexen en centrifugeer bij 25.200 x g (15.000 tpm) gedurende 10 minuten. Bewaar na het centrifugeren de pellet en gooi het supernatant weg.
- Voeg aan de vastgehouden pellet 1,8 ml methanol toe en incubeer gedurende 20 minuten in een hitteblok van 60 °C. Centrifugeer vervolgens bij RT 25.200 x g (15.000 tpm) gedurende 10 minuten. Gooi na centrifugeren het supernatant weg en houd de pellet vast (figuur 2).
- Herhaal stap 2.9 nogmaals voor elk monster.
- Droog de pellet aan de lucht bij RT of ga onmiddellijk verder met vacuümdrogen. Vacuüm drogen met vacuümdroger bij 30 °C gedurende 2 tot 3 uur of totdat de pellet volledig droog is.
OPMERKING: Het experiment kan op dit punt worden onderbroken door 's nachts aan de lucht te drogen of door vacuümdrogen. - Weeg na het drogen monsterbuizen met de gedroogde pellet en noteer het gewicht naast het respectievelijke lege buisgewicht in het laboratoriumnotitieboekje. Schat het pelletgewicht door de twee waarden af te trekken. Deze gewichten zullen worden gebruikt voor lignine schatting aan het einde van lignine extractieproces.
- Op dit punt van lignine extractie, omvatten de commerciële bamboe lignine voor de generatie van de lignine standaard curve. Meet commerciële bamboe lignine in afzonderlijke buizen variërend van 0,5 mg tot 5 mg in stappen van 0,5 mg (0,5 mg, 1 mg, 1,5 mg, 2 mg, 3 mg, 3,5 mg, 4 mg, 4,5 mg en 5,0 mg). Meet elke concentratie drie keer voor drie technische replica's.
OPMERKING: Vanaf nu zijn de normen die in de bovenstaande stap zijn gemeten, op dezelfde manier verwerkt als monsters die zijn gedroogd.
3. Behandeling van pellet met TGA en zuur om lignine neer te doen
- Proef verwerkte monsters uit de bovenstaande stap, samen met gemeten normen, voor TGA -behandeling (thioglycolzuur).
- Voeg 1 ml 3 N HCl(tabel 1)en 100 μL TGA toe aan elke pellet.
- Vortex en incubeer gedurende 3 uur in een voorverwarmd warmteblok van 80 °C in een zuurkast (figuur 2).
OPMERKING: De verwarmingsstap bij 80 °C moet worden bewaakt. Hogedrukopbouw kan de deksels openen en kan leiden tot chemische morsen. Schroefdopbuizen worden aanbevolen, maar 2 ml buizen kunnen tijdens deze stap losjes worden afgedekt als alternatief om dergelijke morsen te voorkomen. - Koel na incubatie gedurende 10-15 minuten koele buizen bij RT en centrifugeer bij 25.200 x g (15.000 tpm) gedurende 10 minuten bij RT.
OPMERKING: Afval afkomstig van zure en organische oplosmiddelen moet worden gescheiden en opgeslagen in glazen containers met geventileerde doppen. Gebruik aparte glazen containers voor de inzameling van TGA-zuurafval en zuurafval. - Gooi na het centrifugeren het supernatant weg en houd de pellet vast. Voeg 1 ml water toe, meng door vortexen en centrifugeer bij 25.200 x g (15.000 tpm) gedurende 10 minuten bij RT.
- Gooi na het centrifugeren het supernatant weg en meng de pellet gedurende 24 uur in 1 N NaOH bij een shaker/thermische mixer van 37 °C bij lage snelheid (figuur 2).
OPMERKING: Deze incubatietijd kan worden teruggebracht tot 1 uur7. - Centrifugeer na incubatie de 2 ml microfuge buizen bij 25.200 x g (15.000 tpm) gedurende 10 minuten bij RT. Bewaar het supernatant voor de volgende stap.
OPMERKING: De procedure omvat het gebruik van sterke zuren en andere chemicaliën die corrosief van aard zijn. Daarom wordt het dragen van de juiste PBM aanbevolen tijdens het hele proces van lignineschatting. TGA heeft een sterke onaangename geur en is corrosief van aard. Daarom wordt aanbevolen om alleen in de zuurkast te gebruiken.
4. Neerslag van lignine
- Breng het supernatant over in een verse microfugebuis van 2 ml en voeg 200 μL geconcentreerd hcl. incubeer gedurende 4 uur of 's nachts bij 4 °C (figuur 2).
