Summary
I det følgende arbejde beskriver vi de på hinanden følgende trin, der er nødvendige for etableringen af en stor biobank af kolorektal og kræft i bugspytkirtlen.
Abstract
I lyset af den voksende viden om kræftens inter-individuelle egenskaber og heterogenitet kræver det nye område for personlig medicin en platform for præklinisk forskning. I de senere år har vi etableret en biobank af kolorektal og kræft i bugspytkirtlen bestående af primære tumorvæv, normalt væv, sera, isolerede perifere blodlymfocytter (PBL), patient-afledte xenografts (PDX), samt primære og sekundære kræftcellelinjer. Da oprindelige tumorvæv er begrænset, og etableringen af primær kræft cellelinjer er stadig relativt lav, PDX tillade ikke kun bevarelse og udvidelse af biobank, men også generering af sekundære kræft cellelinjer. Desuden har PDX-modeller vist sig at være den ideelle in vivo model for prækliniske test af lægemidler. Biobanking kræver dog omhyggelig forberedelse, strenge retningslinjer og en velafstemt infrastruktur. Colectomy, duodenopancreatectomy eller resected metastaser prøver indsamles umiddelbart efter resektion og overføres til patologi afdelingen. Respekt prioritet af en upartisk histopatologisk rapport, efter skøn af den deltagende patolog, der udfører dissektioner, små tumor stykker og ikke-tumor væv høstes.
Nekrotiske dele kasseres, og det resterende tumorvæv skæres i små, identiske terninger og kryopreserveres til senere brug. Derudover, en lille del af tumoren er hakket og anstrengt for primær kræft cellekultur. Derudover behandles blodprøver fra patienten før og efter drift for at opnå serum og PBLs. Til PDX-engraftment optøes og implanteres kryopreserverede prøver subkutant i siderne af immundefektmus. Den resulterende PDX nøje opsummere histologi af "donor" tumorer og kan enten bruges til efterfølgende xenografting eller cryopreserved til senere brug. I det følgende arbejde beskriver vi de enkelte trin i skabelsen, vedligeholdelsen og administrationen af en stor biobank af kolorektal og kræft i bugspytkirtlen. Desuden fremhæver vi de afgørende detaljer og forbehold i forbindelse med biobanking.
Introduction
I de senere år har den akkumulerede viden om kræftens morfologiske, kliniske og genetiske egenskaber ført til opfattelsen af kræft som en heterogen, individuel sygdom. Derfor har mutationskarakterisering af neoplasmer, foruden kliniske og patologiske træk, fået betydning for klinisk beslutningstagning, og mange målrettede terapier blev udviklet til forskellige molekylære ændringer. For eksempel, effekten af cetuximab i kolorektal cancer behandling kan forudsiges ved analyse af KRAS og PIK3CA mutationsstatus1. Præcisionsmedicin sigter mod en skræddersyet tilgang til at give den højeste behandlingsrespons hos hver patient og undgå toksicitet af ineffektive behandlinger2. Biobanker indeholder væv, blod og andre biologiske materialer af kræftpatienter, som er knyttet til de kliniske data, og dermed er et glimrende redskab til translationel kræftforskning. På grund af det store antal kliniske prøver gør biobanker det muligt at opdage sjældne, men potentielt lægemiddelfarlige mutationer, hvilket giver nye behandlingsmuligheder for den enkelte patient3.
For at dække så bredt som muligt et onkoologisk forskningsspektrum begrænsede vi ikke vores aktivitet på prøvehøst alene, men fokuserede på etablering af patientbaserede kræftcellelinjer og xenografter (PDX). Traditionelle 2D-cellelinjer forbliver hjørnestenen i in vitro-forskning og er det primære valg til store lægemiddelscreeninger4,5. Desuden celle linje analyse er ofte lettere, billigere og lettere tilgængelige. Derudover, da patient-afledte perifere blod lymfocytter (PBL) er tilgængelige, også tumor immunologi kan studeres in vitro6. De fleste nyudviklede lægemidler med lovende præklinisk effektivitet i cellebaserede in vitro- eller in vivo-forsøg har imidlertid vist skuffende resultater i kliniske forsøg7. I modsætning hertil har prækliniske undersøgelser baseret på PDX in vivo-undersøgelser afspejlet den kliniske aktivitet af antineoplastiske stoffer meget mere trofast8. Da PDX væv nøje afspejler histologiske og molekylære egenskaber donor tumor, PDX modeller er en god måde at udbrede de ofte meget begrænsede mængder af levedygtige tumorvæv til at opretholde integriteten af en biobank og til at tillade udveksling af prøver mellem forskergrupper og institutioner. Desuden kræft cellelinjer stammer fra PDX væv kan etableres betydeligt lettere end primær kræft cellelinjer9. I de senere år har vores arbejdsgruppe etableret en omfattende integreret kolorektal og kræft i bugspytkirtlen biobank ved trinvis standardisering og optimering af arbejdsflowet for alle de pågældende biologiske prøver (Figur 1).
Figur 1: Biobankens arbejdsgang og organisation Klik her for at se en større version af dette tal.
Protocol
Følgende undersøgelse er godkendt af det institutionelle bedømmelsesudvalg for University Medical Center Rostock (II HV 43/2004, A 45/2007, A 2018-0054, A 2019-0187 og A 2019-0222). Desuden er alle veterinære relevante procedurer blevet godkendt af Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg-Vorpommern under registreringsnumrene LALLF M-V/TSD/ 7221.3-2-020/17 og 7221.3-1-007/19.
1. Eksperimentelle forudsætninger
- Opfylde flere vigtige rammebetingelser for at etablere og vedligeholde en biobank.
- Brug en klinik med en kirurgisk afdeling og et tilstrækkeligt antal onkologiske resektioner sammen med et veludstyret laboratorium og tilstrækkeligt akademisk personale. En god infrastruktur og en fast forbindelse med en samarbejdende patologiafdeling er yderligere forudsætninger.
- Til in vivo-forskning skal du bruge et dyreanlæg med boligforhold, der passer til immundefektmus.
- Få tilladelse til enhver forskning i patient-afledt materiale fra en sundhedspleje etisk udvalg. Indhente godkendelse af enhver in vivo-forskning fra den kompetente myndighed i henhold til lokale lovbestemmelser.
