Summary
多柱板适配器允许色谱柱与多井收集板接口，用于平行亲和力或离子交换纯化，提供经济的高通量蛋白质纯化方法。它可以通过负担得起的仪器在重力或真空下产生毫克蛋白质。
Abstract
蛋白质纯化是蛋白质结构和功能研究的必要条件，通常与生物物理技术相结合使用。它也是开发新疗法的关键组成部分。功能蛋白质组学的不断发展时代正在推动对高通量蛋白质纯化的需求，并改进了技术来促进这一需求。据推测，多柱板适配器（MCPA）可以将不同脂质的多个色谱柱与多井板对接，进行平行净化。这种方法提供了一种经济且多才多艺的蛋白质纯化方法，可在重力或真空下使用，与自动化系统的速度相媲美。MCPA可以用来通过一种经济实惠且省时的方法回收蛋白质的毫克产量，用于后续的定型和分析。MCPA 已用于 SH3 域的高吞吐量亲和力纯化。离子交换也通过MCPA证明净化蛋白质后Ni-NTA亲和色谱，表明该系统如何可以适应其他纯化类型。由于其设置具有多个列，参数的单独自定义可以在同一纯化中进行，目前基于板的方法无法实现。
Introduction
蛋白质纯化技术，以达到毫克的纯化蛋白质的数量是必不可少的，他们的特征和分析，特别是生物物理方法，如NMR。蛋白质纯化也是其他研究领域的核心，如药物发现过程和蛋白质-蛋白质相互作用研究：然而，实现如此数量的纯蛋白质可以成为这些技术的瓶颈1，2，3。蛋白质纯化的主要方法是色谱法，它包括各种依靠蛋白质的个体特征及其标签的方法。在亲和色谱中，蛋白质有一个额外的蛋白质或肽图案，作为一个标签，对色谱树脂4上的某一基质有亲和力。最常见的亲和力方法是使用他标记的蛋白质固定金属亲和力色谱 （IMAC），而另一种流行的方法是离子交换色谱，根据蛋白质的电荷分离蛋白质。对于最高的纯度，亲和色谱和离子交换的组合经常一起使用，通常需要昂贵的实验室设备来获得高通量。
功能蛋白质组学时代的发展正在推动对高通量技术的需求，以纯化不是单一的蛋白质进行特定分析，而是同时大量蛋白质进行综合分析和基因组广泛研究。固定金属亲和色谱 （IMAC） 是高通量蛋白质纯化6、7最广泛使用的方法之一，但其自动化系统对于较小的实验室8来说成本高昂且负担不起。目前可用的更经济实惠的基于板材的替代品采用无障碍实验室设备，如真空。虽然这些方法成功地提高了净化速度，但它只能在较小的规模上实现高通量纯化，只能在微克范围内产生蛋白质。这些限制意味着，在生物物理技术9之前，不能使用预包装的96井过滤板（例如，来自Ge医疗保健公司现在拥有Cytiva）。重力色谱是最经济高效的净化方法：但是，设置多个列不方便，并且可能容易出现多种蛋白质的错误。
多柱板适配器 （MCPA） 已开发和证明成功和方便地运行平行亲和色谱列一次净化他的标签酵母 SH3 域10.MCPA 提供一种经济高效的高通量净化方法，不依赖于昂贵的仪器仪表。其灵活的设计可以通过重力或真空歧管下的多个亲和力色谱柱有效纯化毫克蛋白质。此外，树脂类型、体积和其他参数可用于每个列进行调整，以便更快地优化。这项研究表明，MCPA 的离子交换色谱可用于 MCPA 与亲和力色谱相结合，以提高 Abp1 SH3 域的纯化。此外，使用这些方法可以并行分离多达 24 种不同的蛋白质。
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Protocol
1. 否认尼-NTA色谱
- 准备缓冲区
注：有关所有缓冲器的详细信息，请参阅表 1。- 组成 500 毫升的 0.5 M NaOH，确保先添加 Milli-Q 水，然后在烧嘴在搅拌器上时缓慢添加 NaOH。使用 0.22 μm 过滤器进行筛选。
- 使用 0.22 μm 过滤器准备 100 mL 的 0.1 M 镍硫酸盐和过滤器。
- 使用 0.22 μm 过滤器准备 50 mL 的 2 M 伊米达佐尔和过滤器。
- 准备和 0.22 μm 过滤器 1.5 L 的 变性缓冲在 pH 8.0 包括 5.3 mM 特里斯 -HCl， 4.7 mM 三基（三磷（羟基甲基）甲基胺），13.7 m M NaH2PO4，86.3 mM 纳2HPO4 和 6 M 盐酸瓜尼丁。
- 准备和 0.22 μm 过滤器 500 mL 的 裂解缓冲 液溶解在脱硝缓冲 （见 1.1.4） 使用 2 M imidazole 股票。
- 准备和 0.22 μm 过滤器 500 mL 的 洗涤缓冲 液 10 mm imidazole 溶解在凹陷缓冲区 （见 1.1.4） 使用 2 M imidazole 库存.
