Summary
Bu yöntem, nanomole miktarlarda reaktif kullanarak radyofarmasötiklerin hızlı ve ekonomik optimizasyonu için damlacık kimyasal reaksiyonlarına dayanan yeni bir yüksek verimli metodolojinin kullanımını açıklar.
Abstract
Mevcut otomatik radyosynthesizer'lar, büyük klinik radyofarmasötik partiler üretmek için tasarlanmıştır. Reaksiyon optimizasyonu veya yeni radyofarmasötik gelişim için uygun değildirler, çünkü her veri noktası önemli reaktif tüketimi içerir ve cihazın kirlenmesi bir sonraki kullanımdan önce radyoaktif çürüme için zaman gerektirir. Bu sınırlamaları gidermek için, her biri desenli politetrafloroetilen kaplı silikon "çip" üzerinde bir yüzey gerilim tuzağı içinde sınırlı olan paralel olarak minyatür damlacık bazlı reaksiyon dizileri gerçekleştirmek için bir platform geliştirilmiştir. Bu çipler reaktif konsantrasyonları, reaksiyon çözücü, reaksiyon sıcaklığı ve zaman dahil olmak üzere reaksiyon parametrelerinin hızlı ve rahat bir şekilde çalışmasını sağlar. Bu platform, geleneksel bir radyosithesizer kullanarak aylar almak yerine, minimum reaktif tüketimi ile birkaç gün içinde yüzlerce reaksiyonun tamamlanmasına izin eder.
Introduction
Pozitron emisyon tomografisi (PET) radyofarmasötikler, spesifik in vivo biyokimyasal süreçleri izlemek ve hastalıkları incelemek ve yeni ilaçlar ve tedavilerin geliştirilmesi için araştırma araçları olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Ayrıca, PET hastalığı teşhis etmek veya evrelemek ve hastanın tedaviye yanıtını izlemek için kritik bir araçtır1,2,3. PET radyoizotopların kısa yarı ömrü (örneğin, flor-18 etiketli radyofarmasötikler için 110 dk) ve radyasyon tehlikesi nedeniyle, bu bileşikler radyasyon kalkanının arkasında çalışan özel otomatik sistemler kullanılarak hazırlanır ve kullanımdan hemen önce hazırlanmalıdır.
Radyofarmasötikleri sentezlemek için kullanılan akım sistemleri, üretim maliyetini paylaşmak için birçok bireysel doza bölünmüş büyük partiler üretmek için tasarlanmıştır. Mevcut sistemler [18F]FDG gibi yaygın olarak kullanılan radyotracerlerin üretimi için uygun olsa da (çünkü birden fazla hasta taraması ve araştırma deneyi tek bir günde planlanabilir), bu sistemler erken aşama geliştirme sırasında yeni radyotracerlerin veya daha az yaygın olarak kullanılan radyotracerlerin üretimi için israf edilebilir. Geleneksel sistemlerin kullandığı hacimler tipik olarak 1-5 mL aralığındadır ve reaksiyonlar 1-10 mg aralığında öncül miktarlar gerektirir. Ayrıca, geleneksel radyosynthesizer'ların kullanılması optimizasyon çalışmaları sırasında genellikle hantaldır, çünkü cihaz kullanımdan sonra kirlenir ve kullanıcı bir sonraki deneyi yapmadan önce radyoaktivitenin çürümesini beklemelidir. Ekipman maliyetinin yanı sıra, radyoizotop ve reaktiflerin maliyeti, bu nedenle, birden fazla parti üretimi gerektiren çalışmalar için çok önemli hale gelebilir. Bu, örneğin, ilk in vivo görüntüleme çalışmaları için yeterli verim ve güvenilirlik elde etmek için yeni radyotracers için sentez protokollerinin optimizasyonu sırasında ortaya çıkabilir.
Mikroakışkan teknolojiler, radyokimyada geleneksel sistemler 4,5,6'yagöre çeşitli avantajlardan yararlanmak için giderek daha fazla kullanılmaktadır. 1-10 μL reaksiyon hacimleri7,8,9'a dayananlar da dahil olmak üzere mikroakışkan platformlar, reaktif hacimlerinde ve pahalı öncüllerin tüketiminde ve kısa reaksiyon sürelerinde önemli bir azalma göstermiştir. Bu azalmalar daha düşük maliyetlere, daha hızlı ısıtma ve buharlaşma adımlarına, daha kısa ve daha basit aşağı akış saflaştırmasına, genel bir "daha yeşil" kimyaişlemine 10ve üretilen radyotracers11'indaha yüksek azı dişi aktivitesine yol açar. Bu iyileştirmeler, her sentezin reaktif maliyetini düşürerek daha kapsamlı optimizasyon çalışmaları yapmayı daha pratik hale getirir. Tek bir günde tek bir radyoizotoptan birden fazla deney yapılarak daha fazla fayda elde edilebilir. Örneğin, "keşif modunda" çalışan mikroakışkan akış kimyası radyosynthesizer'ları, her biri yalnızca 10s μL reaksiyon hacmi12kullanarak düzinelerce reaksiyon gerçekleştirebilir.
