Summary
Aşağıdaki çalışmada, kolorektal ve pankreas kanserinden oluşan büyük bir biyobankanın kurulması için gerekli ardışık adımları açıklıyoruz.
Abstract
Kanserlerin bireyler arası özellikleri ve heterojenliği hakkında artan bilgiler ışığında, kişiselleştirilmiş tıbbın ortaya çıkan alanı preklinik araştırmalar için bir platform gerektirir. Son yıllarda primer tümör dokusu, normal doku, sera, izole periferik kan lenfositleri (PBL), hasta kaynaklı ksinograftlar (PDX) ve primer ve sekonder kanser hücre hatlarından oluşan kolorektal ve pankreas kanserlerinden oluşan bir biyobanka kurduk. Orijinal tümör dokusu sınırlı olduğundan ve primer kanser hücre hatlarının kuruluş oranı hala nispeten düşük olduğundan, PDX sadece biyobankanın korunmasına ve genişletilmesine değil, aynı zamanda ikincil kanser hücre hatlarının üretimine de izin verir. Ayrıca, PDX modellerinin klinik öncesi ilaç testleri için ideal in vivo model olduğu kanıtlanmıştır. Bununla birlikte, biyobankalama dikkatli bir hazırlık, katı yönergeler ve iyi ayarlanmış bir altyapı gerektirir. Kolektomi, duodenopankreatektomi veya rezeke edilmiş metastaz örnekleri rezeksiyondan hemen sonra toplanır ve patoloji bölümüne aktarılır. Tarafsız bir histopatolojik raporun önceliğine saygı göstererek, diseksiyonları gerçekleştiren uzman patologun takdirine bağlı olarak, küçük tümör parçaları ve tümör olmayan dokular toplanır.
Nekrotik parçalar atılır ve kalan tümör dokusu küçük, özdeş küpler halinde kesilir ve daha sonra kullanılmak üzere kriyoprezserv edilir. Ek olarak, tümörün küçük bir kısmı birincil kanser hücre kültürü için kıyılır ve zorlanır. Ayrıca hastadan ameliyat öncesi ve sonrası alınan kan örnekleri serum ve PBL'ler elde etmek için işlenir. PDX engraftment için, kriyoprezidasyon örnekleri buzları çözülür ve immün yetmezlikli farelerin kanatlarına deri altından yerleştirilir. Elde edilen PDX, "donör" tümörlerin histolojisini yakından özetler ve sonraki ksinografting için kullanılabilir veya daha sonra kullanılmak üzere kriyoprezerserved edilebilir. Aşağıdaki çalışmada, kolorektal ve pankreas kanserinden oluşan büyük bir biyobankanın oluşturulması, sürdürülmesi ve yönetiminin bireysel adımlarını açıklıyoruz. Ayrıca, biyobankalama ile ilgili önemli ayrıntıları ve uyarılarını vurguluyoruz.
Introduction
Son yıllarda, kanserlerin morfolojik, klinik ve genetik özellikleri hakkında birikmiş bilgi birikimi, kanserin heterojen, bireysel bir hastalık olarak algılanmasına yol açmıştır. Sonuç olarak, klinik ve patolojik özelliklerin yanı sıra neoplazmların mutasyonel karakterizasyonu klinik karar verme için önem kazanmıştır ve çeşitli moleküler değişiklikler için birçok hedefe yönelik tedavi geliştirilmiştir. Örneğin, cetuximab'ın kolorektal kanser tedavisindeki etkinliği KRAS ve PIK3CA mutasyon durumunun analizi ile tahmin edilebilir1. Hassas tıp, her hastada en yüksek tedavi yanıtını sağlamak ve verimsiz tedavilerin toksisitesini önlemek için özel bir yaklaşım amaçlamaktadır2. Biyobankalar, kanser hastalarının klinik verilerle bağlantılı doku, kan ve diğer biyolojik materyallerini içerir ve bu nedenle translojiyel kanser araştırmaları için mükemmel bir araçtır. Çok sayıda klinik örnek nedeniyle, biyobankalar nadir, ancak potansiyel olarak ilaçlanabilir mutasyonların tespit edilmesini sağlar, bu da bireysel hasta için yeni tedavi olanakları sağlar3.
Mümkün olduğunca geniş bir onkolojik araştırma spektrumunu kapsayacak şekilde, sadece numune hasadı konusundaki etkinliğimizi kısıtlamadık, ancak hasta kaynaklı kanser hücre hatları ve ksinograftların (PDX) kurulmasına odaklandık. Geleneksel 2D hücre hatları in vitro araştırmaların köşe taşı olmaya devam eder ve büyük ölçekli ilaç taramaları için birincil seçimdir4,5. Ayrıca, hücre hattı analizi genellikle daha kolay, daha ucuz ve daha kolay kullanılabilir. Ek olarak, hasta kaynaklı periferik kan lenfositleri (PBL) mevcut olduğundan, tümör immünolojisi in vitro6olarak da çalışılabilir. Bununla birlikte, hücre bazlı in vitro veya in vivo deneylerde umut verici preklinik etkiye sahip yeni geliştirilen ilaçların çoğunluğu, klinik çalışmalarda hayal kırıklığı yaratan sonuçlar göstermiştir7. Buna karşılık, PDX in vivo çalışmalarına dayanan preklinik çalışmalar antineoplastik ajanların klinik aktivitesini çok daha sadık bir şekilde yansıtmıştır8. PDX dokusu donör tümörün histolojik ve moleküler özelliklerini yakından yansıttığından, PDX modelleri bir biyobankanın bütünlüğünü korumak ve araştırma grupları ile kurumlar arasında numune değişimine izin vermek için genellikle çok sınırlı miktarda uygulanabilir tümör dokusunu yaymak için iyi bir yoldur. Ayrıca, PDX dokusundan elde edilen kanser hücre hatları primer kanser hücre hatlarından önemli ölçüde daha kolay kurulabilir9. Son yıllarda çalışma grubumuz, söz konusu tüm biyolojik numuneler için iş akışını adım adım standartlaştırarak ve optimize ederek kapsamlı bir entegre kolorektal ve pankreas kanseri biyobankası kurmuştur (Şekil 1).
Şekil 1: Biyobankanın iş akışı ve organizasyonu Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen tıklayınız.
Protocol
Aşağıdaki çalışma Rostock Üniversitesi Tıp Merkezi kurumsal inceleme kurulu tarafından onaylanmıştır (II HV 43/2004, A 45/2007, A 2018-0054, A 2019-0187 ve A 2019-0222). Ayrıca, tüm veterinerlik ilgili prosedürler Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg-Vorpommern tarafından LALLF M-V/TSD/ 7221.3-2-020/17 ve 7221.3-1-007/19 kayıt numaraları altında onaylanmıştır.
1. Deneysel Önkoşullar
- Biyobanka kurmak ve sürdürmek için birkaç önemli çerçeve koşulu karşılar.
