Summary
Denne metode beskriver brugen af en ny højoverførselsmetode baseret på dråbekemiske reaktioner til hurtig og økonomisk optimering af radioaktive lægemidler ved hjælp af nanomolemængder af reagenser.
Abstract
Nuværende automatiserede radiosyntese er designet til at producere store kliniske partier af radioaktive lægemidler. De er ikke velegnede til reaktionsoptimering eller ny radioaktiv udvikling, da hvert datapunkt indebærer betydeligt reagensforbrug, og forurening af apparatet kræver tid til radioaktivt henfald før næste brug. For at imødekomme disse begrænsninger blev der udviklet en platform til at udføre arrays af miniature dråbebaserede reaktioner parallelt, hver begrænset i en overfladespændingsfælde på en mønstret polytetrafluorethylenbelagt silicium "chip". Disse spåner muliggør hurtige og bekvemme undersøgelser af reaktionsparametre, herunder reagenskoncentrationer, reaktionsmiddel, reaktionstemperatur og tid. Denne platform tillader færdiggørelse af hundredvis af reaktioner i et par dage med minimal reagens forbrug, i stedet for at tage måneder ved hjælp af en konventionel radiosyntese.
Introduction
Positronemissionstomografi (PET) radiofarmaceutiske lægemidler anvendes i vid udstrækning som forskningsværktøjer til overvågning af specifikke in vivo biokemiske processer og studiesygdomme og til udvikling af nye lægemidler og terapier. Desuden er PET et kritisk redskab til diagnosticering eller iscenesættelse af sygdomme og overvågning af en patients reaktion på behandling1,2,3. På grund af den korte halveringstid for PET-radioisotoper (f.eks. 110 min for fluor-18-mærkede radioaktive lægemidler) og strålingsfare fremstilles disse forbindelser ved hjælp af specialiserede automatiserede systemer, der opererer bag strålingsafskærmning og skal fremstilles lige før brug.
Nuværende systemer, der anvendes til at syntetisere radioaktive lægemidler er designet til at producere store partier, der er opdelt i mange individuelle doser til at dele produktionsomkostningerne. Mens de nuværende systemer er velegnede til produktion af udbredte radiotracere som [18F] FDG (fordi flere patientscanninger og forskningseksperimenter kan planlægges på en enkelt dag), kan disse systemer være spild til produktion af nye radiotracere i den tidlige fase udvikling, eller mindre almindeligt anvendte radiotracers. Mængder, som konventionelle systemer bruger, er typisk i 1-5 mL-området, og reaktionerne kræver prækursormængder i 1-10 mg-området. Desuden er det generelt besværligt at anvende konventionelle radiosynteseapparater under optimeringsundersøgelser, da apparatet bliver forurenet efter brug, og brugeren skal vente på, at radioaktiviteten forfalder, før det næste forsøg udføres. Bortset fra udstyrsomkostninger kan omkostningerne ved radioisotop og reagenser derfor blive meget betydelige for undersøgelser, der kræver produktion af flere partier. Dette kan f.eks. forekomme under optimering af synteseprotokoller for nye radiotracere for at opnå tilstrækkeligt udbytte og pålidelighed til indledende in vivo-billeddiagnostiske undersøgelser.
Mikrofluidiske teknologier er i stigende grad blevet brugt i radiokemi til at udnytte flere fordele i forhold til konventionelle systemer4,5,6. Mikrofluidiske platforme, herunder platforme baseret på 1-10 μL reaktionsvolumen7,8,9, har vist en betydelig reduktion af reagensmængder og forbrug af dyre prækursorer samt korte reaktionstider. Disse reduktioner fører til lavere omkostninger, hurtigere opvarmnings- og fordampningstrin, kortere og mere ligetil downstream-rensning, en samlet "grønnere" kemiproces10og højere molaraktivitet hos de producerede radiotracere11. Disse forbedringer gør det mere praktisk at udføre mere omfattende optimeringsundersøgelser ved at sænke reagensomkostningerne for hver syntese. Yderligere fordele kan opnås ved at udføre flere eksperimenter fra et enkelt parti radioisotop på en enkelt dag. For eksempel kan mikrofluidiske flowkemiradiosynteser, der opererer i "opdagelsestilstand", sekventielt udføre snesevis af reaktioner, der hver kun bruger 10'ere af μL-reaktionsvolumen12.