Bu avantajlardan esinlenerek, mikrovolum reaksiyonlarının bir dizi yüzey gerilim tuzağıyla sınırlı olduğu, desenli bir Teflon kaplama kullanılarak oluşturulan çok reaksiyonlu damlacık dizisi çipi geliştirildi. Bu yongalar, 1-20 μL ölçeğinde aynı anda gerçekleştirilecek birden fazla reaksiyona olanak tanır ve her biri birden fazla çoğaltmaya sahip günde 10'larca farklı reaksiyon koşulu keşfetme imkanını açar. Bu makalede, hızlı ve düşük maliyetli radyokimya optimizasyonları gerçekleştirmek için bu yeni yüksek verimli yaklaşımın faydası gösterilmiştir. Çok reaksiyonlu damlacık yongaları kullanmak, reaktif konsantrasyonlarının ve reaksiyon çözücüslerinin etkisinin kolayca araştırılmasını sağlar ve birden fazla çipin kullanılması, çok düşük miktarlarda öncü tüketirken reaksiyon sıcaklığının ve zamanının incelenmesini sağlayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
DİkKAT: Bu protokol radyoaktif maddelerin işlenmesini içerir. Gerekli eğitim ve kişisel koruyucu ekipman ve kuruluşunuzdaki radyasyon güvenliği ofisinden onay alınmadan deneyler yapılmamalıdır. Deneyler radyasyon kalkanının arkasında, tercihen havalandırılmış bir sıcak hücrede yapılmalıdır.
1. Çok reaksiyonlu çiplerin imalatı
NOT: Çok reaksiyonlu mikro damlacık çiplerinin partileri, daha önce decribed 10 (Şekil1) gibi standart fotolithografi teknikleri kullanılarak 4" silikon gofretlerden üretilir. Bu prosedür, her biri 4 x 4 reaksiyon sitesi dizisine sahip 7 çip üretecektir.
- Silikon gofreti spin-coater aynasına yerleştirin ve ortalanmasını sağlayın. Gofretin ortasına 30 s (500 rpm/s rampa) için 1000 rpm'de bir transfer pipeti ve palto gofreti ile 3 mL politetrafloroetilen çözeltisi biriktirin.
- Kaplamayı katılaştırmak için gofreti 160 °C'lik bir ocak üzerine 10 dakika yerleştirin ve ardından 10 dakika boyunca 245 °C'lik bir ocakta aktarın.
- Kaplamayı azot atmosferi altında 3,5 saat boyunca 340 °C'de yüksek sıcaklıktaki bir fırında tavlayın, ardından 10 °C/dk'lık bir rampada 70 °C'ye kadar soğutun.
- Silikon gofreti spin-coater aynasının üzerine yerleştirin ve ortalanmasını sağlayın. Bir transfer pipeti kullanarak gofretin ortasına 2 mL pozitif fotoresist dökün ve ardından 30 s (1000 rpm / s rampa) için 3000 rpm'de kaplama gerçekleştirin.
- 3 dakika boyunca 115 °C'lik bir ocakta gofret yumuşak bir fırın yaparak fotoresisti katılaştırın.
- Gofret ve fotokütleyi bir maske hizalayıcısına takın ve sert temas modunda 12 mW/cm2 lamba yoğunluğunda ve 356 nm dalga boyunda 14 s pozlama gerçekleştirin. Bu adım, negatif son politetrafloroetilen desenini içeren bir şeffaflık maskesi kullanır, yani, reaksiyon siteleri şeffaf ve diğer tüm bölgeler opak renkte, 16 reaksiyon çipinin 4 kopyasının 4" çaplı deseni.
- Gofreti, maruz kalan deseni geliştirmek için hafif ajitasyonla 3 dakika boyunca bir cam kapta 20 mL fotoresist geliştirici çözümü kullanarak batırın.
- Gofreti hafif ajitasyonla 3 dakika boyunca 20 mL DI su ile bir cam kaba batırarak gelişen çözeltiyi durulayın. Gofretleri azot tabancasıyla kurulayın.
- Maruz kalan politetrafloroetilen bölgelerini aşağıdaki koşullar altında oksijen plazması ile reaktif iyon gravür (RIE) yoluyla çıkarın: 30 s maruz kalma, 100 mTorr basıncı, 200 W güç ve 50 sccm oksijen akışı.
- Bir silikon gofret kesici kullanarak gofretleri tek tek talaşlara (gofret başına toplam 7 adet) zarlayın.
- Fotoresisti çıkarmak için her çipi aseton halinde 1 dakika batırın, ardından 1 dakika boyunca izopropanol. Son olarak, her çipi bir azot tabancasıyla kurulayın.
- Kuru talaşları bir cam kaba yerleştirin ve kullanıma kadar saklamak için alüminyum folyo ile örtün.
2. Optimizasyon çalışmasının planlanması
NOT: Bu protokolde, yüksek verimli optimizasyonu göstermek için örnek olarak radyofarmasötik [18F]fallypride sentezi kullanılır (Şekil 2). Tek bir çiple, örneğin çeşitli öncül konsantrasyonda (8 farklı konsantrasyon, n=2 her biri çoğalır) 16 eşzamanlı reaksiyon gerçekleştirilebilir. Koşullar Şekil 3A'dakireaksiyon sitelerine eşlenmiştir. Diğer reaksiyon parametrelerini (örneğin reaksiyon çözücü, reaksiyon hacmi, TBAHCO3miktarı vb.) veya diğer radyofarmasötikleri optimize etmek için bu protokolde ayarlamalar yapılabilir.
- Çeşitlileştirilecek reaksiyon parametrelerini, kullanılacak belirli değerleri ve çoğaltma sayısını seçin.
- Denemeyi gerçekleştirmek için gereken yonga sayısını hesaplayın.
- Her çip için, reaktif hazırlamaya ve damlacık reaksiyonlarını gerçekleştirmeye yardımcı olmak için her reaksiyon yerinde hangi reaksiyon koşullarının kullanılacağının bir haritasını hazırlayın.