- İyi donanımlı bir laboratuvar ve yeterli akademik personel ile birlikte cerrahi bölüme ve yeterli sayıda onkolojik reeksiyona sahip bir klinik kullanın. İyi bir altyapı ve işbirliği yapan bir patoloji bölümüyle sıkı bir irtibat daha önkoşuldur.
- In vivo araştırma için, immün yetmezliği olan farelere uygun barınma koşullarına sahip bir hayvan tesisi kullanın.
- Bir sağlık etik komitesinden hasta kaynaklı materyallerle ilgili herhangi bir araştırma için yetki alın. Yerel yasal düzenlemelere göre yetkili makamdan herhangi bir in vivo araştırma için onay alın.
2. Örnek toplama
- Ameliyattan bir gün önce.
- Rezeke edilebilir kolorektal veya pankreas kanseri olan tüm hastaları ve/veya ilgili metastazları biyobankalama uygunluğu için değerlendirin. Neoadjuvan ön tedavi, çok küçük tümörler, belirsiz haysiyetli tümörler veya daha önce kısmen endoskopik olarak reseksiyon edilmiş lezyonları içeren vakaları dahil etmekten kaçının.
- Cerrahi prosedür hakkında bilgilendirilmiş onam tartışması sırasında hastadan katılım için yazılı onay alın. İlgili tüm cerrahları, laboratuvar ekibini ve patologları zamanında bilgilendirin.
- Örnek alma
- Cerrahi işlem başlamadan hemen önce ameliyat odasındaki (AMELIYATHANE) tüm görevlileri biyobanka için doku toplanması hakkında bilgilendirin.
NOT: Dokunun formalin ile sabitlenmemesi çok önemlidir. Doku formalin içine batırılmışsa, entegre biyobankalama için uygun olmaz. - Anestezik indüksiyondan hemen sonra 40 mL heparinize kan (2 x 20 mL şırıng) ve standart bir 7,5 mL serum tüpü çekin ve PBL izolasyonu ve serum işleme için laboratuvara hızlı bir şekilde aktarın (bkz. adım 3-4).
- Resected numuneyi doğrudan ameliyat masasından alın, uygun bir kaba yerleştirin ve patoloji bölümüne götürün. Sirkülasyondan, rezeksiyondan ve patolojiye varıştan kopma zaman noktasını yazın.
NOT: Numunenin biyo bankacılığa uygunluğu, bir dilim tümör ve kötü huylu olmayan dokuyu parçalayan işbirliği yapan patolog tarafından değerlendirilmelidir. Numunenin sonraki patolojik raporu tehlikeye atabilecek herhangi bir bölümünü kendiniz çıkarmayın. - Her iki doku parçasını da 10 ila 30 mL doku depolama çözeltisi (veya DPBS) ile ayrı bir 15 ila 50 mL polipropilen tüpe buz üzerine yerleştirin. Makbuz saatini yazın ve örnekleri hemen laboratuvara aktarın.
NOT: Aşağıdaki protokol adımları 3-6, laminer akış kabininde katı steril koşullar altında yapılmalıdır. Tüm sıvıları oda sıcaklığında kullanın.
- Cerrahi işlem başlamadan hemen önce ameliyat odasındaki (AMELIYATHANE) tüm görevlileri biyobanka için doku toplanması hakkında bilgilendirin.
3. Serum işleme
- 7,5 mL serum tüpünü önceden soğutulmuş bir santrifüjde 1128 x g ve 4 °C'de 15 dakika santrifüj.
- Önceden etiketlenmiş kriyotüplerde tüp başına aliquot 1 mL serum ve sıvı nitrojende dondurun.
4. PBL'nin yoğunluk gradyan santrifüjleme ile izolasyonu
NOT: İki 20 mL şırınnanın her biriyle paralel çalışın.
- 20 mL heparinize kanı 50 mL polipropilen tüpe doldurun ve 15 mL DPBS ekleyin.
- Serolojik pipet ile 15 mL Pancoll alın, pipetleri polipropilen tüpün dibine kadar dikkatlice yerleştirin ve kan / DBPS sütununun altında bir tabaka oluşturmak için Pancoll'u çok yavaşça serbest bırakın.
- Frensiz 15 dakika boyunca 375 x g'da santrifüj.
- Her iki numunenin orta ve üst sütunu arasındaki opak ara tabakayı taze bir 50 mL Polipropilen tüpe epire edin ve aktarın ve DPBS ile 50 mL'ye doldurun.
- Frenli 15 dakika boyunca 270 x g'da santrifüj.
- Süpernatantı aspire edin ve atın, hücre peletini 4,5 mL dondurucu ortamına yeniden atın.
- Kriyotube başına süspansiyonun 1,5 mL'si aliquot, tüpleri sıkıca kapatın ve yavaş dondurma için uygun bir dondurma kabına yerleştirin ve -80 ° C'de saklayın.
5. Doku işleme
NOT: Nükleik asitlerin bütünlüğünü korumak için donmuş tümör ve sağlıklı doku örneklerinin üretilmesiyle başlayın.
- Tümör dokusu örneği
- Tümör örneğini polipropilen tüpten bir Petri kabına birkaç mL doku depolama çözeltisi ile aktarın. Gerekirse DPBS ile durulayın. Örneğe dokunmaktan kaçının ve dokuyu işlemek için iki steril neşter kullanın. Herhangi bir zamanda tahliyeden kaçının.
- Tümör örneğini ayrı bir tabakta uygun ölçekte tartın ve doku ağırlığını not edin.
- Kesmeden önce tümör dokusunun boyut, şekil ve doku kalitesini değerlendirin. Çıtçıt dondurma için bir iğne ucu büyüklüğünde en az bir parça ve hayati kriyoprezervasyon için her biri yaklaşık30 mm 3 (kenar uzunluğu 3 x 3x 3 mm) olan dört küp elde etmeyi hedefleyin. Mümkün olduğunca dörtlü olarak30 mm 3 küp üretin ve 5 dörtlük başına çıtçıt dondurma için tek parça oluşturun. Ayrıca, küplerin sadece hayati dokudan oluşması için nekrotik kısımların kesilmesi gerektiğini de dikkate alın.
- 3 mm kalınlığında dilimler oluşturun. Jel benzeri veya sıvı kütle olarak ayırt edilebilen nekrotik kısımları kesin ve dilimleri istenen iki boyutta küpler halinde kesin.
NOT: Bu noktada herhangi bir doku atmayın. - Dondurmayı tuttur
- Cryotube'ları buna göre etiketle (bkz. adım 7.7).
- Önceden etiketlenmiş kriyotüs başına küçük bir doku parçası yerleştirin. Numuneleri hemen birkaç dakika sıvı nitrojene batırın ve daha sonra -80 °C'de saklayın.
- Hayati dokunun kriyoprezervasyonu
- Cryotube'ları buna göre etiketle (bkz. adım 7.7) ve her birini 1,5 mL dondurucu ortamı ile doldurun. Dondurucu kabı tezgahın yanına yerleştirin.
