Summary
다음 작업에서는 대장암과 췌장암의 대형 바이오뱅크 설립에 필요한 연속적인 단계를 설명합니다.
Abstract
암의 개별 적인 속성 및 이질성에 관하여 증가하는 지식의 관점에서, 개인화한 약의 신흥 필드는 전임상 연구를 위한 발판이 필요합니다. 최근 몇 년 동안, 우리는 1 차종양 조직, 정상 조직, 세라, 고립 된 말초 혈액 림프구 (PBL), 환자 유래 제노 이식 (PDX), 뿐만 아니라 1 차 및 이차 암 세포주로 구성된 대장암 및 췌장암의 바이오 뱅크를 설립했습니다. 원래 종양 조직이 제한되어 있고 1차 암 세포주의 확립속도가 여전히 상대적으로 낮기 때문에, PDX는 바이오뱅크의 보존 및 확장뿐만 아니라 이차암 세포주의 생성을 허용한다. 또한 PDX 모델은 전임상 약물 검사를 위한 이상적인 생체 내 모델로 입증되었습니다. 그러나 바이오뱅킹은 신중한 준비, 엄격한 지침 및 잘 조율된 인프라가 필요합니다. 콜절제술, 십이지장 생성 절제술 또는 절제된 전이 표본은 절제 직후 수집되어 병리학 부서로 옮겨질 수 있습니다. 해부를 수행하는 출석 병리학자의 재량에 따라 편견없는 조직 병리학 보고서의 우선 순위를 존중하는 것은 작은 종양 조각 및 비 종양 조직을 수확합니다.
괴사 부품은 버려지고 나머지 종양 조직은 작고 동일한 큐브로 절단되고 나중에 사용하기 위해 냉동 보존됩니다. 추가적으로, 종양의 작은 부분은 1 차적인 암 세포 배양을 위해 다진 및 긴장됩니다. 추가적으로, 수술 전 및 수술 후 환자에게서 뽑아낸 혈액 샘플은 혈청 및 PBL을 얻기 위하여 처리됩니다. PDX 이식의 경우, 냉동 보존 된 표본은 면역 결핍 마우스의 측면으로 해동되고 이식됩니다. 결과 PDX는 "기증자" 종양의 역사학을 밀접하게 재구성하고 후속 xenografting 또는 나중에 사용하기 위해 냉동 보존에 사용될 수 있습니다. 다음 작업에서, 우리는 대장암과 췌장암의 큰 바이오 뱅크의 생성, 유지 보수 및 관리의 개별 단계를 설명합니다. 또한 바이오뱅킹과 관련된 중요한 세부 사항과 주의 사항을 강조합니다.
Introduction
최근 몇 년 동안, 암의 형태학, 임상 및 유전 적 특성에 대한 축적 된 지식은 이질성, 개별 질환으로 암의 개념으로 이어졌습니다. 결과적으로, 신생물의 돌연변이 특성화는 임상 및 병리학적 특징 외에도 임상 의사 결정에 중요성을 얻고 있으며 다양한 분자 변경을 위해 많은 표적 치료법이 개발되었습니다. 예를 들어, 대장암 치료에서 세툭시맙의 효능은 KRAS 및 PIK3CA 돌연변이 상태1의분석에 의해 예측될 수 있다. 정밀 의학은 각 환자에서 가장 높은 치료 반응을 제공하고 불부한 치료법2의독성을 피하기 위해 맞춤형 접근 방식을 목표로합니다. 바이오뱅크에는 임상 데이터와 연결된 암 환자의 조직, 혈액 및 기타 생물학적 물질이 포함되어 있어 번역암 연구를 위한 훌륭한 도구입니다. 많은 수의 임상 샘플로 인해 바이오뱅크는 희귀하지만 잠재적으로 약물이 가능한 돌연변이의 검출을 가능하게 하며, 이는 개별 환자에게 새로운 치료 기회를제공한다 3.
가능한 한 광범위하게 종양학 연구 스펙트럼을 커버하기 위해, 우리는 단독으로 견본 수확에 우리의 활동을 억제하지 않았습니다, 그러나 환자 유래암 세포주 및 xenografts (PDX)의 설치에 집중했습니다. 전통적인 2D 세포주 체외 연구의 코너 돌 남아 있으며 대규모 약물스크리닝4,5에대한 최고의 선택이다. 또한, 세포주 분석은 종종 더 쉽고 저렴하며 더 쉽게 사용할 수 있습니다. 또한, 환자 유래 말초 혈액 림프구(PBL)가 가능하기 때문에 종양 면역학도 시험관 6에서연구될 수 있다. 그러나, 시험관 내 또는 생체 내 실험에 기반한 세포에서 유망한 전임상 효과성을 가진 새로 개발된 약물의 대다수는 임상 시험7에서실망스러운 결과를 보였다. 대조적으로, 생체 내 PDX에 기초한 전임상 연구는 훨씬 더 충실하게 항신성형제의 임상 활성을 반영하였다8. PDX 조직은 기증자 종양의 조직학적 및 분자 특성을 밀접하게 반영하기 때문에 PDX 모델은 바이오 뱅크의 무결성을 유지하고 연구 그룹과 기관 간의 샘플 교환을 허용하기 위해 종종 매우 제한된 양의 실행 가능한 종양 조직을 전파하는 좋은 방법입니다. 더욱이, PDX 조직에서 유래된 암 세포주9보다 훨씬 쉽게 확립될 수있다. 최근 몇 년 동안, 우리의 워킹 그룹은 문제의 모든 생물학적 샘플에 대한 작업 흐름을 단계별 표준화 및 최적화하여 포괄적 인 통합 대장암 및 췌장암 바이오 뱅크를 설립했습니다(그림 1).
그림 1: 바이오뱅크의 워크플로우 및 조직은 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Protocol
다음 연구는 대학 의료 센터 Rostock의 기관 검토 위원회에 의해 승인되었습니다 (II HV 43/2004, A 45/2007, A 2018-0054, A 2019-0187 및 A 2019-0222). 또한, 모든 수의학 관련 절차는 등록 번호 LALLF M-V /TSD / 7221.3-2-020/17 및 7221.3-10에 따라 Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicheit und Fischerei Mecklenburg-Vorpommern에 의해 승인되었습니다.