3. [18F] fallypride radyosentezini optimize etmek için reaktiflerin ve malzemelerin hazırlanması
NOT: [18F]fallypride(Şekil 2)damlacık bazlı radyosentez, reaksiyon bölgesine [18F]florür ve faz transfer katalizörü (TBAHCO3)eklenmesiyle başlar, ardından suyu buharlaştırmak ve kurutulmuş bir kalıntı bırakmak için ısıtma. Daha sonra, reaksiyon çözücüsüne (tosil-fallypride) bir öncü damlacık eklenir ve radyofluorinasyon reaksiyonunu gerçekleştirmek için ısıtılır. Son olarak, ham ürün analiz için çipten toplanır. Reaktif hazırlama ve sentez prosedürleri, farklı bir izleyicinin optimizasyonu gerçekleştiriliyorsa uyarlanmalıdır.
- Hacim karışımına göre 1:1'de tozil alkol ve asetonitrilden oluşan reaksiyon çözücünün bir stok çözeltisini hazırlayın. Hacmin planlanan seyreltme serisini oluşturmak için yeterli olduğundan emin olun. Bu örnek optimizasyonda ~ 30 μL yeterlidir.
- Reaksiyon çözücüsün içinde, araştırılacak maksimum konsantrasyona (77 mM) sahip 30 μL'lik bir öncül (tosil-fallypride) stok çözeltisi hazırlayın. Birimin planlanan denemeyi gerçekleştirmek için yeterli olduğundan emin olun. Bu örnek optimizasyonda ~ 30 μL yeterlidir.
- Öncü stok çözeltisinden ve reaksiyon çözücüden, öncü çözeltinin farklı konsantrasyonlarını hazırlamak için 2x seri seyreltmeler gerçekleştirin. Her seyreltmenin hacminin, her koşul için istenen sayıda çoğaltmayı gerçekleştirmek için yeterli olduğundan emin olun. Bu örnek optimizasyonda, her konsantrasyonun ~15 μL'si yeterlidir.
- Her bir ham reaksiyon ürününü toplamak için mikrosantrifüj tüpleri hazırlayın ve her tüpü benzersiz bir numarayla etiketlemek için kalıcı bir işaretleyici kullanarak. Toplam mikrosantrifüj tüpü sayısının, çoğaltma sayısıyla çarpılan koşul sayısıyla eşleştiğinden emin olun (8 x 2 = 16).
- 9:1 metanol:DI suyundan (v/v) oluşan bir toplama çözeltisi (10 mL) stoğu hazırlayın. 16 ek etiketli mikrosantrifüj tüpünün her birine Aliquot 50 μL (çipteki reaksiyon bölgesi başına bir tane).
- 75 mM TBAHCO3 çözeltisi (56 μL) ile [18F]florür/[18O]H2O (~260 MBq [7 mCi]) karıştırarak ve 140 μL'ye kadar DI suyu ile seyrelterek 500 μL mikrosantrifüj tüpünde [18F]florür stok çözeltisi hazırlayın. Bu çözeltinin 8 μL'si her reaksiyon bölgesine yüklenecektir (~15 MBq [0,40 mCi] aktivite ve 240 nmol TBAHCO3içerir).
4. Farklı öncül konsantrasyonlara sahip [18F] fallypride paralel sentezi
NOT: Çip, geri bildirim için dahili termokuple sinyali kullanılarak bir açık-kapalı sıcaklık kontrolörü kullanılarak kontrol edilen 25 mm x 25 mm seramik ısıtıcıdan oluşan bir ısıtma platformunun (daha önce açıklandığı gibi13adet) üzerinde çalıştırılır. Isıtıcı yüzey sıcaklıkları termal görüntüleme kullanılarak kalibre edildi. Böyle bir platform mevcut değilse, bir çift sıcak plaka kullanılabilir (biri 105 °C'de ve biri 110 °C'de).
- Yük [18F] florür stok çözeltisi (faz transfer katalizörü ile).
- Bir mikropipette kullanarak, çok reaksiyonlu bir çipin ilk reaksiyon noktasına 8 μL'lik bir damlacık [18F] florür stok çözeltisi yükleyin. Çipi bir doz kalibratöre yerleştirerek aktivitesini ölçün ve ölçümün yapıldığı zamanı kaydedin.
- Çipi doz kalibratörden çıkarın ve ardından ikinci reaksiyon noktasına 8 μL'lik bir damlacık [18F] florür stok çözeltisi yükleyin. Talaş üzerindeki aktiviteyi bir kez daha doz kalibratöre yerleştirerek ölçün ve ölçümün yapıldığı zamanı kaydedin.
- Çipteki diğer tüm reaksiyon siteleri için tekrarlayın.
- Radyoizotopu yükledikten sonra aktivite ölçümünü alarak ve bu bölge yüklenmeden önce önceki ölçümü (çürüme düzeltilmiş) çıkararak reaksiyon noktası başına yüklenen aktiviteyi hesaplayın.
- Çok reaksiyonlu çipi ısıtıcıya hizalayın.
- Seramik ısıtıcının üzerine ince bir termal macun tabakası ekleyin.
- Damlacıkların dökülmesini önlemek için cımbız kullanarak talaşın üzerine dikkatlice yerleştirin, çipin referans köşesini ısıtıcının referans köşesine hizalayın (Şekil 3B'degösterildiği gibi). Çip ısıtıcıyı az miktarda aşacak.
- [18F] florür ve faz transfer katalizörini kurutun.
- Damlacıkları kuruluğa buharlaştırarak [ 18 F] florür ve TBHACO 3 kurutucu bırakarak kontrol programında ısıtıcıyı105°C'ye ayarlayarak çipi1dakika ısıtın. 1 dakika sonra ısıtıcıyı kapatıp kontrol programı ile soğutma fanını açarak çipi soğutun.
- Öncül çözümü ekleyin.
- Bir mikropipette kullanarak, ilk reaksiyon yerindeki kurutulmuş kalıntının üzerine 6 μL fallypride öncüsü çözeltisi ekleyin.