NOT: Sonraki adımları mümkün olduğunca çabuk izleyin. Dondurucu ortamındaki DMSO sitotoksik özelliklere sahip olduğundan, dokunun uygun soğutma olmadan dondurucu ortamına batırılma süresi 2 dakikayı geçmemelidir. - 30 mm3 küpleri dörtlü olarak düzenleyin. Nekrotik dokuyu ve diğer kalıntıları yemeğin kenarına itin, ancak onları atmayın.
- Neşter bıçağı ile küpleri kepçeleyin ve kriyotüp başına 4 küp aktarın. Tümör parçalarının tamamen dondurucu ortama batırıldığından emin olun. Tüpleri sıkıca kapatın ve yavaş dondurmaya uygun bir dondurma kabına yerleştirin ve -80 °C'lik bir dondurucuda saklayın.
- Kriyotütleri -140 °C veya daha düşük bir hızda uzun süreli depolama için uygun bir depolama sistemine aktarın. Laboratuvar envanter yönetim sisteminde dokümantasyon zorunludur.
- Cryotube'ları buna göre etiketle (bkz. adım 7.7) ve her birini 1,5 mL dondurucu ortamı ile doldurun. Dondurucu kabı tezgahın yanına yerleştirin.
- Sağlıklı doku örneği: 5.1.1 adımlarını tekrarlayın. sağlıklı doku örneği için 5.1.6.4'e kadar.
6. Birincil hücre kültürü
- Nekrotik hurda da dahil olmak üzere tümör dokusunun kalıntılarını Petri kabında neşterlerle mümkün olduğunca küçük parçalara ayırın.
- 50 mL polipropilen tüpün üzerine steril bir hücre süzgeci (100 μm gözenek boyutu) yerleştirin.
- Petri kabına 5-10 mL DPBS eklemek için serolojik bir pipet kullanın, doku kalıntılarını yüzdürün ve bir süspansiyon oluşturmak için pipet yukarı ve aşağı.
- Süspansiyonu pipetle hücre süzgecine aktarın.
- Tüm doku kalıntıları Petri kabından çözülene kadar 6.3-6.4 adımlarını tekrarlayın.
- Hücre ve doku süspansiyonunu hücre süzgecinden geçirmek için 20 mL'lik tek yönlü şırınnanın pistonunu kullanın.
- 5-10 mL taze DPBS ile durulayın, hücre süzgecini atın ve tüpü düzgün bir şekilde kapatın.
- Süspansiyonu 180 x g'da 5-10 dakika santrifüjleyin.
- Bir kollajen hazırlayın-I, kuyu başına 1,5 mL orta ile ön kaplamalı 6 kuyu plakası.
- Aspirat ve üstnatant atmak. Peletin 3 mL DPBS veya orta olarak yeniden ıslatır ve her kuyuya 500 μL süspansiyon ekleyin. Plakayı inkübatöre yerleştirin (%100 nem, %5 CO2, 37 °C)
- Hücre büyümesi ve kirlenmesi için plakayı günlük olarak izleyin.
NOT: Kalıcı bir hücre hattının kurulması noktasına kadar daha fazla hücre kültleşmesi burada açıklanmaz.
7. PDX Üretimi
- in vivo deneylerini yalnızca yetki alanınızın yetkili makamının gereksinimlerini karşılayan uygun nitelikli kişiler tarafından gerçekleştirin.
- İmmün yetmezlikli fareleri, kullanılan fare suşunun taleplerini karşılayan spesifik patojen içermeyen (SPF) koşullar altında barındırın. Hijyenik önlemler arasında ayrı ayrı havalandırılan kafesler, otoklavlı yiyecekler, su ve yuva malzemesinin yanı sıra bir güvenlik hava kilidi ve kişisel, koruyucu ekipmanların giyilmesi yer almaktadır.
- Tüm aletleri önceden otoklavlayın ve çapraz kontaminasyonu önlemek için her tümör vakası için sadece bir cihaz seti kullanın. Tümör dokusunu mümkün olduğunca aseptik olarak ele alın. Aşağıda adı geçen tüm plastik eşyalar steril, tek kullanımlık olmalı ve her ameliyattan sonra atılmalıdır.
NOT: Kriyotüt başına dört tümör dokusu parçasını dondurma yöntemiyle belirlenen PDX üretimi, örnek başına her zaman iki fare gerektirir ve ideal olarak dört PDX tümörü ile sonuçlanır. - Laboratuvar envanter yönetim sistemi üzerinden engraftment için istenen primer tümörü seçin ve numuneyi (hayati derecede korunmuş tümör dokusu) ana depolama tankından taşınabilir bir sıvı azot kabına aktarın (Kuru buz üzerinde -80 °C'de orta depolama da uygundur).
- SPF bölümüne girmeden önce kişisel koruyucu ekipman takın (önlükler, takunyalar, önlük, saç örtüsü, cerrahi maske ve overshoes), ellerinizi ve tüm ekipmanlarınızı dezenfekte edin.
- Matrigel ıslatma
- Kriyotüt formunu sıvı nitrojen kabından çıkarın ve numunenin çözülmesini bekliyoruz.
- 50 mL polipropilen boruyu etiketle ve 35 mL DPBS ile doldur.
- Kriyotülü yukarı ve aşağı eğin ve doku-orta-çamur kaydırılır kaydırılmaz içeriği hemen polipropilen tüpüne aktarın. Tümör doku parçalarını hafifçe durulayın, ana hacmi tüpten ayrı bir kapta atın, kapağı kapatın ve tüpü yukarı-aşağı koyun, böylece dört doku parçası kapakta toplanır.
- Soğutma akümülatörüne bir Petri kabı koyun ve ortaya tek bir damlacık olarak 100 μL Matrigel yerleştirin. Tümör parçalarını Matrigel'e aktarmak için anatomik toparlayıcı kullanın. Her parçanın tamamen Matrigel ile kaplı olduğundan emin olun. 4 °C'de 10 dakika kuluçkaya yaslanın.
- Fare anestezisi (örnek başına 2 fare, paralel çalışır)
- 3:1- ketamin (100 mg/mL) ve ksilazin (20 mg/mL) anestezik çözelti stoğu hazırlayın. Önerilen doz 90/6 mg/kg vücut ağırlığıdır.
- Fareyi tartın ve gerekli anestezik çözeltiyi tek kullanımlık bir insülin şırıngına çekin.
- Fareyi kafesin ızgarasına yerleştirin, kuyruğunu bir elinizle hafifçe çekerek ileriye doğru bir hareket çalıştırın ve aynı anda boynu diğer elin bir tutam tutuşu ile yengeçleyin. Izgaranın faresini kaldırın ve tutma elini çevirin, böylece hayvanın sırtı avucunuza dayanır. Arka ayaklardan birini serçe parmağınızla hareketsiz hale edin ve narkotikleri intraperitoneal olarak enjekte edin. Fareyi kafesine geri koyun ve narkotik indüksiyonu bekliyoruz.
- Anestezi edilmiş fareyi ısıtma plakasına yerleştirin ve korneanın zarar görmemesi için gözleri merhemle kapatın. Farenin arka ayağını cerrahi tokmalarla hafifçe sıkıştırarak anestezinin derinliğini siler.
