Summary
En el siguiente trabajo, describimos los pasos consecutivos necesarios para el establecimiento de un gran biobanco de cáncer colorrectal y pancreático.
Abstract
A la luz del creciente conocimiento sobre las propiedades inter-individuales y la heterogeneidad de los cánceres, el campo emergente de la medicina personalizada requiere una plataforma para la investigación preclínica. En los últimos años, hemos establecido un biobanco de cánceres colorrectal y pancreático compuesto por tejido tumoral primario, tejido normal, sera, linfocitos sanguíneos periféricos aislados (PBL), xenoinjertos derivados del paciente (PDX), así como líneas celulares de cáncer primaria y secundaria. Dado que el tejido tumoral original es limitado y la tasa de establecimiento de líneas celulares primarias contra el cáncer sigue siendo relativamente baja, PDX permite no sólo la preservación y extensión del biobanco, sino también la generación de líneas celulares secundarias contra el cáncer. Además, se ha demostrado que los modelos PDX son el modelo in vivo ideal para las pruebas preclínicas de drogas. Sin embargo, el biobanco requiere una preparación cuidadosa, directrices estrictas y una infraestructura bien sintonizada. Colectomía, duodenopancreatoctomía o metástasis resecadas se recogen inmediatamente después de la resección y se transfieren al departamento de patología. Respetando la prioridad de un informe histopatológico imparcial, a discreción del patólogo asistente que lleva a cabo las disecciones, se cosechan pequeñas piezas tumorales y tejido no tumoral.
Las partes necróticas se desechan y el tejido tumoral restante se corta en cubos pequeños e idénticos y se criopreserva para su uso posterior. Además, una pequeña porción del tumor se extrae y se tensa para el cultivo primario de células cancerosas. Además, las muestras de sangre extraídas del paciente de forma pre y postoperatoria, se procesan para obtener suero y PBLs. Para el enjerftment PDX, los especímenes criopreservados se descongelan e implantan subcutáneamente en los flancos de ratones inmunodeficientes. El PDX resultante recapitular estrechamente la histología de los tumores "donantes" y se puede utilizar para el xenoinjerto posterior o criopreservado para su uso posterior. En el siguiente trabajo, describimos los pasos individuales de creación, mantenimiento y administración de un gran biobanco de cáncer colorrectal y pancreático. Además, destacamos los detalles y advertencias cruciales asociados con el biobanco.
Introduction
En los últimos años, el conocimiento acumulado de las propiedades morfológicas, clínicas y genéticas de los cánceres condujo a la concepción del cáncer como una enfermedad heterogénea, individual. En consecuencia, la caracterización mutacional de los neoplasias, además de las características clínicas y patológicas, ha cobrado importancia para la toma de decisiones clínicas y se desarrollaron muchas terapias dirigidas para diversas alteraciones moleculares. Por ejemplo, la eficacia del cetuximab en el tratamiento del cáncer colorrectal puede predecirse mediante el análisis del KRAS y pik3CA estado mutacional1. La medicina de precisión tiene como objetivo un enfoque personalizado para proporcionar la respuesta de tratamiento más alta en cada paciente y evitar la toxicidad de las terapias ineficaces2. Los biobancos contienen tejidos, sangre y otros materiales biológicos de pacientes con cáncer, que están vinculados a los datos clínicos, y por lo tanto son una excelente herramienta para la investigación traslacional del cáncer. Debido al gran número de muestras clínicas, los biobancos permiten la detección de mutaciones raras, pero potencialmente farmacológicas, lo que proporciona nuevas oportunidades de tratamiento para el paciente individual3.
Para cubrir lo más amplio posible un espectro de investigación oncológica, no limitamos nuestra actividad solo en la recolección de muestras, sino que nos centramos en el establecimiento de líneas celulares de cáncer derivadas del paciente y xenoinjertos (PDX). Las líneas celulares 2D tradicionales siguen siendo la piedra angular de la investigación in vitro y son la opción principal para los exámenes de drogas a gran escala4,5. Además, el análisis de líneas celulares es a menudo más fácil, más barato y más fácilmente disponible. Además, puesto que existen linfocitos sanguíneos periféricos derivados del paciente (PBL), también se puede estudiar inmunología tumoral in vitro6. Sin embargo, la mayoría de los fármacos recientemente desarrollados con una efectoividad preclínica prometedora en experimentos in vitro o in vivo basados en células, han mostrado resultados decepcionantes en los ensayos clínicos7. Por el contrario, los estudios preclínicos basados en estudios in vivo de PDX han reflejado la actividad clínica de los agentes antineoplásicos mucho más fielmente8. Dado que el tejido PDX refleja de cerca las propiedades histológicas y moleculares del tumor del donante, los modelos PDX son una buena manera de propagar las cantidades a menudo muy limitadas de tejido tumoral viable para mantener la integridad de un biobanco y permitir el intercambio de muestras entre grupos de investigación e instituciones. Además, las líneas celulares cancerosas derivadas del tejido PDX se pueden establecer significativamente más fáciles que las líneas celulares primarias de cáncer9. En los últimos años, nuestro grupo de trabajo ha establecido un biobanco integrado integral de cáncer colorrectal y pancreático mediante la estandarización escalonada y la optimización del flujo de trabajo para todas las muestras biológicas en cuestión (Figura 1).
Figura 1: Flujo de trabajo y organización del biobanco Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Protocol
El siguiente estudio ha sido aprobado por la junta de revisión institucional del Centro Médico Universitario Rostock (II HV 43/2004, A 45/2007, A 2018-0054, A 2019-0187 y A 2019-0222). Además, todos los procedimientos veterinarios pertinentes han sido aprobados por el Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg-Vorpommern bajo los números de registro LALLF M-V/TSD/ 7221.3-2-020/17 y 7221.3-1-007/19.