- Çipteki diğer tüm reaksiyon siteleri için tekrarlayın. Her reaksiyon bölgesi için seyreltme serisinin hangi konsantrasyonunun kullanıldığını belirlemek için optimizasyon planını kullanın.
- Florasyon reaksiyonunu gerçekleştirin.
- Radyofluorinasyon reaksiyonunu gerçekleştirmek için kontrol programını kullanarak her çipi 7 dakika boyunca 110 °C'ye ısıtın. Daha sonra ısıtıcıyı kapatarak ve kontrol programı ile soğutma fanını açarak çipi soğutun.
- Tepki sitelerinden ham ürünleri toplayın.
- Mikropipette aracılığıyla belirlenen mikrosantrifüj tüpünden 10 μL toplama çözeltisi ekleyerek ilk reaksiyon yerinde ham ürünü toplayın. 5 s bekledikten sonra, seyreltilmiş ham ürünü aspire etmek ve ilgili etiketli toplama mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için mikropipette (aynı ucu takılı) kullanın.
- Tüm işlemler için aynı pipet ucunu kullanarak bu işlemi toplam 4 kez tekrarlayın.
- Çipteki diğer tüm reaksiyon siteleri için toplama işlemini tekrarlayın.
5. Reaksiyon performansını ve optimum koşulları belirlemek için sentez analizi
- Çipteki ilk reaksiyon için "toplama verimliliğini" belirleyin.
- Mikrosantrifüj tüpünü, aktiviteyi ölçmek için doz kalibratörüne ilk reaksiyon noktasının toplanan ham ürünüyle yerleştirin. Ölçümün ölçümünü ve zamanını kaydedin.
- Toplanan ham ürünün aktivitesini aynı reaksiyon sitesi için ölçülen başlangıç etkinliğine bölerek toplama verimliliğini hesaplayın (faaliyet değerlerini aynı zaman noktasına bozunma düzeltin).
- Çipteki diğer tüm reaksiyon siteleri için tekrarlayın.
- Toplanan her ham ürünün bileşimini (florasyon verimliliği) analiz edin.
NOT: Tüm numunelerin kısa sürede analizini pratik hale getirmek için florasyon verimliliği, daha önce tanımlanmış yüksek verimli radyo ince tabaka kromatografisi (radyo-TLC) yaklaşımı kullanılarak analiz edilir14. Bu teknik, sekiz numunenin paralel olarak işlenmesini sağlar, daha sonra tek bir TLC plaka üzerinde yan yana (nokta başına 5 mm pitch, 0,5 μL) tespit edilir, daha sonra birlikte gelişir ve Cerenkov görüntüleme14,15kullanılarak birlikte okuma yapılır. 16 paralel reaksiyonlu örnek optimizasyon için 2 TLC plakaya ihtiyaç vardır. Diğer bir seçenek de analiz için radyo- yüksek performanslı sıvı kromatografisi (radyo-HPLC) kullanmaktır, ancak ayırma, temizleme ve dengelenme süresi analiz edilebilen numune sayısını sınırlayabilir.- Her TLC plakası (50 mm x 60 mm), kalemle, bir 50 mm kenardan (altta) 15 mm uzakta ve aynı kenardan 50 mm uzaklıkta başka bir çizgi çizin. İlk satır orijin satırıdır; ikincisi solvent ön hattıdır. 8 "şeridin" her biri için örnek tespit pozisyonunu tanımlamak için 5 mm aralıkta menşe çizgisi boyunca 8 küçük "X" çizin.
- Bir mikropipette kullanarak, ilk ham ürünün 0,5 μL'lik kısmını ilk şerit için "X" deki TLC plakasına aktarın. Ek ham ürünler için tekrarlayın (TLC plakası başına 8'e kadar). TLC plakasında ham ürün lekelerin kurumasını bekleyin.
- Her TLC plakası için, solvent ön cephe çözücü ön çizgisine ulaşana kadar% 1 TEA (v / v) ile25 mM NH4HCO 2'de% 60 MeCN mobil faz kullanarak geliştirin. TLC plakasındaki çözücünün kurumasını bekleyin ve ardından cam mikroskop kaydırağı (76,2 mm x 50,8 mm, 1 mm kalınlığında) ile örtün.
- Plakayı 5 dakikalık pozlama için Cerenkov görüntüleme sistemine yerleştirerek her TLC plakasının radyoaktivite görüntüsünü elde edin. Standart görüntü düzeltmeleri gerçekleştirin (koyu akım çıkarma, düz alan düzeltme, ortanca filtreleme ve arka plan çıkarma).
- İlk TLC plakasının ilk şeridi için ilgi alanı (ROI) analizini kullanın. Şeritte görünen her bandın etrafına bölgeler çizin. Yazılım, tüm bölgelerin (bantların) toplam entegre yoğunluğuna kıyasla her bölgenin (bant) entegre yoğunluğunun kesirini hesaplar.
- Bu mobil fazda, belirtilen tutma faktörlerinde aşağıdaki bantlar beklenir: Rf = 0.0: Tepkilenmemiş [18F]florür; Rf = 0.9: [18F]fallypride; Rf = 0.94: Yan ürün. Florasyon verimliliğini [18F] fallypride bandındaki aktivitenin fraksiyonu olarak belirleyin.
- Tüm TLC plakalarındaki diğer tüm şeritler için bu analizi tekrarlayın.
NOT: Cerenkov görüntüleme odası yoksa, TLC plakalarını görüntülemek için küçük bir hayvan (preklinik) in vivo optik görüntüleme sistemi kullanılabilir. Alternatif olarak, 2 boyutlu bir TLC tarayıcı kullanılabilir. Alternatif olarak, yalnızca 1 boyutlu bir TLC tarayıcı mevcutsa, TLC plakaları makaslı şeritler halinde kesilerek (şerit başına 1) ve her şerit ayrı ayrı taranarak analiz edilebilir.
