I det følgende arbeidet beskriver vi de påfølgende trinnene som er nødvendige for etablering av en stor biobank av kolorektal og bukspyttkjertelkreft.
I lys av den økende kunnskapen om de mellomindiske egenskapene og heterogeniteten til kreft, krever det nye feltet av personlig medisin en plattform for preklinisk forskning. I løpet av de siste årene har vi etablert en biobank av kolorektal- og bukspyttkjertelkreft bestående av primærsvulstvev, normalt vev, sera, isolerte perifere blodlymfocytter (PBL), pasientavledede xenografter (PDX), samt primære og sekundære kreftcellelinjer. Siden originalt tumorvev er begrenset og etableringsraten for primære kreftcellelinjer fortsatt er relativt lav, tillater PDX ikke bare bevaring og forlengelse av biobanken, men også generering av sekundære kreftcellelinjer. Videre har PDX-modeller vist seg å være den ideelle in vivo-modellen for preklinisk narkotikatesting. Biobanking krever imidlertid nøye forberedelse, strenge retningslinjer og en godt tilpasset infrastruktur. Kolektomi, duodenopankrekretektomi eller resected metastaser prøvene samles umiddelbart etter reseksjon og overføres til patologi avdelingen. Respektere prioritet av en objektiv histopatologisk rapport, etter skjønn av den behandlende patologen som utfører disseksjonene, høstes små svulststykker og ikke-tumorvev.
Nekrotiske deler kastes og det gjenværende tumorvevet kuttes i små, identiske terninger og kryopreservert for senere bruk. I tillegg er en liten del av svulsten hakket og anstrengt for primær kreftcellekultur. I tillegg behandles blodprøver fra pasienten pre- og postoperativt for å oppnå serum og PBLer. For PDX-engraftment blir de kryobserverte prøvene tint og implantert subkutant inn i flankene av immunsviktede mus. Den resulterende PDX nøye rekafulere histologien til “donor” svulster og kan enten brukes til etterfølgende xenografting eller kryopreservert for senere bruk. I det følgende arbeidet beskriver vi de enkelte trinnene for etablering, vedlikehold og administrasjon av en stor biobank av kolorektal og bukspyttkjertelkreft. Videre fremhever vi de avgjørende detaljene og advarslene knyttet til biobanking.
I de senere årene førte den akkumulerte kunnskapen om kreftens morfologiske, kliniske og genetiske egenskaper til oppfatningen av kreft som en heterogen, individuell sykdom. Følgelig har mutasjonskarakterisering av neoplasmer, foruten kliniske og patologiske egenskaper, fått betydning for klinisk beslutningstaking og mange målrettede terapier ble utviklet for ulike molekylære endringer. For eksempel kan effekten av cetuximab i kolorektal kreftbehandling forutsies ved analyse av KRAS og PIK3CA mutasjonsstatus1. Presisjonsmedisin tar sikte på en skreddersydd tilnærming for å gi den høyeste behandlingsresponsen hos hver pasient og unngå toksisitet av ineffektive behandlinger2. Biobanker inneholder vev, blod og andre biologiske materialer av kreftpasienter, som er knyttet til de kliniske dataene, og dermed er et utmerket verktøy for translasjonell kreftforskning. På grunn av det store antallet kliniske prøver muliggjør biobanker påvisning av sjeldne, men potensielt druggable mutasjoner, noe som gir nye behandlingsmuligheter for den enkeltepasient 3.
For å dekke så bredt som mulig et onkologisk forskningsspektrum, begrenset vi ikke vår aktivitet på prøvehøsting alene, men fokuserte på etablering av pasientavledede kreftcellelinjer og xenografter (PDX). Tradisjonelle 2D cellelinjer forblir hjørnesteinen av in vitro forskning og er det viktigste valget for storskala narkotikascreenings 4,5. Videre er cellelinjeanalyse ofte enklere, billigere og lettere tilgjengelig. I tillegg, siden pasientavledede perifere blodlymfocytter (PBL) er tilgjengelige, kan også tumorimmunologi studeres in vitro6. Imidlertid har flertallet av nyutviklede legemidler med lovende preklinisk effektivitet i cellebaserte in vitro- eller in vivo-eksperimenter, vist skuffende resultater i kliniske studier7. I motsetning har prekliniske studier basert på PDX in vivo-studier reflektert den kliniske aktiviteten til antineoplastiske midler mye mer trofast8. Siden PDX-vevet reflekterer de histologiske og molekylære egenskapene til donorsvulsten, er PDX-modeller en god måte å forplante de ofte svært begrensede mengdene levedyktig tumorvev for å opprettholde integriteten til en biobank og for å tillate utveksling av prøver mellom forskningsgrupper og institusjoner. Videre kan kreftcellelinjer avledet fra PDX-vev etableres betydelig enklere enn primære kreftcellelinjer9. De siste årene har vår arbeidsgruppe etablert en omfattende integrert kolorektal og bukspyttkjertelkreft biobank ved trinnvis standardisering og optimalisering av arbeidsflyten for alle biologiske prøver i spørsmålet (figur 1).