1. 실험 전제 조건
- 바이오뱅크를 설립하고 유지하기 위한 몇 가지 중요한 프레임워크 조건을 충족합니다.
- 외과 부서와 충분한 수의 종양학 절제술을 갖춘 클리닉과 잘 갖추어진 실험실 및 충분한 학술 직원과 함께 사용하십시오. 좋은 인프라와 협력 병리학 부서와의 확고한 연락은 추가 전제 조건입니다.
- 생체 내 연구를 위해 면역 결핍 마우스에 적합한 주거 조건을 가진 동물 시설을 사용하십시오.
- 의료 윤리 위원회에서 환자 파생 자료에 대한 모든 연구에 대한 승인을 받으십시오. 현지 법정 규정에 따라 관할 당국으로부터 생체 내 연구에 대한 승인을 얻으십시오.
2. 샘플 컬렉션
- 수술 전날
- 절제 가능한 대장암 또는 췌장암 및/또는 바이오뱅킹 자격에 대한 해당 전이환자를 평가합니다. 네오아드주반트 전처리, 아주 작은 종양, 불확실한 존엄성 또는 병변의 종양이 이전에 부분적으로 내시경적으로 절제된 케이스를 포함하지 마십시오.
- 수술 절차에 대한 정보에 입각한 동의 토론 중에 환자의 참여에 대한 서면 승인을 얻습니다. 적시에 모든 관련 외과 의사, 실험실 팀 뿐만 아니라 병리학자를 알립니다.
- 샘플 수집
- 수술실(OR)의 모든 승무원에게 수술 수술 이 시작되기 직전에 바이오뱅크의 조직 수집에 대해 알립니다.
참고: 조직이 포르말린에 고정되어서는 안 되는 것이 중요합니다. 조직이 포르말린에 잠긴 경우 통합 바이오 뱅킹에 적합하지 않습니다. - 40mL의 고원화된 혈액(2 x 20mL 주사기)과 표준 7.5mL 혈청튜브를 마취 유도 직후에 끌어들이고 PBL 격리 및 혈청 처리를 위해 실험실로 신속하게 이송합니다(3단계 3-4 단계 참조).
- 수술대에서 직접 절제된 시편을 구하고 적절한 용기에 넣고 병리학 부서에 가져가십시오. 병리학에서 순환, 절제술 및 도착에서 분리의 시간 지점을 적어 둡니다.
참고: 바이오 뱅킹시 표본의 적합성은 종양 과 비 악성 조직의 조각을 해부하는 협력 병리학자에 의해 평가되어야 합니다. 후속 병리학 적 보고를 손상시킬 수있는 직접 표본의 일부를 소비하지 마십시오. - 두 조직 조각을 별도의 15~50mL 폴리프로필렌 튜브에 10~30mL 조직 저장 용액(또는 DPBS)을 얼음에 놓습니다. 수령 시간을 기록하고 표본을 즉시 실험실로 옮기십시오.
참고: 다음 프로토콜 단계 3-6은 엄격한 멸균 조건하에서 라미나르 흐름 캐비닛에서 수행해야 합니다. 실온에서 모든 액체를 사용하십시오.
- 수술실(OR)의 모든 승무원에게 수술 수술 이 시작되기 직전에 바이오뱅크의 조직 수집에 대해 알립니다.
3. 세럼 가공
- 원심분리기는 7.5mL 혈청튜브를 1128xg, 4°C에서 15분간 미리 냉각된 원심분리기에서 원심분리하였다.
- 사전 라벨이 붙은 냉동튜브의 튜브 당 1mL 세럼을 알리쿼트하고 액체 질소로 동결합니다.
4. 밀도 그라데이션 원심분리에 의한 PBL 분리
참고: 20mL 주사기 2개와 평행하게 작업합니다.
- 50 mL 폴리 프로필렌 튜브에 헤파린화 혈액 의 20 mL을 채우고 DPBS의 15 mL을 추가합니다.
- 15mL의 판콜을 세골 파이프로 가져 가서 파이펫을 폴리 프로필렌 튜브의 바닥까지 조심스럽게 삽입하고 매우 천천히 판콜을 방출하여 혈액 /DBPS 컬럼 아래에 층을 형성하십시오.
- 375 x g의 원심분리기는 브레이크없이 15 분 동안.
- 두 샘플의 중간 및 상단 컬럼 사이의 불투명한 상간 층을 신선한 50mL 폴리프로필렌 튜브로 배분하고 DPBS를 50mL로 채웁니다.
- 270 x g의 원심분리기는 브레이크로 15분 동안.
- 흡인 및 슈퍼나탄을 폐기하고, 냉동고 배지의 4.5mL에서 세포 펠릿을 재보중단한다.
- 동결튜브당 서스펜션의 알리쿼트 1.5mL은 튜브를 단단히 닫고 느린 동결에 적합한 냉동 용기에 넣고 -80°C에 보관한다.
5. 조직 처리
참고: 핵산의 무결성을 유지하기 위해 종양과 건강한 조직의 스냅 냉동 샘플 생성부터 시작합니다.
- 종양 조직 표본
- 폴리프로필렌 튜브에서 페트리 접시로 여러 mL의 조직 저장 용액으로 종양 시편을 전달한다. 필요한 경우 DPBS로 헹구는 경우. 시편을 만지지 말고 두 개의 멸균 메스를 사용하여 조직을 처리하십시오. 언제든지 탈수되지 마십시오.
- 종양 표본을 별도의 접시에 편리한 스케일로 계량하고 조직 무게를 기록합니다.
- 절단하기 전에 종양 조직의 크기, 모양 및 조직 품질을 평가합니다. 스냅 동결핀헤드 의 크기에 대해 적어도 한 조각을 얻는 것을 목표로 하고 있으며, 중요한 냉동 보존을 위해 각각 30mm3(가장자리 길이 3 x 3mm) 4개의 큐브를 얻을 수 있습니다. 가능한 한 30mm3-큐브를 4배로 생성하고 5개의 네 배당 스냅 동결을 위해 한 조각을 생성합니다. 또한 큐브가 중요한 조직으로만 구성되도록 괴사 부위를 잘라야 한다는 점을 고려하십시오.