- Her reaksiyon bölgesi için ham radyokimyasal verimi (ham RPB) belirleyin.
- Toplama verimliliğini florasyon verimliliği ile çarparak ilk ham ürün için ham RCY'yi belirleyin.
- Diğer tüm reaksiyon siteleri için tekrarlayın.
- Sonuçları analiz etme
- Herhangi bir çoğaltma denemesi için toplam değerler ortalama ve standart sapma.
- Koleksiyon verimliliğini, florasyon verimliliğini ve ham RCY'yi çeşitli parametrenin bir işlevi olarak çizin (bu örnekte öncül konsantrasyon).
- İstediğiniz ölçüte göre en uygun koşulları seçin. Genellikle, bu maksimum ham RCY'dir. Ayrıca, nokta genellikle grafiğin eğiminin nispeten düz olduğu bir bölgede seçilir, parametredeki küçük değişikliklere duyarsız olduğunu gösterir ve daha sağlam bir protokol sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu yöntemi göstermek için temsili bir deney gerçekleştirildi. 16 reaksiyon kullanarak, radyofarmasötik [18F]fallypride optimizasyon çalışmaları, reaksiyon çözücü olarak preksil alkolde (77, 39, 19, 9.6, 4.8, 2.4, 1.2 ve 0.6 mM) değişen öncül konsantrasyon (77, 39, 19, 2.2 ve 0.6 mM) ile gerçekleştirildi. Reaksiyonlar 7 dakika boyunca 110 °C'de yapıldı. Toplama verimliliği, örnek kompozisyon (yani[18F]fallypride ürününün oranları, yayınlanmamış [18F]florür ve yan ürün) Tablo 1'de tablolanmıştır ve Şekil 4'tegrafiksel olarak özetlenmiştir.
Çalışma, florasyon verimliliğinin ([18F]fallypride oranı) artan öncül konsantrasyonla arttığını ve kalan tepkisiz [18F] florürün ters yönde değiştiğini göstermiştir (Şekil 4A). Düşük öncül konsantrasyonlarda az miktarda radyoaktif yan ürün vardı, ancak oran daha yüksek öncül konsantrasyonlarda sıfıra yakın bir düşüşe düştü (Şekil 4A). Toplama verimliliği çoğu koşul için neredeyse niceldi, ancak düşük öncül konsantrasyonlarda biraz düştü.
Bu sonuçlardan, en yüksek RPP ~ 230 nmol öncü ile elde edilebilir (yani, 6 μL damlacıkta 39 mM konsantrasyon). Bu durumda florasyon verimliliği %0,5 (n=2) ± 96,0 ve ham RPB 2,7 (n=2) ± 87,0 olarak gerçekleşti ve gözlenen radyoaktif yan ürün oluşumu gözlenmedi. 77 mM öncül kullanımı benzer sonuçlar gösterirken, genel olarak maliyeti azaltmak ve aşağı akış arıtma adımlarını basitleştirmek için daha düşük miktarda öncü kullanılması arzu edilir.
Şekil 1: Fotolithografi ile çok reaksiyonlu mikrodroplet çiplerinin imalatı. (A) 4 x 4 reaksiyon bölgesi dizisine sahip çok reaksiyonlu mikro damlacık çipinin fotoğrafı. Çip, hidrofilik reaksiyon bölgelerini oluşturmak için kazınmış dairesel politetrafloroetilen bölgelerine sahip politetrafloroetilen kaplı silikondan oluşur. (B) İmalat prosedürünün şeması. Silikon gofret Teflon çözeltisi ile spin kaplıdır ve kaplamayı katılaştırmak için pişirilir. Daha sonra, fotoresist bir etch maskesi üretmek için fotolithografi ile spin kaplı ve desenli. Fotoresist, fotoresist gelişen bir çözümle geliştirilmiştir. Maruz kalan Teflon daha sonra oksijen plazması ile kuru gravür ile çıkarılır. Gofret tek tek cipslere doğranmış ve fotoresist soyulmuş. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Paralel reaksiyonlar için prosedür. Çok reaksiyonlu bir çip üzerinde radyofarmasötik [ 18 F] fallypride'ın16paralel sentezini gerçekleştirmek için deneysel prosedür. Bu örnekte, öncül konsantrasyon her reaksiyon için çeşitlidir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Reaksiyon bölgelerindeki koşulların haritası. (A) Tek bir 16 reaksiyon çipi (üst görünüm) kullanarak tosil fallypride radyofluorinasyonu üzerinde öncü konsantrasyonun etkisini keşfetmek için deneysel tasarım. Her biri n=2 kopyaları olan sekiz farklı konsantrasyon araştırıldı. Diğer reaksiyon koşulları sabit tutuldu (sıcaklık: 110 °C; süre: 7 dk; çözücü: thexyl alcohol:MeCN; TBAHCOmiktarı 3: 240 nmol). Her reaksiyon ~14 MBq aktivite ile gerçekleştirildi. (B) Deney sırasında ısıtıcı platformuna monte edilmiş 16 reaksiyon çipinin fotoğrafı. Kırmızı çizgiler, ısıtıcının referans köşesiyle hizalama için kullanılan çipin referans köşesini temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Öncül konsantrasyonun [18F]fallypride mikro damlacık sentezi üzerindeki etkisi. (A) Toplanan ham reaksiyon ürününde bulunan radyoaktif türlerin oranı, yani [18F]fallypride, yan ürün veya tepkisiz [18F]florür. (B) Sentez performansı. Toplama verimliliği, florasyon verimliliği ve ham RCY öncül konsantrasyonun bir fonksiyonu olarak çizilir. Her iki grafikte de, veri noktaları n=2 çoğaltmalarının ortalamasını, hata çubukları ise standart sapmayı temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Öncü konser (mM) | Toplama verimliliği (%) | Florasyon verimliliği (%) | Ham RCY (%) | Tepkisiz [18F]florür (%) | Yan ürün (%) |