1. Requisitos previos experimentales
- Cumplir con varias condiciones marco importantes para establecer y mantener un biobanco.
- Utilice una clínica con un departamento quirúrgico y un número suficiente de resecciones oncológicas junto con un laboratorio bien equipado y suficiente personal académico. Una buena infraestructura y un firme enlace con un departamento de patología cooperante son otros requisitos previos.
- Para la investigación in vivo, utilice una instalación animal con condiciones de vivienda adecuadas para ratones inmunodeficientes.
- Obtenga autorización sobre cualquier investigación sobre material derivado del paciente de un comité de ética de la atención médica. Obtener la aprobación de cualquier investigación in vivo de la autoridad competente de acuerdo con la normativa legal local.
2. Colección de muestras
- El día antes de la cirugía
- Evaluar a todos los pacientes con cáncer colorrectal o pancreático resectable y/o metástasis correspondientes para la elegibilidad de biobanco. Evite incluir casos con pretratamiento de neoadjuvante, tumores muy pequeños, tumores de dignidad o lesiones inciertas que hayan sido parcialmente resesegados endoscópicamente antes.
- Obtenga la aprobación por escrito de la participación del paciente durante la discusión de consentimiento informado sobre el procedimiento quirúrgico. Informar oportunamente a todos los cirujanos involucrados, el equipo de laboratorio, así como el patólogo.
- Adquisición de muestras
- Informe a todos los asistentes en la sala de operaciones (OR) sobre la recolección de tejidos para el biobanco inmediatamente antes del inicio del procedimiento quirúrgico.
NOTA: Es crucial que el tejido no se debe fijar en formalina. Si el tejido está sumergido en formalina, se vuelve inadecuado para el biobanco integrado. - Dibuje 40 ml de sangre heparinizada (jeringa de 2 x 20 ml), así como un tubo sérico estándar de 7,5 ml inmediatamente después de la inducción anestésica y transfiéralo rápidamente al laboratorio para el aislamiento pbl y el procesamiento sérico (ver paso 3-4).
- Obtenga la muestra resecada directamente de la mesa de operaciones, colóquela en un recipiente adecuado y llévala al departamento patológico. Anote el punto de tiempo del desprendimiento de la circulación, la resección y la llegada a la patología.
NOTA: La idoneidad de la muestra para la biobancidad debe ser evaluada por el patólogo cooperante que disecciona una porción de tumor y tejido no maligno. No excisa ninguna parte del espécimen por sí mismo que pueda comprometer el informe patológico posterior. - Coloque ambas piezas de tejido en un tubo de polipropileno separado de 15 a 50 ml con una solución de almacenamiento de tejido de 10 a 30 ml (o DPBS) sobre hielo. Anote el tiempo de recepción y transfiera las muestras inmediatamente al laboratorio.
NOTA: Los siguientes pasos de protocolo 3-6 deben realizarse en un armario de flujo laminar en condiciones estériles estrictas. Utilice todos los líquidos a temperatura ambiente.
- Informe a todos los asistentes en la sala de operaciones (OR) sobre la recolección de tejidos para el biobanco inmediatamente antes del inicio del procedimiento quirúrgico.
3. Procesamiento sérico
- Centrífuga el tubo sérico de 7,5 ml a 1128 x g y 4 °C durante 15 minutos en una centrífuga preenfriada.
- Aliquot 1 mL sérico por tubo en criotubos preetiquetados y congelación en nitrógeno líquido.
4. Aislamiento de PBL por centrifugación de gradiente de densidad
NOTA: Trabajar en paralelo con cada una de las dos jeringas de 20 ml.
- Llene 20 ml de sangre heparinizada en un tubo de polipropileno de 50 ml y agregue 15 ml de DPBS.
- Tome 15 ml de Pancoll con una pipeta serológica, inserte la pipeta cuidadosamente hasta la parte inferior del tubo de polipropileno y suelte el Pancoll muy lentamente para formar una capa debajo de la columna sangre / DBPS.
- Centrífuga a 375 x g durante 15 min sin freno.
- Aspirar y transferir la capa de interfase opaca entre la columna media y superior de ambas muestras a un tubo de polipropileno fresco de 50 ml y llenar con DPBS a 50 ml.
- Centrífuga a 270 x g durante 15 min con freno.
- Aspirar y desechar el sobrenadante, resuspend el pellet celular en 4,5 ml de medio congelador.
- Aliquot 1,5 ml de la suspensión por criotubo, cierre bien los tubos y colóquelos en un recipiente congelado adecuado para una congelación lenta y guárdelos a -80 °C.
5. Procesamiento de tejidos
NOTA: Comience con la generación de muestras congeladas de tumor y tejido sano para mantener la integridad de los ácidos nucleicos.
- Muestra de tejido tumoral
- Transfiera la muestra tumoral con varios ml de solución de almacenamiento de tejidos desde el tubo de polipropileno a una placa de Petri. Enjuague con DPBS si es necesario. Evite tocar la muestra y use dos bisturíes estériles para manejar el tejido. Evite la desecación en cualquier momento.
- Pesar la muestra tumoral en una escala conveniente en un plato separado y anotar el peso del tejido.
- Evalúe el tamaño, la forma y la calidad del tejido tumoral antes de cortar. Aspirar a obtener al menos una pieza del tamaño de un cabezal de alfiler para congelación por broche y cuatro cubos de aprox. 30 mm3 (longitud del borde 3 x 3x 3 mm) cada uno para una criopreservación vital. Genere tantos cubos de30 mm 3 en cuadrillizos como sea posible y genere una pieza para la congelación por cada 5 cuádruples. También tenga en cuenta que las porciones necróticas deben cortarse para que los cubos consistan únicamente en tejido vital.