2. Prøveindsamling
- Dagen før operationen
- Vurder alle patienter med resectable kolorektal eller kræft i bugspytkirtlen og / eller tilsvarende metastaser for biobanking berettigelse. Undgå at medtage tilfælde med neoadjuvans forbehandling, meget små tumorer, tumorer af usikker værdighed eller læsioner, som er blevet delvist resected endoskopisk før.
- Få skriftlig godkendelse af patientens deltagelse under den informerede samtykkediskussion om den kirurgiske procedure. Informer rettidig alle involverede kirurger, laboratorieteamet såvel som patologen.
- Prøve anskaffelse
- Informer alle hjælpere i operationsstuen (OR) om vævsindsamlingen til biobanken umiddelbart før starten på den kirurgiske procedure.
BEMÆRK: Det er afgørende, at vævet ikke må fastgøres i formalin. Hvis vævet er nedsænket i formalin, bliver det uegnet til integreret biobanking. - Træk 40 mL hepariniseret blod (2 x 20 mL sprøjte) samt en standard 7,5 mL serum rør umiddelbart efter bedøvelse induktion og overføre hurtigt til laboratoriet for PBL isolation og serum behandling (se trin 3-4).
- Den resected prøve fås direkte fra operationsbordet, læg den i en passende beholder og tag den til den patologiske afdeling. Skriv tidspunktet for løsrivelse fra cirkulation, resektion og ankomst til patologi ned.
BEMÆRK: Prøveemnets egnethed til biobank bør vurderes af den samarbejdsvillige patolog, der dissekerer et stykke tumor og ikke-ondartet væv. Du må ikke fjerne dele af prøven alene, som kan bringe den efterfølgende patologiske rapport i fare. - Placer begge vævsstykker i et separat 15 til 50 mL polypropylenrør med 10 til 30 ml vævsopbevaringsopløsning (eller DPBS) på is. Skriv tidspunktet for modtagelsen ned, og overfør straks prøverne til laboratoriet.
BEMÆRK: Følgende protokoltrin 3-6 skal udføres i et laminarflowkabinet under strenge sterile forhold. Brug alle væsker ved stuetemperatur.
- Informer alle hjælpere i operationsstuen (OR) om vævsindsamlingen til biobanken umiddelbart før starten på den kirurgiske procedure.
3. Behandling af serum
- Centrifuge det 7,5 mL serumrør ved 1128 x g og 4 °C i 15 minutter i en forkølet centrifuge.
- Aliquot 1 mL serum pr. rør i formærkede kryorør og fryser i flydende nitrogen.
4. Isolering af PBL ved tæthedsgradient centrifugering
BEMÆRK: Arbejd parallelt med hver af de to 20 mL sprøjter.
- Fyld 20 mL hepariniseret blod i et 50 mL polypropylenrør og tilsæt 15 mL DPBS.
- Tag 15 mL Pancoll med en serologisk pipette, indsæt pipetten forsigtigt hele vejen til bunden af polypropylenrøret og slip Pancoll meget langsomt for at danne et lag under blod / DBPS-kolonnen.
- Centrifuge ved 375 x g i 15 minutter uden bremse.
- Aspirat og overfør det uigennemsigtige interfaselag mellem midten og den øverste kolonne af begge prøver til et friskt 50 mL polypropylenrør og fyld op med DPBS til 50 mL.
- Centrifuge ved 270 x g i 15 minutter med bremse.
- Aspirat og kassér supernatanten, genbrug cellepillen i 4,5 mL frysermedium.
- Aliquot 1,5 mL af suspensionen pr. kryorør, luk rørene tæt og læg dem i en frysebeholder, der er egnet til langsom frysning og opbevares ved -80 °C.
5. Vævsbehandling
BEMÆRK: Start med generationen af snap frosne prøver af tumor og sundt væv for at opretholde integriteten af nukleinsyrer.
- Tumorvævsprøve
- Tumorprøven overføres med flere ml vævsopbevaringsopløsning fra polypropylenrøret til en petriskål. Skyl om nødvendigt med DPBS. Undgå at røre ved prøven og bruge to sterile skalpeller til at håndtere vævet. Undgå udtørring når som helst.
- Afveje tumor prøve på en bekvem skala i en separat skål og bemærk vævsvægt.
- Vurder størrelse, form og vævskvalitet af tumorvævet, før du skærer. Tilstræbe at opnå mindst ét stykke på størrelse med en pinhead til snap frysning og fire terninger på ca. 30 mm3 (kant længde 3 x 3x 3 mm) hver for vital kryopræservering. Generer så mange 30 mm3-terninger i firdobler som muligt og generere et stykke for snap frysning pr 5 firdobler. Også tage hensyn til, at nekrotiske portioner skal afskæres, så terningerne kun består af vitalt væv.
- Generer skiver af 3 mm tykkelse. Afskær nekrotiske portioner, der kan skelnes som gellignende eller flydende masse, og skær skiverne i terninger af de to ønskede størrelser.
BEMÆRK: Der må ikke kasseres væv på nuværende tidspunkt. - Fastgør frysning
- Label kryorør i overensstemmelse hermed (se trin 7.7).
- Placer et lille væv stykke pr pre-mærket cryotube. Prøverne nedsænkes straks i flydende nitrogen i flere minutter og opbevares efterfølgende ved -80 °C.
- Kryopræservering af vitalt væv
- Label kryorør i overensstemmelse hermed (se trin 7.7) og fyld hver med 1,5 mL fryser medium. Placer frysebeholderen ved siden af bænken.
BEMÆRK: Følg de næste trin så hurtigt som muligt. Da DMSO i frysemediet har cytotoksiske egenskaber, bør tidspunktet for det væv, der nedsænkes i frysermedium uden korrekt afkøling, ikke overstige 2 minutter. - Arranger 30 mm3 terninger i firdobler. Skub nekrotisk væv og andre rester til kanten af skålen, men kassér dem ikke.
- Scoop terningerne med skalpelbladet og overfør 4 terninger pr. kryorør. Sørg for, at tumor stykker er helt nedsænket i fryser medium. Luk rørene tæt og læg dem i en frysebeholder, der er egnet til langsom frysning, og opbevar dem i en fryser på -80 °C.