| 77 | 91,8 ± 2,1 | 96.7 ± 2.0 | 88.8 ± 3.9 | 3.3 ± 2.0 | 0,0 ± 0,0 |
| 39 | 90,6 ± 2,4 | 96.0 ± 0.5 | 87.0 ± 2.7 | 4.0 ± 0.5 | 0,0 ± 0,0 |
| 19 | 91.1 ± 0.5 | 81.1 ± 0.3 | 73.9 ± 0.7 | 8.4 ± 1.2 | 10,5 ± 2,0 |
| 9.6 | 90.9 ± 0.6 | 62.7 ± 0.9 | 57.0 ± 0.5 | 23.3 ± 2.1 | 14.0 ± 0.9 |
| 4.8 | 88.4 ± 0.8 | 37.0 ± 1.5 | 32.8 ± 1.6 | 47.3 ± 0.8 | 15.7 ± 1.0 |
| 2.4 | 87.6 ± 2.0 | 21.0 ± 2.1 | 18.4 ± 2.2 | 67,4 ± 2,1 | 11.6 ± 1.0 |
| 1.2 | 82.3 ± 1.6 | 12.7 ± 0.3 | 10.4 ± 0.1 | 72.8 ± 0.7 | 14.5 ± 1.0 |
| 0.6 | 81.2 ± 3.7 | 6.3 ± 0.8 | 5.1 ± 0.5 | 84.3 ± 0.2 | 9.4 ± 1.0 |
Tablo 1: Öncül konsantrasyon çalışmasından elde edilen veriler. Tüm değerler ortalamalardır ± n=2 çoğaltmalarından hesaplanan standart sapmalardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Günde sadece bir veya az sayıda reaksiyona izin veren ve veri noktası başına önemli miktarda reaktif tüketen geleneksel radyokimya sistemlerinin sınırlamaları nedeniyle, genel reaksiyon parametre alanının sadece küçük bir kısmı pratikte araştırılabilir ve çoğu zaman sonuçlar tekrarsız olarak bildirilir (n=1). Geleneksel sistemlerle karşılaştırıldığında, bu çok reaksiyonlu damlacık radyosentez platformu, çok az zaman ve öncül tüketirken radyosentez koşullarının daha kapsamlı ve titiz çalışmalarını gerçekleştirmeyi pratik hale getirir ve potansiyel olarak ürün verimini ve yan ürün oluşumunu etkileyen parametreler hakkında yeni içgörüler sağlar. Bilgiler, en yüksek ürün verimi veya en sağlam sentezle sonuçlanan koşulları seçmek için kullanılabilir. Düşük öncül tüketimi, özellikle yeni radyotracer'ların erken gelişiminde, sadece az miktarda öncül mevcut olduğunda veya öncü pahalı olduğunda yararlı olabilir. Çiplerin açık doğası pipet yoluyla hızlı sentez süresine ve erişim kolaylığına katkıda bulunurken, uçucu moleküllerin önemli kayıplarına yol açabilir ve uçucu öncülleri, ara maddeleri veya ürünleri olan radyofarmasötiklerin sentezini optimize ederken pratik olmayabilir.
Radyasyona maruz kalma tehlikesi nedeniyle, bu deneylerin sadece uygun eğitim ve onaylarla yapılması ve radyasyon kalkanının arkasında, tercihen havalandırılmış bir sıcak hücrede yapılması gerektiği yinelenmelidir. Radyoisotopların kısa yarı ömrü nedeniyle, deneylerin hızlı ve verimli bir şekilde yapılması önemlidir. Çipe reaktiflerin boruya alınması ve çipten ürün toplanması, sıcak bir hücredeki erişimin ve görünürlüğün azalmasına aşina olmak için radyoaktif olmayan koşullar altında uygulanmalıdır. Benzer şekilde, çipin takılması ve çıkarılması ve doz kalibratör ile çipin ölçümlerinin yapılması da uygulanmalıdır. Ek olarak, ayrıntılı bir deney haritası (yani çip üzerindeki her bir sahadaki özel reaksiyon koşulları) ile organize olmak önemlidir. Ölçümler yapılırken doldurulacak bir sonuç tablosunu önceden hazırlamak da yararlıdır. Tekrarlanabilirliği sağlamak için, özellikle insan hatası olasılığı ile, her koşul kümesinin birden fazla çoğaltması yapılmalıdır. Reaksiyon alanının dışına sıvı dökülmesini önlemek ve bitişik reaksiyon alanlarıyla çapraz kontaminasyona neden olmak için çipten ham numunelerin toplanması sırasında özellikle dikkatli olmak önemlidir. Herhangi bir hata fark edilirse, verilerin nihai analizden dışlanabilmesi için bu reaksiyon sitelerini işaretlemek önemlidir.
Bu örnek çalışmada, 16 veri noktası için tüketilen öncül miktarı 1,1 mg (~70 μg) iken, geleneksel bir radyosiynthesizer kullanılarak veri noktası başına 4 mg idi. Ayrıca, 16 reaksiyon da tek bir deneyde 25 dakikada tamamlandı. Buna karşılık, geleneksel bir radyosentezatörde ham [18F] fallypride sentezi reaksiyon başına ~ 15-20 dakika gerektirir16,17.