OPMERKING: Het extractieproces kan op dit punt worden onderbroken door de koelstap uit te breiden tot 's nachts. - Centrifugeer bij 25.200 x g (15.000 tpm) gedurende 10 minuten bij RT en los de pellet op in 1 ml 1 N NaOH.
- Incubeer in de shaker bij RT gedurende 10 minuten om de pellet volledig op te schorten in NaOH.
- Meet ten slotte de absorptie van monsters bij 280 nm met behulp van een spectrofotometer en vergelijk met de standaard ligninecurve.
- Meet de onbekende concentratie lignine met behulp van de regressielijnwaarden van de kalibratiecurve en de absorpties van geëxtraheerde monsters bij 280 nm.
5. Standaardcurvevoorbereiding en lignineschatting in het monster
- Verwerk ligninenormen op dezelfde manier als experimentele monsters van TGA-behandeling.
- Meet commerciële bamboe lignine normen in stappen van 0,5 mg vanaf 0,5 mg, 1 mg, 1,5 mg, 2 mg, 2,5 mg, 3,0 mg, 3,5 mg, 4,0 mg, 4,5 mg en 5 mg. Vervolgens, proces door TGA, HCl, oplossen in 1 N NaOH gevolgd door het meten van absorptie bij 280 nm (Figuur 3A).
- Gebruik waarden van lignineconcentratie en absorptiewaarden om een verspreide plot van de standaard ligninecurve te genereren (Figuur 3B).
- Gebruik de regressielijn, y = mx+c gegenereerd in het verspreide perceel, voor de schatting van het onbekende ligninegehalte van bereide monsters met behulp van "x"-waarden uit gemiddelde absorpties van geëxtraheerde monsters bij 280 nm en "m" en "c" waarden van lignine standaard curve regressielijn.
- Verdeel het ligninegehalte in de resulterende y-waarde naar totaalgewicht van het vacuüm/luchtgedroogde biomassamonster van de installatie na methanolextractie in mg (ongeveer 15 mg) om de lignineconcentratie per mg te verkrijgen. Vermenigvuldig deze waarde vervolgens met 100 om het ligninepercentage per mg te berekenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Twee verschillende katoenen experimentele lijnen werden vergeleken voor verschillen in hun ligninegehalte in verschillende weefsels. Het geëxtraheerde ligninegehalte van elk monster werd gemeten op 280 nm en registreerde de respectieve absorptiewaarden. De gemiddelde absorptiewaarden van elk biologisch repliceren werden vergeleken met de regressielijn van de ligninestandaardcurve (Tabel 2, figuur 3C). De regressielijn, y = mx + c, wordt gebruikt om het onbekende ligninegehalte van de geëxtraheerde experimentele lijnen, monster 1 en monster 2, te berekenen. De resultaten van de gemiddelde OD-waarden werden vervangen door "x" terwijl de waarden "m" en "c" werden aangesloten op de regressielijn van de ligninestandaardcurve om lignineconcentratie "y" in mg te verkrijgen (tabel 3, figuur 3B). In de volgende stap, om per 1 mg ligninegehalte te berekenen, deelt u de "y"-waarde door het gewicht van het monster (15 mg) na methanolextractie. In de volgende stap werd de y/15-waarde vermenigvuldigd met 1.000 om per gram (= 1.000 mg) te berekenen. Om % lignine te krijgen delen we de y/15 waarde door 1.000 en vermenigvuldigen we met 100. Het gemiddelde van lignine % voor drie biologische duplo's (van elke lijn, monster 1 en monster 2) werd vergeleken tussen de twee experimentele lijnen monster 1 (11,7%) en monster 2 (10,3%). De ligninewaarden waren consistent onder biologische replica's die suggereren dat de TGA-methode een betrouwbare methode is en zeer specifiek om het ligninegehalte te meten. Er werden ook vergelijkingsstudies gemaakt tussen verschillende weefseltypen (wortel, stengel en bladeren) van twee experimentele katoenlijnen, en beide lijnen vertoonden een relatief lager ligninegehalte in bladeren (3,4%) vergeleken met stengels (9,4% tot 9,9%) en wortels (9,4% tot 9,2%) (Tabel 4, figuur 4).