- Kryorør overføres til et egnet opbevaringssystem til langtidsopbevaring ved -140 °C eller lavere. Dokumentation i laboratoriets lagerstyringssystem er obligatorisk.
- Label kryorør i overensstemmelse hermed (se trin 7.7) og fyld hver med 1,5 mL fryser medium. Placer frysebeholderen ved siden af bænken.
- Sundt vævsprøve: Gentag trin 5.1.1. til 5.1.6.4 for den sunde vævsprøve.
6. Primær cellekultur
- Opløse resterne af tumorvævet, herunder den nekrotiske skrot, i petriskålen med skalpellerne i stykker så små som muligt.
- En steril cellesien (100 μm porestørrelse) anbringes oven på et 50 mL polypropylenrør.
- Brug en serologisk pipette til at tilføje 5-10 mL DPBS til petriskålen, flyde vævsresterne og pipette op og ned for at generere en suspension.
- Overfør affjedringen med pipetten til cellesien.
- Gentag trin 6.3-6.4, indtil alt væv forbliver løst fra petriskålen.
- Brug stemplet på en 20 mL envejssprøjte til at presse celle- og vævsaffjedringen gennem cellesien.
- Skyl med 5-10 mL frisk DPBS, kassér cellesien og luk røret korrekt.
- Affjedringen centrifuges ved 180 x g i 5-10 minutter.
- Forbered en kollagen-I precoated 6 godt plade med 1,5 mL medium per brønd.
- Aspirér og kassér supernatanten. Pelletpen blev genbrugt i 3 mL DPBS eller medium og tilføjede 500 μL af suspensionen til hver brønd. Pladen anbringes i inkubatoren (100 % fugtighed, 5 % CO2, 37 °C)
- Overvåg pladen dagligt for cellevækst og forurening.
BEMÆRK: Yderligere celle dyrkning op til det punkt, hvor etableringen af en permanent celle linje er ikke beskrevet her.
7. PDX Generation
- Udfør kunforsøg med passende kvalificerede personer, der opfylder kravene fra den kompetente myndighed i din jurisdiktion.
- Hus immundefekt mus under specifikke patogenfri (SPF) betingelser, der opfylder kravene i den anvendte musestamme. De hygiejniske foranstaltninger omfatter individuelt ventilerede bure, autoklaveret mad, vand og redemateriale samt en sikkerhedsluftlås og brug af personlige, beskyttende udstyr.
- Autoklave alle instrumenter på forhånd og brug kun ét sæt instrumenter til hver tumor sag for at undgå krydskontaminering. Håndtere tumorvævet så aseptisk som muligt. Alle plastgenstande, der er nævnt nedenfor, skal være sterile, engangsbrug og kasseres efter hver operation.
BEMÆRK: Bestemt af metoden til frysning af fire tumorvævstykker pr. kryorør kræver PDX-generationen altid to mus pr. Prøve, hvilket ideelt resulterer i fire PDX-tumorer. - Vælg den ønskede primære tumor til engraftment via laboratoriet inventory management system og overføre prøven (vitalt bevaret tumorvæv) fra de vigtigste lagertank til en bærbar flydende nitrogen container (Intermediate opbevaring ved -80 °C på tøris er også praktisk).
- Tag personlige værnemidler på, før du går ind i SPF-sektionen (krat, træsko, forklæde, hårdæksel, kirurgisk maske og overshoes), desinficere dine hænder og alt udstyr.
- Matrigel iblødsætning
- Fjern kryorøret fra den flydende nitrogenbeholder, og vent på optøning af prøven.
- Mærk et 50 mL polypropylenrør og fyld med 35 mL DPBS.
- Vip kryorøret op og ned, og overfør straks indholdet til polypropylenrøret, så snart vævet-medium-sjap kan flyttes. Skyl forsigtigt tumorvævstykkerne, kassér hovedvolumenet fra røret i et separat fartøj, luk låget og læg røret op-side-down, så de fire vævsstykker samles i låget.
- Sæt en petriskål på køleakkumulatoren og læg 100 μL Matrigel som en enkelt dråbe i midten. Brug anatomiske pincet til at overføre tumor stykker i Matrigel. Sørg for, at hvert stykke er dækket helt med Matrigel. Inkuber i 10 minutter ved 4 °C.
- Musebedøvelse (2 mus pr. prøve, arbejde parallelt)
- Der fremstilles en 3:1- bestand af en ketamin (100 mg/mL) og xylazin (20 mg/mL) bedøvelsesopløsning. Den anbefalede dosis er 90/6 mg/kg legemsvægt.
- Vej musen og optræk den nødvendige bedøvelsesopløsning i en engangs insulinsprøjte.
- Placer musen på burets gitter, træk halen forsigtigt med den ene hånd for at fremkalde en fremadgående bevægelse og samtidig krabbe halsen med et knivspidsgreb på den anden side. Løft musen på gitteret og drej holdehånden, så dyrets ryg hviler på din håndflade. Immobilisere en af bagbenene med din pinky og injicere narkotika intraperitoneally. Sæt musen tilbage til sit bur og afvente narkotiske induktion.
- Placer den bedøvede mus på varmepladen og dæk øjnene med salve for at undgå hornhindeskader. Æsler dybden af anæstesi ved forsigtigt at klemme bagsiden foden af musen med kirurgisk tang.
BEMÆRK: Fravær af bevægelse indikerer dyb narkose. Enhver form for bevægelse enten kræver mere tid til at nå den ønskede narkotiske dybde eller en ekstra dosis af bedøvelsesmidler.
- Kirurgisk procedure
- Form en hudfold ved at klemme musens hals og injicere mikrochippen subkutant med applikatoren (Se trin 9 for programmeringsdetaljer)
- Barber musens sider, hvis det er nødvendigt (NMRInu/nu mus kræver ikke barbering), påfør povidone-jod med en vatpind og brug kirurgisk drapering til at skabe et sterilt felt.
- Løft flankens hud med kirurgiske pincet, lav et lille snit på ca. 4 mm og form en lille subkutan lomme ved stump forberedelse med saks.