- 두께가 3mm인 조각을 생성합니다. 괴사 부분을 잘라, 젤 같은 또는 액체 질량으로 구별, 두 원하는 크기의 큐브로 조각을 잘라.
참고 : 이 시점에서 어떤 조직을 버리지 마십시오. - 스냅 동결
- 그에 따라 라벨 극저온튜브(7.7단계 참조).
- 미리 표시된 냉동 튜브 당 작은 티슈 조각 1 개를 놓습니다. 샘플을 즉시 액체 질소에 몇 분 동안 담그고 -80 °C에 저장하십시오.
- 중요한 조직의 냉동 보존
- 그에 따라 냉동 튜브를 라벨 (단계 7.7 참조) 냉동고 매체의 1.5 mL각각을 채웁니다. 동결 용기를 벤치 옆에 놓습니다.
참고: 가능한 한 빨리 다음 단계를 따르십시오. 냉동고 배지의 DMSO는 세포독성 특성을 가지고 있기 때문에 적절한 냉각 없이 냉동고 배지에 침수되는 조직의 시간은 2분을 초과해서는 안 된다. - 30mm3 큐브를 네 배로 배열합니다. 괴사 조직 및 기타 유해를 접시 가장자리에 밀어 넣지만 버리지 마십시오.
- 메스 블레이드로 큐브를 떠서 저온튜브 당 4개의 큐브를 옮습니다. 종양 조각이 냉동고 배지에 완전히 침수되어 있는지 확인하십시오. 튜브를 단단히 닫고 느린 동결에 적합한 냉동 용기에 넣고 -80 °C 냉동고에 보관하십시오.
- -140°C 이하의 장기 보관을 위한 적합한 저장 시스템으로 냉동튜브를 전송합니다. 실험실 재고 관리 시스템의 설명은 필수입니다.
- 그에 따라 냉동 튜브를 라벨 (단계 7.7 참조) 냉동고 매체의 1.5 mL각각을 채웁니다. 동결 용기를 벤치 옆에 놓습니다.
- 건강한 조직 표본: 5.1.1 단계를 반복합니다. 건강한 조직 표본을 위한 5.1.6.4.
6. 1 차 세포 배양
- 괴사 스크랩을 포함한 종양 조직의 유해를 가능한 한 작은 조각으로 메스와 페트리 접시에 분해합니다.
- 멸균 세포 여조기 (100 μm 모공 크기)를 50 mL 폴리 프로필렌 튜브 위에 놓습니다.
- 페트리 접시에 5-10 mL의 DPBS를 추가하기 위해 세로지 학적 파이펫을 사용하여 조직 유적과 파이펫을 위아래로 띄워 서스펜션을 생성합니다.
- 파이펫으로 서스펜션을 셀 스트레이너로 옮기습니다.
- 모든 조직 유해가 페트리 접시에서 해결될 때까지 6.3-6.4 단계를 반복하십시오.
- 20mL 단방향 주사기의 플런저를 사용하여 세포 스트레이너를 통해 세포 및 조직 현탁액을 짜냅니다.
- 신선한 DPBS의 5-10 mL로 헹구고, 세포 여과기를 버리고 튜브를 제대로 닫습니다.
- 서스펜션을 180 x g에서 5-10분 동안 원심분리합니다.
- 콜라겐-I 미리 코팅 된 6 웰 플레이트와 1.5 mL의 중간 매디엄을 잘 준비하십시오.
- 상체를 속이고 폐기하십시오. DPBS 또는 중간 크기의 3mL에서 펠릿을 다시 중단하고 각 웰에 서스펜션의 500 μL을 추가합니다. 플레이트를 인큐베이터에 넣습니다(습도 100%, CO25%, 37°C)
- 세포 의 성장과 오염을 위해 매일 플레이트를 모니터링하십시오.
참고: 영구 세포주를 확립하는 시점까지 배양하는 추가 세포는 여기에 설명되지 않는다.
7. PDX 세대
- 귀하의 관할 권세의 요구 사항을 충족하는 적절한 자격을 갖춘 사람에 의해서만 in vivo 실험을 수행하십시오.
- 중고 마우스 균주의 요구를 충족시키는 특정 병원체(SPF) 조건 하에서 집 면역결핍 마우스. 위생 조치에는 개별적으로 환기된 케이지, 오토클레이브 식품, 물 및 중첩 재료뿐만 아니라 안전 공기 잠금 장치 및 개인 보호 장비 착용이 포함됩니다.
- 모든 기기를 미리 자동 클런스하고 교차 오염을 방지하기 위해 각 종양 케이스에 하나의 계측기 세트만 사용하십시오. 가능한 한 무균으로 종양 조직을 처리합니다. 아래에 명명된 모든 플라스틱 은 각 수술 후 멸균, 일회용 및 폐기되어야 합니다.
참고: 냉동튜브 당 4개의 종양 조직 조각을 동결하는 방법에 의해 결정된 PDX 생성은 시료 당 항상 2개의 마우스를 필요로 하며, 이상적으로 4개의 PDX 종양의 결과로 서있다. - 실험실 재고 관리 시스템을 통해 이식하기 위해 원하는 1차 종양을 선택하고 시료(매우 보존된 종양 조직)를 메인 저장 탱크에서 휴대용 액체 질소 용기로 이송합니다(드라이 아이스에 -80°C의 중간 저장도 편리합니다).
- SPF 섹션(스크럽, 나막신, 앞치마, 헤어 커버, 수술용 마스크 및 오버슈즈)에 들어가기 전에 개인 보호 장비를 착용하여 손과 모든 장비를 소독하십시오.
- 마모젤 담그기
- 액체 질소 용기를 형성하는 냉동튜브를 제거하고 시편의 해동을 기다립니다.
- 50mL 폴리프로필렌 튜브에 라벨을 부착하고 35mL의 DPBS로 채웁니다.