Figuur 1: Bereiding van het monster van plantaardige biomassa. (A) Verzameld katoenen plantenmateriaal van green house. (B) Draai de potten voorzichtig om om de wortels te scheiden. (C) Grondig gewassen in water om al het vuil te verwijderen. (D) Gescheiden wortel-, stengel- en bladweefsels. (E) Luchtgedroogd weefsel gedurende 2 dagen na het scheiden van het weefsel. (F) Luchtgedroogd weefsel wordt gedurende 10 dagen bij 49 °C overgebracht naar de incubator. (G) Biomassamolen werd gebruikt om biomassamonsters van planten te malen. (H) Biomassamonsters van wortel, stengel en blad. (I) Gemalen monsters worden in de maalflacons geladen, in de vriesmolenkamer geplaatst, geaard in de vriesmolen met een snelheid van 10 CPS gedurende 3 cycli. (J) Gemalen flacons met fijngemalen weefselpoeder na het malen in de diepvriesmolen. (K) Fijngemalen weefselpoeder van wortel, stengel en blad na gebruik van diepvriesmolen voor het malen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Kritieke stappen bij TGA-gemedieerde lignine-extractie. Stroomschema van kritieke stappen in verband met ligninewinning uit plantaardige biomassa naar schatting van het ligninegehalte met behulp van de TGA-methode: 1. Bereiding van plantenmonsters door voldoende drogen en malen tot fijn poeder met behulp van vriesmolen; 2. 20 mg weefselpoeder werd blootgesteld aan PSB, methanol en waterwassingen, gedroogd en geëxtraheerd alcoholonoplosbaar materiaal; 3. Met behulp van TGA en zuur werd lignine neergeslagen; 4. Bereiding van lignine standaard curve met behulp van commerciële bamboe lignine; 5. Schatting van het ligninegehalte. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Standaardcurvevoorbereiding en lignineschatting in het monster. (A) Tabel met verschillende concentraties commerciële bamboe lignine die worden gebruikt voor het genereren van lignine standaardcurve uit absorptiewaarden bij 280 nm. (B) Verspreide plot gegenereerd met Excel-programma met behulp van de waarden uit tabel A. (C) Staafgrafieken die de geschatte lignine-inhoud van het wortelweefsel van monster 1 en monster 2 vertegenwoordigen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| oplossing | Benodigde voorraden | voorbereiding | ||
| Eiwit oplosbaarheidsbuffer (PSB) | 1 M Tris HCl pH 8,8 en 0,5 M EDTA pH 8,0 | Voeg 5 ml 100 ml werkoplossing van PSB met een eindconcentratie van 50 mM Tris, 0,5 mM EDTA en 10 % SDS toe en voeg 5 ml 1 M Tris, 1 ml EDTA en 10 g SDS toe aan steriel water van 80 ml, meng, los op en maak het uiteindelijke volume op tot 100 ml steriel water. Autoclaaf bij 121 °C, 15 psi druk, gedurende 30 min. | ||
| 1 M Tris HCl | Om 100 ml 1 M Tris te bereiden, voegt u 12,1 g Tris HCl (moleculair gewicht = 121,14 g) toe in 80 ml water. Meng Tris HCl door te roeren op een magneetroerder, stel de pH met NaOH in op 8,8 en maak het volume op tot 100 ml met steriel water en autoclaaf bij 121 °C, 15 psi druk, gedurende 30 minuten. | |||
| 0,5 M EDTA (Ethyleendiamine tetraaceticacid) | Voeg 18,6 g EDTA toe in 70 ml water om 100 ml EDTA te bereiden. Stel de pH in op 8,0 (EDTA lost volledig op bij pH 8,0) met natriumhydroxidekorrels en vul het volume aan tot 100 ml. Autoclaaf de oplossing bij 121 °C, 15 psi druk, gedurende 30 min. | |||
| 3 N Zoutzuur (HCL) | Voeg 26 ml geconcentreerd HCL toe aan 74 ml steriel water om 100 ml 3 N HCl te bereiden. | |||
| 4 % Natriumhydroxide (NaOH) | Bereid 1 N natriumhydroxideoplossing, voeg 4 g natriumhydroxide toe in 90 ml steriel water, los op, maak het volume op tot 100 ml en autoclaaf bij 121 °C, druk van 15 psi, gedurende 30 minuten. | |||
Tabel 1: Voorbereiding van oplossingen die in het protocol worden gebruikt. Tabel met de voorbereiding van verschillende oplossingen die in het protocol worden gebruikt.
