I det følgende arbejde beskriver vi de på hinanden følgende trin, der er nødvendige for etableringen af en stor biobank af kolorektal og kræft i bugspytkirtlen.
I lyset af den voksende viden om kræftens inter-individuelle egenskaber og heterogenitet kræver det nye område for personlig medicin en platform for præklinisk forskning. I de senere år har vi etableret en biobank af kolorektal og kræft i bugspytkirtlen bestående af primære tumorvæv, normalt væv, sera, isolerede perifere blodlymfocytter (PBL), patient-afledte xenografts (PDX), samt primære og sekundære kræftcellelinjer. Da oprindelige tumorvæv er begrænset, og etableringen af primær kræft cellelinjer er stadig relativt lav, PDX tillade ikke kun bevarelse og udvidelse af biobank, men også generering af sekundære kræft cellelinjer. Desuden har PDX-modeller vist sig at være den ideelle in vivo model for prækliniske test af lægemidler. Biobanking kræver dog omhyggelig forberedelse, strenge retningslinjer og en velafstemt infrastruktur. Colectomy, duodenopancreatectomy eller resected metastaser prøver indsamles umiddelbart efter resektion og overføres til patologi afdelingen. Respekt prioritet af en upartisk histopatologisk rapport, efter skøn af den deltagende patolog, der udfører dissektioner, små tumor stykker og ikke-tumor væv høstes.
Nekrotiske dele kasseres, og det resterende tumorvæv skæres i små, identiske terninger og kryopreserveres til senere brug. Derudover, en lille del af tumoren er hakket og anstrengt for primær kræft cellekultur. Derudover behandles blodprøver fra patienten før og efter drift for at opnå serum og PBLs. Til PDX-engraftment optøes og implanteres kryopreserverede prøver subkutant i siderne af immundefektmus. Den resulterende PDX nøje opsummere histologi af “donor” tumorer og kan enten bruges til efterfølgende xenografting eller cryopreserved til senere brug. I det følgende arbejde beskriver vi de enkelte trin i skabelsen, vedligeholdelsen og administrationen af en stor biobank af kolorektal og kræft i bugspytkirtlen. Desuden fremhæver vi de afgørende detaljer og forbehold i forbindelse med biobanking.
I de senere år har den akkumulerede viden om kræftens morfologiske, kliniske og genetiske egenskaber ført til opfattelsen af kræft som en heterogen, individuel sygdom. Derfor har mutationskarakterisering af neoplasmer, foruden kliniske og patologiske træk, fået betydning for klinisk beslutningstagning, og mange målrettede terapier blev udviklet til forskellige molekylære ændringer. For eksempel, effekten af cetuximab i kolorektal cancer behandling kan forudsiges ved analyse af KRAS og PIK3CA mutationsstatus1. Præcisionsmedicin sigter mod en skræddersyet tilgang til at give den højeste behandlingsrespons hos hver patient og undgå toksicitet af ineffektive behandlinger2. Biobanker indeholder væv, blod og andre biologiske materialer af kræftpatienter, som er knyttet til de kliniske data, og dermed er et glimrende redskab til translationel kræftforskning. På grund af det store antal kliniske prøver gør biobanker det muligt at opdage sjældne, men potentielt lægemiddelfarlige mutationer, hvilket giver nye behandlingsmuligheder for den enkelte patient3.
For at dække så bredt som muligt et onkoologisk forskningsspektrum begrænsede vi ikke vores aktivitet på prøvehøst alene, men fokuserede på etablering af patientbaserede kræftcellelinjer og xenografter (PDX). Traditionelle 2D-cellelinjer forbliver hjørnestenen i in vitro-forskning og er det primære valg til store lægemiddelscreeninger4,5. Desuden celle linje analyse er ofte lettere, billigere og lettere tilgængelige. Derudover, da patient-afledte perifere blod lymfocytter (PBL) er tilgængelige, også tumor immunologi kan studeres in vitro6. De fleste nyudviklede lægemidler med lovende præklinisk effektivitet i cellebaserede in vitro- eller in vivo-forsøg har imidlertid vist skuffende resultater i kliniske forsøg7. I modsætning hertil har prækliniske undersøgelser baseret på PDX in vivo-undersøgelser afspejlet den kliniske aktivitet af antineoplastiske stoffer meget mere trofast8. Da PDX væv nøje afspejler histologiske og molekylære egenskaber donor tumor, PDX modeller er en god måde at udbrede de ofte meget begrænsede mængder af levedygtige tumorvæv til at opretholde integriteten af en biobank og til at tillade udveksling af prøver mellem forskergrupper og institutioner. Desuden kræft cellelinjer stammer fra PDX væv kan etableres betydeligt lettere end primær kræft cellelinjer9. I de senere år har vores arbejdsgruppe etableret en omfattende integreret kolorektal og kræft i bugspytkirtlen biobank ved trinvis standardisering og optimering af arbejdsflowet for alle de pågældende biologiske prøver (Figur 1).