NOT: Hareket yokluğu derin narkozu gösterir. Her türlü hareket ya istenen narkotik derinliğe ulaşmak için daha fazla zaman ya da ek bir anestezi dozu gerektirir.
- Cerrahi prosedür
- Farenin boynunu sıkıştırarak bir cilt kıvrımı oluşturun ve mikroçipi aplikatörle deri altı olarak enjekte edin (Programlama ayrıntıları için 9. adıma bakın)
- Gerekirse farenin kanatlarını tıraş edin (NMRInu/ nu fareleri tıraş gerektirmez), pamuklu çubukla povidone-iyot uygulayın ve steril bir alan oluşturmak için cerrahi örtü kullanın.
- Cerrahi forseps ile kanadın derisini kaldırın, yaklaşık 4 mm'lik küçük bir kesi yapın ve makasla künt bir hazırlık yaparak küçük bir deri altı cebi oluşturur.
- Her cebe bir tümör parçası koyun ve arka uca yerleştirin.
- 100 μL pipet ucunun ucunu kırpın ve kalan Matrigel'i Petri kabından epire edin ve her cilt cebine eşit olarak uygulayın.
- Yaraları basit kesilmiş dikişlerle kapatın ve sprey pansuman uygulayın.
- Mikroçipi tarayın ve fare ve tümör-id'nin geçerliliğini kontrol edin.
- Taze yatak takımı ve yuva malzemesinin yanı sıra kemiren bir çubukla yeni bir kafes hazırlayın. Kağıt havlulardan bir "yastık" katlayın ve fareyi kızılötesi bir ısı lambasının altına yükseltilmiş kafa ile bırakın.
- 0.25 mL trimethoprim/sulfamethoxazole (400 mg/80 mg) 100 mL içme suyu ile karıştırın ve içme şişesi ile idare edin. Bir farenin günlük kg vücut ağırlığı başına yaklaşık 150 mL tükettiği düşünülmektedir.
NOT: Subkutan PDX modeli postoperatif ağrı ile ilişkili olmadığından, ne yara iyileşme sürecinde, ne de tümör büyümesi sırasında postoperatif analjezi gerekli değildir. Kurumunuzun/otoritenizin hayvan refahı yönergelerinin farklı olabileceğini lütfen unutmayın. - Deney hayvanlarının izlenmesi
- Fareleri her gün sıkıntı belirtileri için izleyin. Bu, nitelikli hayvan bakıcılarına devredilebilir.
- Ameliyat sonrası antibiyotik tedavisini yukarıda belirtilen dozajla 4 hafta boyunca sürdürin. Antibiyotik karışımını haftada iki kez değiştirin.
- Tümör boyutunu haftada en az bir kez, ideal olarak günlük, kaliperle ölçün (tümör hacmi = 0,52 x uzunluk x genişlik x yükseklik [mm3]) ve veritabanına kaydedin.
8. PDX hasat ve işleme
- PDX tümörlerini hasat edin ve işleyin, ne zaman:
Tümör büyüklüğü 1.500 mm3hedef hacme ulaşır.
Hayvan taşıyan tümör sıkıntı ve/veya hastalık belirtileri gösterir ve tedavi beyhudedir.
Tümör ülser olur veya farenin cildine nüfuz eder. - Doğru PDX'i tanımlamak için mikroçipi okuyun.
- Fareyi yasal bir yöntemle (ulusal yönergelere bağlı olarak) CO2-asfiksasyon veya ketamin/ksilazin enjeksiyonu ve ardından servikal çıkık olarak ötenazi edin.
- Deriyi yanlarda cerrahi dikps ile kaldırın ve metzenbaum makası ile tümörden birkaç milimetre uzakta inzivaya alın.
- Tümörün üzerindeki cildi künt hazırlıkla ayırın, ardından anatomik kümeslerle tümörü dikkatlice kavrayın ve tümörü vücudun yüzeysel fasyasından ayırın.
- Tümörü DPBS ile durulayın, bir Petri kabına koyun ve bitişik bağ dokusunu çıkarın.
- Bu noktada, aşağıdakilerden birini gerçekleştirin:
- 30 mm3 küp kesin ve yeni PDX oluşturun (7.7.4 noktasında protokolle devam edin).
- Tümörü dilimler halinde kesin, daha sonra histoloji kasetlerine aktarılır ve daha sonra parafin gömülmesi için% 4 formaldehitte korunur.
- Tümörü biyobankaya eklemek için doku depolama çözeltisi ile bir tüpte koruyun (Adım 3.'de protokolle devam edin) ve/veya PDX türevi hücre hatları oluşturun (Adım 4'te protokolle devam edin.)
9. Biyobanka ve veri yönetimi
- Tablo 1'egöre her tümör vakasına bir iç kimlik atayın.
| Laboratuvar yeri/adı | kanser varlığı | ardışık servis talebi numarası | Belirtimi | ardışık sayı |
| C=kolorektal | _Met=Metastaz | |||
| P=pankreas | _Tu=Tümör | |||
| Örnek: HROC389_Met2 = Rostock, kolorektal kanser, vaka 389, ikinci metastaz | ||||
Tablo 1: Örnek kimliğin tanımı.
- Hasta rızasını tümör-kimlik ile birlikte elektronik ve kağıt formunda saklayın.
- Mümkün olduğunca çok klinik veri toplayın ve bunları anonim ve ayrı ayrı saklayın.
- Bir veri yönetimi yazılımı (örneğin, Freezerworks) veya başka bir yazılım kullanın ve sıcaklığa dayanıklı, kendinden yapışan barkod etiketleri oluşturmak için etiket yazdırma yazılımıyla bir arayüz oluşturun.
- Veri yönetimi yazılımını açarak yeni bir örnek ekleyin, numune türünü tanımlayın ve aşağıdaki bilgileri kaydedin: tümör kimliği, doku tipi, dondurma yöntemi, tarih, sorumlu çalışan, geçiş numarası, fare kimliği ve fare zorlanması.
- Numuneleri depolama tankındaki belirli konumlara atayın.
- PDX'in izlenmesi ve izlenmesi (7-8. adım için geçerlidir)
- Tümör kimliği, implantasyon tarihi, ötanazi tarihi, fare yaşı ve zorlanmasının yanı sıra zaman içinde tümör büyümesini kaydetmek için taşınabilir, Bluetooth özellikli bir cihazda (dizüstü bilgisayar veya tablet) bir MS Access veri tabanı (veya benzer bir sistem) kullanın.
- Mikroçip okuyucuyu cihaza bağlayın ve implantasyondan önce mikroçipi okuyun.
- Her fareye belirli bir kimlik atayın; aşağıdaki şemayı kullanıyoruz: (aşağıdaki Tablo 2'ye bakın)
- İmplantasyondan sonra, kimliği veri tabanındaki fare özellikleriyle birlikte kaydedin.
- Mikroçipi yeniden okuyun ve mikroçip, veri tabanı ve kriyotüp etiketinin özellikleri tutarlı olup olmadığını kontrol edin.