Inspireret af disse fordele blev der udviklet en multireaktionsdråbe arraychip, hvor mikrovolumereaktioner er begrænset til en række overfladespændingsfælder på en siliciumoverflade, skabt ved hjælp af en mønstret Teflon-belægning. Disse spåner gør det muligt at udføre flere reaktioner på 1-20 μL-skalaen samtidigt, hvilket åbner mulighed for at udforske 10'erne af forskellige reaktionsforhold om dagen, hver med flere replikater. I dette papir, nytten af denne nye high-throughput tilgang til at udføre hurtige og billige radiokemi optimeringer er påvist. Brug af multireaktionsdråbechips giver mulighed for bekvem udforskning af virkningen af reagenskoncentrationer og reaktionsmiddel, og brugen af flere chips kan gøre det muligt at studere reaktionstemperatur og tid, alt sammen mens der forbruges meget lave mængder prækursorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ADVARSEL: Denne protokol indebærer håndtering af radioaktive materialer. Eksperimenter bør ikke udføres uden den nødvendige uddannelse og personlige værnemidler og godkendelse fra strålingssikkerhedskontoret i din organisation. Forsøg skal udføres bag strålingsafskærmning, helst i en ventileret varmcelle
1. Fremstilling af multireaktionschips
BEMÆRK: Partier af multireaktions-mikrodråber fremstilles af 4" siliciumskiver ved hjælp af standardfotolitografiteknikker, som tidligere beskrevet10 (Figur 1). Denne procedure vil producere 7 chips hver med 4 x 4 vifte af reaktionssteder.
- Placer siliciumskiver på spin-coater chucken, så det sikres, at den er centreret. Der aflejres 3 ml polytetrafluorethylenopløsning i midten af waferen med en overførselspipette og pelsskiver ved en 1000 omdrejningstal i 30 s (500 rpm/s rampe).
- For at størkne belægningen anbringes vaflen på en kogeplade på 160 °C i 10 min. og derefter overføres til en kogeplade på 245 °C i 10 min.
- Belægningen anneal i en højtemperaturovn ved 340 °C i 3,5 timer under nitrogenatmosfære efterfulgt af afkøling til 70 °C ved en rampe på 10 °C/min.
- Placer siliciumskiver på spin-coater chucken, så det sikres, at den er centreret. Hæld 2 mL positiv fotoresist i midten af waferen ved hjælp af en overførselspipette, og udfør derefter belægning ved 3000 omdrejninger i minuttet i 30 s (1000 rpm / s rampe).
- Fotoresisten størknes ved at udføre en blød bage af waferen på en 115 °C kogeplade i 3 min.
- Wafer og photomask monteres i maske og udføres ved 14 s eksponering ved 12 mW/cm2 lampeintensitet og 356 nm bølgelængde i hård kontakttilstand. Dette trin bruger en gennemsigtighedsmaske, der indeholder det negative endelige polytetrafluorethylenmønster, dvs.
- Vande wafer ved hjælp af 20 ml fotoresist udvikler opløsning i en glasbeholder i 3 min med let omrøring for at udvikle det eksponerede mønster.
- Udskyl udviklingsopløsningen væk ved at nedsænke waferen i en glasbeholder med 20 ml DI-vand i 3 minutter med let omrøring. Tør vaflen med en nitrogenpistol.
- Fjern de eksponerede polytetrafluorethylenområder via reaktiv ionætsning (RIE) med iltplasma under følgende betingelser: 30 s eksponering, 100 mTorrtryk, 200 W effekt og 50 sccm iltstrøm.
- Skær vaflen i små spåner (7 i alt pr. wafer) med en siliciumskiverskærer.
- Nedsænk hver chip i acetone i 1 minut for at fjerne fotoresisten, og isopropanol derefter i 1 min. Til sidst tørres hver chip med en nitrogenpistol.
- Placer tørre spåner i en glasbeholder og dæk med aluminiumsfolie til opbevaring indtil brug.
2. Planlægning af optimeringsundersøgelsen
BEMÆRK: I denne protokol anvendes syntese af den radioaktivefarmaceutiske [18F]fallypride som et eksempel til at illustrere optimering af høj gennemløb (figur 2). Med en enkelt chip kan der udføres 16 samtidige reaktioner, for eksempel med varieret prækursorkoncentration (8 forskellige koncentrationer, n = 2 replikerer hver). Betingelserne er kortlagt reaktionssteder i figur 3A. Der kan foretages justeringer af denne protokol for at optimere andre reaktionsparametre (f.eks. reaktionsopløsningsmiddel, reaktionsvolumen, mængden af TBAHCO3osv.) eller andre radioaktive lægemidler.
- Vælg de reaktionsparametre, der skal varieres, de specifikke værdier, der skal bruges, og antallet af replikater.
- Beregn det antal chips, der er nødvendige for at udføre eksperimentet.
- For hver chip skal du udarbejde et kort over, hvilke reaktionsbetingelser der vil blive brugt på hvert reaktionssted for at hjælpe med reagensforberedelse og udførelse af dråbereaktionerne.
3. Fremstilling af reagenser og materialer til optimering af radiosyntesen af [18F]fallypride
BEMÆRK: Den dråbebaserede radiosyntese på [18F]fallypride (figur 2) begynder med tilsætning af [18 F]fluorog faseoverførselskatalysator (TBAHCO3) til reaktionsstedet efterfulgt af opvarmning for at fordampe vand og efterlade en tørret rest. Dernæst tilsættes og opvarmes en dråbe prækursor (tosyl-fallypride) i reaktionsmiddel (thexylalkohol og acetonomitril) for at udføre radiofluorinationsreaktionen. Endelig indsamles råproduktet fra chippen til analyse. Procedurerne for forberedelse og syntese af reagenser bør tilpasses, hvis der udføres optimering af et andet sporstof.