- 저온튜브를 위아래로 기울이고 티슈-중간 슬러시를 이동하자마자 즉시 폴리프로필렌 튜브로 콘텐츠를 전송합니다. 종양 조직 조각을 부드럽게 헹구고, 튜브에서 주부들을 별도의 용기에 버리고 뚜껑을 닫고 튜브를 위쪽으로 내려 놓아 4개의 조직 조각이 뚜껑에 모이게 합니다.
- 페트리 접시를 냉각 축산기에 넣고 100 μL의 트리겔을 한 방울로 중간에 놓습니다. 해부학 적 집게를 사용하여 종양 조각을 Matrigel으로 옮기습니다. 각 조각이 마트리겔로 완전히 덮여 있는지 확인하십시오. 4 °C에서 10 분 동안 배양하십시오.
- 마우스 마취 (샘플 당 2 마우스, 병렬로 작동)
- 케타민 (100 mg/mL) 및 자일라진 (20 mg/mL) 마취 용액의 3:1- 스톡을 준비합니다. 권장된 복용량은 90/6 mg/kg 체중.
- 마우스의 무게를 측정하고 필요한 마취 용액을 단일 사용 인슐린 주사기로 그립니다.
- 마우스를 케이지 의 격자에 놓고 한 손으로 꼬리를 부드럽게 당겨 앞으로 이동을 유도하고 동시에 다른 손의 핀치 그립으로 목을 게합니다. 그리드의 마우스를 들어 올리고 손을 돌리면 동물의 등받이가 손바닥에 놓입니다. 당신의 새끼 손가락으로 뒷다리 중 하나를 고정하고 중복구를 주입. 마우스를 케이지에 다시 넣고 마약 유도를 기다립니다.
- 마취 된 마우스를 가열 판에 놓고 각막 해를 피하기 위해 연고로 눈을 가룹니다. 수술용 집게로 마우스의 뒷발을 부드럽게 꼬집어 마취의 깊이를 어기십시오.
참고: 무브먼트의 부재는 깊은 마약엄을 나타냅니다. 운동의 모든 종류 중 원하는 마약 깊이 또는 마취제의 추가 복용량에 도달 하기 위한 더 많은 시간이 필요.
- 수술
- 마우스의 목을 꼬집고 마이크로칩을 어플리케이터로 피하하여 피부 주름을 형성합니다(프로그래밍 세부 사항은 9단계 참조)
- 필요한 경우 마우스의 측면을 면도 (NMRInu / nu 마우스는 면도가 필요하지 않습니다), 면 봉면으로 포비도네 요오드를 적용하고 멸균 필드를 만들기 위해 외과 커튼을 사용합니다.
- 수술 용 집게로 측면의 피부를 들어 올리고, 4mm 경에 작은 절개를하고 가위로 무딘 준비로 작은 피하 포켓을 형성합니다.
- 각 포켓에 종양 조각 1 개를 넣고 후면 끝에 놓습니다.
- 100 μL 파이펫 팁의 끝을 잘라 페트리 접시에서 나머지 Matrigel을 흡인하고 각 피부 주머니에 동등하게 적용합니다.
- 간단한 방해 봉합사로 상처를 닫고 스프레이 드레싱을 적용합니다.
- 마이크로칩을 스캔하고 마우스 및 종양 ID의 유효성을 확인합니다.
- 신선한 침구와 중첩 소재와 함께 새로운 케이지와 그을링 스틱을 준비합니다. 종이 타월에서 "쿠션"을 접어 적외선 열램프 아래에 높은 머리로 마우스를 내려 놓습니다.
- 0.25 mL의 트리메토프림/설파메톡사졸(400 mg/80 mg)과 100mL의 식수와 혼합하고 음용병을 통해 투여한다. 한 마우스는 매일 킬로그램 당 약 150 mL를 소비 하는 것을 고려 하십시오.
참고: 피하 PDX 모델은 수술 후 통증과 관련이 없기 때문에 상처 치유 과정이나 종양 이내 의한 통증이 필요하지 않습니다. 귀하의 기관/권한의 동물 복지 지침은 다를 수 있습니다. - 실험 동물의 모니터링
- 고민의 표시를 위해 매일 마우스를 모니터링하십시오. 이것은 자격을 갖춘 동물 관리인에게 위임 될 수 있습니다.
- 전술한 복용량으로 수술 후 항생제 치료를 유지 4 주. 항생제 혼합물을 일주일에 두 번 교체하십시오.
- 캘리퍼 (종양 부피 = 0.52 x 길이 x 너비 x 높이 [mm3])를사용하여 일주일에 한 번 이상적으로 종양 크기를 측정하고 데이터베이스에 기록합니다.
8. PDX 수확 및 가공
- 수확 하고 PDX 종양을 처리, 때:
종양 크기는 1.500 mm3의표적 부피에 도달한다.
종양 베어링 동물은 고민및/또는 질병의 징후를 보여주고 처리는 쓸모가 없습니다.
종양은 궤양이 되거나 마우스의 피부에 침투합니다. - 올바른 PDX를 식별하려면 마이크로칩을 읽어보십시오.
- 예를 들어 CO2-질식또는 케타민/자일라진 주사와 자궁 경부 탈구와 같은 법적 방법(국가 지침에 따라)에 의해 마우스를 안락사시킵니다.
- 측면에 수술 용 집게로 피부를 들어 올리고 종양에서 몇 밀리미터 떨어진 Metzenbaum 가위로 절개하십시오.
- 무딘 준비로 종양 위에 피부를 분리한 다음 해부학 적 집게로 종양을 조심스럽게 파악하고 종양을 신체의 표면 적 근막에서 분리시하십시오.
- DPBS로 종양을 헹구고 페트리 접시에 넣고 인접한 결합 조직을 제거하십시오.
- 이 시점에서 다음 중 하나를 수행합니다.
- 30mm3 큐브를 자르고 새 PDX를 만듭니다(7.7.4 지점에서 프로토콜로 진행).
- 그 때 역사학 카세트로 옮겨지고 나중에 파라핀 포함을 위한 4% 포름알데히드에서 보존되는 조각으로 종양을 잘라냅니다.