- Sæt en tumor stykke i hver lomme og placere den i bagenden.
- Klip enden af en 100 μL pipettespids, og indsug den resterende Matrigel fra petriskålen, og påfør den ligeligt i hver hudlomme.
- Luk sårene med enkle afbrudte suturer og påfør spraydressing.
- Scan mikrochippen og kontroller gyldigheden af muse- og tumor-ID.
- Forbered et nyt bur med frisk strøelse og nestemateriale samt en gnavepind. Fold en "pude" ud af papirhåndklæder og læg musen med forhøjet hoved under en infrarød varmelampe.
- 0,25 mL trimethoprim/sulfamethoxazol (400 mg/80 mg) blandes med 100 mL drikkevand og administreres via drikkeflasken. Overvej at en mus bruger ca. 150 mL pr. Kg kropsvægt dagligt.
BEMÆRK: Da den subkutane PDX-model ikke er forbundet med postoperativ smerte, hverken under sårhelingsprocessen eller under tumorudvækst er postoperativ analgesi ikke påkrævet. Bemærk, at din institutions/myndigheds retningslinjer for dyrevelfærd kan være forskellige. - Overvågning af forsøgsdyr
- Overvåg musene dagligt for tegn på nød. Dette kan uddelegeres til kvalificerede dyr viceværter.
- Hold op postoperative antibiotiske behandling med ovennævnte dosis i 4 uger. Udskift antibiotikablandingen to gange om ugen.
- Mål tumor størrelse mindst en gang om ugen, ideelt dagligt, med en caliper (tumor volumen = 0,52 x længde x bredde x højde [mm3]) og optage i databasen.
8. PDX-høst og -forarbejdning
- Høst og behandl PDX-tumoren, når:
Tumorstørrelsen når målvolumenet på 1.500 mm3.
Tumorbærende dyr viser tegn på angst og / eller sygdom, og behandling er forgæves.
Tumoren bliver sår eller trænger ind i musens hud. - Læs mikrochippen op for at identificere den korrekte PDX.
- Aflive musen ved en juridisk metode (afhængigt af nationale retningslinjer) som for eksempel CO2-kvælningeller ketamin / xylazin injektion efterfulgt af livmoderhalskræft dislokation.
- Løft huden med kirurgiske pincet på flankerne og incise med Metzenbaum saks et par millimeter væk fra tumoren.
- Løsrive huden over tumoren ved stump forberedelse, og tag derefter forsigtigt tumoren med anatomiske pincet og løsrive tumoren fra kroppens overfladiske fascia.
- Skyl tumoren med DPBS, læg den i en petriskål og fjern tilstødende bindevæv.
- Udfør et af følgende på dette tidspunkt:
- Klip 30 mm3 kuber, og opret ny PDX (Fortsæt med protokollen ved punkt 7.7.4).
- Skær tumoren i skiver, som derefter overføres til histologi kassetter og bevares i 4% formaldehyd til senere paraffinindlejring.
- Bevar tumoren i et rør med vævsopbevaringsopløsning for at tilføje den til biobanken (Fortsæt med protokollen i trin 3.) og/ eller opret PDX-afledte cellelinjer (Fortsæt med protokollen ved trin 4.)
9. Biobank og datastyring
- Tildel et internt id til hvert tumortilfælde i henhold til tabel 1.
| Laboratorieplacering/navn | kræft enhed | fortløbende sagsnummer | Specifikation | fortløbende nummer |
| C=kolorektal | _Met=Metastase | |||
| P=bugspytkirtel | _Tu=Tumor | |||
| Eksempel: HROC389_Met2 = Rostock, tyktarmskræft, tilfælde 389, anden metastase | ||||
Tabel 1: Definition af eksempel-id'et.
- Opbevar patientens samtykke i elektronisk og papirform sammen med tumor-ID.
- Indsamle så mange kliniske data som muligt og gemme dem anonymiseret og separat.
- Brug en datastyringssoftware (f.eks. Freezerworks) eller en anden, og opret en grænseflade med en etiketudskrivningssoftware for at generere temperaturbestandige, selvhævdende stregkodeetiketter.
- Tilføj en ny prøve ved at åbne datastyringssoftwaren, definere prøvetypen og registrere følgende oplysninger: tumor-id, vævstype, frysemetode, dato, ansvarlig medarbejder, passagenummer, muse-id og musebelastning.
- Tildel prøverne til bestemte positioner i lagertanken.
- Sporing og overvågning af PDX (gælder for trin 7-8)
- Brug en MS Access-database (eller et lignende system) på en bærbar, Bluetooth-aktiveret enhed (bærbar computer eller tablet) til at registrere tumor-id, dato for implantation, dato for aktiv dødshjælp, musealder og -belastning samt tumorvækst over tid.
- Tilslut mikrochiplæseren til enheden, og læs mikrochippen op inden implantation.
- Tildel et bestemt id til hver mus. vi anvender følgende ordning: (se tabel 2 nedenfor)
- Efter implantation skal du registrere id'et sammen med musens egenskaber i databasen.
- Læs mikrochippen igen, og kontroller, om specifikationerne for mikrochippen, databasen og kryorøretiketten er konsistente.
- Opret en etiket for hvert musebur i overensstemmelse hermed.
BEMÆRK: Hvis du vil oprette en fysisk sikkerhedskopiering, skal du sætte kryorøretiketterne med de tilsvarende mikrochipetiketter i et hæfte og en notedato og musebelastning. - For at overvåge tumorvæksten af den enkelte PDX skal du scanne musens mikrochip med læseren tilsluttet databaseenheden til identifikation og registrere tumorstørrelsen målt ved caliper hver uge.
- Planlæg det ideelle tidspunkt for PDX høst ved at analysere tumorens vækstkurve.
| Tumor-ID | Forudgående opbevaring i N2 (=f) | Passagenummer (=T) | fortløbende musenummer (=M) |
| Eksempel: HROP12 fT0 M1 = Rostock, kræft i bugspytkirtlen, tilfælde 12, genereret af frosset primært væv, første passage, mus 1. | |||
Tabel 2: Definition af PDX-id' et.