- Der fremstilles en stamopløsning af reaktionsopløsningen, der består af thexylalkohol og acetonontril i en blanding på 1:1 vol. Sørg for, at lydstyrken er nok til at oprette den planlagte fortyndingsserie. I dette eksempeloptimering er ~30 μL tilstrækkelig.
- Der fremstilles en 30 μL bestandsopløsning af prækursor (tosyl-fallypride) i reaktionsopløsningsopløsningen med den maksimale koncentration, der skal undersøges (77 mM). Kontroller, at diskenheden er nok til at udføre det planlagte eksperiment. I dette eksempeloptimering er ~30 μL tilstrækkelig.
- Fra prækursorlageropløsningen og reaktionsopløsningen skal der udføres 2x serielle fortyndinger for at forberede de forskellige koncentrationer af prækursoropløsningen. Sørg for, at mængden af hver fortynding er nok til at udføre det ønskede antal replikater for hver tilstand. I dette eksempel er optimering ~ 15 μL af hver koncentration tilstrækkelig.
- Forbered mikrocentrifuge rør til at indsamle hver rå reaktion produkt ved hjælp af en permanent markør til at mærke hvert rør med et unikt nummer. Sørg for, at det samlede antal mikrocentrifugerør svarer til antallet af betingelser ganget med antallet af replikater (8 x 2 = 16).
- Der fremstilles en beholdning af indsamlingsopløsning (10 ml) bestående af 9:1 methanol:DI-vand (v/v). Aliquot 50 μL i hver af 16 yderligere mærkede mikrocentrifugerør (en pr. reaktionssted på chippen).
- Der fremstilles en [18F]fluorbestandsopløsning i et 500 μL mikrocentrifugerør ved blanding [18F]fluorid/[18O]H2O (~260 MBq [7 mCi]) med 75 mM TBAHCO3 opløsning (56 μL) og fortynding med DI-vand op til 140 μL. 8 μL af denne opløsning vil blive lastet på hvert reaktionssted (indeholdende ~15 MBq [0,40 mCi] aktivitet og 240 nmol TBAHCO3).
4. Parallel syntese af [18F]fallypride med forskellige prækursorkoncentrationer
BEMÆRK: Chippen betjenes oven på en varmeplatform (konstrueret som tidligere beskrevet13) bestående af en 25 mm x 25 mm keramisk varmelegeme, der styres ved hjælp af en on-off temperaturregulator ved hjælp af det interne termoelementsignal til feedback. Varmeapparatets overfladetemperaturer blev kalibreret ved hjælp af termisk billeddannelse. Hvis en sådan platform ikke er tilgængelig, kan der anvendes et par kogeplader (en ved 105 °C og en ved 110 °C).
- Belastning [18F]fluorbestandsopløsning (med faseoverførselskatalysator).
- Ved hjælp af en mikropipette skal der indlæses en 8 μL dråbe [18F]fluorbestandopløsning på det første reaktionspunkt på en multireaktionschip. Mål chippens aktivitet ved at placere den i en dosiskalibrator og registrere det tidspunkt, hvor målingen udføres.
- Spånen fjernes fra dosiskalibratoren, og der derefter indlæses en 8 μL dråbe [18F]fluorbestandopløsning på det andet reaktionspunkt. Aktiviteten måles på chippen ved at placere den igen i dosiskalibratoren og registrere det tidspunkt, hvor målingen udføres.
- Gentag for alle andre reaktionssteder på chippen.
- Beregn den aktivitet, der er indlæst pr. reaktionspunkt, ved at tage aktivitetsmålingen efter indlæsning af radioisotopen og fratrække den tidligere måling (henfaldskorrigeret), før dette sted blev indlæst.
- Juster multireaktionschippen på varmeapparatet.
- Tilsæt et tyndt lag termisk pasta oven på den keramiske varmelegeme.
- Placer forsigtigt chippen oven på varmeapparatet ved hjælp af pincet for at undgå spild af dråberne, og juster referencehjørnet på chippen med varmeapparatets referencehjørne (som vist i figur 3B). Chippen vil overhænge varmeapparatet med en lille mængde.
- Tør [18 F]fluorog faseoverførselskatalysator.
- Spånen opvarmes i 1 min. Efter 1 min. afkøles chippen ved at slukke for varmeapparatet og tænde køleventilatoren med kontrolprogrammet.
- Tilsæt prækursoropløsningen.
- Ved hjælp af en mikropipette tilsættes en 6 μL opløsning af fallyprideprækursor oven på den tørrede rest på det første reaktionssted.
- Gentag for alle andre reaktionssteder på chippen. Brug optimeringsplanen til at bestemme, hvilken koncentration af fortyndingsserien der bruges til hvert reaktionssted.
- Udfør fluorinationsreaktion.
- Varm hver chip op til 110 °C i 7 minutter ved hjælp af kontrolprogrammet til at udføre radiofluorinationsreaktion. Derefter afkøles chippen ved at slukke for varmeapparatet og tænde køleventilatoren med kontrolprogrammet.
- Saml de rå produkter fra reaktionsstederne.