- 조직 저장 용액을 가진 튜브에서 종양을 보존하여 바이오뱅크에 추가(3단계에서 프로토콜로 진행) 및/또는 PDX 유래 세포주를 생성합니다(4단계에서 프로토콜을 진행한다.)
9. 바이오뱅크 및 데이터 관리
- 표 1에따라 각 종양 케이스에 내부 ID를 할당합니다.
| 실험실 위치/이름 | 암 엔티티 | 연속 케이스 번호 | 사양 | 연속 번호 |
| C=대장 | _Met=전이 | |||
| P=췌장 | _Tu=종양 | |||
| 예: HROC389_Met2 = 로스토크, 대장암, 케이스 389, 제2 전이 | ||||
표 1: 샘플 ID의 정의입니다.
- 종양 ID와 함께 전자 및 종이 형태로 환자의 동의를 저장합니다.
- 가능한 한 많은 임상 데이터를 수집하고 익명화하고 별도로 저장합니다.
- 데이터 관리 소프트웨어(예: Freezerworks) 또는 기타 를 사용하고 라벨 인쇄 소프트웨어와 인터페이스를 만들어 온도 에 강한 자체 부착 바코드 라벨을 생성합니다.
- 데이터 관리 소프트웨어를 열어 새로운 샘플을 추가하고, 시편 유형을 정의하고, 종양 ID, 조직 유형, 동결 방법, 날짜, 책임있는 직원, 통로 번호, 마우스 ID 및 마우스 변형과 같은 정보를 기록합니다.
- 저장 탱크의 특정 위치에 샘플을 할당합니다.
- PDX 추적 및 모니터링(7-8단계 적용)
- 휴대용 Bluetooth 지원 장치(노트북 또는 태블릿)에 MS Access 데이터 베이스(또는 유사한 시스템)를 사용하여 종양 ID, 이식 날짜, 안락사 날짜, 마우스 나이 및 변형뿐만 아니라 시간이 지남에 따라 종양 성장을 기록합니다.
- 마이크로칩 판독기를 장치에 연결하고 이식 전에 마이크로칩을 읽어보십시오.
- 각 마우스에 특정 ID를 할당합니다. 다음 방식을 사용합니다.
- 이식 후 데이터 베이스의 마우스 특성과 함께 ID를 기록합니다.
- 마이크로칩의 사양, 데이터 베이스 및 저온튜브 라벨의 사양이 일관된지 다시 읽고 확인합니다.
- 따라서 각 마우스 케이지에 대한 레이블을 만듭니다.
참고: 물리적 백업을 만들려면 해당 마이크로칩 라벨이 있는 냉동튜브 라벨을 소책자 및 메모 날짜 및 마우스 변형에 넣습니다. - 개별 PDX의 종양 성장을 모니터링하기 위해, 매주 캘리퍼에 의해 측정된 종양 크기를 식별하고 기록하기 위해 데이터 베이스 장치에 연결된 판독기와 함께 마우스의 마이크로칩을 스캔한다.
- 종양의 성장 곡선을 분석하여 PDX 수확의 이상적인 시간 지점을 계획한다.
| 종양 ID | N2의 이전 저장소(=f) | 통로(=T) 번호 | 연속 마우스(=M) 번호 |
| 예: HROP12 fT0 M1 = 로스톡, 췌장암, 케이스 12, 냉동 1차 조직, 첫 번째 통로, 마우스 1로부터 발생한다. | |||
표 2: PDX ID의 정의입니다.
Representative Results
우리 손에는 1차 세포 배양(그림 2A&B)의설립률은 대형 시리즈9에서12.9%였다. 새로운 외과 절제 된 표본에서 확장 가능한 종양 세포를 분리 하는 시도의 대부분은 성장 또는 초기 오염의 부족으로 인해 실패. 세포주 설립은 표준 배양 조건(DMEM, 10% FCS, 표준 배양 용기)에서 꾸준한 성장을 이한 3개 통로와 FACS 분석을 통한 상피 분화검증(10)에성공한 것으로 간주되었다. PDX종양(도 2C & D)에서유래한 세포주들은 23.6%의 높은 확립율을 보였으며, 이는 또한 1차 절제된 종양9과는 대조적으로 반복적 시도의 가능성 때문이기도 하다. 그러나, 일부 혼합배양(도 2E)은섬유아세포 성장에서 해방될 수 없거나 섬유아세포 과성장(도2F)으로인해 손실되기도 한다.
그림 2: 세포 배양. 1차 암 세포주, 대장암 케이스 HROC313의 전이로부터 유래된, 통과 21(A) 및 췌장암 케이스 HROP88, 통로 5(B). PDX 유래 암 세포주 결장 PDX HROC285 T0 M2 (D) 및 췌장 PDX HROP10 T5 M2, 통로 4 (E). 췌장암 HROP75, 통로 8 (C) 및 섬유 아세포 과성장 (F)에서 섬유 아세포 및 암세포의 혼합 배양. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
PDX 생성 프로토콜의 변화를 고려하면, 마우스 균주 사용 및 또한 몇 년 동안 실험자, 이식에 사용할 수있는 종양 조직의 양에 큰 차이뿐만 아니라, PDX 생성의 전반적인 성공률을 제공하는 것은 사소한 일이 아니다. 최근 2명의 연구원(S.M 및 F.B.)에 의해 수행된 PDX 세대 실험의 아주 최근 시리즈에서, 대장 PDX에 대한 63%의 1차 성장률(그림 3A에서예시적인 히스토릭이 묘사될 수 있음) 및 췌장 PDX(그림3B)의경우 48%가 관찰되었다. 이식 부위에서 뮤린 또는 인간 림프종의 자라나는 것은 비교적 드물지만 성공적인 PDX 아웃성장을 모방할 수있습니다(도 3C). 조직 병리학 검사 외에도 PDX 모델과 기증자 환자 간의 일치는 짧은 탠덤 반복 (STR) 분석(그림 3D)에의해 정기적으로 확인되었습니다. 현재까지 바이오뱅크는 >50초및 >50초, 3차 및 6차 췌장암 세포주와 >150대장 및 19개의 췌장 PDX 모델로 구성된다.