Figur 1:Arbeidsflyt og organisering av biobanken Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Generasjonen av en levende biobank forutsetter, bortsett fra å overholde de juridiske forskriftene for personvern, medisinsk lov og dyrevelferd, en god infrastruktur og et godt koordinert team. Det har vist seg fordelaktig å direkte involvere en del av kirurgisk personell i forskningsprosedyrene, siden de veldig godt kan vurdere egnetheten til den enkelte pasient for vevsdonasjon. Videre har pasientene en tendens til å samtykke med biobanking oftere, når deres skriftlige godkjenning er innhentet i løpet av den kirurgiske informerte samtykkediskusjonen. For å spare tid og ressurser, bør tilfeller som antagelig vil gi utilstrekkelige mengder tumorvev ikke velges for biobanking. Når det gjelder prøveoppkjøp, er maksimal “kommunikasjon nøkkelen” en enkel, men ofte oversett sannhet. Det tar bare en eneste uinformert teatersykepleier eller kirurgisk kollega å ødelegge prøven helt i utgangspunktet ved å fortsette som vanlig og legge til formaldehyd til reseksjonsprøven. Derfor er det helt avgjørende at hvert eneste medlem av de involverte ansatte blir kjent med SOP for biobanking. Kirurger bør bli lagt merke til dagen før og rett ved starten av prosedyren om planlagt vevsamling. Videre bør saker valgt for biobanking fremheves i den elektroniske ELLER-planen. Vevhøsting fra den kirurgiske prøven skal utføres av en patolog. For det første vil dette sikre at vevshøstingen ikke forstyrrer den endelige patologiske rapporten. For det andre øker dette sannsynligheten for å motta vev med tilstrekkelige mengder levedyktig kreftvev. Spesielt i bukspyttkjertelkreft med en uttalt desmoplastisk reaksjon og hyppige nekrotiske områder, er levedyktige deler vanskelige å identifisere makrooskopisk for det utrente øyet. Som et unntak fra denne regelen kan vevsblokker fra store lever- eller lungemetastaser til tider bli skåret ut “back-table” av kirurgen, hvis kirurgiske marginer kan defineres makrooskopisk. Rektal kreft resected av total mesorectal excision (TME), kan ikke være egnet for biobanking, siden vev høsting fra den nye prøven før parafin innebygging kan forstyrre TME kvalitetsvurdering. Alternativt kan vev for biobanking erverves ved transanal biopsi av rektal kreft.
Etableringsratene for primærcellekulturer avledet fra den opprinnelige svulsten er generelt lave. PDX-avledede, sekundære cellekulturer kan mer sannsynlig bli etablert. Vi anbefaler testing av forskjellige medier for hvert tilfelle og bruk av antibiotikatilskudd for de første passasjene for å redusere forurensning til et minimum siden høstet vev er sjelden sterilt. Etter vellykket forplantning bør hver enkelt cellelinje bekreftes som en kreftcellelinje ved FACS-analyse og regelmessig testet for mycoplasmaforurensning. For å utelukke krysskontaminering er regelmessig STR-analyse tilrådelig. Det bør bemerkes, at etableringsprotokollen for primære og sekundære cellelinjer blir stadig utsatt for optimalisering. Detaljer om sammensetningen og suksessratene til enkeltmediene er tydelig utenfor omfanget av dette arbeidet og vil bli publisert separat.