- Råproduktet opsamles på det første reaktionssted ved at tilsætte 10 μL opsamlingsopløsning fra det udpegede mikrocentrifugerør via mikropipette. Efter at have ventet i 5 s skal du bruge mikropipetten (med den samme spids installeret) til at suge det fortyndede råprodukt og overføre det tilsvarende mærkede opsamlingsmikrocentrifugerør til det tilsvarende mærkede kollektionsmikrocentrifugerør.
- Gentag denne proces i alt 4 gange ved hjælp af den samme pipettespids til alle operationer.
- Gentag indsamlingsprocessen for alle andre reaktionssteder på chippen.
5. Sammenfattende analyse til bestemmelse af reaktionsydelse og optimale forhold
- Bestem "indsamlingseffektiviteten" for den første reaktion på chippen.
- Placer mikrocentrifugerøret med det opsamlede råprodukt fra det første reaktionspunkt i dosiskalibratoren for at måle aktiviteten. Registrer målingen og tidspunktet for målingen.
- Opregn indsamlingseffektiviteten ved at dividere aktiviteten af det indsamlede råprodukt med den startaktivitet, der måles for det samme reaktionssted (forfaldskorrigerende aktivitetsværdierne til samme tidspunkt).
- Gentag for alle andre reaktionssteder på chippen.
- Analysere sammensætningen (fluorinationseffektivitet) af hvert indsamlet råprodukt.
BEMÆRK: For at gøre analysen af alle prøver praktisk på kort tid analyseres fluorinationseffektiviteten ved hjælp af en tidligere beskrevet højoverførselshastighedsradiotynd lagkromatografi (radio-TLC) tilgang14. Denne teknik gør det muligt at behandle op til otte prøver parallelt ved at spotte og derefter side om side (5 mm tonehøjde, 0,5 μL pr. spot) på en enkelt TLC-plade, derefter udvikle sig sammen og udføre udlæsning sammen ved hjælp af Cerenkov imaging14,15. For eksempel optimering med 16 parallelle reaktioner er der brug for 2 TLC-plader. En anden mulighed er at bruge radio-højtydende væskekromatografi (radio-HPLC) til analyse, selv om tiden for adskillelse, rengøring og ekvilibrering kan begrænse antallet af prøver, der kan analyseres.- For hver TLC-plade (50 mm x 60 mm) med blyant tegnes en streg 15 mm væk fra en 50 mm kant (nederst) og en anden linje 50 mm væk fra samme kant. Den første linje er oprindelseslinjen. den anden er opløsningsmiddel frontlinjen. Tegn 8 små "X" langs oprindelseslinjen med 5 mm afstand for at definere prøvespottingspositionen for hver af 8 "baner".
- Ved hjælp af en mikropipette overføres 0,5 μL af det første råprodukt til TLC-pladen ved "X" for den første vognbane. Gentag dette for yderligere råprodukter (op til 8 pr. TLC-plade). Vent på, at råproduktpletterne tørrer på TLC-pladen.
- For hver TLC plade, udvikle ved hjælp af en mobil fase på 60% MeCN i 25 mM NH4HCO2 med 1% TEA (v/ v), indtil opløsningsmiddel front når opløsningsmiddel frontlinjen. Vent på, at opløsningsmidlet på TLC-pladen tørrer og derefter dækkes med en glasmikroskoprutsjebane (76,2 mm x 50,8 mm, 1 mm tyk).
- Få et radioaktivitetsbillede af hver TLC-plade ved at placere pladen i et Cerenkov-billedsystem i 5 minutters eksponering. Udfør standardbilledkorrektioner (mørkstrømstraktion, flad feltkorrektion, medianfiltrering og baggrundsfratraktion).
- Brug analyse af interesseområde (ROI) til den første bane på den første TLC-plade. Tegn områder omkring hvert bånd synligt i banen. Softwaren vil beregne brøkdelen af integreret intensitet i hver region (bånd) i forhold til den samlede integrerede intensitet af alle regioner (bands).
- Med denne mobile fase forventes følgende bånd ved de angivne fastholdelsesfaktorer: Rf = 0,0: Ureageret [18F]fluorid; Rf = 0,9: [18F]fallypride; Rf = 0,94: Sideprodukt. Fluorinationseffektiviteten bestemmes som den brøkdel af aktiviteten i[18F]-fallypride-båndet.
- Gentag denne analyse for alle andre baner på alle TLC-plader.
BEMÆRK: Hvis der ikke findes et Cerenkov-billedkammer, kan et lille dyr (præklinisk) in vivo optisk billeddannelsessystem bruges til at afbilde TLC-pladerne. Alternativt kan en 2-dimensionel TLC-scanner bruges. Alternativt, hvis kun en 1-dimensionel TLC-scanner er tilgængelig, kan TLC-pladerne analyseres ved at skære i strimler med en saks (1 pr. Vognbane) og scanne hver strimmel individuelt.
- Det rå radiokemiske udbytte (rå RCY) bestemmes for hvert reaktionssted.