그림 3: 대장(A) 및 췌장 PDX(B)의 대표적인 조직학적 비교. PDX 아웃성장을 모방하는 이식 부위의 인간 림프종(C). PDX 모델(HROC430 T1 M2)의 유전자 ID 검사는 짧은 탠덤 반복(STR) 분석에 의하여 원래 환자 종양 조직(HROC430Tu)에 대한 것이다. 9개의 STR loci, vWA, THO1, TPOX, CSF1 PO(FAM 염료) 및 D5S818, D13S317, D7S820, D16S539(HEX 염료)의 비교는 모세관 및 소형성 전기포에 따른 다중PCR을 이용한 멀티플렉스 PCR을 사용하여 유전자검사(유전자펜소)를 확인하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
살아있는 바이오 뱅크의 세대는 개인 정보 보호, 의료법 및 동물 복지, 좋은 인프라 및 잘 조정 된 팀의 법적 규정을 준수하는 것 외에도 전제됩니다. 조직 기증을 위해 개별 환자의 적합성을 아주 잘 평가할 수 있기 때문에 연구 절차에 있는 외과 직원의 일부를 직접 관련시키는 것이 유리하다는 것을 입증했습니다. 더욱이, 환자는 그들의 서면 승인이 외과 통보 동의 토론의 과정 내에서 얻어지는 때, biobanking와 더 자주 동의하는 경향이 있습니다. 시간과 자원을 절약하기 위해, 아마도 종양 조직의 부족한 양을 산출 할 경우는 바이오 뱅킹을 위해 선택해서는 안됩니다. 표본 획득에 관해서, 격언 "통신은 핵심입니다"간단하지만 종종 간과 진실이다. 그것은 단지 평소와 같이 진행하고 절제술 견본에 포름알데히드를 추가하여 처음부터 바로 표본을 망치기 위하여 단 하나 통보되지 않은 극장 간호원 또는 외과 동료를 취합니다. 따라서 관련 직원의 모든 구성원이 바이오 뱅킹을 위한 SOP에 익숙해지는 것이 절대적으로 중요합니다. 외과 의사는 예정된 조직 수집에 대한 절차의 시작 전날과 바로 눈치 채야한다. 또한 바이오뱅킹에 선정된 경우는 전자 또는 계획에서 강조표시되어야 합니다. 외과 표본에서 조직 수확은 병리학자에 의해 수행되어야한다. 첫째, 이것은 조직 수확이 최종 병리학 적인 보고를 방해하지 않는다는 것을 보장할 것입니다. 둘째, 이것은 실행 가능한 암 조직의 적당한 양으로 조직을 수신의 확률을 증가시킵니다. 특히 뚜렷한 담수화 반응과 빈번한 괴사 부위를 가진 췌장암에서는, 실행 가능한 부분은 훈련되지 않은 눈을 위해 매크로를 식별하기 어렵다. 이 규칙에 예외로, 큰 간 또는 폐 전이에서 조직 블록, 외과 마진이 매크로로 정의 될 수있는 경우, 외과 의사에 의해 때때로 "백 테이블"을 절제 할 수있다. 총 중각 절제술(TME)에 의해 제분된 직장암은 파라핀 포함 이전에 절제된 표본에서 채취된 조직 수확이 TME 품질 평가를 방해할 수 있기 때문에 바이오뱅킹에 적합하지 않을 수 있다. 대안적으로, 바이오뱅킹을 위한 조직은 직장암의 트랜스아날 생검에 의해 취득될 수 있다.
본래 종양으로부터 유래된 1차 세포 배양을 위한 확립비율은 일반적으로 낮다. PDX 유래, 이차 세포 배양은 더 성공적으로 설치될 수 있다. 각 경우에 대해 다른 매체를 테스트하고 수확 된 조직이 거의 멸균되지 않으므로 오염을 최소한으로 줄이기 위해 첫 번째 통로에 대한 항생제 보충제를 사용하는 것이 좋습니다. 성공적인 전파 후, 각 개별 세포주 FACS 분석에 의해 암 세포주로 확인 하 고 정기적으로 마이코 플라즈마 오염에 대 한 테스트 해야 합니다. 교차 오염을 제외하려면 정기적인 STR 분석이 좋습니다. 1차 세포주 및 이차 세포주를 위한 설립 프로토콜이 지속적으로 최적화를 받는다는 점에 유의해야 한다. 단일 미디어의 구성 및 성공률에 대한 세부 사항은 이 작품의 범위를 분명히 벗어나 별도로 게시될 것입니다.
PDX 이식의 경우 종양 조직은 10% DMSO 또는 유사한 동결 매체를 통해 태아 종아리 혈청에서 절제 후 직접 이식하거나 냉동 보존될 수 있다. 종양 조직 수확 시 즉시 이식하면 물류 및 실험실 직원에게 부담을 주며, 냉동 보존 후 xenografting 결과는 10전혀열등하지 않습니다. 더욱이, 종양 이식 전에 마트리겔에서 조직의 배양, 크게 이식 속도 증가12. 명확한 병리학적 발견과 잘못 수집된 조직 표본의 즉각적인 폐기에 따라 이식이 지연되는 것이 좋습니다. 수령 마우스의 면역 결핍으로 1 차 생생의 성공률이 증가하기 때문에, 우리는 최초의 PDX 통로에 NSG 마우스를 사용하는 경향이 있습니다. 첫 번째 성공적인 PDX 이식 후, NMRInu/nu 마우스는 후속 통로 및 조직 확장을 위해 사용될 수 있고 사용해야 합니다. 이 균주는 NSG 또는 유사한 면역 결핍 균주에 비해 더 강력하고 저렴하며 번식하기 쉽지만 여전히 합리적인 이식 속도를 보여줍니다. 또한, 그것의 누드 이식 및 종양 성장 모니터링을 촉진. 후속 구절에서 이식 속도를 높이기 위해, 우리는 특히 느린 성장 PDX및 낮은 기본 이식 성공률을 가진 경우에 대 한, 가능한 한 마우스를 호스트 하는 갓 수확 PDX 조직의 직접 전송 하는 것이 좋습니다. 콜린스와 랭은 최근 대장 PDX 설립의 14 연구를 검토하고 68 %의 중간 PDX 설립 비율로 14에서 100 %의 다양한 접목 비율을보고, 후자는 우리의 연구 결과와 일치되고13. 문헌에 따라, 우리는 대장암 PDX14에비해 췌장의 낮은 설립 비율을 관찰했다. 숙주 마우스 균주 및 종양 실체에 관계없이, 이식 측에서 인간, 엡스타인-바 바이러스(EBV)-연관된 B세포 림프종 및 뮤린 림프종의 아웃성장은 중요한 함정15,16을제기한다. 인식되지 않는 경우, 이러한 종양은 후속 구절을 "오염"할 수 있으므로 연속 결과를 혼동 할 수 있습니다. 특이한 빠른 PDX 성장과 자궁 경부의 붓기, axillar 및 inguinal 림프절은 뮤린 림프종 성장의 강한 지표이지만 PDX의 정기적 인 조직학적 검사는 그럼에도 불구하고 권장됩니다. 더욱이, PDX와 해당 기증자 환자 사이의 유전 적 일치는 STR 분석에 의해 정기적으로 테스트되어야한다. 이상적으로, 바이오뱅크는 환자 특성(일반 정보, 생존, 재발 자유로운 생존, 치료, 이차 신화증 등)을 포함하는 임상 데이터베이스에 연결되어야 한다. 개인 정보 보호의 법적 규정과 이러한 익명화된 데이터 기반의 부족으로 인해 당사의 임상 데이터 세트는 협력 의사가 정기적으로 관리하고 수동으로 업데이트합니다.