Bu temsili deney, 8 farklı öncül konsantrasyonu (her koşul için n=2 çoğalır) hızlı ve ekonomik bir şekilde keşfederek radyofarmasötik [ 18 F] fallypride radyosentezinin koşullarını optimize etmek için16reaksiyonlu çok reaksiyonlu bir mikro damlacık çipinin yararını göstermiştir. Çok reaksiyonlu bir çip kullanılarak uygun şekilde optimize edilebilen diğer değişkenler arasında radyoaktivite miktarı, faz transfer katalizörü türü, faz transfer katalizörü miktarı, buharlaşma/kurutma koşulları (örneğin, azeotropik kurutma adımlarının sayısı), reaksiyon çözücü vb. Birden fazla çoklu reaksiyon çipi kullanarak, buharlaşma/ kurutma sıcaklığı ve süresi gibi koşullara ek olarak reaksiyon sıcaklığının ve reaksiyon süresinin etkisini keşfetmek de mümkündür. Bu tür çalışmaların tek ısıtıcı kullanılarak ardışık olarak yapılması gerekir veya aynı anda birden fazla ısıtıcı çalıştırılarak paralel hale getirilebilir.
Alttaki damlacık sentez yönteminin çok çeşitli 18F etiketli radyofarmasötik ile uyumlu olduğu gösterilmiştir. [18F]fallypride10, [18F]FET18, [18F]FDOPA19, [18F]FBB20 gibi ve diğer 18F etiketli bileşik ve diğer izotoplarla etiketlenmiş bileşiklerin çoğunun optimizasyonu için kullanılabilir. Ayrıca, elde edilen optimize edilmiş damlacık bazlı reaksiyonlar, öncül tüketimin azalması, daha hızlı işlem süreleri ve kompakt enstrümantasyon da dahil olmak üzere mikrovolum radyokimyasının avantajlarından özünde yararlanır ve büyük partilerin rutin üretimi için aynı avantajları sunabilir. Daha büyük partiler, reaksiyonun başlangıcında başlangıçta yüklenen etkinlik miktarını ölçeklendirme gerektirir. In vitro veya in vivo tahlillerde kullanıma uygun bir izleyici hazırlamak için, ham ürün saflaştırılmalı (örneğin analitik ölçekli HPLC kullanılarak) ve formüle edilmelidir (örneğin buharlaştırıcı veya katı fazlı çözücü değişimi21aracılığıyla) Alternatif olarak, damlacık ölçeğinden geleneksel şişe bazlı bir radyosantezatöre en uygun koşulların uyarlandırılması mümkün olabilir. Bu olasılığın araştırılması devam etmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Kaliforniya Üniversitesi Vekilleri, Dr. van Dam tarafından icat edilen Sofie, Inc.'e teknoloji lisansı vermiş ve lisanslama işleminin bir parçası olarak Sofie, Inc.'de özkaynak almıştır. Dr. van Dam, Sofie, Inc.'in kurucusu ve danışmanıdır. Geri kalan yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder. Bu çalışma kısmen Ulusal Kanser Enstitüsü (R33 240201) tarafından desteklendi.
Acknowledgments
UCLA Biyomedikal Siklotron Tesisi'ne ve Dr. Roger Slavik ve Dr. Giuseppe Carlucci'ye bu çalışmalar için cömertçe[18F] florür sağladıkları için ve UCLA NanoLab'a çip üretimi için ekipman desteği için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3-dimethyl-2-butanol (thexyl alcohol) | Sigma-Aldrich | 594-60-5 | 98% |
| Acetone | KMG Chemicals | Cleanroom LP grade | |
| Ammonium formate (NH4HCO2) | Sigma-Aldrich | 540-69-2 | 97% |
| Anhydrous acetonitrile (MeCN) | Sigma-Aldrich | 75-05-8 | 99.80% |
| Ceramic heater | Watlow | Utramic CER-1-01-0093 | 25 mm x 25 mm |
| Cerenkov imaging chamber | Custom built | Other instruments can be used for TLC plate readout including: small animal in vivo optical imaging system, 2D radio-TLC scanner, 1D radio-TLC scanner | |
| DI water | Sigma-Aldrich | 7732-18-5 | |
| Disposable transfer pipets, 3 mL | Falcon | 13-680-50 | |
| Dose calibrator | Capintec, Inc. | CRC-25 PET | |
| Fallypride | ABX Advanced Biochemical Compounds | 1560.0010.000 | Fallypride reference standard, >95% |
| [18F]fluoride in [18O]H2O | UCLA Ahmanson Biomedical Cyclotron Facility | Due to short half-life this must be obtained from local radiochemistry lab or commercial radiopharmacy | |
| Glass cover plates (76.2 mm x 50.8 mm x 1 mm thick) | C&A Scientific | 6101 | |
| Headway spin coater | Headway Research, Inc. | PWM50-PS-R790 Sipinner system | PWM50-control box, PS-motor, R790-bowl |
| High temperature oven | Carbolite | HTCR 6 28 | |
| Hot plate | Thermo Scientific | Super-Nuova HP133425 | |
| Isopropanol (IPA) | KMG Chemicals | Cleanroom LP grade | |
| Mask aligner | Karl Suss | MA/BA6 | |
| Methanol (MeOH) | Sigma-Aldrich | 67-56-1 | ≥99.9% |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | 0030 123.301 | 500 µL, colorless, polypropylene |
| Micropipette (0.5-10 µL) | Labnet | BioPette P3940-10 | |
| Micropipette (100-1000 µL) | Labnet | BioPette P3940-1000 | |
| Micropipette (10-100 µL) | Labnet | BioPette P3940-100 | |
| Micropipette tips (0.1-10 µL) | USA Scientific Inc Tips | 11113810 | |
| Micropipette tips (2-200 µL) | BrandTech | 13-889-143 | |
| Micropipette tips (50-1000 µL) | BrandTech | 13-889-145 | |