- Den rå RV for det første råprodukt bestemmes ved at gange indsamlingseffektiviteten med fluorinationseffektiviteten.
- Gentag dette for alle andre reaktionssteder.
- Analyser resultaterne
- Aggregatværdier for replikerede eksperimenter til en gennemsnitlig afvigelse og standardafvigelse.
- Opvaskeeffektivitet, fluorinationseffektivitet og rå RV som en funktion af den varierede parameter (prækursorkoncentration i dette eksempel).
- Vælg de optimale betingelser baseret på de ønskede kriterier. Typisk er dette den maksimale rå RCY. Derudover vælges punktet ofte i et område, hvor grafens hældning er relativt flad, hvilket indikerer, at den er ufølsom over for små ændringer i parameteren, hvilket giver en mere robust protokol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Der blev udført et repræsentativt eksperiment for at illustrere denne metode. Ved hjælp af 16 reaktioner blev optimeringsundersøgelser af det radioaktive lægemiddel [18F]fallypride udført ved varierende prækursorkoncentration (77, 39, 19, 9,6, 4,8, 2,4, 1,2 og 0,6 mM) i thexylalkohol:MeCN (1:1, v/v) som reaktionsmiddel. Reaktionerne blev udført ved 110 °C i 7 min. Indsamlingseffektivitet, prøvesammensætning (dvs. andele af [18F]fallypride-produkt, ureageret [18 F]fluoridog sideprodukt) er tabel 1 og er sammenfattet grafisk i figur 4.
Undersøgelsen viste, at fluorholdighedseffektiviteten (andel af [18F]fallypride) stiger med stigendeprækursorkoncentration, og at den resterende ureagerede fluorid varierede omvendt (figur 4A). Der var en lille mængde radioaktivt sideprodukt ved lave prækursorer, men andelen faldt til næsten nul ved de højere prækursorkoncentrationer (figur 4A). Indsamlingseffektiviteten var næsten kvantitativ for de fleste forhold, selv om den faldt en smule ved lave prækursorkoncentrationer.
Ud fra disse resultater kan den højeste RCY opnås med ~230 nmol prækursor (dvs. 39 mM koncentration i en 6 μL dråbe). Ved denne tilstand var fluorinationseffektiviteten 96,0 ± 0,5% (n = 2), og den rå RCY var 87,0 ± 2,7 (n = 2), og der var ingen observeret dannelse af radioaktive sideprodukter. Mens brugen af 77 mM forløber viste lignende resultater, generelt er det ønskeligt at bruge en lavere mængde prækursor til at reducere omkostningerne og forenkle downstream rensningstrin.
Figur 1:Fremstilling af mikrodråber med flere reaktioner viafotolitografi. Chippen består af polytetrafluorethylen-belagt silicium med cirkulære områder af polytetrafluorethylen ætset væk for at skabe de hydrofile reaktionssteder. (B)Skematisk over fabrikationsproceduren. En siliciumskiver er spin-coatet med Teflon-opløsning og bagt for at størkne belægningen. Dernæst er fotoresisten spin-coatet og mønstret via fotolitografi for at producere en ætsemaske. Fotoresisten er udviklet med en fotoresist udviklende løsning. Den udsatte Teflon fjernes derefter via tør ætsning med iltplasma. Waferen er hakket i individuelle chips, og fotoresisten er strippet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Procedure for parallelle reaktioner. Eksperimentel procedure for udførelse af 16 parallelle synteter af det radioaktive lægemiddel [18F]fallypride på en multireaktionschip. I dette eksempel varieres prækursorkoncentrationen for hver reaktion. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:Kort over forholdene på reaktionsstederne. Otte forskellige koncentrationer blev undersøgt, hver med n = 2 replikater. Andre reaktionsbetingelser blev holdt konstante (temperatur: 110 °C; tid: 7 min; opløsningsmiddel: thexylalkohol:MeCN; mængden af TBAHCO3: 240 nmol). Hver reaktion blev udført med ~ 14 MBq af aktivitet. (B) Fotografi af en 16-reaktionschip, der blev installeret på varmeplatformen under forsøget. Røde linjer repræsenterer referencehjørnet på den chip, der bruges til justering med varmeapparatets referencehjørne. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Prækursorkoncentrationens indflydelsepå mikrodråbesyntesen på [ 18 F]fallypride. (A) Andel af radioaktive arter, der findes idet indsamlede råreaktionsprodukt, dvs. (b) Syntesepræstation. Indsamling effektivitet, fluorination effektivitet, og rå RCY er afbildet som en funktion af prækursor koncentration. I begge grafer repræsenterer datapunkter gennemsnittet af n=2 replikeringer, og fejllinjer repræsenterer standardafvigelsen. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Forløberkoncert (mM) | Indsamlingseffektivitet (%) | Fluorholdighedseffektivitet (%) | Rå RCY (%) | Ureageret [18F]fluor (%) | Sideprodukt (%) |