For PDX-engraftment kan tumorvev enten implanteres direkte etter reseksjon eller kryopreservert i fosterkalverum med 10% DMSO eller lignende frysemedier for forsinket implantasjon. Implantasjon umiddelbart ved tumorvev høsting setter en belastning på logistikk og laboratoriepersonell, og xenografting resultater etter kryopreservation er ikke dårligere i det hele tatt 10. Videre, inkubasjon av vevet i Matrigel før tumorimplantasjon, øker betydelig engraftment priser12. Vi anbefaler forsinket engraftment etter bestemt patologisk funn og umiddelbar avhending av feilaktig innsamlede vevsprøver. Siden suksessraten for primær engraftment øker med immunsvikt hos mottakermusen, har vi en tendens til å bruke NSG-mus for den aller første PDX-passasjen. Etter den første vellykkede PDX-engraftmentet kan NMRInu/nu-mus brukes til påfølgende passasjer og vevsutvidelse. Denne belastningen er mer robust, billigere og lettere å avle sammenlignet med NSG eller lignende immunsvikt, men viser fortsatt rimelige engraftment priser. Videre forenkler nakenheten implantasjon og tumorvekstovervåking. For å øke overføringsratene i påfølgende passasjer anbefaler vi direkte overføring av nyhøstet PDX-vev for å være vert for mus når det er mulig, spesielt for langsom voksende PDX og tilfeller med lav primær engraftment suksessrate. Collins og Lang har nylig gjennomgått 14 studier av kolorektal PDX-etablering og rapporterte engraftmentrater som varierer fra 14 til 100% med en median PDX-etableringsrate på 68%, sistnevnte er i samsvar medvåre funn 13. I tråd med litteraturen observerte vi lavere etableringsrater for bukspyttkjertel sammenlignet med kolorektal kreft PDX14. Uavhengig av vertens musstamme og tumorenhet utgjør utveksten av menneskelig, Epstein-Barr Virus (EBV)-assosiertE B-cellelymfomer og murinlymfomer ved implantasjonssiden en viktig fallgruve15,16. Hvis ukjent, kan slike svulster “forurense” etterfølgende passasjer og dermed forvirre påfølgende resultater. Uvanlig rask PDX vekst og hevelse av cervical, axillar og inguinal lymfeknuter er sterke indikatorer på murin lymfomvekst, men regelmessig histologisk undersøkelse av PDX er likevel tilrådelig. Videre bør genetisk konkordans mellom PDX og den tilsvarende donorpasienten testes regelmessig ved STR-analyse. Ideelt sett bør biobanken knyttes til en klinisk database bestående av pasientens egenskaper (generell informasjon, overlevelse, tilbakefallsfri overlevelse, terapi, sekundær neoplasi etc.). På grunn av juridiske forskrifter om personvernbeskyttelse og mangel på et slikt anonymisert datagrunnlag, administreres og oppdateres vårt kliniske datasett regelmessig og oppdateres manuelt av de samarbeidende legene.
Mens konvensjonelle biobanker er begrenset til observatoriumforskning, gir en levende biobank mulighet for in vitro- og in vivo-intervensjoner. Pasientavledede cellelinjer er et viktig verktøy for grunnleggende forskning, høy gjennomstrømning medikamentscreening og vurdering av nye farmasøytiske midler4. Tilsvarende PDX-modeller er imidlertid av økende betydning, siden de nøye rekafulerer histologien til den opprinneligesvulsten 17,18 ogviser høy genetisk stabilitet over flere passasjer19,20. Vår PDX biobank har vist seg som en utmerket plattform for preklinisk og grunnleggende forskning6,21. Videre, siden store PDX-samlinger tilstrekkelig gjenspeiler den inter-individuelle heterogeniteten til pasientpopulasjonen, har PDX klinisk studie (PCT) tilnærming (ett dyr per modell per behandling) fått betydning for narkotikautvikling siden det tillater trofast prediksjon av klinisk respons på nye legemidler og kombinatorisk regime8. Vi vurderer også for tiden nye eksperimentelle legemidler i små PCT-studier.
Til tross for disse lovende resultatene, innebærer median etableringsvarighet på 12,2 måned, den kliniske anvendeligheten til PDX-modeller som “avatarmus” for testing av behandlingsalternativer for kreft, i hvert fall for de pasientene som trenger umiddelbar adjuvant eller til og med neoadjuvant behandling22. En ekstra ulempe med standard PDX-modeller er mangelen på brukervennlighet for immunterapitesting på grunn av vert for musenes immunsvikt. For å overvinne disse begrensningene har flere “humaniserte” musestammer blitt utviklet. Disse musene er sterkt immunkompromitterte, men kan rekonstitueres med ulike typer humane benmargsavledede celler eller CD34+ hematopoetiske stamceller etter PDX-utvekst23, slik at evalueringen av lymfocyttmediert cytotoksisitet og terapirespons på immunkontrollpunkthemmerbehandling24,25.