Representative Results
I vores hænder var etableringsraten for primærcellekulturer (Figur 2A &B) 12,9% i en stor serie9. De fleste forsøg på at isolere udvidelige tumorceller fra friske kirurgiske resected prøver mislykkedes på grund af manglende udvækst eller tidlig forurening. Cellelinje etablering blev anset for vellykket efter 3 passager med en stabil vækst under standard kultur betingelser (DMEM, 10% FCS, standard kultur fartøj) og validering af epitel differentiering via FACS-analyse10. Cellelinjer afledt af PDX tumorer (Figur 2C & D) viste en højere etablering på 23,6%, hvilket også skyldes muligheden for gentagne forsøg i modsætning til primære resected tumorer9. Nogle blandede kulturer(figur 2E)kan imidlertid ikke frigøres for fibroblastisk vækst eller går endda tabt på grund af fibroblastisk overvækst(figur 2F).
Figur 2:Cellekultur. Primær kræft cellelinjer, stammer fra en metastase af tyktarmskræft tilfælde HROC313, passage 21 (A) og kræft i bugspytkirtlen tilfælde HROP88, passage 5 (B). PDX-afledte kræftcellelinjer i tyktarmen PDX HROC285 T0 M2 (D) og bugspytkirtel PDX HROP10 T5 M2, passage 4 (E). Blandet kultur af fibroblaster og kræftceller fra kræft i bugspytkirtlen HROP75, passage 8 (C) og fibroblastisk overvækst (F). Klik her for at se en større version af dette tal.
I betragtning af ændringer i PDX generation protokol, mus anvendte stammer og også eksperimenterer over flere år, samt store forskelle i mængden af tumorvæv til rådighed for engraftment, er det ikke trivielt at give den samlede succesrate for PDX generation. I en meget ny serie af PDX generation eksperimenter udført af to forskere (S.M. og F.B.), primære udvækst satser på 63% for kolorektal PDX (en eksemplarisk histologi kan afbildes fra figur 3A) og 48% for bugspytkirtel PDX (Figur 3B) blev observeret. Udvæksten af murin eller humane lymfomer på implantationsstedet er relativt sjælden, men kan efterligne vellykket PDX-udvækst (Figur 3C). Bortset fra histopatologiske undersøgelser blev overensstemmelsen mellem PDX-modeller og deres donorpatienter regelmæssigt bekræftet ved kort tandemrekomstanalyse(figur 3D). Til i dag biobank består >50 primære og >50 sekundære kolorektal, 3 primære og 6 sekundære kræft i bugspytkirtlen cellelinjer samt >150 kolorektal og 19 bugspytkirtel PDX modeller.
Figur 3: Repræsentativ histologisk sammenligning af kolorektal (A) og bugspytkirtel PDX (B). Humant lymfom på implantationsstedet efterligner PDX-udvækst (C). Genetisk identitetstest af en PDX-model (HROC430 T1 M2) til den oprindelige patient tumorvæv (HROC430Tu) ved kort tandem repeat (STR) analyse. Sammenligning af de ni STR loci, vWA, THO1, TPOX, CSF1 PO (FAM farvestof) og D5S818, D13S317, D7S820, D16S539 (HEX farvestof) ved hjælp af multiplex PCR med fluorescerende-mærkede primere efter kapillær elektrophoresis bekræftet genetisk overensstemmelse mellem PDX og donor tumor (D). Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Dannelsen af en levende biobank forudsætter, ud over at overholde de juridiske regler om privatlivets fred, medicinsk ret og dyrevelfærd, en god infrastruktur og et velkoordineret team. Det har vist sig fordelagtigt direkte at inddrage en del af det kirurgiske personale i forskningsprocedurerne, da de meget vel kan vurdere den enkelte patients egnethed til vævsdonation. Desuden har patienterne en tendens til at give samtykke til biobanking oftere, når deres skriftlige godkendelse opnås inden for rammerne af den kirurgisk informerede samtykkediskussion. For at spare tid og ressourcer, tilfælde, der vil formentlig give utilstrækkelige mængder af tumorvæv bør ikke vælges til biobanking. Når det kommer til erhvervelse af prøver, er maksimen "kommunikation nøglen" en enkel, men ofte overset sandhed. Det tager kun en enkelt uvidende teater sygeplejerske eller kirurgisk kollega til at ødelægge prøven lige fra starten ved at gå videre som sædvanlig og tilføje formaldehyd til resektion prøve. Derfor er det helt afgørende, at hvert enkelt medlem af det involverede personale stifter bekendtskab med SOP for biobanking. Kirurger bør bemærkes dagen før og lige i starten af proceduren om planlagt vævsindsamling. Desuden bør sager, der udvælges til biobanking, fremhæves i den elektroniske OR-plan. Vævshøst fra den kirurgiske prøve skal udføres af en patolog. For det første vil dette sikre, at vævshøsten ikke forstyrrer den endelige patologiske rapport. For det andet øger dette sandsynligheden for at modtage væv med tilstrækkelige mængder af levedygtigt kræftvæv. Især i kræft i bugspytkirtlen med en udtalt desmoplastisk reaktion og hyppige nekrotiske områder, levedygtige dele er svære at identificere makrovidenskabeligt for utrænede øje. Som en undtagelse fra denne regel, væv blokke fra store lever-eller lungemetastaser, kan til tider fjernes "back-table" af kirurgen, hvis kirurgiske margener kan defineres makroskopisk. Endetarmskræft resected af den samlede mesorectal excision (TME), måske ikke være egnet til biobanking, da væv høst fra den resected prøve forud for paraffin indlejring kan forstyrre TME kvalitetsvurdering. Alternativt, væv til biobanking kan erhverves ved transanal biopsi af endetarmskræft.
Etableringen satser for primære cellekulturer stammer fra den oprindelige tumor er generelt lave. PDX-afledte, sekundære cellekulturer kan mere sandsynligt etableres med succes. Vi anbefaler test af forskellige medier for hvert enkelt tilfælde og brug af antibiotikatilskud til de første passager for at reducere forureningen til et minimum, da det høstede væv sjældent er sterilt. Efter vellykket formering, hver enkelt celle linje bør bekræftes som en kræft celle linje ved FACS analyse og regelmæssigt testet for mycoplasma forurening. For at udelukke krydskontaminering anbefales regelmæssig STR-analyse. Det skal bemærkes, at etableringsprotokollen for primære og sekundære cellelinjer konstant udsættes for optimering. Detaljer om de enkelte mediers sammensætning og succesrater ligger klart uden for dette værks anvendelsesområde og vil blive offentliggjort særskilt.