| 77 | 91,8 ± 2,1 | 96,7 ± 2,0 | 88,8 ± 3,9 | 3.3 ± 2.0 | 0,0 ± 0,0 |
| 39 | 90,6 ± 2,4 | 96,0 ± 0,5 | 87,0 ± 2,7 | 4.0 ± 0,5 | 0,0 ± 0,0 |
| 19 | 91.1 ± 0,5 | 81.1 ± 0.3 | 73,9 ± 0,7 | 8.4 ± 1.2 | 10,5 ± 2,0 |
| 9.6 | 90,9 ± 0,6 | 62,7 ± 0,9 | 57,0 ± 0,5 | 23.3 ± 2.1 | 14.0 ± 0,9 |
| 4.8 | 88,4 ± 0,8 | 37.0 ± 1.5 | 32,8 ± 1,6 | 47.3 ± 0,8 | 15.7 ± 1.0 |
| 2.4 | 87,6 ± 2,0 | 21.0 ± 2.1 | 18.4 ± 2.2 | 67,4 ± 2,1 | 11.6 ± 1.0 |
| 1.2 | 82.3 ± 1.6 | 12.7 ± 0.3 | 10.4 ± 0.1 | 72,8 ± 0,7 | 14.5 ± 1.0 |
| 0.6 | 81.2 ± 3.7 | 6.3 ± 0,8 | 5.1 ± 0,5 | 84.3 ± 0.2 | 9.4 ± 1.0 |
Tabel 1: Data fra undersøgelse af prækursorkoncentrationen. Alle værdier er gennemsnit ± standardafvigelser beregnet ud fra n=2 replikater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På grund af begrænsninger i konventionelle radiokemisystemer, der kun tillader et eller et lille antal reaktioner om dagen og forbruger en betydelig mængde reagenser pr. datapunkt, kan kun en lille del af det samlede reaktionsparameterrum undersøges i praksis, og mange gange rapporteres resultater uden gentagelser (n = 1). Sammenlignet med konventionelle systemer gør denne multireaktionsdråberadiosynteseplatform det praktisk at udføre mere omfattende og stringente undersøgelser af radiosynteseforhold, mens der forbruges meget lidt tid og mængde prækursor, hvilket potentielt muliggør ny indsigt i parametre, der påvirker produktudbytte og dannelse af sideprodukter. Oplysningerne kan bruges til at vælge de forhold, der resulterer i det højeste produktudbytte eller den mest robuste syntese. Det lave prækursorforbrug kan især være nyttigt i den tidlige udvikling af nye radiotracere, når der kun kan være en lille mængde prækursorer til rådighed, eller når prækursoren er dyr. Mens chipsenes åbne natur bidrager til hurtig syntesetid og let adgang via pipette, kan det føre til betydelige tab af flygtige molekyler og kan ikke være praktisk, når man optimerer syntesen af radioaktive lægemidler, der har flygtige prækursorer, mellemprodukter eller produkter.
På grund af faren for strålingseksponering skal det gentages, at disse forsøg kun bør udføres med passende uddannelse og godkendelser og bør udføres bag strålingsafskærmning, helst i en ventileret varm celle. På grund af radioisotopernes korte halveringstid er det vigtigt at udføre forsøgene hurtigt og effektivt. Pipetter af reagenser til chippen og opsamlingsprodukter fra chippen bør praktiseres under ikke-radioaktive forhold for at blive fortrolig med den reducerede adgang og synlighed i en varm celle. På samme måde bør installation og fjernelse af chippen og måling af chippen med dosiskalibratoren også praktiseres. Derudover er det vigtigt at være organiseret med et detaljeret eksperimentkort (dvs. specifikke reaktionsforhold på hvert sted på chippen). Det er også nyttigt på forhånd at udarbejde en resultattabel, der skal udfyldes, efterhånden som målingerne foretages. For at sikre reproducerbarhed, især med mulighed for menneskelige fejl, bør der udføres flere replikater af hvert sæt betingelser. Det er vigtigt at være særlig forsigtig i trinnet med at indsamle de rå prøver fra chippen for at undgå at spilde væske uden for reaktionsstedet og forårsage krydskontaminering med tilstødende reaktionssteder. Hvis der bemærkes fejl, er det vigtigt at markere disse reaktionssteder, så dataene kan udelukkes fra den endelige analyse.
I denne eksempelundersøgelse var den mængde prækursor, der blev indtaget for 16 datapunkter, 1,1 mg (~70 μg hver) sammenlignet med 4 mg pr. datapunkt ved hjælp af en konventionel radiosyntese. Desuden blev alle 16 reaktioner afsluttet på 25 minutter i alt i et enkelt eksperiment. Til sammenligning kræver syntesen af rå [18F] fallypride på en konventionel radiosynteseør ~ 15-20 min pr. reaktion16,17.