- Generar rodajas de 3 mm de espesor. Cortar porciones necróticas, distinguibles como masa de gel o líquido, y cortar las rodajas en cubos de los dos tamaños deseados.
NOTA: No descarte ningún tejido en este momento. - Congelación rápida
- Etiqueta criotubos en consecuencia (véase el paso 7.7).
- Coloque una pequeña pieza de tejido por criotubo preetiquetado. Sumerja las muestras inmediatamente en nitrógeno líquido durante varios minutos y guárdelo a -80 °C posteriormente.
- Criopreservación del tejido vital
- Etiquete los criotubos en consecuencia (ver paso 7.7) y llene cada uno con 1,5 ml de medio congelador. Coloque el recipiente congelado junto al banco.
NOTA: Siga los siguientes pasos lo más rápido posible. Dado que la DMSO en el medio congelador tiene propiedades citotóxicas, el tiempo del tejido sumergido en el medio congelador sin una refrigeración adecuada no debe exceder de 2 minutos. - Coloca los cubos de 30 mmy 3 en cuadruplicaciones. Empuje el tejido necrótico y otros restos al borde del plato, pero no los deseche.
- Recoge los cubos con la hoja del bisturí y transfiere 4 cubos por criotubo. Asegúrese de que las piezas tumorales estén completamente sumergidas en el medio congelador. Cierre bien los tubos y colóquelos en un recipiente congelador adecuado para una congelación lenta y guárdelos en un congelador de -80 °C.
- Transfiera criotubos a un sistema de almacenamiento adecuado para almacenamiento a largo plazo a -140 °C o inferior. La documentación en el sistema de gestión de inventario de laboratorio es obligatoria.
- Etiquete los criotubos en consecuencia (ver paso 7.7) y llene cada uno con 1,5 ml de medio congelador. Coloque el recipiente congelado junto al banco.
- Muestra de tejido sano: Repita los pasos 5.1.1. a 5.1.6.4 para la muestra de tejido sano.
6. Cultivo celular primario
- Desintegrar los restos del tejido tumoral, incluida la chatarra necrótica, en la placa de Petri con los bisturíes en pedazos lo más pequeños posible.
- Coloque un colador de células estériles (tamaño de poro de 100 μm) encima de un tubo de polipropileno de 50 ml.
- Utilice una pipeta serológica para añadir 5-10 ml de DPBS a la placa Petri, flotar los restos de tejido y pipeta hacia arriba y hacia abajo para generar una suspensión.
- Transfiera la suspensión con la pipeta al colador celular.
- Repita los pasos 6.3-6.4 hasta que todos los restos de tejido se resuelvan de la placa de Petri.
- Utilice el émbolo de una jeringa unidireccional de 20 ml para exprimir la suspensión celular y tisular a través del colador celular.
- Enjuague con 5-10 ml de DPBS fresco, deseche el colador celular y cierre el tubo correctamente.
- Centrífuga la suspensión a 180 x g durante 5-10 minutos.
- Preparar un colágeno-I precoado 6 placa de pozo con 1,5 ml de medio por pozo.
- Aspirar y desechar el sobrenadante. Resuspend el pellet en 3 ml de DPBS o medio y añadir 500 μL de la suspensión a cada pozo. Coloque la placa en la incubadora (100% humedad, 5% CO2,37 °C)
- Monitoree la placa diariamente para el crecimiento celular y la contaminación.
NOTA: Aquí no se describe más células que culturan hasta el punto de establecer una línea celular permanente.
7. Generación PDX
- Realice experimentos in vivo únicamente por personas debidamente calificadas que cumplan con los requisitos de la autoridad competente de su jurisdicción.
- Los ratones inmunodeficientes de la casa en condiciones específicas libres de patógenos (SPF) satisfacen las demandas de la cepa de ratón utilizada. Las medidas higiénicas incluyen jaulas ventiladas individualmente, alimentos autoclavados, agua y material de anidación, así como una cerradura de aire de seguridad y el uso de equipos personales y de protección.
- Autoclave todos los instrumentos de antemano y utilice sólo un conjunto de instrumentos para cada caso tumoral para evitar la contaminación cruzada. Manipule el tejido tumoral lo más aséptico posible. Todos los artículos plásticos que se nombren a continuación deben ser estériles, de un solo uso y descartados después de cada cirugía.
NOTA: Determinada por el método de congelación de cuatro piezas de tejido tumoral por criotubo, la generación PDX requiere siempre dos ratones por muestra, lo que idealmente resulta en cuatro tumores PDX. - Elija el tumor primario deseado para el enjerftment a través del sistema de gestión de inventario de laboratorio y transfiera la muestra (tejido tumoral preservado vitalmente) desde el tanque de almacenamiento principal a un recipiente portátil de nitrógeno líquido (el almacenamiento intermedio a -80 °C en hielo seco también es conveniente).
- Póngase equipo de protección personal antes de entrar en la sección SPF (exfoliantes, zuecos, delantal, cubierta para el cabello, máscara quirúrgica y overshoes), desinfecte las manos y todo el equipo.
- Matrigel empapado
- Retire el criotube forma el recipiente de nitrógeno líquido y espere el deshielo de la muestra.
- Etiquete un tubo de polipropileno de 50 ml y llénelo con 35 ml de DPBS.
- Incline el criotube hacia arriba y hacia abajo y transfiera el contenido inmediatamente al tubo de polipropileno tan pronto como se pueda desplazar el tejido medio-slush. Enjuague suavemente las piezas del tejido tumoral, deseche el volumen principal del tubo en un recipiente separado, cierre la tapa y coloque el tubo hacia abajo, de modo que las cuatro piezas de tejido se reúnan en la tapa.
- Coloque una placa Petri en el acumulador de refrigeración y coloque 100 μL de Matrigel como una sola gota en el medio. Utilice fórceps anatómicos para transferir las piezas tumorales al Matrigel. Asegúrese de que cada pieza esté completamente cubierta con Matrigel. Incubar durante 10 minutos a 4 °C.