Figur 1: Biobankens arbejdsgang og organisation Klik her for at se en større version af dette tal.
Dannelsen af en levende biobank forudsætter, ud over at overholde de juridiske regler om privatlivets fred, medicinsk ret og dyrevelfærd, en god infrastruktur og et velkoordineret team. Det har vist sig fordelagtigt direkte at inddrage en del af det kirurgiske personale i forskningsprocedurerne, da de meget vel kan vurdere den enkelte patients egnethed til vævsdonation. Desuden har patienterne en tendens til at give samtykke til biobanking oftere, når deres skriftlige godkendelse opnås inden for rammerne af den kirurgisk informerede samtykkediskussion. For at spare tid og ressourcer, tilfælde, der vil formentlig give utilstrækkelige mængder af tumorvæv bør ikke vælges til biobanking. Når det kommer til erhvervelse af prøver, er maksimen “kommunikation nøglen” en enkel, men ofte overset sandhed. Det tager kun en enkelt uvidende teater sygeplejerske eller kirurgisk kollega til at ødelægge prøven lige fra starten ved at gå videre som sædvanlig og tilføje formaldehyd til resektion prøve. Derfor er det helt afgørende, at hvert enkelt medlem af det involverede personale stifter bekendtskab med SOP for biobanking. Kirurger bør bemærkes dagen før og lige i starten af proceduren om planlagt vævsindsamling. Desuden bør sager, der udvælges til biobanking, fremhæves i den elektroniske OR-plan. Vævshøst fra den kirurgiske prøve skal udføres af en patolog. For det første vil dette sikre, at vævshøsten ikke forstyrrer den endelige patologiske rapport. For det andet øger dette sandsynligheden for at modtage væv med tilstrækkelige mængder af levedygtigt kræftvæv. Især i kræft i bugspytkirtlen med en udtalt desmoplastisk reaktion og hyppige nekrotiske områder, levedygtige dele er svære at identificere makrovidenskabeligt for utrænede øje. Som en undtagelse fra denne regel, væv blokke fra store lever-eller lungemetastaser, kan til tider fjernes “back-table” af kirurgen, hvis kirurgiske margener kan defineres makroskopisk. Endetarmskræft resected af den samlede mesorectal excision (TME), måske ikke være egnet til biobanking, da væv høst fra den resected prøve forud for paraffin indlejring kan forstyrre TME kvalitetsvurdering. Alternativt, væv til biobanking kan erhverves ved transanal biopsi af endetarmskræft.
Etableringen satser for primære cellekulturer stammer fra den oprindelige tumor er generelt lave. PDX-afledte, sekundære cellekulturer kan mere sandsynligt etableres med succes. Vi anbefaler test af forskellige medier for hvert enkelt tilfælde og brug af antibiotikatilskud til de første passager for at reducere forureningen til et minimum, da det høstede væv sjældent er sterilt. Efter vellykket formering, hver enkelt celle linje bør bekræftes som en kræft celle linje ved FACS analyse og regelmæssigt testet for mycoplasma forurening. For at udelukke krydskontaminering anbefales regelmæssig STR-analyse. Det skal bemærkes, at etableringsprotokollen for primære og sekundære cellelinjer konstant udsættes for optimering. Detaljer om de enkelte mediers sammensætning og succesrater ligger klart uden for dette værks anvendelsesområde og vil blive offentliggjort særskilt.