For PDX engraftment, tumor væv kan enten implanteres direkte efter resektion eller kryopreserveret i fosteret calve serum med 10% DMSO eller lignende indefrysning medier for forsinket implantation. Implantation umiddelbart efter tumorvæv høst lægger pres på logistik og laboratoriepersonale, og xenografting resultater efter cryopreservation er ikke ringere på alle 10. Desuden øger inkubation af vævet i Matrigel før tumorimplantation betydeligt engraftmenthastigheder12. Vi anbefaler forsinket engraftment efter konkret patologisk fund og øjeblikkelig bortskaffelse af fejlagtigt indsamlede vævsprøver. Da succesraten for primær engraftment stiger med immundefekt af modtagermusen, har vi en tendens til at bruge NSG-mus til den allerførste PDX-passage. Efter den første vellykkede PDX-engraftment kan og bør NMRInu/nu-mus bruges til efterfølgende passager og vævsudvidelse. Denne stamme er mere robust, billigere og lettere at opdrætte i forhold til NSG eller lignende immundefektstammer, men viser stadig rimelige engraftmenthastigheder. Desuden, dens nøgenhed letter implantation og tumor vækst overvågning. For at øge engraftmentraterne i efterfølgende passager anbefaler vi direkte overførsel af friskhøsted PDX-væv til at være vært for mus, når det er muligt, især for langsomt voksende PDX og tilfælde med en lav primær engraftment succesrate. Collins og Lang nylig gennemgået 14 undersøgelser af kolorektal PDX etablering og rapporterede engraftment satser varierer fra 14 til 100% med en median PDX etablering sats på 68%, sidstnævnte er i overensstemmelse med vores resultater13. I overensstemmelse med litteraturen observerede vi lavere etableringsrater for bugspytkirtel sammenlignet med kolorektal cancer PDX14. Uanset værten mus stamme og tumor enhed, udvækst af mennesker, Epstein-Barr Virus (EBV)-associerede B-celle lymfomer og murine lymfomer på implantation side udgør en vigtig faldgrube15,16. Hvis ukendt, sådanne tumorer kan "forurene" efterfølgende passager og dermed forvirre på hinanden følgende resultater. Usædvanlig hurtig PDX vækst og hævelse af livmoderhalskræft, axillar og inguinal lymfeknuder er stærke indikatorer for murine lymfom vækst, men regelmæssig histologisk undersøgelse af PDX er ikke desto mindre tilrådeligt. Desuden bør genetisk overensstemmelse mellem PDX og den tilsvarende donorpatient testes regelmæssigt ved hjælp af STR-analyse. Ideelt set bør biobanken knyttes til en klinisk database, der omfatter patienternes karakteristika (generel information, overlevelse, tilbagefaldsfri overlevelse, terapi, sekundær neoplasi osv.). På grund af juridiske regler om beskyttelse af personlige oplysninger og mangel på en sådan anonymiseret database administreres og opdateres vores kliniske datasæt regelmæssigt manuelt af de samarbejdende læger.
Mens konventionelle biobanker er begrænset til observatoriumforskning, giver en levende biobank mulighed for in vitro- og in vivo-interventioner. Patient-afledte cellelinjer er et vigtigt redskab til grundforskning, screening af lægemidler med høj gennemstrømning og vurdering af nye farmaceutiske midler4. Tilsvarende PDX-modeller er imidlertid af stigende betydning, da de nøje opsummerer histologien af den oprindelige tumor17,18 og viser en høj genetisk stabilitet over flere passager19,20. Vores PDX biobank har vist sig som en fremragende platform for præklinisk og grundforskning6,21. Da store PDX-samlinger desuden i tilstrækkelig grad afspejler patientpopulationens heterogenitet mellem de enkelte, har PDX's kliniske forsøgsmetode (PCT) (et dyr pr. model pr. behandling) fået betydning for udviklingen af lægemidler, da det giver mulighed for en trofast forudsigelse af klinisk respons på nye lægemidler og kombinatorisk regime8. Vi er også i øjeblikket evaluere nye eksperimentelle lægemidler i små PCT forsøg.
På trods af disse lovende resultater, median etablering varigheden af 12,2 måned, hæmmer den kliniske anvendelighed af PDX modeller som "avatar mus" til test af anticancer behandlingsmuligheder, i det mindste for de patienter, der har behov for øjeblikkelig adjuvans eller endda neoadjuvans behandling22. En yderligere ulempe ved standard PDX-modeller er manglen på anvendelighed til immunterapitest på grund af værtsmuss immundefekt. For at overvinde disse begrænsninger er der udviklet flere "humaniserede" musestammer. Disse mus er stærkt immunkompromitterede, men kan rekonstitueres med forskellige typer af humane knoglemarvs-afledte celler eller CD34+ hæmatopoietiske stamceller efter PDX-udvækst23, hvilket gør det muligt at evaluere lymfocyt-medieret cytotoksicitet og behandlingsrespons på immunkontrolpunkthæmmerbehandling24,25.