| Photoresist developer solution | MicroChem | MEGAPOSIT MF-26A | |
| Positive photoresist | MicroChem | MEGAPOSIT 220-7.0 | |
| Reactive-ion etcher (RIE) | Oxford Instruments | Plasma Lab 80 Plus | |
| Silicon wafer cutter | Euro Tool | CSCB-431.00 | |
| Silicon wafer; 4" diameter | Silicon Valley Microelectronics Inc. | 0017227-048 | P type, boron doped, thickness 525 ± 25 µm |
| Teflon AF 2400 | Chemours | D14896765 | 1% solids |
| Tetrabutylammonium bicarbonate (TBAHCO3) | ABX Advanced Biochemical Compounds | 808 | Aqueous solution stabilized with ethanol, 0.075 M |
| Themal conducting paste | OMEGA | OT-201-2 | |
| TLC plates | Merck KGaA | 1.05554.0001 | Silica gel 60 F254, 50 mm x 60 mm, aluminum back |
| Tosyl-fallypride | ABX Advanced Biochemical Compounds | 1550.004.000 | Fallypride precursor, >90% |
| Trimethylamine (TEA) | Sigma-Aldrich | 75-50-3 | ≥ 99% |
| Tweezers | Cole-Parmer | UX-07387-08 | Stainless steel, fine tip |
References
- Matthews, P. M., Rabiner, E. A., Passchier, J., Gunn, R. N. Positron emission tomography molecular imaging for drug development. British Journal of Clinical Pharmacology. 73 (2), 175-186 (2012).
- Piel, M., Vernaleken, I., Rösch, F. Positron emission tomography in CNS drug discovery and drug monitoring. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (22), 9232-9258 (2014).
- Cherry, S. R., Sorenson, J. A., Phelps, M. E. Physics in Nuclear Medicine. , Elsevier Saunders. Philadelphia, PA, USA. (2012).
- Knapp, K. -A., Nickels, M. L., Manning, H. C. The current role of microfluidics in radiofluorination chemistry. Molecular Imaging and Biology. 22 (3), 463-475 (2020).
- Rensch, C., et al. Microfluidics: A groundbreaking technology for PET tracer production. Molecules. 18 (7), 7930-7956 (2013).
- Pascali, G., Watts, P., Salvadori, P. A. Microfluidics in radiopharmaceutical chemistry. Nuclear Medicine and Biology. 40 (6), 776-787 (2013).
- Keng, P. Y., van Dam, R. M. Digital microfluidics: A new paradigm for radiochemistry. Molecular Imaging. 14, 579-594 (2015).
- Wang, J., Chao, P. H., Janet, S., van Dam, R. M. Performing multi-step chemical reactions in microliter-sized droplets by leveraging a simple passive transport mechanism. Lab on a Chip. 17 (24), 4342-4355 (2017).
- Wang, J., Chao, P. H., van Dam, R. M. Ultra-compact, automated microdroplet radiosynthesizer. Lab on a Chip. (19), 2415-2424 (2019).
- Rios, A., Wang, J., Chao, P. H., van Dam, R. M. A novel multi-reaction microdroplet platform for rapid radiochemistry optimization. RSC Advances. 9 (35), 20370-20374 (2019).
- Sergeev, M., et al. Performing radiosynthesis in microvolumes to maximize molar activity of tracers for positron emission tomography. Communications Chemistry. 1 (1), 10 (2018).
- Pascali, G., et al. Optimization of nucleophilic 18F radiofluorinations using a microfluidic reaction approach. Nature Protocols. 9 (9), 2017-2029 (2014).
- Lisova, K., et al. Microscale radiosynthesis, preclinical imaging and dosimetry study of [18F]AMBF3-TATE: A potential PET tracer for clinical imaging of somatostatin receptors. Nuclear Medicine and Biology. 61, 36-44 (2018).
- Wang, J., et al. High-throughput radio-TLC analysis. Nuclear Medicine and Biology. 82-83, 41-48 (2020).
- Dooraghi, A. A., et al. Optimization of microfluidic PET tracer synthesis with Cerenkov imaging. Analyst. 138 (19), 5654-5664 (2013).
- Collins, J., et al. Production of diverse PET probes with limited resources: 24 18F-labeled compounds prepared with a single radiosynthesizer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (43), 11309-11314 (2017).
- Lazari, M., et al. Fully automated production of diverse 18F-labeled PET tracers on the ELIXYS multireactor radiosynthesizer without hardware modification. Journal of Nuclear Medicine Technology. 42 (3), 203-210 (2014).
- Lisova, K., et al. Rapid, efficient, and economical synthesis of PET tracers in a droplet microreactor: application to O-(2-[18F]fluoroethyl)-L-tyrosine ([18F]FET). EJNMMI Radiopharmacy and Chemistry. 5 (1), 1 (2019).
- Wang, J., Holloway, T., Lisova, K., van Dam, R. M. Green and efficient synthesis of the radiopharmaceutical [18F]FDOPA using a microdroplet reactor. Reaction Chemistry & Engineering. 5 (2), 320-329 (2020).
- Lisova, K., Wang, J., Rios, A., van Dam, R. M. Adaptation and optimization of [F-18] Florbetaben ([F-18] FBB) radiosynthesis to a microdroplet reactor. Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals. 62, 353-354 (2019).
- Wang, J., Chao, P. H., Slavik, R., van Dam, R. M. Multi-GBq production of the radiotracer [18F]fallypride in a droplet microreactor. RSC Advances. 10 (13), 7828-7838 (2020).