De siste årene har pasientavledede organoider (PUD) fremstått som viktige kreftmodeller som konkurrerte med PDX. Avledet fra intakte tumorstykker og kultivert i et ekstracellulært matrisestillas, reflekterer disse tredimensjonale strukturene nøye de histologiske og genetiske egenskapene til den opprinnelige svulsten. Muligheten for langsiktig ekspansjon og kryopreservation gjør PUD et ideelt supplement til en levende biobank26,27. I tillegg til en relativt høy etableringsrate, har pålitelig legemiddelresponsprognose blitt rapportert for PUD av flere tumorenheter28. Videre har PDOer til og med blitt generert fra sirkulerende tumorceller, og også samtidig etablering av organoider fra tilsvarende sunt vev er mulig, slik at vurdering av terapirelatert toksisitet på pasient-individuell basis29,30. Men sammenlignet med konvensjonelle 2D-cellekulturer, er organoid kultur tid og ressurskrevende og kunstige ekstracellulære matriseforbindelser kan forstyrre visse analytiske prosedyrer31. Videre er kreft organoider utsatt for overvekst ved raskere voksende, ikke-ondartede organoider avledet fra sunt epitel30. På grunn av mangel på stroma, blodkar og immunceller, er PDOer for det meste uanvendelige for testing av antiangiogene immunterapeutiske midler. Likevel tillater nye kulteringsmetoder modellering av tumormikromiljøin vitro, noe som gjør PDOer til en sann utfordrer for PDX-modeller32. I nær fremtid vil pasient-individuelle tumormodeller, kombinert med kraftige genetiske verktøy som neste generasjons sekvensering, forhåpentligvis bane veien til ekte presisjonsmedisin og skreddersydde behandlingstilnærminger.
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkjenner Jenny Burmeister, vår grafiske assistent, for opptak og redigering av videoen. Videre takker vi våre kolleger av kirurgisk og patologisk avdeling for det langvarige samarbeidet. Vi vil også takke Marcus Müller, produksjonsleder for IT- og mediesenteret, Universitetet i Rostock, for å ha levert lydopptaksutstyret og raffinering av lydkvaliteten.
FINANSIERING: Den tyske Cancer Aid Foundation (DKH e.V.), tilskudd nummer 108446, og tilskudd nummer TBI-V-1-241-VBW-084 fra staten Mecklenburg-Vorpommern delvis finansiert denne forskningen.
Bacillol® AF; 1L | Bode, Hartmann | REF 973380 | desinfection |
PP centrifuge tube, 15ml; sterile | Greiner Bio One | GBO Cat. No.:188271 | centrifuge tube |
PP centrifuge tube, 50ml, sterile | Sarstedt | Order number: 62.547.254 | centrifuge tube |
BD DiscarditTM II Syringe 20ml | BD | REF 300296 | blood collection |
Serum 7,5ml Sarstedt Monovette | Sarstedt | Item number: 01.1601 | blood collection |
serological Pipette 10ml | Sarstedt | REF 86.1254.001 | liquid transfer |
Pipetboy ratiolab® accupetta | Ratiolab | Item number: RL3200300 | liquid transfer |
PIPETBOY acu 2 | Integra Biosciences | VWR Cat.No: 613-4438 | liquid transfer |
DPBS; w/o Ca & Mg | Pan Biotech | Cat. No.: P04-36500 | washing |
Pancoll human | Pan Biotech | Cat. No.: P04-60500 | density gradient centrifugation |
DMEM/F12 (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) | PAN Biotech | Cat. No.: P04-41500 | cell cultivation |
FBS Good Forte (Filtrated Bovine Serum) | PAN Biotech | Cat. No.: P40-47500 | cell cultivation |
L-Glutamine 200mM | PAN Biotech | Cat. No.: P04-80100 | cell cultivation |
Trypsin / EDTA | PAN Biotech | Cat. No.: P10-023100 | cell cultivation |