For PDX engraftment, tumor væv kan enten implanteres direkte efter resektion eller kryopreserveret i fosteret calve serum med 10% DMSO eller lignende indefrysning medier for forsinket implantation. Implantation umiddelbart efter tumorvæv høst lægger pres på logistik og laboratoriepersonale, og xenografting resultater efter cryopreservation er ikke ringere på alle 10. Desuden øger inkubation af vævet i Matrigel før tumorimplantation betydeligt engraftmenthastigheder12. Vi anbefaler forsinket engraftment efter konkret patologisk fund og øjeblikkelig bortskaffelse af fejlagtigt indsamlede vævsprøver. Da succesraten for primær engraftment stiger med immundefekt af modtagermusen, har vi en tendens til at bruge NSG-mus til den allerførste PDX-passage. Efter den første vellykkede PDX-engraftment kan og bør NMRInu/nu-mus bruges til efterfølgende passager og vævsudvidelse. Denne stamme er mere robust, billigere og lettere at opdrætte i forhold til NSG eller lignende immundefektstammer, men viser stadig rimelige engraftmenthastigheder. Desuden, dens nøgenhed letter implantation og tumor vækst overvågning. For at øge engraftmentraterne i efterfølgende passager anbefaler vi direkte overførsel af friskhøsted PDX-væv til at være vært for mus, når det er muligt, især for langsomt voksende PDX og tilfælde med en lav primær engraftment succesrate. Collins og Lang nylig gennemgået 14 undersøgelser af kolorektal PDX etablering og rapporterede engraftment satser varierer fra 14 til 100% med en median PDX etablering sats på 68%, sidstnævnte er i overensstemmelse med vores resultater13. I overensstemmelse med litteraturen observerede vi lavere etableringsrater for bugspytkirtel sammenlignet med kolorektal cancer PDX14. Uanset værten mus stamme og tumor enhed, udvækst af mennesker, Epstein-Barr Virus (EBV)-associerede B-celle lymfomer og murine lymfomer på implantation side udgør en vigtig faldgrube15,16. Hvis ukendt, sådanne tumorer kan “forurene” efterfølgende passager og dermed forvirre på hinanden følgende resultater. Usædvanlig hurtig PDX vækst og hævelse af livmoderhalskræft, axillar og inguinal lymfeknuder er stærke indikatorer for murine lymfom vækst, men regelmæssig histologisk undersøgelse af PDX er ikke desto mindre tilrådeligt. Desuden bør genetisk overensstemmelse mellem PDX og den tilsvarende donorpatient testes regelmæssigt ved hjælp af STR-analyse. Ideelt set bør biobanken knyttes til en klinisk database, der omfatter patienternes karakteristika (generel information, overlevelse, tilbagefaldsfri overlevelse, terapi, sekundær neoplasi osv.). På grund af juridiske regler om beskyttelse af personlige oplysninger og mangel på en sådan anonymiseret database administreres og opdateres vores kliniske datasæt regelmæssigt manuelt af de samarbejdende læger.
Mens konventionelle biobanker er begrænset til observatoriumforskning, giver en levende biobank mulighed for in vitro- og in vivo-interventioner. Patient-afledte cellelinjer er et vigtigt redskab til grundforskning, screening af lægemidler med høj gennemstrømning og vurdering af nye farmaceutiske midler4. Tilsvarende PDX-modeller er imidlertid af stigende betydning, da de nøje opsummerer histologien af den oprindelige tumor17,18 og viser en høj genetisk stabilitet over flere passager19,20. Vores PDX biobank har vist sig som en fremragende platform for præklinisk og grundforskning6,21. Da store PDX-samlinger desuden i tilstrækkelig grad afspejler patientpopulationens heterogenitet mellem de enkelte, har PDX’s kliniske forsøgsmetode (PCT) (et dyr pr. model pr. behandling) fået betydning for udviklingen af lægemidler, da det giver mulighed for en trofast forudsigelse af klinisk respons på nye lægemidler og kombinatorisk regime8. Vi er også i øjeblikket evaluere nye eksperimentelle lægemidler i små PCT forsøg.
På trods af disse lovende resultater, median etablering varigheden af 12,2 måned, hæmmer den kliniske anvendelighed af PDX modeller som “avatar mus” til test af anticancer behandlingsmuligheder, i det mindste for de patienter, der har behov for øjeblikkelig adjuvans eller endda neoadjuvans behandling22. En yderligere ulempe ved standard PDX-modeller er manglen på anvendelighed til immunterapitest på grund af værtsmuss immundefekt. For at overvinde disse begrænsninger er der udviklet flere “humaniserede” musestammer. Disse mus er stærkt immunkompromitterede, men kan rekonstitueres med forskellige typer af humane knoglemarvs-afledte celler eller CD34+ hæmatopoietiske stamceller efter PDX-udvækst23, hvilket gør det muligt at evaluere lymfocyt-medieret cytotoksicitet og behandlingsrespons på immunkontrolpunkthæmmerbehandling24,25.