- Her fare kafesi için buna göre bir etiket oluşturun.
NOT: Fiziksel bir yedekleme oluşturmak için, ilgili mikroçip etiketleriyle birlikte kriyotüp etiketlerini bir kitapçık ve not tarihi ve fare zorlanması içine yapıştırın. - Bireysel PDX'in tümör büyümesini izlemek için, farenin mikroçipini kimlik tespiti için veri tabanı cihazına bağlı okuyucu ile tarayın ve her hafta kaliperle ölçülen tümör boyutunu kaydedin.
- Tümörün büyüme eğrisini analiz ederek PDX hasadının ideal zaman noktasını planlayın.
| Tümör Kimliği | N2'de önceki depolama (=f) | Geçiş (=T) numarası | ardışık fare (=M) numarası |
| Örnek: HROP12 fT0 M1 = Rostock, pankreas kanseri, vaka 12, dondurulmuş birincil dokudan oluşturulan, ilk pasaj, fare 1. | |||
Tablo 2: PDX Kimliği'nin tanımı.
Representative Results
Elimizde, birincil hücre kültürlerinin kuruluş oranı (Şekil 2A & B) büyük bir seride% 12.9 idi9. Genişletilebilir tümör hücrelerini taze cerrahi resected örneklerden izole etme girişimlerinin çoğu, büyüme veya erken kontaminasyon eksikliği nedeniyle başarısız oldu. Hücre hattı kuruluşu, standart kültür koşullarında (DMEM, % 10 FCS, standart kültür gemisi) istikrarlı bir büyüme ve FACS analizi ile epitel farklılaşması doğrulaması ile 3 pasajdan sonra başarılı olarak kabul edildi10. PDX tümörlerinden elde edilen hücre hatları (Şekil 2C & D) primer resected tümörlerin aksine tekrarlayan girişimler olasılığından da kaynaklanan% 23.6'lık daha yüksek bir kuruluş oranı göstermiştir9. Bununla birlikte, bazı karma kültürler (Şekil 2E) fibroblastic büyümeden kurtulamaz ve hatta fibroblastic overrowth nedeniyle kaybolur (Şekil 2F).
Şekil 2: Hücre kültürü. Kolon kanseri olgusunun metastazından türetilen primer kanser hücre hatları HROC313, pasaj 21 (A) ve pankreas kanseri olgu hrop88, pasaj 5 (B). Kolon PDX HROC285 T0 M2 (D) ve pankreas PDX HROP10 T5 M2'nin PDX türevi kanser hücresi hatları, geçiş 4 (E). Pankreas kanseri HROP75, pasaj 8 (C) ve fibroblastic overrowth (F) gelen fibroblastlar ve kanser hücrelerinin karma kültürü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
PDX oluşturma protokolündeki değişiklikler, kullanılan fare suşları ve birkaç yıl boyunca deneyler ve ayrıca engraftasyon için mevcut tümör dokusu miktarındaki büyük farklılıklar göz önüne alındığında, PDX neslinin genel başarı oranını vermek önemsiz değildir. İki araştırmacı (S.M. ve F.B. ) tarafından gerçekleştirilen çok yeni bir PDX nesil deney serisinde, kolorektal PDX için birincil büyüme oranları (Örnek bir histoloji Şekil 3A'dangösterilebilir) ve pankreas PDX(Şekil 3B)için% 48 gözlenmiştir. İmplantasyon alanında murine veya insan lenfomalarının büyümesi nispeten nadirdir, ancak başarılı PDX büyümesini taklit edebilir (Şekil 3C). Histopatolojik muayene dışında PDX modelleri ile donör hastaları arasındaki uyum kısa tandem tekrar (STR) analizi ile düzenli olarak doğrulanmıştır(Şekil 3D). Günümüzde biyobanka >50 birincil ve 50 > ikincil kolorektal, 3 birincil ve 6 ikincil pankreas kanseri hücre hattının yanı sıra >150 kolorektal ve 19 pankreas PDX modeli içer vermektedir.
Şekil 3: Kolorektal (A) ve pankreas PDX 'in (B) temsili histolojik karşılaştırması. İmplantasyon alanında PDX büyümesini taklit eden insan lenfoma (C). Pdx modelinin (HROC430 T1 M2) kısa tandem tekrar (STR) analizi ile orijinal hasta tümör dokusuna (HROC430Tu) genetik kimlik testi. Dokuz STR loci, vWA, THO1, TPOX, CSF1 PO (FAM boyası) ve D5S818, D13S317, D7S820, D16S539 (HEX boyası) çok katlı PCR kullanılarak, kılcal elektroforezi takiben floresan etiketli astarlarla karşılaştırılması PDX ve donör tümörün (D) genetik uyumunu doğruladı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Yaşayan bir biyobankanın üretimi, gizlilik, tıp hukuku ve hayvan refahı yasal düzenlemelerine, iyi bir altyapıya ve iyi koordine edilmiş bir ekibe uymanın yanı sıra önazi sağlar. Cerrahi personelin bir kısmını doğrudan araştırma prosedürlerine dahil etmek avantajlıdır, çünkü bireysel hastanın doku bağışına uygunluğunu çok iyi değerlendirebilirler. Ayrıca, hastalar cerrahi bilgilendirilmiş rıza tartışması kapsamında yazılı onayları alındığında biyobankalama ile daha sık rıza gösterme eğilimindedir. Zamandan ve kaynaklardan tasarruf etmek için, biyobankalama için muhtemelen yetersiz miktarda tümör dokusu verecek vakalar seçilmemelidir. Örnek alımı söz konusu olduğunda, maksimum "iletişim anahtardır" basit, ancak genellikle göz ardı edilen bir gerçektir. Her zamanki gibi devam ederek ve rezeksiyon örneğine formaldehit ekleyerek numuneyi en başta mahvetmek için sadece tek bir bilgisiz tiyatro hemşiresi veya cerrahi meslektaşı gerekir. Bu nedenle, ilgili personelin her bir üyesinin biyobankalama için SÇP ile tanışması kesinlikle çok önemlidir. Cerrahlar, planlanan doku toplama ile ilgili prosedürün bir gün önce ve hemen başında fark edilmelidir. Ayrıca, biyobankalama için seçilen durumlar elektronik OR planında vurgulanmalıdır. Cerrahi numuneden doku hasadı bir patolog tarafından yapılmalıdır. İlk olarak, bu, doku hasadının nihai patolojik rapora müdahale etmemesini sağlayacaktır. İkincisi, bu yeterli miktarda canlı kanser dokusu ile doku alma olasılığını arttırır. Özellikle belirgin desmoplastik reaksiyona ve sık görülen nekrotik bölgelere sahip pankreas kanserlerinde, eğitimsiz göz için uygulanabilir parçaların makroskopik olarak tanımlanması zordur. Bu kuralın bir istisnası olarak, cerrahi marjlar makroskopik olarak tanımlanabiliyorsa, büyük hepatik veya pulmonal metastazlardan kaynaklanan doku blokları, zaman zaman cerrah tarafından "arka masa" olarak eksest edilebilir. Toplam mezorektal eksizyon (TME) ile resected rektal kanser biyobankalama için uygun olmayabilir, çünkü parafin gömmeden önce resected örnekten doku hasadı TME kalite değerlendirmesini engelleyebilir. Alternatif olarak, biyobankalama için doku rektum kanserinin transanal biyopsisi ile elde edilebilir.