DMSO (Dimethyl Sulfoxid for cell culture) | PanReac AppliChem | VWR Cat.No: A3672.0250 | cell freezing |
Freezer Medium (FCS with 10% DMSO) | selfmade | — | cell freezing |
cryotube- CryoPure 2ml | Sarstedt | 72380 | cell freezing |
6-Well cell culture plate; steril; with lid | Greiner bio-one | Cat.-No.: 657 160 | cell cultivation |
Petri dish 92 x 16 mm, PS, without cams | Sarstedt | Cat. No.: 82.1472.001 | tissue preparation |
sterile surgical blades | B.Braun (Aesculap) | REF BB510 | tissue preparation |
BD DiscarditTM II Syringe 10ml | BD | REF 309110 | tissue preparation |
cell strainer; yellow; 100µm | Falcon | REF 352360 | tissue preparation |
CoolCell | biocision | Item number: 210004 | cooling container with -1°C/min |
Dewar transport vessel type 27 B, 2 l, 138 mm | KGW | Cat. No.: HT39.1 | transport system |
Pipette tip 200µl | Sarstedt | REF 70.760.002 | liquid transfer |
Filter tip 1000µl | Sarstedt | REF 70.762.411 | liquid transfer |
Pipette 200µl, yellow | Eppendorf | Cat. No.: 3121 000.082 | liquid transfer |
Pipette 1000µl, blue | Eppendorf | Cat. No.: 3121 000.120 | liquid transfer |
incubator BB 6220 CU | Heraeus | Cat.-No.: 51012839 | cell cultivation |
heating plate PRÄZITHERM | Harry Gestigkeit GmbH | — | heating |
Microscope Zeiss Primo Vert | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | Serial number. 3842000839 | imaging cell cultures |
Sterile bench Safe flow 1.8 nunc | nunc GmbH & Co. KG | — | sterile working bench |
freezer -80°C | Kryotec-Kryosafe GmbH | — | sample storage |
Electronic balance MP-300 | Chyo | — | Scale |
BD Micro-fine, U100 insulin syringe | BD | REF 324826 | injection anesthetic |
Rompun 2%; 25ml | Bayer | approval number: 6293841.00.00 | anesthesia |
Ketamin 100 mg/ml, 25ml | CP-Pharma GmbH | approval number: 401650.00.00 | anesthesia |
GES3S Reader | Datamars | not available | RFID reader |
ISO-Transponder FDX-B (1,4x8mm) | Peddymark | — | RFID chip |
Cotrim-ratiopharm® Ampullen SF 480 mg/5 ml | Ratiopharm | PZN-03928197 | antibiotic drinking water |
Heating plate #FM-20 42x28cm | Dragon | — | heating |
Heating lamp | Electric Petra, Burgau | — | heating |
Ointment for the eyes and nose (5% Dexpanthenol) Bepanthen | Bayer | PZN-01578675 | Eye protection |
anatomical tweezer | B.Braun Aesculap | BD21 OR | surgical instruments |
surgical tweezer | B.Braun Aesculap | BD50 1 R | surgical instruments |
scissors | B.Braun Aesculap | BC05 6R | surgical instruments |
needle holder | B.Braun Aesculap | BH1 1 OR | surgical instruments |
Prolene 5-0 | Ethicon | XN8870.P32 | surgical suture material |
Opsite moisture vapour permable spray dressing | Smith&Nephew | REF 66004978, PZN- 02063507 | surgical suture material |
Adhesive aperture drape | Barrier | REF 904622 | sterile OP tissue |
gauze swap Gazin®; steril; 10×10 cm | Lohmann&Rauscher | REF 18506 | sterile OP tissue |
Raucotupf cotton tipped applicators | Lohmann&Rauscher | REF 11969 | applicator |
Corning® Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | Cat.-No.: 354234 | Basement Membrane Matrix |
iodine solution Braunol (7,5g povidone iodine) | B.Braun Melsungen AG | Item number: 18839 | desinfection |
MACS® Tissue Storage Solution | Miltenyi Biotec GmbH | Order No.:130-100-008 | storage solution |
Formafix 4% | Grimm med. Logistik GmbH | Item number: F10010G | fixation solution |
Software FreezerworksBasic | Dataworks Development, Inc | — | sample organization |
Zebra TLP 2844 printer | Zebra | — | label printer |