I de senere år har patient-afledte organoider (BOB) vist sig som vigtige kræftmodeller konkurrerer med PDX. Stammer fra intakt tumor stykker og dyrket i en ekstracellulær matrix stillads, disse tre-dimensionelle strukturer nøje afspejler histologiske og genetiske egenskaber af den oprindelige tumor. Muligheden for langsigtet ekspansion og kryopræservering gør BOB til et ideelt supplement til en levende biobank26,27. Ud over en relativt høj etableringsrate er der rapporteret pålidelig lægemiddelresponsforudsigelse for BOB af flere tumorenheder28. Desuden er BOB’er endda blevet genereret fra cirkulerende tumorceller, og det er også muligt samtidig etablering af organoider fra tilsvarende sundt væv, hvilket gør det muligt at vurdere terapirelateret toksicitet på patient-individuel basis29,30. Sammenlignet med konventionelle 2D-cellekulturer er organoidkultur imidlertid tids- og ressourcekrævende, og kunstige ekstracellulære matrixforbindelser kan forstyrre visse analytiske procedurer31. Desuden er kræftorganoider modtagelige for overvækst ved hurtigere voksende, ikke-ondartede organoider afledt af sundt epitel30. På grund af mangel på stroma, blodkar og immunceller er BOB’er for det meste uanvendelige til test af antiangiogene immunterapeutiske midler. Men nye dyrkningsmetoder tillader modellering af tumormikromiljø in vitro, hvilket gør PDO’er til en sand udfordrer til PDX-modeller32. I den nærmeste fremtid, patient-individuelle tumor modeller, kombineret med kraftfulde genetiske værktøjer som næste generation sekventering, vil forhåbentlig bane vejen for ægte præcision medicin og skræddersyet behandling tilgange.
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkender venligst Jenny Burmeister, vores grafiske assistent, for optagelse og redigering af videoen. Derudover takker vi vores kolleger i den kirurgiske og patologiske afdeling for det mangeårige samarbejde. Vi vil også gerne takke Marcus Müller, produktionschef for IT- og Media Center, University of Rostock, for at levere lydoptagelsesudstyret og forfine lydkvaliteten.
FINANSIERING: Den tyske Cancer Aid Foundation (DKH e.V.), tilskud nummer 108446, og tilskud nummer TBI-V-1-241-VBW-084 fra staten Mecklenburg-Vorpommern delvist finansieret denne forskning.
Bacillol® AF; 1L | Bode, Hartmann | REF 973380 | desinfection |
PP centrifuge tube, 15ml; sterile | Greiner Bio One | GBO Cat. No.:188271 | centrifuge tube |
PP centrifuge tube, 50ml, sterile | Sarstedt | Order number: 62.547.254 | centrifuge tube |
BD DiscarditTM II Syringe 20ml | BD | REF 300296 | blood collection |
Serum 7,5ml Sarstedt Monovette | Sarstedt | Item number: 01.1601 | blood collection |
serological Pipette 10ml | Sarstedt | REF 86.1254.001 | liquid transfer |
Pipetboy ratiolab® accupetta | Ratiolab | Item number: RL3200300 | liquid transfer |
PIPETBOY acu 2 | Integra Biosciences | VWR Cat.No: 613-4438 | liquid transfer |
DPBS; w/o Ca & Mg | Pan Biotech | Cat. No.: P04-36500 | washing |
Pancoll human | Pan Biotech | Cat. No.: P04-60500 | density gradient centrifugation |
DMEM/F12 (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) | PAN Biotech | Cat. No.: P04-41500 | cell cultivation |
FBS Good Forte (Filtrated Bovine Serum) | PAN Biotech | Cat. No.: P40-47500 | cell cultivation |
L-Glutamine 200mM | PAN Biotech | Cat. No.: P04-80100 | cell cultivation |
Trypsin / EDTA | PAN Biotech | Cat. No.: P10-023100 | cell cultivation |