Orijinal tümörden elde edilen primer hücre kültürlerinin kuruluş oranları genellikle düşüktür. PDX türevli, ikincil hücre kültürleri daha başarılı bir şekilde kurulabilir. Hasat edilen doku nadiren steril olduğundan kontaminasyonu minimuma indirmek için her vaka için farklı ortamların testini ve ilk pasajlar için antibiyotik takviyelerinin kullanılmasını öneririz. Başarılı bir yayılmadan sonra, her bir hücre hattı FACS analizi ile kanser hücre hattı olarak doğrulanmalı ve düzenli olarak mikoplazma kontaminasyonu için test edilmelidir. Çapraz kontaminasyonu dışlamak için düzenli STR analizi önerilir. Birincil ve ikincil hücre hatları için kuruluş protokolünün sürekli optimizasyona tabi tutulduğu unutulmamalıdır. Tek medyanın kompozisyonu ve başarı oranları ile ilgili detaylar açıkça bu çalışmanın kapsamı dışındadır ve ayrıca yayınlanacaktır.
PDX engraftment için tümör dokusu rezeksiyondan sonra doğrudan implante edilebilir veya fetal baldır serumunda% 10 DMSO veya gecikmeli implantasyon için benzer donma ortamı ile kriyoprezervasyon yapılabilir. Tümör dokusu hasadından hemen sonra implantasyon lojistik ve laboratuvar personeline baskı yapar ve kriyoprezervasyondan sonra xenografting sonuçları 10'undandaha düşük değildir. Ayrıca, tümör implantasyonundan önce Matrigel'deki dokunun inkübasyonu, engraftasyon oranlarını önemli ölçüde arttırır12. Kesin patolojik bulgu ve hatalı toplanan doku örneklerinin derhal atılmasını takiben gecikmeli engraftment öneriyoruz. Birincil engraftment başarı oranı alıcı farenin immün yetmezliği ile arttığından, ilk PDX geçişi için NSG fareleri kullanma eğilimindeyiz. İlk başarılı PDX gravürden sonra, NMRInu/nu fareleri sonraki pasajlar ve doku genişlemesi için kullanılabilir ve kullanılmalıdır. Bu suş, NSG veya benzeri immün yetmezlik suşlarına kıyasla daha sağlam, daha ucuz ve üremesi daha kolaydır, ancak yine de makul engraftment oranları gösterir. Ayrıca, çıplaklığı implantasyon ve tümör büyüme takibini kolaylaştırır. Sonraki pasajlardaki engraftment oranlarını artırmak için, özellikle yavaş büyüyen PDX ve düşük birincil engraftment başarı oranına sahip vakalar için, taze hasat edilmiş PDX dokularının mümkün olduğunda konak farelere doğrudan aktarılmasını öneririz. Collins ve Lang yakın zamanda kolorektal PDX kuruluşunun 14 çalışmalarını gözden geçirdiler ve % 68'lik ortanca PDX kuruluş oranı ile% 14 ila% 100 arasında değişen engraftment oranları bildirdiler, ikincisi bulgularımızla tutarlı13. Literatür doğrultusunda kolorektal kanser PDX14'ekıyasla pankreasın kuruluş oranlarının daha düşük olduğunu gözlemledik. Konak fare suşu ve tümör varlığından bağımsız olarak, implantasyon tarafındaki insan, Epstein-Barr Virüsü (EBV) ilişkili B hücreli lenfomalar ve murine lenfomaların büyümesi önemli bir tuzak oluşturur15,16. Tanınmazsa, bu tür tümörler sonraki pasajları "kirletebilir" ve böylece ardışık sonuçları karıştırabilir. Olağandışı hızlı PDX büyümesi ve servikal, aksiller ve kasık lenf düğümlerinin şişmesi murine lenfoma büyümesinin güçlü göstergeleridir, ancak PDX'in düzenli histolojik muayenesi yine de tavsiye edilir. Ayrıca PDX ile ilgili donör hasta arasındaki genetik uyum STR analizi ile düzenli olarak test edilmelidir. İdeal olarak, biyobanka hastaların özelliklerini (genel bilgi, sağkalım, nükssüz sağkalım, tedavi, sekonder neoplazi vb.) içeren bir klinik veritabanına bağlanmalıdır. Gizliliğin korunmasına ilişkin yasal düzenlemeler ve anonimleştirilmiş bir veri tabanının olmaması nedeniyle, klinik veri setimiz işbirliği yapan doktorlar tarafından düzenli olarak yönetilir ve manuel olarak güncellenir.
Konvansiyonel biyobankalar gözlemevi araştırmalarıyla sınırlı olmakla birlikte, canlı bir biyobanka in vitro ve in vivo müdahaleler için fırsat sağlamaktadır. Hasta kaynaklı hücre hatları temel araştırmalar, yüksek verimli ilaç taramaları ve yeni farmasötik ajanların değerlendirilmesi için önemli bir araçtır4. Bununla birlikte, karşılık gelen PDX modelleri, orijinal tümör17,18'in histolojisini yakından özetledikleri ve çeşitli pasajlar üzerinde yüksek genetik stabilite gösterdikleri için artan öneme sahiptir19,20. PDX biyobankamız klinik öncesi ve temel araştırmalar için mükemmel bir platform olduğunu kanıtlamıştır6,21. Ayrıca, büyük PDX koleksiyonları hasta popülasyonunun bireyler arası heterojenliğini yeterince yansıttığından, PDX klinik çalışma (PCT) yaklaşımı (tedavi başına model başına bir hayvan) ilaç gelişimi için önem kazanmıştır, çünkü yeni ilaçlara ve kombinatoryal rejime karşı klinik yanıtın sadık bir şekilde öngörülmesine izin verir8. Ayrıca şu anda küçük PCT denemelerinde yeni deneysel ilaçları değerlendiriyoruz.
Bu umut verici sonuçlara rağmen, 12,2 aylık ortanca kuruluş süresi, PDX modellerinin antikanser tedavi seçeneklerini test etmek için "avatar fareler" olarak klinik uygulanabilirliğini engeller, en azından acil adjuvan veya hatta neoadjuvan tedaviye ihtiyaç duyan hastalar için22. Standart PDX modellerinin ek bir dezavantajı, konak farelerin immün yetmezliği nedeniyle immünoterapi testi için kullanılabilirlik eksikliğidir. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için birkaç "insanlaştırılmış" fare suşu geliştirilmiştir. Bu fareler ağır bir şekilde bağışıklık sistemi baskılanır, ancak PDX büyümesi23'tensonra çeşitli insan kemik iliği türevi hücreler veya CD34+ hematopoetik kök hücreler ile yeniden inşa edilebilir Lenfosit aracılı sitotoksisitenin değerlendirilmesine ve immün kontrol noktası inhibitörü tedavisine tedavi yanıtı24,25.