- Anestesia del ratón (2 ratones por muestra, trabajo en paralelo)
- Preparar un 3:1- stock de una solución anestésica de ketamina (100 mg/ml) y xilazina (20 mg/ml). La dosis recomendada es de 90/6 mg/kg de peso corporal.
- Pesar el ratón y extraer la solución anestésica necesaria en una sola jeringa de insulina de un solo uso.
- Coloque el ratón en la rejilla de la jaula, tire suavemente de su cola con una mano para inducir un movimiento hacia adelante y simultáneamente cangrejo el cuello con un agarre de pellizcar de la otra mano. Levante el ratón de la rejilla y gire la mano de la mano, para que la espalda de ese animal se apoye sobre su palma. Inmovilizar una de las patas traseras con el meñique e inyectar los narcóticos por vía intraperitoneally. Vuelva a poner el ratón en su jaula y espere la inducción de narcóticos.
- Coloque el ratón anestesiado en la placa de calentamiento y cubra los ojos con ungüento para evitar daños corneales. Asesa la profundidad de la anestesia pellizcando suavemente el pie trasero del ratón con fórceps quirúrgicos.
NOTA: La ausencia de movimiento indica una narcosis profunda. Cualquier tipo de movimiento requiere más tiempo para alcanzar la profundidad de narcótico deseada o una dosis adicional de anestésicos.
- Procedimiento quirúrgico
- Formar un pliegue de piel pellizcar el cuello del ratón e inyectar el microchip subcutáneamente con el aplicador (Ver paso 9 para los detalles de programación)
- Afeite los flancos del ratón si es necesario (los ratones NMRInu/nu no requieren afeitado), aplique povido-yodo con un hisopo de algodón y utilice cortina quirúrgica para crear un campo estéril.
- Levante la piel del flanco con fórceps quirúrgicos, haga una pequeña incisión de alrededor de 4 mm y forme un pequeño bolsillo subcutáneo mediante una preparación contundente con tijeras.
- Coloque una pieza tumoral en cada bolsillo y colóquela en la parte trasera.
- Recorta el extremo de una punta de pipeta de 100 μL y aspira el Matrigel restante de la placa Petri y aplícalo por igual en cada bolsillo de la piel.
- Cierre las heridas con suturas interrumpidas simples y aplique apósito en aerosol.
- Escanee el microchip y compruebe la validez de la identificación con ratones y tumores.
- Prepare una nueva jaula con ropa de cama fresca y material de anidación, así como un palo de roer. Doble un "cojín" de toallas de papel y dejé el ratón con la cabeza elevada bajo una lámpara de calor infrarroja.
- Mezclar 0,25 ml de trimetoprim/sulfamethoxazole (400 mg/80 mg) con 100 ml de agua potable y administrarla a través de la botella de bebida. Tenga en cuenta que un ratón consume aproximadamente 150 ml por kg de peso corporal al día.
NOTA: Dado que el modelo pdx subcutáneo no está asociado con el dolor postoperatorio, ni durante el proceso de cicatrización de la herida, ni durante el crecimiento tumoral, no se requiere analgesia postoperatoria. Tenga en cuenta que las directrices de bienestar animal de su institución/autoridad pueden diferir. - Seguimiento de animales experimentales
- Monitoree a los ratones diariamente en busca de signos de angustia. Esto se puede delegar en cuidadores de animales calificados.
- Mantener el tratamiento antibiótico postoperatorio con la dosis antes mencionada durante 4 semanas. Reemplace la mezcla de antibióticos dos veces por semana.
- Mida el tamaño del tumor al menos una vez por semana, idealmente diariamente, con una pinza (volumen tumoral = 0,52 x longitud x anchura x altura [mm3])y registre en la base de datos.
8. Recolección y procesamiento de PDX
- Cosechar y procesar el tumor PDX, cuando:
El tamaño del tumor alcanza el volumen objetivo de 1.500 mm3.
El tumor que lleva animal muestra signos de angustia y/o enfermedad y el tratamiento es inútil.
El tumor se ulcera o penetra en la piel del ratón. - Lea el microchip para identificar el PDX correcto.
- Eutanasiar el ratón mediante un método legal (dependiendo de las directrices nacionales) como por ejemplo CO2-asfixia o inyección de ketamina/xilazina seguida de dislocación cervical.
- Levante la piel con fórceps quirúrgicos en los flancos e incienso con tijeras Metzenbaum a pocos milímetros del tumor.
- Desasociar la piel por encima del tumor mediante una preparación contundente, luego agarrar cuidadosamente el tumor con fórceps anatómicos y separar el tumor de la fascia superficial del cuerpo.
- Enjuague el tumor con DPBS, colórelo en una placa de Petri y extraiga el tejido conectivo adyacente.
- En este punto, realice una de las siguientes acciones:
- Cortar cubosde 30 mm 3 y crear nuevos PDX (Continuar con el protocolo en el punto 7.7.4).
- Corta el tumor en rodajas, que luego se transfieren a casetes histología y se conservan en un 4% de formaldehído para la incrustación posterior de parafinas.
- Conservar el tumor en un tubo con solución de almacenamiento de tejidos para añadirlo al biobanco (Continuar con el protocolo en el paso 3.) y/o crear líneas celulares derivadas de PDX (Continuar con el protocolo en el paso 4.)
9. Biobanco y gestión de datos
- Asigne un ID interno a cada caso tumoral según la Tabla 1.
| Ubicación/nombre del laboratorio | entidad oncológica | número de caso consecutivo | especificación | número consecutivo |
| C=colorrectal | _Met=Metástasis | |||
| P=pancreático | _Tu=Tumor | |||
| Ejemplo: HROC389_Met2 = Rostock, cáncer colorrectal, caso 389, segunda metástasis | ||||
Tabla 1: Definición del ID de muestra.