Tabel 2: Lignine standaardcurve bereid van 0,5 mg tot 3,5 mg industriële bamboe lignine. Verspreide grafiek met regressielijn met m- en c-waarden. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 3: Ligninesjabloon die wordt gebruikt voor de berekening van het onbekende ligninegehalte met behulp van absorptiewaarden van monsters bij 280 nm (als x) en standaardcurveregressielijn 'm' en 'c'-waarden van de standaardcurve. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 4: Ligninegehalte uit verschillende weefsels (wortel, stengel en bladeren) van katoenplant in de postbloeifase. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lignine speelt een belangrijke rol in de groei en ontwikkeling van planten en is onlangs uitgebreid bestudeerd voor biobrandstof, bio-energie en bioproducttoepassingen. Lignine is rijk aan aromatische verbindingen die worden opgeslagen in alle secundaire celwanden van vasculaire planten. Het heeft verscheidene industriële toepassingen zoals houten paneelproducten, biodispersies, flocculanten, polyurethaanschuimen en in harsen van kringsraad29,30,31. Het grootste deel van de lignine gegenereerd uit papier- en pulpindustrie komt vrij als afval of verbrand voor warmteproductie. Bij efficiënte verwerking kan lignine dus worden gebruikt als alternatief voor zowel op fossiele brandstoffen gebaseerde producten32,33 als bio-elektrische productie34. Daarom zijn een nauwkeurige schatting van het ligninegehalte en de samenstelling van cruciaal belang voor industriële toepassingen, aangezien de samenstelling varieert op basis van de plantensoort en het type plantenorgaan. De belangrijkste beperking voor lignineschatting is het verschil dat voortvloeit uit de methode die is gekozen voor de schatting van het ligninegehalte35. De schattingsverschillen tussen de verschillende methoden zijn voornamelijk te wijten aan de verontreiniging met andere niet-ligninecomponenten, variatie in de oplosbaarheid, toevoeging van nieuwe groepen aan lignine, xylandegradatie/verontreiniging, inheemse structurele veranderingen en verlies van sommige ligninefracties tijdens de eliminatie van andere componenten. Verder zijn de meeste lignineprotocollen oorspronkelijk ontwikkeld op basis van houtchemie27. Daarom is het van cruciaal belang lignineprotocollen vast te stellen voor kruidachtige monsters, aangezien meer gewas-/plantensoorten gericht zijn op biobrandstoffen en bioproducten. De TGA-methode schat het gehalte aan zuivere lignine op basis van specifieke binding met TGA. Daarom levert de lignineraming door TGA een lager ligninegehalte op in vergelijking met Klason - en acetylbromidemethoden35,36. Dit komt door de specifieke binding van lignine met TGA en het verlies van een ligninegehalte tijdens lignineprecipitatie (onoplosbaar deel).
Het ligninegehalte dat met behulp van de TGA-methode wordt geschat, is reproduceerbaar en consistent. De resultaten van deze studie waren consistent tussen de biologische duplo's en toonden een significant verschil tussen twee lijnen, wat wijst op de betrouwbaarheid van de TGA-methode voor lignineschatting. Voor de reproduceerbaarheid van de gegevens en een nauwkeurige schatting van het ligninegehalte is het belangrijk om de stappen te volgen en de volgende voorzorgsmaatregelen te nemen. Opname van positieve controles in verschillende concentraties, variërend van 0,5 mg tot 5 mg in drie duplo's, en het verwerken ervan samen met monsters uit de TGA-stap zal experimentele fouten voorkomen en resulteert in een nauwkeurige schatting van het ligninegehalte. De standaardcurve moet worden gegenereerd voor elke set monsters en regressielijnstatistiek R2 moet tussen 97% en 99% vallen. Het exacte gewicht van de lege buis en gedroogd methanol geëxtraheerd weefsel is van cruciaal belang voor een exacte schatting van het ligninegehalte. Bovendien zullen verschillende factoren zoals het specifieke stadium van planten, groeiomstandigheden, genotypen, type weefsel en de leeftijd van de plant het ligninegehalte30,37,38beïnvloeden . Daarom is het belangrijk om alle experimentele lijnen in dezelfde omgeving te laten groeien en tegelijkertijd hetzelfde type weefsels te oogsten. De resultaten van de huidige studie toonden een verwachte trend van een lager ligninegehalte in de bladeren, een hoger ligninegehalte in stengels en wortels, en toonden de toepasbaarheid van deze methode op verschillende plantenweefsels aan. Verder suggereerde minder variatie tussen biologische duplo's dat TGA reproduceerbare ligninegehalte in alle plantenweefsels kan schatten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen belangenverstrengeling hebben.