Son yıllarda hasta kaynaklı organoidler (PDO), PDX ile rekabet eden önemli kanser modelleri olarak ortaya çıkmıştır. Sağlam tümör parçalarından türetilen ve hücre dışı matris iskelesinde kültürlenen bu üç boyutlu yapılar, orijinal tümörün histolojik ve genetik özelliklerini yakından yansıtmaktadır. Uzun vadeli genişleme ve kriyoprezervasyon olasılığı PDO'yu yaşayan bir biyobankanın ideal bir takviyesi haline getirir26,27. Nispeten yüksek bir kuruluş oranına ek olarak, çeşitli tümör varlıklarının PDO'ları için güvenilir ilaç yanıt tahmini bildirilmiştir28. Ayrıca, PDO'lar dolaşımdaki tümör hücrelerinden bile üretilmiştir ve ayrıca organoidlerin ilgili sağlıklı dokudan eşzamanlı olarak kurulması mümkündür, bu da tedaviye bağlı toksisitenin hasta-birey bazında değerlendirilmesine izin verir29,30. Bununla birlikte, geleneksel 2D hücre kültürlerine kıyasla, organoid kültürü zaman ve kaynak tüketendir ve yapay hücre dışı matris bileşikleri belirli analitik prosedürlere müdahale edebilir31. Ayrıca, kanser organoidleri sağlıklı epitelden elde edilen daha hızlı büyüyen, kötü huylu olmayan organoidler tarafından aşırı büyümeye karşı hassastır30. Stroma, kan damarları ve bağışıklık hücrelerinin eksikliği nedeniyle, PDO'lar çoğunlukla antianjiyojenik immünoterapik ajanların test edilmesi için uygulanamaz. Yine de, yeni kültleme yöntemleri tümör mikroçevrimi in vitromodellemesine izin verir, PDO'ları PDX modelleri için gerçek bir rakip haline getirir32. Yakın gelecekte, hasta-bireysel tümör modelleri, yeni nesil dizileme gibi güçlü genetik araçlarla birleştiğinde, umarım gerçek hassas tıbba ve özel tedavi yaklaşımlarına giden yolu açacaktır.
Disclosures
Hiçbiri.
Acknowledgments
Videonun kaydedilme ve düzenlenmesi için grafik asistanımız Jenny Burmeister'ı nazik olarak kabul ediyoruz. Ayrıca, cerrahi ve patolojik bölümdeki meslektaşlarımıza uzun süredir devam eden işbirliği için teşekkür ederiz. Ayrıca Rostock Üniversitesi BT ve Medya Merkezi üretim müdürü Marcus Müller'e ses kayıt ekipmanlarını tedarik ettiği ve ses kalitesini iyi hale getirdiği için teşekkür ederiz.
FINANSMAN: Alman Kanser Yardım Vakfı (DKH e.V.), 108446 hibe numarası ve Mecklenburg-Vorpommern eyaletinden TBI-V-1-241-VBW-084 hibe numarası bu araştırmayı kısmen finanse etti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacillol® AF; 1L | Bode, Hartmann | REF 973380 | desinfection |
| PP centrifuge tube, 15ml; sterile | Greiner Bio One | GBO Cat. No.:188271 | centrifuge tube |
| PP centrifuge tube, 50ml, sterile | Sarstedt | Order number: 62.547.254 | centrifuge tube |
| BD DiscarditTM II Syringe 20ml | BD | REF 300296 | blood collection |
| Serum 7,5ml Sarstedt Monovette | Sarstedt | Item number: 01.1601 | blood collection |
| serological Pipette 10ml | Sarstedt | REF 86.1254.001 | liquid transfer |
| Pipetboy ratiolab® accupetta | Ratiolab | Item number: RL3200300 | liquid transfer |
| PIPETBOY acu 2 | Integra Biosciences | VWR Cat.No: 613-4438 | liquid transfer |
| DPBS; w/o Ca & Mg | Pan Biotech | Cat. No.: P04-36500 | washing |
| Pancoll human | Pan Biotech | Cat. No.: P04-60500 | density gradient centrifugation |
| DMEM/F12 (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) | PAN Biotech | Cat. No.: P04-41500 | cell cultivation |
| FBS Good Forte (Filtrated Bovine Serum) | PAN Biotech | Cat. No.: P40-47500 | cell cultivation |
| L-Glutamine 200mM | PAN Biotech | Cat. No.: P04-80100 | cell cultivation |
| Trypsin / EDTA | PAN Biotech | Cat. No.: P10-023100 | cell cultivation |
| DMSO (Dimethyl Sulfoxid for cell culture) | PanReac AppliChem | VWR Cat.No: A3672.0250 | cell freezing |
| Freezer Medium (FCS with 10% DMSO) | selfmade | --- | cell freezing |
| cryotube- CryoPure 2ml | Sarstedt | 72380 | cell freezing |
| 6-Well cell culture plate; steril; with lid | Greiner bio-one | Cat.-No.: 657 160 | cell cultivation |
| Petri dish 92 x 16 mm, PS, without cams | Sarstedt | Cat. No.: 82.1472.001 | tissue preparation |
| sterile surgical blades | B.Braun (Aesculap) | REF BB510 | tissue preparation |
| BD DiscarditTM II Syringe 10ml | BD | REF 309110 | tissue preparation |
| cell strainer; yellow; 100µm | Falcon | REF 352360 | tissue preparation |
| CoolCell | biocision | Item number: 210004 | cooling container with -1°C/min |
| Dewar transport vessel type 27 B, 2 l, 138 mm | KGW | Cat. No.: HT39.1 | transport system |
| Pipette tip 200µl | Sarstedt | REF 70.760.002 | liquid transfer |
| Filter tip 1000µl | Sarstedt | REF 70.762.411 | liquid transfer |
| Pipette 200µl, yellow | Eppendorf | Cat. No.: 3121 000.082 | liquid transfer |
| Pipette 1000µl, blue | Eppendorf | Cat. No.: 3121 000.120 | liquid transfer |
| incubator BB 6220 CU | Heraeus | Cat.-No.: 51012839 | cell cultivation |
| heating plate PRÄZITHERM | Harry Gestigkeit GmbH | --- | heating |
| Microscope Zeiss Primo Vert | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | Serial number. 3842000839 | imaging cell cultures |
| Sterile bench Safe flow 1.8 nunc | nunc GmbH & Co. KG | --- | sterile working bench |
| freezer -80°C | Kryotec-Kryosafe GmbH | --- | sample storage |
| Electronic balance MP-300 | Chyo | --- | Scale |
| BD Micro-fine, U100 insulin syringe | BD | REF 324826 | injection anesthetic |
| Rompun 2%; 25ml | Bayer | approval number: 6293841.00.00 | anesthesia |
| Ketamin 100 mg/ml, 25ml | CP-Pharma GmbH | approval number: 401650.00.00 | anesthesia |
| GES3S Reader | Datamars | not available | RFID reader |
| ISO-Transponder FDX-B (1,4x8mm) | Peddymark | --- | RFID chip |
| Cotrim-ratiopharm® Ampullen SF 480 mg/5 ml | Ratiopharm | PZN-03928197 | antibiotic drinking water |
| Heating plate #FM-20 42x28cm | Dragon | --- | heating |
| Heating lamp | Electric Petra, Burgau | --- | heating |
| Ointment for the eyes and nose (5% Dexpanthenol) Bepanthen | Bayer | PZN-01578675 | Eye protection |
| anatomical tweezer | B.Braun Aesculap | BD21 OR | surgical instruments |
| surgical tweezer | B.Braun Aesculap | BD50 1 R | surgical instruments |
| scissors | B.Braun Aesculap | BC05 6R | surgical instruments |