- Almacene el consentimiento del paciente en formato electrónico y papel junto con el tumor-ID.
- Recopile tantos datos clínicos como sea posible y guárdelos anonymizados y por separado.
- Utilice un software de gestión de datos (por ejemplo, Freezerworks) u otro y cree una interfaz con un software de impresión de etiquetas para generar etiquetas de código de barras autoadherentes resistentes a la temperatura.
- Añada una nueva muestra abriendo el software de gestión de datos, defina el tipo de muestra y registre la siguiente información: identificación del tumor, tipo de tejido, método de congelación, fecha, empleado responsable, número de pasaje, identificación del ratón y tensión del ratón.
- Asigne las muestras a posiciones específicas en el tanque de almacenamiento.
- Seguimiento y supervisión de PDX (se aplica al paso 7-8)
- Utilice una base de datos de MS Access (o un sistema similar) en un dispositivo portátil habilitado para Bluetooth (portátil o tableta) para registrar el ID tumoral, la fecha de implantación, la fecha de eutanasia, la edad y la tensión del ratón, así como el crecimiento del tumor con el tiempo.
- Conecte el lector de microchip al dispositivo y lea el microchip antes de la implantación.
- Asigne un ID específico a cada ratón; utilizamos el siguiente esquema: (véase el cuadro 2 a continuación)
- Después de la implantación, registre el ID junto con las características del ratón en la base de datos.
- Vuelva a leer el microchip y compruebe, si las especificaciones del microchip, la base de datos y la etiqueta cryotube son consistentes.
- Cree una etiqueta para cada jaula del ratón en consecuencia.
NOTA: Para crear una copia de seguridad física, pegue las etiquetas de criotubos con las etiquetas de microchip correspondientes en un folleto y la fecha de la nota y la tensión del ratón. - Para monitorear el crecimiento tumoral del PDX individual, escanee el microchip del ratón con el lector conectado al dispositivo base de datos para su identificación y registre el tamaño del tumor medido por la pinza cada semana.
- Planifique el punto de tiempo ideal de la cosecha de PDX mediante el análisis de la curva de crecimiento del tumor.
| Tumor-ID | Almacenamiento previo en N2 (=f) | Número de pasaje (=T) | número consecutivo del ratón (=M) |
| Ejemplo: HROP12 fT0 M1 = Rostock, cáncer de páncreas, caso 12, generado a partir de tejido primario congelado, primer paso, ratón 1. | |||
Tabla 2: Definición del ID de PDX.
Representative Results
En nuestras manos, la tasa de establecimiento de cultivos celulares primarios(Figura 2A & B)fue del 12,9% en una serie grande9. La mayoría de los intentos de aislar las células tumorales ampliables de muestras resecadas quirúrgicas frescas fracasaron debido a la falta de crecimiento o contaminación temprana. El establecimiento de líneas celulares se consideró exitoso después de 3 pasajes con un crecimiento constante en condiciones de cultivo estándar (DMEM, 10% FCS, buque de cultivo estándar) y validación de la diferenciación epitelial a través del análisis FACS10. Las líneas celulares derivadas de tumores PDX(Figura 2C y D)mostraron una tasa de establecimiento más alta de 23.6% que también se debe a la posibilidad de intentos repetitivos en contraste con los tumores primarios resecados9. Sin embargo, algunos cultivos mixtos(Figura 2E)no pueden liberarse del crecimiento fibroblástico o incluso se pierden debido al crecimiento excesivo fibroblástico(Figura 2F).
Figura 2: Cultivo celular. Líneas celulares primarias contra el cáncer, derivadas de una metástasis del caso de cáncer de colon HROC313, pasaje 21 (A) y caso de cáncer de páncreas HROP88, pasaje 5 (B). Líneas celulares cancerosas derivadas de PDX de colon PDX HROC285 T0 M2 (D) y PDX PANCREÁTICO HROP10 T5 M2, paso 4 (E). Cultivo mixto de fibroblastos y células cancerosas del cáncer de páncreas HROP75, paso 8 (C) y crecimiento excesivo fibroblástico (F). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Teniendo en cuenta los cambios en el protocolo de generación PDX, las cepas de ratón utilizadas y también los experimentadores durante varios años, así como las grandes diferencias en la cantidad de tejido tumoral disponible para el enjerftment, no es trivial dar la tasa de éxito general de la generación PDX. En una serie muy reciente de experimentos de generación PDX realizados por dos investigadores (S.M. y F.B.), se observaron tasas de crecimiento primario del 63% para PDX colorrectal (una histología ejemplar puede representarse de la Figura 3A)y del 48% para PDX pancreático(Figura 3B). El crecimiento de linfomas murcianos o humanos en el sitio de implantación es relativamente raro, pero puede imitar el crecimiento exitoso de PDX(Figura 3C). Además del examen histopatológico, la concordancia entre los modelos PDX y sus pacientes donantes se confirmó regularmente mediante un breve análisis de repetición en tándem (STR)(Figura 3D). Hasta la actualidad, el biobanco comprende >50 líneas celulares de cáncer de páncreas primario y >50 secundarios, 3 líneas celulares de cáncer de páncreas primaria y 6 secundarias, así como modelos >150 colorrectal y 19 modelos PANCREÁTICOS PDX.