Acknowledgments
We danken het Department of Plant &Soil Science en Cotton Inc. voor hun gedeeltelijke steun aan deze studie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioSpectrophotometer kinetic | Eppendorf kinetic | 6136000010 | For measuring absorbance at 280 nm |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | For centrifuging samples |
| Commercial bamboo lignin | Aldrich | 1002171289 | Used in the preparation of the standard curve |
| Distilled water | Fischer Scientific | 16690382 | Used in the protocol |
| Falcon tubes | VWR | 734-0448 | Containers for solutions |
| Freezer mill | Spex Sample Prep | 68-701-15 | For fine grinding of plant tissue samples |
| Heat block/ Thermal mixer | Eppendorf | 13527550 | For temperature controlled steps during lignin extraction |
| Hotplate stirrer | Walter | WP1007-HS | Used for preparation of solutions |
| Hydrochloric acid (HCL) | Sigma | 221677 | Used in the protocol |
| Incubator | Fisherbrand | 150152633 | For thorough drying of plant tissue samples |
| Measuring scale | Mettler toledo | 30243386 | For measuring plant tissue weight, standards and microfuge tubes |
| Methanol (100 %) | Fischer Scientific | 67-56-1 | Used in the protocol |
| Microfuge tubes (2 mL) | Microcentrifuge | Z628034-500EA | Containers for extraction of lignin |
| Plant biomass gerinder | Hanchen | Amazon | Used for crushing dried samples |
| pH meter | Fisher Scientific | AE150 | Measuring pH for solutions prepared for lignin extraction |
| Temperature controlled incubator/oven | Fisher Scientific | 15-015-2633 | Used in the protocol |
| Thioglycolic acid (TGA) | Sigma Aldrich | 68-11-1 | Used in the protocol |
| Vacuum dryer | Eppendorf | 22820001 | Used for drying samples |
| Vortex mixer | Eppendorf | 3340001 | For proper mixing of samples |
References
- Freudenberg, K., Neish, A. C. Constitutionand Biosynthesis of Lignin. , Springer-Verlag Inc. New York, NY. 129 (1968).
- Chio, C., Sain, M., Qin, W. Lignin utilization: A review of lignin depolymerization from various aspects. Renewable and Sustainable Energy Reviews. 107, 232-249 (2019).
- Sun, Z., Fridrich, B., de Santi, A., Elangovan, S., Barta, K. Bright Side of Lignin Depolymerization: Toward New Platform Chemicals. Chemical Reviews. 118, 614-678 (2018).
- Xu, F. Cereal Straw as a Resource for Sustainable Biomaterials and Biofuels. Sun, R. C. , Elsevier. 9-47 (2010).
- Liu, Q., Luo, L., Zheng, L. Lignins: Biosynthesis and Biological Functions in Plants. International Journal of Molecular Sciences. 19, 335 (2018).
- Ithal, N., et al. Developmental transcript profiling of cyst nematode feeding cells in soybean roots. Molecular Plant-Microbe Interactions. 20, 510-525 (2007).
- Moura, J. C. M. S., et al. Abiotic and Biotic Stresses and Changes in the Lignin Content and Composition in Plants. Journal of Integrative Plant Biology. 52, 360-376 (2010).
- Vanholme, R., Morreel, K., Ralph, J., Boerjan, W. Lignin engineering. Current Opinion In Plant Biology. 11, 278-285 (2008).
- Lupoi, J. S., Singh, S., Parthasarathi, R., Simmons, B. A., Henry, R. J. Recent innovations in analytical methods for the qualitative and quantitative assessment of lignin. Renewable and Sustainable Energy Reviews. 49, 871-906 (2015).
- Mendu, V., et al. Identification and thermochemical analysis of high-lignin feedstocks for biofuel and biochemical production. Biotechnology for Biofuels. 4, 43 (2011).
- Shrotri, A., Kobayashi, H., Fukuoka, A. Advances in Catalysis. Song, C. 60, Academic Press. 59-123 (2017).
- Brunow, G. Biorefineries-Industrial Processes and Products: Status Quo and Future Directions. 2, 151-163 (2008).
- Constant, S., et al. New insights into the structure and composition of technical lignins: a comparative characterisation study. Green Chemistry. , (2016).
- Shimada, N., Tsuyama, T., Kamei, I. Rapid Determination of Thioglycolic Acid Lignin for Various Biomass Samples. Mokuzai Gakkaishi. 65, 25-32 (2019).
- Li, X., Weng, J. K., Chapple, C. Improvement of biomass through lignin modification. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 54, 569-581 (2008).