Dette repræsentative eksperiment viste nytten af en multireaktionsmikredråbechip med 16 reaktioner for at optimere betingelserne for radiosyntesen af den radioaktivefarmaceutiske [18F]fallypride ved at udforske 8 forskellige prækursorkoncentrationer (n=2 replikater for hver tilstand) på en hurtig og økonomisk måde. Andre variabler, der nemt kan optimeres ved hjælp af en multireaktionschip, omfatter mængden af radioaktivitet, type faseoverførselskatalysator, mængde faseoverførselskatalysator, fordampnings-/tørringsforhold (f.eks. antal azeotropiske tørringstrin), reaktionsopløsningsmiddel osv. Ved at bruge flere multireaktionschips er det også muligt at udforske påvirkningen af reaktionstemperatur og reaktionstid ud over forhold som fordampning / tørretemperatur og tid. Sådanne undersøgelser skal udføres sekventielt ved hjælp af enkeltvarmeren eller paralleliseres ved at betjene flere varmeapparater på samme tid.
Den underliggende dråbesyntesemetode har vist sig at være forenelig med en lang række 18F-mærkede radioaktive lægemidler, f.eks. [18F]fallypride10, [18F]FET18, [18F]FDOPA19, [18F]FBB20, og det kan bruges til optimering af størstedelen af de øvrige 18F-mærkede forbindelser og forbindelser mærket med andre isotoper. Desuden udnytter de resulterende optimerede dråbebaserede reaktioner i sig selv fordelene ved mikrovolume-radiokemi, herunder reduceret prækursorforbrug, hurtigere procestider og kompakt instrumentering, og kan tilbyde de samme fordele ved rutinemæssig produktion af store partier. Større partier kræver simpelthen opskalering af den aktivitet, der oprindeligt blev indlæst i starten af reaktionen. For at forberede et røbestof, der er egnet til anvendelse i in vitro- eller in vivo-assays, skal råproduktet renses (f.eks. ved hjælp af HPLC i analytisk skala) og formuleres (f.eks. via fordampnings- eller fastfaset solventudveksling21) Alternativt kan det være muligt at tilpasse de optimale forhold fra dråbeskala til en konventionel vialbaseret radiosyntese. Undersøgelsen af denne mulighed er i gang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Regents fra University of California har licenseret teknologi til Sofie, Inc., der blev opfundet af Dr. van Dam, og har taget egenkapital i Sofie, Inc. som en del af licenstransaktionen. Dr. van Dam er grundlægger og konsulent for Sofie, Inc. De resterende forfattere erklærer ingen interessekonflikter. Dette arbejde blev delvist støttet af National Cancer Institute (R33 240201).
Acknowledgments
Vi takker UCLA Biomedical Cyclotron Facility og Dr. Roger Slavik og Dr. Giuseppe Carlucci for generøst at give [18F] fluor for disse undersøgelser og UCLA NanoLab for støtte med udstyr til chip fabrikation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3-dimethyl-2-butanol (thexyl alcohol) | Sigma-Aldrich | 594-60-5 | 98% |
| Acetone | KMG Chemicals | Cleanroom LP grade | |
| Ammonium formate (NH4HCO2) | Sigma-Aldrich | 540-69-2 | 97% |
| Anhydrous acetonitrile (MeCN) | Sigma-Aldrich | 75-05-8 | 99.80% |
| Ceramic heater | Watlow | Utramic CER-1-01-0093 | 25 mm x 25 mm |
| Cerenkov imaging chamber | Custom built | Other instruments can be used for TLC plate readout including: small animal in vivo optical imaging system, 2D radio-TLC scanner, 1D radio-TLC scanner | |
| DI water | Sigma-Aldrich | 7732-18-5 | |
| Disposable transfer pipets, 3 mL | Falcon | 13-680-50 | |
| Dose calibrator | Capintec, Inc. | CRC-25 PET | |
| Fallypride | ABX Advanced Biochemical Compounds | 1560.0010.000 | Fallypride reference standard, >95% |
| [18F]fluoride in [18O]H2O | UCLA Ahmanson Biomedical Cyclotron Facility | Due to short half-life this must be obtained from local radiochemistry lab or commercial radiopharmacy | |
| Glass cover plates (76.2 mm x 50.8 mm x 1 mm thick) | C&A Scientific | 6101 | |
| Headway spin coater | Headway Research, Inc. | PWM50-PS-R790 Sipinner system | PWM50-control box, PS-motor, R790-bowl |
| High temperature oven | Carbolite | HTCR 6 28 | |
| Hot plate | Thermo Scientific | Super-Nuova HP133425 | |
| Isopropanol (IPA) | KMG Chemicals | Cleanroom LP grade | |
| Mask aligner | Karl Suss | MA/BA6 | |
| Methanol (MeOH) | Sigma-Aldrich | 67-56-1 | ≥99.9% |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | 0030 123.301 | 500 µL, colorless, polypropylene |
| Micropipette (0.5-10 µL) | Labnet | BioPette P3940-10 | |
| Micropipette (100-1000 µL) | Labnet | BioPette P3940-1000 | |
| Micropipette (10-100 µL) | Labnet | BioPette P3940-100 | |
| Micropipette tips (0.1-10 µL) | USA Scientific Inc Tips | 11113810 | |
| Micropipette tips (2-200 µL) | BrandTech | 13-889-143 | |
| Micropipette tips (50-1000 µL) | BrandTech | 13-889-145 | |
| Photoresist developer solution | MicroChem | MEGAPOSIT MF-26A | |
| Positive photoresist | MicroChem | MEGAPOSIT 220-7.0 | |
| Reactive-ion etcher (RIE) | Oxford Instruments | Plasma Lab 80 Plus | |
| Silicon wafer cutter | Euro Tool | CSCB-431.00 | |
| Silicon wafer; 4" diameter | Silicon Valley Microelectronics Inc. | 0017227-048 | P type, boron doped, thickness 525 ± 25 µm |
| Teflon AF 2400 | Chemours | D14896765 | 1% solids |
| Tetrabutylammonium bicarbonate (TBAHCO3) | ABX Advanced Biochemical Compounds | 808 | Aqueous solution stabilized with ethanol, 0.075 M |
| Themal conducting paste | OMEGA | OT-201-2 | |
| TLC plates | Merck KGaA | 1.05554.0001 | Silica gel 60 F254, 50 mm x 60 mm, aluminum back |
| Tosyl-fallypride | ABX Advanced Biochemical Compounds | 1550.004.000 | Fallypride precursor, >90% |
| Trimethylamine (TEA) | Sigma-Aldrich | 75-50-3 | ≥ 99% |
| Tweezers | Cole-Parmer | UX-07387-08 | Stainless steel, fine tip |
References
- Matthews, P. M., Rabiner, E. A., Passchier, J., Gunn, R. N. Positron emission tomography molecular imaging for drug development. British Journal of Clinical Pharmacology. 73 (2), 175-186 (2012).