Figura 3: Comparación histológica representativa de colorrectal (A) y PDX pancreático (B). Linfoma humano en el sitio de implantación imitando el crecimiento de PDX (C). Pruebas genéticas de identidad de un modelo PDX (HROC430 T1 M2) al tejido tumoral del paciente original (HROC430Tu) mediante un breve análisis de repetición en tándem (STR). Comparación de los nueve STR loci, vWA, THO1, TPOX, CSF1 PO (tinte FAM) y D5S818, D13S317, D7S820, D16S539 (tinte HEX) utilizando PCR multiplex con imprimaciones de etiqueta fluorescente después de la electroforesis capilar confirmada concordancia genética del PDX y el tumor donante (D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
La generación de un biobanco vivo presupone, además de cumplir con las regulaciones legales de privacidad, derecho médico y bienestar animal, una buena infraestructura y un equipo bien coordinado. Ha demostrado ser ventajoso involucrar directamente a una parte del personal quirúrgico en los procedimientos de investigación, ya que pueden evaluar muy bien la idoneidad del paciente individual para la donación de tejidos. Además, los pacientes tienden a dar su consentimiento con más frecuencia con el biobanco, cuando su aprobación por escrito se obtiene en el transcurso de la discusión de consentimiento informado quirúrgico. Para ahorrar tiempo y recursos, no se deben seleccionar casos que presumiblemente produzcan cantidades insuficientes de tejido tumoral para el biobanco. Cuando se trata de la adquisición de especímenes, la máxima "la comunicación es clave" es una verdad simple, pero a menudo pasada por alto. Sólo se necesita una sola enfermera de teatro no informada o colega quirúrgico para arruinar el espécimen justo al principio procediendo como de costumbre y añadiendo formaldehído al espécimen de resección. Por lo tanto, es absolutamente crucial que todos y cada uno de los miembros del personal involucrado se familiaricen con el PSOE para el biobanco. Los cirujanos deben ser notados el día antes y justo al comienzo del procedimiento sobre la recolección programada de tejidos. Además, los casos seleccionados para la biobanco deben destacarse en el plan electrónico de quirófano. La recolección de tejidos a partir de la muestra quirúrgica debe ser realizada por un patólogo. En primer lugar, esto garantizará que la recolección de tejidos no interfiera con el informe patológico final. En segundo lugar, esto aumenta la probabilidad de recibir tejido con cantidades adecuadas de tejido canceroso viable. Especialmente en los cánceres de páncreas con una reacción desmoplástica pronunciada y áreas necróticas frecuentes, las partes viables son difíciles de identificar macroscópicamente para el ojo no entrenado. Como excepción a esta regla, los bloques de tejido de grandes metástasis hepáticas o pulmonales, a veces pueden ser exculpados "back-table" por el cirujano, si los márgenes quirúrgicos se pueden definir macroscópicamente. Es posible que el cáncer rectal resecado por la escisión mesorectal total (TME), no sea adecuado para el biobanco, ya que la recolección de tejidos del espécimen resecado antes de la incrustación de parafina podría interferir con la evaluación de la calidad de las TME. Alternativamente, el tejido para biobanco puede ser adquirido por biopsia transanal de cáncer rectal.
Las tasas de establecimiento de cultivos celulares primarios derivados del tumor original son generalmente bajas. Es más probable que se puedan establecer con éxito cultivos celulares secundarios derivados de PDX. Recomendamos pruebas de diferentes medios para cada caso y el uso de suplementos antibióticos para los primeros pasajes para reducir la contaminación al mínimo ya que el tejido cosechado rara vez es estéril. Después de una propagación exitosa, cada línea celular individual debe ser confirmada como una línea de células cancerosas mediante análisis FACS y pruebas periódicas para detectar la contaminación por micoplasma. Para excluir la contaminación cruzada, se recomienda un análisis regular de STR. Cabe señalar, que el protocolo de establecimiento para las líneas celulares primarias y secundarias se somete constantemente a la optimización. Los detalles relativos a la composición y las tasas de éxito de los medios únicos están claramente fuera del alcance de esta obra y se publicarán por separado.
Para el injerto PDX, el tejido tumoral se puede implantar directamente después de la resección o criopreservado en suero calve fetal con UN 10% de DMSO o medios de congelación similares para una implantación retardada. La implantación inmediatamente después de la recolección del tejido tumoral pone una tensión en el personal de logística y laboratorio, y los resultados de xenoinjertos después de la criopreservación no son inferiores en absoluto a 10. Además, la incubación del tejido en Matrigel antes de la implantación tumoral, aumenta significativamente las tasas de enjerftment12. Recomendamos retrasar el enjerftment tras el hallazgo patológico definitivo y la eliminación inmediata de especímenes de tejido recogidos erróneamente. Dado que la tasa de éxito del enjerftment primario aumenta con la inmunodeficiencia del ratón receptor, tendemos a utilizar ratones NSG para el primer paso PDX. Después del primer enjerftment PDX exitoso, los ratonesNMRI nu/nu pueden y deben utilizarse para pasajes posteriores y expansión de tejidos. Esta variedad es más robusta, más barata y más fácil de reproducir en comparación con NSG o cepas inmunodeficientes similares, pero todavía muestra tasas de enjertado razonables. Además, su desnudo facilita la implantación y el seguimiento del crecimiento tumoral. Para aumentar las tasas de enjertado en pasajes posteriores, recomendamos la transferencia directa de tejidos PDX recién cosechados a ratones anfitriones siempre que sea posible, especialmente para pdx de crecimiento lento y casos con una baja tasa de éxito de enjerftment primario. Collins y Lang revisaron recientemente 14 estudios de establecimiento colorrectal de PDX y reportaron tasas de arraigamiento que oscilan entre el 14 y el 100% con una tasa media de establecimiento pdx del 68%, siendo estos últimos consistentes con nuestros hallazgos13. En línea con la literatura, observamos menores tasas de establecimiento de páncreas en comparación con el cáncer colorrectal PDX14. Independientemente de la cepa del ratón huésped y la entidad tumoral, el crecimiento de linfomas de células B asociados al Virus Epstein-Barr (EBV) y linfomas murinos en el lado de la implantación plantea un escollo importante15,16. Si no se reconocen, estos tumores pueden "contaminar" pasajes posteriores y, por lo tanto, confundir resultados consecutivos. El crecimiento rápido inusual de PDX y la hinchazón de los ganglios linfáticos cervicales, axilares e inguinales son indicadores sólidos del crecimiento del linfoma murino, pero el examen histológico regular de PDX es, sin embargo, aconsejable. Además, la concordancia genética entre PDX y el paciente donante correspondiente debe hacerse la prueba periódica mediante análisis STR. Idealmente, el biobanco debe estar vinculado a una base de datos clínica que comprende las características de los pacientes (información general, supervivencia, supervivencia libre de recaídas, terapia, neoplasia secundaria, etc.). Debido a las regulaciones legales de protección de la privacidad y la falta de una base de datos anonymizada, nuestro conjunto de datos clínicos es administrado y actualizado regularmente manualmente por los médicos cooperantes.