기존의 바이오뱅크는 천문대 연구로 제한되어 있지만, 살아있는 바이오뱅크는 체외 및 생체 내정간섭의 기회를 제공합니다. 환자 유래 세포주근본적인 연구, 고처리량 약물 스크리닝 및 새로운 제약에이전트4의평가를 위한 중요한 도구이다. 그러나 상응하는 PDX 모델은 원래 종양17,18의 공증을 면밀히 재구성하고19,20의여러 구절에 걸쳐 높은 유전적 안정성을 나타내기 때문에 중요성이 커지고 있다. 우리의 PDX 바이오 뱅크는 전임상 및 기초 연구를위한 우수한 플랫폼으로입증6,21. 더욱이, 대형 PDX 수집은 환자 집단의 개별 간 이질성을 적절히 반영하기 때문에, PDX 임상시험(PCT) 접근법(치료당 모델당 1마리)은 신약 및조합요법에대한 임상반응의 충실한 예측을 허용하기 때문에 약물 개발에 대한 중요성을 얻고 있다. 우리는 또한 현재 작은 PCT 예심에 있는 새로운 실험적인 약을 평가하고 있습니다.
이러한 유망한 결과에도 불구하고, 12.2개월의 중간 설립 기간은 PDX 모델의 임상 적용가능성을 항암 치료 옵션 테스트용 "아바타 마우스"로 방해하며, 적어도 즉각적인 보조 또는 신아드주반트 치료가 필요한환자(22)를대상으로 한다. 표준 PDX 모델의 추가 단점은 숙주 마우스의 면역 결핍으로 인한 면역 요법 테스트용 유용성이 부족하다는 것입니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 여러 "인간화"마우스 균주가 개발되었습니다. 이들 마우스는 면역장애가 심하지만, PDX 에 이어 다양한 유형의 인간 골수유래 세포 또는 CD34+조혈줄기세포로 재구성될 수있으며,림프구 매개 세포독성 및 면역체크포인트 억제제 치료에 대한 치료 반응의 평가를 허용한다.
최근 몇 년 동안, 환자 유래 오르가노이드 (PDO)는 PDX와 경쟁하는 중요한 암 모델로 부상했습니다. 그대로 종양 조각에서 파생되고 세포외 매트릭스 스캐폴드에서 배양된 이 3차원 구조는 원래 종양의 조직학적 및 유전적 특성을 밀접하게 반영한다. 장기 확장 및 냉동 보존의 가능성은 PDO살아있는 바이오 뱅크26,27의이상적인 보충을 렌더링합니다. 비교적 높은 확립률 외에도, 여러 종양개체(28)의PDO에 대해 신뢰할 수 있는 약물 반응 예측이 보고되었다. 더욱이, PdOs는 종양 세포를 순환시키고 또한 대응하는 건강한 조직에서 organoids의 동시 설치가 가능하여 환자-개인 기준29,30에대한 치료 관련 독성의 평가를허용함으로써발생하였다. 그러나, 종래의 2D 세포 배양에 비해, 오르가노이드 배양은 시간과 자원이 소모되고 인공 세포외 매트릭스 화합물은 특정 분석절차(31)를방해할 수 있다. 더욱이, 암 오르가노이드는 건강한 상피(30)에서파생된 더 빠른 성장, 비 악성 오르가노이드에 의해 과성장에 취약하다. 기질, 혈관 및 면역 세포의 부족으로 인해, PdOs는 항 혈관 신생 면역 치료제의 테스트에 주로 적용되지 않습니다. 그러나 새로운 배양 방법은 시험관내종양 미세 환경을 모델링할 수 있게 하여 PDX모델(32)에대한 PDOs의 진정한 경쟁자가 되었다. 가까운 장래에 차세대 염기서열분석과 같은 강력한 유전 적 도구와 결합 된 환자 개인 종양 모델은 진정한 정밀 의학 및 맞춤형 치료 접근법으로가는 길을 열어 줄 것입니다.
Disclosures
없음.
Acknowledgments
우리는 비디오의 녹음 및 편집에 대한 제니 버마이스터, 우리의 그래픽 조수를 인정합니다. 또한, 우리는 오랜 협력에 대한 외과 및 병리학 부서의 동료에게 감사드립니다. 또한 로스토크 대학교 IT 미디어 센터의 프로덕션 매니저인 마커스 뮐러(Marcus Müller)에게 오디오 녹음 장비를 제공하고 음질을 개선해 주신 것에 대해 감사드립니다.