DMSO (Dimethyl Sulfoxid for cell culture) | PanReac AppliChem | VWR Cat.No: A3672.0250 | cell freezing |
Freezer Medium (FCS with 10% DMSO) | selfmade | — | cell freezing |
cryotube- CryoPure 2ml | Sarstedt | 72380 | cell freezing |
6-Well cell culture plate; steril; with lid | Greiner bio-one | Cat.-No.: 657 160 | cell cultivation |
Petri dish 92 x 16 mm, PS, without cams | Sarstedt | Cat. No.: 82.1472.001 | tissue preparation |
sterile surgical blades | B.Braun (Aesculap) | REF BB510 | tissue preparation |
BD DiscarditTM II Syringe 10ml | BD | REF 309110 | tissue preparation |
cell strainer; yellow; 100µm | Falcon | REF 352360 | tissue preparation |
CoolCell | biocision | Item number: 210004 | cooling container with -1°C/min |
Dewar transport vessel type 27 B, 2 l, 138 mm | KGW | Cat. No.: HT39.1 | transport system |
Pipette tip 200µl | Sarstedt | REF 70.760.002 | liquid transfer |
Filter tip 1000µl | Sarstedt | REF 70.762.411 | liquid transfer |
Pipette 200µl, yellow | Eppendorf | Cat. No.: 3121 000.082 | liquid transfer |
Pipette 1000µl, blue | Eppendorf | Cat. No.: 3121 000.120 | liquid transfer |
incubator BB 6220 CU | Heraeus | Cat.-No.: 51012839 | cell cultivation |
heating plate PRÄZITHERM | Harry Gestigkeit GmbH | — | heating |
Microscope Zeiss Primo Vert | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | Serial number. 3842000839 | imaging cell cultures |
Sterile bench Safe flow 1.8 nunc | nunc GmbH & Co. KG | — | sterile working bench |
freezer -80°C | Kryotec-Kryosafe GmbH | — | sample storage |
Electronic balance MP-300 | Chyo | — | Scale |
BD Micro-fine, U100 insulin syringe | BD | REF 324826 | injection anesthetic |
Rompun 2%; 25ml | Bayer | approval number: 6293841.00.00 | anesthesia |
Ketamin 100 mg/ml, 25ml | CP-Pharma GmbH | approval number: 401650.00.00 | anesthesia |
GES3S Reader | Datamars | not available | RFID reader |
ISO-Transponder FDX-B (1,4x8mm) | Peddymark | — | RFID chip |
Cotrim-ratiopharm® Ampullen SF 480 mg/5 ml | Ratiopharm | PZN-03928197 | antibiotic drinking water |
Heating plate #FM-20 42x28cm | Dragon | — | heating |
Heating lamp | Electric Petra, Burgau | — | heating |
Ointment for the eyes and nose (5% Dexpanthenol) Bepanthen | Bayer | PZN-01578675 | Eye protection |
anatomical tweezer | B.Braun Aesculap | BD21 OR | surgical instruments |
surgical tweezer | B.Braun Aesculap | BD50 1 R | surgical instruments |
scissors | B.Braun Aesculap | BC05 6R | surgical instruments |
needle holder | B.Braun Aesculap | BH1 1 OR | surgical instruments |
Prolene 5-0 | Ethicon | XN8870.P32 | surgical suture material |
Opsite moisture vapour permable spray dressing | Smith&Nephew | REF 66004978, PZN- 02063507 | surgical suture material |
Adhesive aperture drape | Barrier | REF 904622 | sterile OP tissue |
gauze swap Gazin®; steril; 10×10 cm | Lohmann&Rauscher | REF 18506 | sterile OP tissue |
Raucotupf cotton tipped applicators | Lohmann&Rauscher | REF 11969 | applicator |
Corning® Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | Cat.-No.: 354234 | Basement Membrane Matrix |
iodine solution Braunol (7,5g povidone iodine) | B.Braun Melsungen AG | Item number: 18839 | desinfection |
MACS® Tissue Storage Solution | Miltenyi Biotec GmbH | Order No.:130-100-008 | storage solution |
Formafix 4% | Grimm med. Logistik GmbH | Item number: F10010G | fixation solution |
Software FreezerworksBasic | Dataworks Development, Inc | — | sample organization |
Zebra TLP 2844 printer | Zebra | — | label printer |