I de senere år har patient-afledte organoider (BOB) vist sig som vigtige kræftmodeller konkurrerer med PDX. Stammer fra intakt tumor stykker og dyrket i en ekstracellulær matrix stillads, disse tre-dimensionelle strukturer nøje afspejler histologiske og genetiske egenskaber af den oprindelige tumor. Muligheden for langsigtet ekspansion og kryopræservering gør BOB til et ideelt supplement til en levende biobank26,27. Ud over en relativt høj etableringsrate er der rapporteret pålidelig lægemiddelresponsforudsigelse for BOB af flere tumorenheder28. Desuden er BOB'er endda blevet genereret fra cirkulerende tumorceller, og det er også muligt samtidig etablering af organoider fra tilsvarende sundt væv, hvilket gør det muligt at vurdere terapirelateret toksicitet på patient-individuel basis29,30. Sammenlignet med konventionelle 2D-cellekulturer er organoidkultur imidlertid tids- og ressourcekrævende, og kunstige ekstracellulære matrixforbindelser kan forstyrre visse analytiske procedurer31. Desuden er kræftorganoider modtagelige for overvækst ved hurtigere voksende, ikke-ondartede organoider afledt af sundt epitel30. På grund af mangel på stroma, blodkar og immunceller er BOB'er for det meste uanvendelige til test af antiangiogene immunterapeutiske midler. Men nye dyrkningsmetoder tillader modellering af tumormikromiljø in vitro, hvilket gør PDO'er til en sand udfordrer til PDX-modeller32. I den nærmeste fremtid, patient-individuelle tumor modeller, kombineret med kraftfulde genetiske værktøjer som næste generation sekventering, vil forhåbentlig bane vejen for ægte præcision medicin og skræddersyet behandling tilgange.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Vi anerkender venligst Jenny Burmeister, vores grafiske assistent, for optagelse og redigering af videoen. Derudover takker vi vores kolleger i den kirurgiske og patologiske afdeling for det mangeårige samarbejde. Vi vil også gerne takke Marcus Müller, produktionschef for IT- og Media Center, University of Rostock, for at levere lydoptagelsesudstyret og forfine lydkvaliteten.
FINANSIERING: Den tyske Cancer Aid Foundation (DKH e.V.), tilskud nummer 108446, og tilskud nummer TBI-V-1-241-VBW-084 fra staten Mecklenburg-Vorpommern delvist finansieret denne forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacillol® AF; 1L | Bode, Hartmann | REF 973380 | desinfection |
| PP centrifuge tube, 15ml; sterile | Greiner Bio One | GBO Cat. No.:188271 | centrifuge tube |
| PP centrifuge tube, 50ml, sterile | Sarstedt | Order number: 62.547.254 | centrifuge tube |
| BD DiscarditTM II Syringe 20ml | BD | REF 300296 | blood collection |
| Serum 7,5ml Sarstedt Monovette | Sarstedt | Item number: 01.1601 | blood collection |
| serological Pipette 10ml | Sarstedt | REF 86.1254.001 | liquid transfer |
| Pipetboy ratiolab® accupetta | Ratiolab | Item number: RL3200300 | liquid transfer |
| PIPETBOY acu 2 | Integra Biosciences | VWR Cat.No: 613-4438 | liquid transfer |
| DPBS; w/o Ca & Mg | Pan Biotech | Cat. No.: P04-36500 | washing |
| Pancoll human | Pan Biotech | Cat. No.: P04-60500 | density gradient centrifugation |
| DMEM/F12 (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) | PAN Biotech | Cat. No.: P04-41500 | cell cultivation |
| FBS Good Forte (Filtrated Bovine Serum) | PAN Biotech | Cat. No.: P40-47500 | cell cultivation |
| L-Glutamine 200mM | PAN Biotech | Cat. No.: P04-80100 | cell cultivation |
| Trypsin / EDTA | PAN Biotech | Cat. No.: P10-023100 | cell cultivation |
| DMSO (Dimethyl Sulfoxid for cell culture) | PanReac AppliChem | VWR Cat.No: A3672.0250 | cell freezing |
| Freezer Medium (FCS with 10% DMSO) | selfmade | --- | cell freezing |
| cryotube- CryoPure 2ml | Sarstedt | 72380 | cell freezing |
| 6-Well cell culture plate; steril; with lid | Greiner bio-one | Cat.-No.: 657 160 | cell cultivation |
| Petri dish 92 x 16 mm, PS, without cams | Sarstedt | Cat. No.: 82.1472.001 | tissue preparation |
| sterile surgical blades | B.Braun (Aesculap) | REF BB510 | tissue preparation |
| BD DiscarditTM II Syringe 10ml | BD | REF 309110 | tissue preparation |
| cell strainer; yellow; 100µm | Falcon | REF 352360 | tissue preparation |
| CoolCell | biocision | Item number: 210004 | cooling container with -1°C/min |
| Dewar transport vessel type 27 B, 2 l, 138 mm | KGW | Cat. No.: HT39.1 | transport system |
| Pipette tip 200µl | Sarstedt | REF 70.760.002 | liquid transfer |
| Filter tip 1000µl | Sarstedt | REF 70.762.411 | liquid transfer |
| Pipette 200µl, yellow | Eppendorf | Cat. No.: 3121 000.082 | liquid transfer |
| Pipette 1000µl, blue | Eppendorf | Cat. No.: 3121 000.120 | liquid transfer |
| incubator BB 6220 CU | Heraeus | Cat.-No.: 51012839 | cell cultivation |
| heating plate PRÄZITHERM | Harry Gestigkeit GmbH | --- | heating |
| Microscope Zeiss Primo Vert | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | Serial number. 3842000839 | imaging cell cultures |
| Sterile bench Safe flow 1.8 nunc | nunc GmbH & Co. KG | --- | sterile working bench |
| freezer -80°C | Kryotec-Kryosafe GmbH | --- | sample storage |
| Electronic balance MP-300 | Chyo | --- | Scale |
| BD Micro-fine, U100 insulin syringe | BD | REF 324826 | injection anesthetic |
| Rompun 2%; 25ml | Bayer | approval number: 6293841.00.00 | anesthesia |
| Ketamin 100 mg/ml, 25ml | CP-Pharma GmbH | approval number: 401650.00.00 | anesthesia |
| GES3S Reader | Datamars | not available | RFID reader |
| ISO-Transponder FDX-B (1,4x8mm) | Peddymark | --- | RFID chip |
| Cotrim-ratiopharm® Ampullen SF 480 mg/5 ml | Ratiopharm | PZN-03928197 | antibiotic drinking water |
| Heating plate #FM-20 42x28cm | Dragon | --- | heating |
| Heating lamp | Electric Petra, Burgau | --- | heating |
| Ointment for the eyes and nose (5% Dexpanthenol) Bepanthen | Bayer | PZN-01578675 | Eye protection |
| anatomical tweezer | B.Braun Aesculap | BD21 OR | surgical instruments |
| surgical tweezer | B.Braun Aesculap | BD50 1 R | surgical instruments |
| scissors | B.Braun Aesculap | BC05 6R | surgical instruments |
| needle holder | B.Braun Aesculap | BH1 1 OR | surgical instruments |
| Prolene 5-0 | Ethicon | XN8870.P32 | surgical suture material |
| Opsite moisture vapour permable spray dressing | Smith&Nephew | REF 66004978, PZN- 02063507 | surgical suture material |
| Adhesive aperture drape | Barrier | REF 904622 | sterile OP tissue |
| gauze swap Gazin®; steril; 10x10 cm | Lohmann&Rauscher | REF 18506 | sterile OP tissue |
| Raucotupf cotton tipped applicators | Lohmann&Rauscher | REF 11969 | applicator |
| Corning® Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | Cat.-No.: 354234 | Basement Membrane Matrix |
| iodine solution Braunol (7,5g povidone iodine) | B.Braun Melsungen AG | Item number: 18839 | desinfection |
| MACS® Tissue Storage Solution | Miltenyi Biotec GmbH | Order No.:130-100-008 | storage solution |
| Formafix 4% | Grimm med. Logistik GmbH | Item number: F10010G | fixation solution |
| Software FreezerworksBasic | Dataworks Development, Inc | --- | sample organization |
| Zebra TLP 2844 printer | Zebra | --- | label printer |
References
- Sartore-Bianchi, A., et al. PIK3CA mutations in colorectal cancer are associated with clinical resistance to EGFR-targeted monoclonal antibodies. Cancer research. 69 (5), 1851-1857 (2009).