Mientras que los biobancos convencionales se limitan a la investigación del observatorio, un biobanco vivo ofrece la oportunidad de intervenciones in vitro e in vivo. Las líneas celulares derivadas del paciente son una herramienta importante para la investigación fundamental, los exámenes farmacológicos de alto rendimiento y la evaluación de los nuevos agentes farmacéuticos4. Los modelos PDX correspondientes, sin embargo, son de creciente importancia, ya que recapitularán de cerca la histología del tumor original17,18 y muestran una alta estabilidad genética sobre varios pasajes19,20. Nuestro biobanco PDX ha demostrado ser una excelente plataforma para la investigación preclínica y fundamental6,21. Además, dado que las grandes colecciones de PDX reflejan adecuadamente la heterogeneidad inter-individual de la población del paciente, el enfoque del ensayo clínico PDX (PCT) (un animal por modelo por tratamiento) ha cobrado importancia para el desarrollo de fármacos, ya que permite la fiel predicción de la respuesta clínica a nuevos fármacos y al régimen combinatorio8. También estamos evaluando nuevos fármacos experimentales en pequeños ensayos de PCT.
A pesar de estos prometedores resultados, la mediana de duración del establecimiento de 12,2 meses, impide la aplicabilidad clínica de los modelos PDX como "ratones avatar" para probar las opciones de tratamiento anticancerígeno, al menos para aquellos pacientes que necesitan un adyuvante inmediato o incluso tratamiento neoadjuvante22. Una desventaja adicional de los modelos PDX estándar es la falta de usabilidad para las pruebas de inmunoterapia debido a la inmunodeficiencia de los ratones anfitriones. Para superar estas limitaciones, se han desarrollado varias cepas de ratón "humanizadas". Estos ratones están muy inmunodeprimidos, pero pueden ser reconstituidos con varios tipos de células derivadas de la médula ósea humana o células madre hematopoyéticas CD34+ posteriores al crecimiento de PDX23,permitiendo la evaluación de la citotoxicidad mediada por linfocitos y de la respuesta terapéutica al tratamiento inhibidor del punto de control inmune24,25.
En los últimos años, los organoides derivados del paciente (DOP) surgieron como importantes modelos oncológicos que compiten con PDX. Derivadas de piezas tumorales intactas y cultivadas en un andamio de matriz extracelular, estas estructuras tridimensionales reflejan de cerca las propiedades histológicas y genéticas del tumor original. La posibilidad de expansión y criopreservación a largo plazo hace de la DOP un suplemento ideal de un biobanco vivo26,27. Además de una tasa de establecimiento relativamente alta, se ha notificado una predicción fiable de la respuesta a fármacos para la DOP de varias entidades tumorales28. Además, incluso se han generado PDA a partir de células tumorales circulantes y también es posible el establecimiento simultáneo de organoides a partir del tejido sano correspondiente, permitiendo la evaluación de la toxicidad relacionada con el tratamiento de forma individual del paciente29,30. Sin embargo, en comparación con los cultivos celulares 2D convencionales, el cultivo organoide es lento y consume recursos y compuestos de matriz extracelular artificial pueden interferir con ciertos procedimientos analíticos31. Además, los organoides oncológicos son susceptibles al crecimiento excesivo por organoides no malignos de crecimiento más rápido derivados del epitelio saludable30. Debido a la falta de estroma, vasos sanguíneos y células inmunes, las PDA son en su mayoría inaplicables para la prueba de agentes inmunoterapéuticos antiangiogénicos. Sin embargo, los nuevos métodos de cultivo permiten el modelado del microambiente tumoral in vitro,convirtiendo a los PDA en un verdadero contendiente para los modelos32de PDX. En un futuro próximo, los modelos de tumores individuales para pacientes, combinados con potentes herramientas genéticas como la secuenciación de próxima generación, con suerte allanarán el camino hacia la verdadera medicina de precisión y enfoques de tratamiento personalizado.
Disclosures
ninguno.
Acknowledgments
Reconocemos amablemente a Jenny Burmeister, nuestra asistente gráfica, por la grabación y edición del video. Además, agradecemos a nuestros colegas del departamento quirúrgico y patológico la colaboración de larga data. También queremos dar las gracias a Marcus Müller, director de producción del Centro de TI y Medios de la Universidad de Rostock, por suministrar el equipo de grabación de audio y refinar la calidad del sonido.