- Ponnusamy, V. K., et al. A review on lignin structure, pretreatments, fermentation reactions and biorefinery potential. Bioresource Technology. 271, 462-472 (2019).
- Hatfield, R., Fukushima, R. S. Can Lignin Be Accurately Measured. Crop Science. 45, 832-839 (2005).
- Bolker, H., Somerville, N. Ultraviolet spectroscopicstudies of lignin in solid state. I. Isolated lignin preparations. Tappi Journal. 72, 826-829 (1962).
- Fergus, B. J., Goring, D. A. I. The distribution of lignin in birchwood as determined by ultraviolet microscopy. Holzforschung. 24, 118-124 (1970).
- Schultz, T. P., Templeton, M. C., McGinnis, G. D. Rapid determination of lignocellulose by diffuse reflectance Fourier transform infrared spectrometry. Analytical Chemistry. 57, 2867-2869 (1985).
- Dence, C. W. The Determination of Lignin. Methods in Lignin Chemistry. Lin, S. Y., Dence, C. W. , (1992).
- Adler, E. Lignin chemistry-past, present and future. Wood Science and Technology. 11, 169-218 (1977).
- Brinkmann, K., Blaschke, L., Polle, A. Comparison of different methods for lignin determination as a basis for calibration of near-infrared reflectance spectroscopy and implications of lignoproteins. Journal of Chemical Ecology. 28, 2483-2501 (2002).
- Pandey, M. P., Kim, C. S. Lignin Depolymerization and Conversion: A Review of Thermochemical Methods. Chemical Engineering & Technology. 34, 29-41 (2011).
- Moreira-Vilar, F. C., et al. The acetyl bromide method is faster, simpler and presents best recovery of lignin in different herbaceous tissues than Klason and thioglycolic acid methods. PLoS One. 9, 110000 (2014).
- Hatfield, R. D., Grabber, J., Ralph, J., Brei, K. Using the Acetyl Bromide Assay To Determine Lignin Concentrations in Herbaceous Plants: Some Cautionary Notes. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 47, 628-632 (1999).
- Suzuki, S., et al. High-throughput determination of thioglycolic acid lignin from rice. Plant Biotechnology. 26, 337-340 (2009).
- Nakatsubo, F., Tanahashi, M., Higuchi, T. Acidolysis of Bamboo Lignin II : Isolation and Identification of Acidolysis Products. Wood research. 53, 9-18 (1972).
- Aro, T., Fatehi, P. Production and Application of Lignosulfonates and Sulfonated Lignin. ChemSusChem. 10, 1861-1877 (2017).
- Frei, M. Lignin: Characterization of a Multifaceted Crop Component. The Scientific World Journal. 2013, 436517 (2013).
- Lora, J. H., Glasser, W. G. Recent Industrial Applications of Lignin: A Sustainable Alternative to Nonrenewable Materials. Journal of Polymers and the Environment. 10, 39-48 (2002).
- Wang, R., Zhou, B., Wang, Z. Study on the Preparation and Application of Lignin-Derived Polycarboxylic Acids. Journal of Chemistry. 2019, 5493745 (2019).
- Welker, C. M., et al. Engineering Plant Biomass Lignin Content and Composition for Biofuels and Bioproducts. Energies. 8, 7654-7676 (2015).
- Mendu, V., et al. Global bioenergy potential from high-lignin agricultural residue. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 4014-4019 (2012).
- Brinkmann, K., Blaschke, L., Polle, A. Comparison of Different Methods for Lignin Determination as a Basis for Calibration of Near-Infrared Reflectance Spectroscopy and Implications of Lignoproteins. Journal of Chemical Ecology. 28, 2483-2501 (2002).
- Moreira-Vilar, F. C., et al. The Acetyl Bromide Method Is Faster, Simpler and Presents Best Recovery of Lignin in Different Herbaceous Tissues than Klason and Thioglycolic Acid Methods. PLoS One. 9, 110000 (2014).
- Iwaasa, A. D., Beauchemin, K. A., Acharya, S. N., Buchanan-Smith, J. G. Effect of stage of maturity and growth cycle on shearing force and cell wall chemical constituents of alfalfa stems. Canadian Journal of Animal Science. 76, 321-328 (1996).
- Arai-Sanoh, Y., et al. Genotypic Variations in Non-Structural Carbohydrate and Cell-Wall Components of the Stem in Rice, Sorghum, and Sugar Vane. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. , 1105072478 (2011).