- Pauli, C., et al. Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine. Cancer discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
- Lipson, D., et al. Identification of new ALK and RET gene fusions from colorectal and lung cancer biopsies. Nature medicine. 18 (3), 382-384 (2012).
- Wilding, J. L., Bodmer, W. F. Cancer cell lines for drug discovery and development. Cancer research. 74 (9), 2377-2384 (2014).
- Mouradov, D., et al. Colorectal cancer cell lines are representative models of the main molecular subtypes of primary cancer. Cancer research. 74 (12), 3238-3247 (2014).
- Klier, U., Maletzki, C., Kreikemeyer, B., Klar, E., Linnebacher, M. Combining bacterial-immunotherapy with therapeutic antibodies: a novel therapeutic concept. Vaccine. 30 (17), 2786-2794 (2012).
- DiMasi, J. A., Reichert, J. M., Feldman, L., Malins, A. Clinical approval success rates for investigational cancer drugs. Clinical pharmacology and therapeutics. 94 (3), 329-335 (2013).
- Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nature medicine. 21 (11), 1318-1325 (2015).
- Mullins, C. S., et al. Integrated Biobanking and Tumor Model Establishment of Human Colorectal Carcinoma Provides Excellent Tools for Preclinical Research. Cancers. 11 (10), (2019).
- Kuehn, F., et al. Establishment and characterization of HROC69 - a Crohn's related colonic carcinoma cell line and its matched patient-derived xenograft. Scientific reports. 6, 24671 (2016).
- Dangles-Marie, V., et al. Establishment of human colon cancer cell lines from fresh tumors versus xenografts: comparison of success rate and cell line features. Cancer research. 67 (1), 398-407 (2007).
- Gock, M., et al. Tumor Take Rate Optimization for Colorectal Carcinoma Patient-Derived Xenograft Models. BioMed research international. 2016, 11715053 (2016).
- Collins, A. T., Lang, S. H. A systematic review of the validity of patient derived xenograft (PDX) models: the implications for translational research and personalised medicine. PeerJ. 6, 5981 (2018).
- Brown, K. M., et al. Patient-derived xenograft models of colorectal cancer in pre-clinical research: a systematic review. Oncotarget. 7 (40), 66212-66225 (2016).
- Zhang, L., et al. The extent of inflammatory infiltration in primary cancer tissues is associated with lymphomagenesis in immunodeficient mice. Scientific reports. 5, (2015).
- Moyer, A. M., et al. Spontaneous murine tumors in the development of patient-derived xenografts: a potential pitfall. Oncotarget. 10 (39), 3924-3930 (2019).
- Prall, F., Maletzki, C., Hühns, M., Krohn, M., Linnebacher, M. Colorectal carcinoma tumour budding and podia formation in the xenograft microenvironment. PloS one. 12 (10), 0186271 (2017).
- Guenot, D., et al. Primary tumour genetic alterations and intra-tumoral heterogeneity are maintained in xenografts of human colon cancers showing chromosome instability. The Journal of pathology. 208 (5), 643-652 (2006).
- Mattie, M., et al. Molecular characterization of patient-derived human pancreatic tumor xenograft models for preclinical and translational development of cancer therapeutics. Neoplasia. 15 (10), New York, N.Y. 1138-1150 (2013).
- Cho, Y. B., et al. Colorectal cancer patient-derived xenografted tumors maintain characteristic features of the original tumors. The Journal of surgical research. 187 (2), 502-509 (2014).
- Maletzki, C., et al. Functional Characterization and Drug Response of Freshly Established Patient-Derived Tumor Models with CpG Island Methylator Phenotype. PloS one. 10 (11), 0143194 (2015).
- Katsiampoura, A., et al. Modeling of Patient-Derived Xenografts in Colorectal Cancer. Molecular cancer therapeutics. 16 (7), 1435-1442 (2017).
- Wege, A. K., et al. Humanized tumor mice--a new model to study and manipulate the immune response in advanced cancer therapy. International journal of cancer. 129 (9), 2194-2206 (2011).
- Herndler-Brandstetter, D., et al. Humanized mouse model supports development, function, and tissue residency of human natural killer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), 9626-9634 (2017).
- Capasso, A., et al. Characterization of immune responses to anti-PD-1 mono and combination immunotherapy in hematopoietic humanized mice implanted with tumor xenografts. Journal for immunotherapy of cancer. 7 (1), 37 (2019).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), New York, N.Y. 920-926 (2018).
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature reviews. Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Abe, Y., et al. Improved phosphoproteomic analysis for phosphosignaling and active-kinome profiling in Matrigel-embedded spheroids and patient-derived organoids. Scientific reports. 8 (1), 11401 (2018).
- Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