| needle holder | B.Braun Aesculap | BH1 1 OR | surgical instruments |
| Prolene 5-0 | Ethicon | XN8870.P32 | surgical suture material |
| Opsite moisture vapour permable spray dressing | Smith&Nephew | REF 66004978, PZN- 02063507 | surgical suture material |
| Adhesive aperture drape | Barrier | REF 904622 | sterile OP tissue |
| gauze swap Gazin®; steril; 10x10 cm | Lohmann&Rauscher | REF 18506 | sterile OP tissue |
| Raucotupf cotton tipped applicators | Lohmann&Rauscher | REF 11969 | applicator |
| Corning® Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | Cat.-No.: 354234 | Basement Membrane Matrix |
| iodine solution Braunol (7,5g povidone iodine) | B.Braun Melsungen AG | Item number: 18839 | desinfection |
| MACS® Tissue Storage Solution | Miltenyi Biotec GmbH | Order No.:130-100-008 | storage solution |
| Formafix 4% | Grimm med. Logistik GmbH | Item number: F10010G | fixation solution |
| Software FreezerworksBasic | Dataworks Development, Inc | --- | sample organization |
| Zebra TLP 2844 printer | Zebra | --- | label printer |
References
- Sartore-Bianchi, A., et al. PIK3CA mutations in colorectal cancer are associated with clinical resistance to EGFR-targeted monoclonal antibodies. Cancer research. 69 (5), 1851-1857 (2009).
- Pauli, C., et al. Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine. Cancer discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
- Lipson, D., et al. Identification of new ALK and RET gene fusions from colorectal and lung cancer biopsies. Nature medicine. 18 (3), 382-384 (2012).
- Wilding, J. L., Bodmer, W. F. Cancer cell lines for drug discovery and development. Cancer research. 74 (9), 2377-2384 (2014).
- Mouradov, D., et al. Colorectal cancer cell lines are representative models of the main molecular subtypes of primary cancer. Cancer research. 74 (12), 3238-3247 (2014).
- Klier, U., Maletzki, C., Kreikemeyer, B., Klar, E., Linnebacher, M. Combining bacterial-immunotherapy with therapeutic antibodies: a novel therapeutic concept. Vaccine. 30 (17), 2786-2794 (2012).
- DiMasi, J. A., Reichert, J. M., Feldman, L., Malins, A. Clinical approval success rates for investigational cancer drugs. Clinical pharmacology and therapeutics. 94 (3), 329-335 (2013).
- Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nature medicine. 21 (11), 1318-1325 (2015).
- Mullins, C. S., et al. Integrated Biobanking and Tumor Model Establishment of Human Colorectal Carcinoma Provides Excellent Tools for Preclinical Research. Cancers. 11 (10), (2019).
- Kuehn, F., et al. Establishment and characterization of HROC69 - a Crohn's related colonic carcinoma cell line and its matched patient-derived xenograft. Scientific reports. 6, 24671 (2016).
- Dangles-Marie, V., et al. Establishment of human colon cancer cell lines from fresh tumors versus xenografts: comparison of success rate and cell line features. Cancer research. 67 (1), 398-407 (2007).
- Gock, M., et al. Tumor Take Rate Optimization for Colorectal Carcinoma Patient-Derived Xenograft Models. BioMed research international. 2016, 11715053 (2016).
- Collins, A. T., Lang, S. H. A systematic review of the validity of patient derived xenograft (PDX) models: the implications for translational research and personalised medicine. PeerJ. 6, 5981 (2018).
- Brown, K. M., et al. Patient-derived xenograft models of colorectal cancer in pre-clinical research: a systematic review. Oncotarget. 7 (40), 66212-66225 (2016).
- Zhang, L., et al. The extent of inflammatory infiltration in primary cancer tissues is associated with lymphomagenesis in immunodeficient mice. Scientific reports. 5, (2015).
- Moyer, A. M., et al. Spontaneous murine tumors in the development of patient-derived xenografts: a potential pitfall. Oncotarget. 10 (39), 3924-3930 (2019).
- Prall, F., Maletzki, C., Hühns, M., Krohn, M., Linnebacher, M. Colorectal carcinoma tumour budding and podia formation in the xenograft microenvironment. PloS one. 12 (10), 0186271 (2017).
- Guenot, D., et al. Primary tumour genetic alterations and intra-tumoral heterogeneity are maintained in xenografts of human colon cancers showing chromosome instability. The Journal of pathology. 208 (5), 643-652 (2006).
- Mattie, M., et al. Molecular characterization of patient-derived human pancreatic tumor xenograft models for preclinical and translational development of cancer therapeutics. Neoplasia. 15 (10), New York, N.Y. 1138-1150 (2013).
- Cho, Y. B., et al. Colorectal cancer patient-derived xenografted tumors maintain characteristic features of the original tumors. The Journal of surgical research. 187 (2), 502-509 (2014).
- Maletzki, C., et al. Functional Characterization and Drug Response of Freshly Established Patient-Derived Tumor Models with CpG Island Methylator Phenotype. PloS one. 10 (11), 0143194 (2015).
- Katsiampoura, A., et al. Modeling of Patient-Derived Xenografts in Colorectal Cancer. Molecular cancer therapeutics. 16 (7), 1435-1442 (2017).
- Wege, A. K., et al. Humanized tumor mice--a new model to study and manipulate the immune response in advanced cancer therapy. International journal of cancer. 129 (9), 2194-2206 (2011).
- Herndler-Brandstetter, D., et al. Humanized mouse model supports development, function, and tissue residency of human natural killer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), 9626-9634 (2017).
- Capasso, A., et al. Characterization of immune responses to anti-PD-1 mono and combination immunotherapy in hematopoietic humanized mice implanted with tumor xenografts. Journal for immunotherapy of cancer. 7 (1), 37 (2019).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), New York, N.Y. 920-926 (2018).
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature reviews. Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Abe, Y., et al. Improved phosphoproteomic analysis for phosphosignaling and active-kinome profiling in Matrigel-embedded spheroids and patient-derived organoids. Scientific reports. 8 (1), 11401 (2018).
- Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