자금 조달: 독일 암 원조 재단 (DKH e.V.), 교부금 번호 108446, 주 메클렌 부르크 - Vorpommern에서 번호 TBI-V-1-241-VBW-084를 부여 부분적으로이 연구에 자금을 지원.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacillol® AF; 1L | Bode, Hartmann | REF 973380 | desinfection |
| PP centrifuge tube, 15ml; sterile | Greiner Bio One | GBO Cat. No.:188271 | centrifuge tube |
| PP centrifuge tube, 50ml, sterile | Sarstedt | Order number: 62.547.254 | centrifuge tube |
| BD DiscarditTM II Syringe 20ml | BD | REF 300296 | blood collection |
| Serum 7,5ml Sarstedt Monovette | Sarstedt | Item number: 01.1601 | blood collection |
| serological Pipette 10ml | Sarstedt | REF 86.1254.001 | liquid transfer |
| Pipetboy ratiolab® accupetta | Ratiolab | Item number: RL3200300 | liquid transfer |
| PIPETBOY acu 2 | Integra Biosciences | VWR Cat.No: 613-4438 | liquid transfer |
| DPBS; w/o Ca & Mg | Pan Biotech | Cat. No.: P04-36500 | washing |
| Pancoll human | Pan Biotech | Cat. No.: P04-60500 | density gradient centrifugation |
| DMEM/F12 (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) | PAN Biotech | Cat. No.: P04-41500 | cell cultivation |
| FBS Good Forte (Filtrated Bovine Serum) | PAN Biotech | Cat. No.: P40-47500 | cell cultivation |
| L-Glutamine 200mM | PAN Biotech | Cat. No.: P04-80100 | cell cultivation |
| Trypsin / EDTA | PAN Biotech | Cat. No.: P10-023100 | cell cultivation |
| DMSO (Dimethyl Sulfoxid for cell culture) | PanReac AppliChem | VWR Cat.No: A3672.0250 | cell freezing |
| Freezer Medium (FCS with 10% DMSO) | selfmade | --- | cell freezing |
| cryotube- CryoPure 2ml | Sarstedt | 72380 | cell freezing |
| 6-Well cell culture plate; steril; with lid | Greiner bio-one | Cat.-No.: 657 160 | cell cultivation |
| Petri dish 92 x 16 mm, PS, without cams | Sarstedt | Cat. No.: 82.1472.001 | tissue preparation |
| sterile surgical blades | B.Braun (Aesculap) | REF BB510 | tissue preparation |
| BD DiscarditTM II Syringe 10ml | BD | REF 309110 | tissue preparation |
| cell strainer; yellow; 100µm | Falcon | REF 352360 | tissue preparation |
| CoolCell | biocision | Item number: 210004 | cooling container with -1°C/min |
| Dewar transport vessel type 27 B, 2 l, 138 mm | KGW | Cat. No.: HT39.1 | transport system |
| Pipette tip 200µl | Sarstedt | REF 70.760.002 | liquid transfer |
| Filter tip 1000µl | Sarstedt | REF 70.762.411 | liquid transfer |
| Pipette 200µl, yellow | Eppendorf | Cat. No.: 3121 000.082 | liquid transfer |
| Pipette 1000µl, blue | Eppendorf | Cat. No.: 3121 000.120 | liquid transfer |
| incubator BB 6220 CU | Heraeus | Cat.-No.: 51012839 | cell cultivation |
| heating plate PRÄZITHERM | Harry Gestigkeit GmbH | --- | heating |
| Microscope Zeiss Primo Vert | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | Serial number. 3842000839 | imaging cell cultures |
| Sterile bench Safe flow 1.8 nunc | nunc GmbH & Co. KG | --- | sterile working bench |
| freezer -80°C | Kryotec-Kryosafe GmbH | --- | sample storage |
| Electronic balance MP-300 | Chyo | --- | Scale |
| BD Micro-fine, U100 insulin syringe | BD | REF 324826 | injection anesthetic |
| Rompun 2%; 25ml | Bayer | approval number: 6293841.00.00 | anesthesia |
| Ketamin 100 mg/ml, 25ml | CP-Pharma GmbH | approval number: 401650.00.00 | anesthesia |
| GES3S Reader | Datamars | not available | RFID reader |
| ISO-Transponder FDX-B (1,4x8mm) | Peddymark | --- | RFID chip |
| Cotrim-ratiopharm® Ampullen SF 480 mg/5 ml | Ratiopharm | PZN-03928197 | antibiotic drinking water |
| Heating plate #FM-20 42x28cm | Dragon | --- | heating |
| Heating lamp | Electric Petra, Burgau | --- | heating |
| Ointment for the eyes and nose (5% Dexpanthenol) Bepanthen | Bayer | PZN-01578675 | Eye protection |
| anatomical tweezer | B.Braun Aesculap | BD21 OR | surgical instruments |
| surgical tweezer | B.Braun Aesculap | BD50 1 R | surgical instruments |
| scissors | B.Braun Aesculap | BC05 6R | surgical instruments |
| needle holder | B.Braun Aesculap | BH1 1 OR | surgical instruments |
| Prolene 5-0 | Ethicon | XN8870.P32 | surgical suture material |
| Opsite moisture vapour permable spray dressing | Smith&Nephew | REF 66004978, PZN- 02063507 | surgical suture material |
| Adhesive aperture drape | Barrier | REF 904622 | sterile OP tissue |
| gauze swap Gazin®; steril; 10x10 cm | Lohmann&Rauscher | REF 18506 | sterile OP tissue |
| Raucotupf cotton tipped applicators | Lohmann&Rauscher | REF 11969 | applicator |
| Corning® Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | Cat.-No.: 354234 | Basement Membrane Matrix |
| iodine solution Braunol (7,5g povidone iodine) | B.Braun Melsungen AG | Item number: 18839 | desinfection |
| MACS® Tissue Storage Solution | Miltenyi Biotec GmbH | Order No.:130-100-008 | storage solution |
| Formafix 4% | Grimm med. Logistik GmbH | Item number: F10010G | fixation solution |
| Software FreezerworksBasic | Dataworks Development, Inc | --- | sample organization |
| Zebra TLP 2844 printer | Zebra | --- | label printer |
References
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