- Piel, M., Vernaleken, I., Rösch, F. Positron emission tomography in CNS drug discovery and drug monitoring. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (22), 9232-9258 (2014).
- Cherry, S. R., Sorenson, J. A., Phelps, M. E. Physics in Nuclear Medicine. , Elsevier Saunders. Philadelphia, PA, USA. (2012).
- Knapp, K. -A., Nickels, M. L., Manning, H. C. The current role of microfluidics in radiofluorination chemistry. Molecular Imaging and Biology. 22 (3), 463-475 (2020).
- Rensch, C., et al. Microfluidics: A groundbreaking technology for PET tracer production. Molecules. 18 (7), 7930-7956 (2013).
- Pascali, G., Watts, P., Salvadori, P. A.
- Keng, P. Y., van Dam, R. M. Digital microfluidics: A new paradigm for radiochemistry. Molecular Imaging. 14, 579-594 (2015).
- Wang, J., Chao, P. H., Janet, S., van Dam, R. M. Performing multi-step chemical reactions in microliter-sized droplets by leveraging a simple passive transport mechanism. Lab on a Chip. 17 (24), 4342-4355 (2017).
- Wang, J., Chao, P. H., van Dam, R. M.
- Rios, A., Wang, J., Chao, P. H., van Dam, R. M. A novel multi-reaction microdroplet platform for rapid radiochemistry optimization. RSC Advances. 9 (35), 20370-20374 (2019).
- Sergeev, M., et al. Performing radiosynthesis in microvolumes to maximize molar activity of tracers for positron emission tomography. Communications Chemistry. 1 (1), 10 (2018).
- Pascali, G., et al. Optimization of nucleophilic 18F radiofluorinations using a microfluidic reaction approach. Nature Protocols. 9 (9), 2017-2029 (2014).
- Lisova, K., et al. Microscale radiosynthesis, preclinical imaging and dosimetry study of [18F]AMBF3-TATE: A potential PET tracer for clinical imaging of somatostatin receptors. Nuclear Medicine and Biology. 61, 36-44 (2018).
- Wang, J., et al.
- Dooraghi, A. A., et al. Optimization of microfluidic PET tracer synthesis with Cerenkov imaging. Analyst. 138 (19), 5654-5664 (2013).
- Collins, J., et al. Production of diverse PET probes with limited resources: 24 18F-labeled compounds prepared with a single radiosynthesizer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (43), 11309-11314 (2017).
- Lazari, M., et al. Fully automated production of diverse 18F-labeled PET tracers on the ELIXYS multireactor radiosynthesizer without hardware modification. Journal of Nuclear Medicine Technology. 42 (3), 203-210 (2014).
- Lisova, K., et al. Rapid, efficient, and economical synthesis of PET tracers in a droplet microreactor: application to O-(2-[18F]fluoroethyl)-L-tyrosine ([18F]FET). EJNMMI Radiopharmacy and Chemistry. 5 (1), 1 (2019).
- Wang, J., Holloway, T., Lisova, K., van Dam, R. M. Green and efficient synthesis of the radiopharmaceutical [18F]FDOPA using a microdroplet reactor. Reaction Chemistry & Engineering. 5 (2), 320-329 (2020).
- Lisova, K., Wang, J., Rios, A., van Dam, R. M. Adaptation and optimization of [F-18] Florbetaben ([F-18] FBB) radiosynthesis to a microdroplet reactor. Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals. 62, 353-354 (2019).
- Wang, J., Chao, P. H., Slavik, R., van Dam, R. M. Multi-GBq production of the radiotracer [18F]fallypride in a droplet microreactor. RSC Advances. 10 (13), 7828-7838 (2020).