FINANCIACIÓN: La Fundación Alemana de Ayuda contra el Cáncer (DKH e.V.), número de subvención 108446, y el número de subvención TBI-V-1-241-VBW-084 del estado Mecklemburgo-Vorpommern financiaron parcialmente esta investigación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacillol® AF; 1L | Bode, Hartmann | REF 973380 | desinfection |
| PP centrifuge tube, 15ml; sterile | Greiner Bio One | GBO Cat. No.:188271 | centrifuge tube |
| PP centrifuge tube, 50ml, sterile | Sarstedt | Order number: 62.547.254 | centrifuge tube |
| BD DiscarditTM II Syringe 20ml | BD | REF 300296 | blood collection |
| Serum 7,5ml Sarstedt Monovette | Sarstedt | Item number: 01.1601 | blood collection |
| serological Pipette 10ml | Sarstedt | REF 86.1254.001 | liquid transfer |
| Pipetboy ratiolab® accupetta | Ratiolab | Item number: RL3200300 | liquid transfer |
| PIPETBOY acu 2 | Integra Biosciences | VWR Cat.No: 613-4438 | liquid transfer |
| DPBS; w/o Ca & Mg | Pan Biotech | Cat. No.: P04-36500 | washing |
| Pancoll human | Pan Biotech | Cat. No.: P04-60500 | density gradient centrifugation |
| DMEM/F12 (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) | PAN Biotech | Cat. No.: P04-41500 | cell cultivation |
| FBS Good Forte (Filtrated Bovine Serum) | PAN Biotech | Cat. No.: P40-47500 | cell cultivation |
| L-Glutamine 200mM | PAN Biotech | Cat. No.: P04-80100 | cell cultivation |
| Trypsin / EDTA | PAN Biotech | Cat. No.: P10-023100 | cell cultivation |
| DMSO (Dimethyl Sulfoxid for cell culture) | PanReac AppliChem | VWR Cat.No: A3672.0250 | cell freezing |
| Freezer Medium (FCS with 10% DMSO) | selfmade | --- | cell freezing |
| cryotube- CryoPure 2ml | Sarstedt | 72380 | cell freezing |
| 6-Well cell culture plate; steril; with lid | Greiner bio-one | Cat.-No.: 657 160 | cell cultivation |
| Petri dish 92 x 16 mm, PS, without cams | Sarstedt | Cat. No.: 82.1472.001 | tissue preparation |
| sterile surgical blades | B.Braun (Aesculap) | REF BB510 | tissue preparation |
| BD DiscarditTM II Syringe 10ml | BD | REF 309110 | tissue preparation |
| cell strainer; yellow; 100µm | Falcon | REF 352360 | tissue preparation |
| CoolCell | biocision | Item number: 210004 | cooling container with -1°C/min |
| Dewar transport vessel type 27 B, 2 l, 138 mm | KGW | Cat. No.: HT39.1 | transport system |
| Pipette tip 200µl | Sarstedt | REF 70.760.002 | liquid transfer |
| Filter tip 1000µl | Sarstedt | REF 70.762.411 | liquid transfer |
| Pipette 200µl, yellow | Eppendorf | Cat. No.: 3121 000.082 | liquid transfer |
| Pipette 1000µl, blue | Eppendorf | Cat. No.: 3121 000.120 | liquid transfer |
| incubator BB 6220 CU | Heraeus | Cat.-No.: 51012839 | cell cultivation |
| heating plate PRÄZITHERM | Harry Gestigkeit GmbH | --- | heating |
| Microscope Zeiss Primo Vert | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | Serial number. 3842000839 | imaging cell cultures |
| Sterile bench Safe flow 1.8 nunc | nunc GmbH & Co. KG | --- | sterile working bench |
| freezer -80°C | Kryotec-Kryosafe GmbH | --- | sample storage |
| Electronic balance MP-300 | Chyo | --- | Scale |
| BD Micro-fine, U100 insulin syringe | BD | REF 324826 | injection anesthetic |
| Rompun 2%; 25ml | Bayer | approval number: 6293841.00.00 | anesthesia |
| Ketamin 100 mg/ml, 25ml | CP-Pharma GmbH | approval number: 401650.00.00 | anesthesia |
| GES3S Reader | Datamars | not available | RFID reader |
| ISO-Transponder FDX-B (1,4x8mm) | Peddymark | --- | RFID chip |
| Cotrim-ratiopharm® Ampullen SF 480 mg/5 ml | Ratiopharm | PZN-03928197 | antibiotic drinking water |
| Heating plate #FM-20 42x28cm | Dragon | --- | heating |
| Heating lamp | Electric Petra, Burgau | --- | heating |
| Ointment for the eyes and nose (5% Dexpanthenol) Bepanthen | Bayer | PZN-01578675 | Eye protection |
| anatomical tweezer | B.Braun Aesculap | BD21 OR | surgical instruments |
| surgical tweezer | B.Braun Aesculap | BD50 1 R | surgical instruments |
| scissors | B.Braun Aesculap | BC05 6R | surgical instruments |
| needle holder | B.Braun Aesculap | BH1 1 OR | surgical instruments |
| Prolene 5-0 | Ethicon | XN8870.P32 | surgical suture material |
| Opsite moisture vapour permable spray dressing | Smith&Nephew | REF 66004978, PZN- 02063507 | surgical suture material |
| Adhesive aperture drape | Barrier | REF 904622 | sterile OP tissue |
| gauze swap Gazin®; steril; 10x10 cm | Lohmann&Rauscher | REF 18506 | sterile OP tissue |
| Raucotupf cotton tipped applicators | Lohmann&Rauscher | REF 11969 | applicator |
| Corning® Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | Cat.-No.: 354234 | Basement Membrane Matrix |
| iodine solution Braunol (7,5g povidone iodine) | B.Braun Melsungen AG | Item number: 18839 | desinfection |
| MACS® Tissue Storage Solution | Miltenyi Biotec GmbH | Order No.:130-100-008 | storage solution |
| Formafix 4% | Grimm med. Logistik GmbH | Item number: F10010G | fixation solution |
| Software FreezerworksBasic | Dataworks Development, Inc | --- | sample organization |
| Zebra TLP 2844 printer | Zebra | --- | label printer |
References
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