- 准备和 0.22 μm 过滤器 500 mL 的 100 mM EDTA 缓冲区，使用 1 M NaOH 将 pH 调整为 8。
- 准备和0.22 μm过滤器500 mL的 洗脱缓冲器 组成7mL的99%冰川醋酸成6M盐酸瓜尼丁。
注意：如果使用原生缓冲器，请根据 表 1进行调整。
- 莱辛细胞（变性方法）
- 每收获1克大 肠杆菌 细胞颗粒中加入2mL的裂解缓冲器，这些颗粒含有过度表达的"他标记"蛋白质。漩涡几分钟，直到细胞被重新悬浮。将样品放在摇动器上 30 分钟，在 4 °C。
- 离心解解颗粒在 18，000 x g 30 分钟。将 50 μL 放在 -20 °C 冰柜中，以便稍后在 SDS-PAGE 凝胶上进行分析。
- 小心地倒掉超细剂，确保颗粒不受干扰。莱萨特应该是一种清晰、浅黄色。如果丽萨特多云，离心机样品再次：考虑声波，如果可用于降解核酸。
- 通过空柱（无树脂但使用过滤器）过滤超纳特，并收集在打开的收集托盘中。然后转移到管中，用于步骤 1.3。
注意：如果使用原生缓冲器，则在步骤 1.2.1 之后，将样品处理到 -80 °C 的 3 个周期的冻结/解冻，或通过声波或法国压榨来解冻细胞。
- 准备真空净化设置和平衡柱
注：参见 图1 用于设置有24列的MCPA。- 确定需要多少列以及所需的树脂类型和体积。作为使用T7基质粒表达其标记的SH3域的100mL自动感应培养物（~2克颗粒）的经验法则，每列使用0.6 mL的Ni-NTA树脂从约6毫升的裂解水中产生约3毫克蛋白质。
- 将所需的 12 mL 柱数（无树脂但使用过滤器）插入预组装的 MCPA（带穿刺密封垫的长滴板）中。柱子应紧贴在被刺穿的密封垫孔中。
- 如果使用少于 24 列，请用空封闭柱关闭空孔。
- 拿一个打开的收集板，把这个盘子放到真空歧管的底部，靠近歧管的顶部。
- 将带柱子的组装 MCPA 放在真空歧管的顶部。
- 将真空泵系统的管子连接到真空歧管底部的入口/喷嘴。
- 确保 Ni-NTA 珠子在 50% 的溶液中，并配有 20% 乙醇。在用珠子做任何事情之前，轻轻摇动/混合珠子/乙醇溶液，均匀地恢复。然后，使用 5 mL 移液器，将 50% 解决方案的 1.2 mL 移液器放入柱中。在管道输送时，确保珠子保持完全混合。
- 管道进入所有 24 根柱子后，打开真空泵，将 20% 乙醇通过柱子运行到下面的收集板中。
- 一旦所有 20% 乙醇都通过所有柱子，请关闭泵（如果缓冲区通过柱子后仍使用真空，Ni-NTA 树脂可以耐受短暂的干燥）。将打开的收集板中的内容放入废品箱中。
注意：在处理珠子或处理废物时，所有来自 Ni-NTA 珠子的废物都是危险的，请戴上手套、护目镜和其他 PPE。此外，将所有硫酸盐镍废物处理在单独的容器中，供以后单独处理。
注意：如果树脂是新的或最近再生的，则可以忽略这些步骤的其余部分，请移动到下一节。 - 使用 20 mL 注射器或带 50 mL 注射器的中继注射器设备添加 3 个100 mM EDTA 缓冲器的 3个树脂体积（1.8 mL）。然后打开真空泵，让 EDTA 缓冲器冲洗干净，并在泵冲过后将其关闭。
注意：此洗涤应去除镍蓝色，但如果情况并非如此，请重复此步骤，直到所有列都丢失其蓝色。关闭泵，将打开的收集板的内容倒入废品箱中。 - 在打开泵并贯穿每个柱子之前，将 3 个0.5 M NaOH缓冲器的3 个树脂体积（1.8 mL） 添加到每个柱中。空收集板。
- 在每个列中加入4 个树脂体积（2.4 mL），即 100 mM 硫酸镍。打开真空泵，再次通过列运行此。
- 加入 10 个树脂卷 （约 6000 μL） 的 Milli-Q 水 ，并通过柱子运行。关闭泵，将收集板中的内容倒入废品箱中。
- 每次在洗涤缓冲器（脱脂或原生）中 用 4 个树脂卷 （2.4 mL） 的 10 midazole 洗柱两次，以去除任何多余的镍和均等性。空收集板。
注意：如果任何列运行速度明显变慢，则可以使用大注射器将分离柱和检查空气推过 MCPA。如果此问题已解除阻止，请使用带有新过滤器的不同列。 - 如果 MCPA 上要纯化多个不同的样品/蛋白质，则用 48 x （5 mL/井） 收集板替换开放收集板。但是，当每个列上只运行相同的蛋白质样本时，使用打开的收集板进行则可以。
- 装载、清洗和洗涤
- 关闭真空后，将解体加载到柱中（lysate 的量会有所不同，通常为 1 到 12 mL 或更多，可能需要分批加载）。使用薄塑料搅拌器轻轻混合珠子和柱子中的禇石，以最大限度地结合。
- 将每个柱子轻轻混合几分钟后，打开真空泵，将 lysates 穿过柱子。如果运行多个蛋白质样本，请使用 48 个收集板，并确保在 4 mL 运行完后将收集板换成另一个 48 井板，因为这些板中的井只能容纳 4 mL 的溶液。继续运行利萨特，直到所有的化解已经通过一个列运行。冻结包含流经的收集板。
注：列可能会变得"堵塞"，导致 lysate 流过柱子的速度比它应该慢得多。这很容易被发现，因为相邻的柱子将以正常速度流动。如果确实发生这种情况，建议将赖素/树脂混合物转移到包含新鲜过滤器的柱子上。 - 将收集板替换为空的开放式收集板，然后将 9 个树脂卷 （5.4 mL） 的 10 mM imidazole 洗涤缓冲器添加到每个柱子上，然后打开真空并运行洗涤。重复此4-5次。为了避免溢出，定期空废盘。
- 然后用干净合适的板替换收集板（如果有多种蛋白质，则只打开一个蛋白质和 96 个井，确保 A1 位于左上角）。
- 使用带有 12.5 mL 注射器的中继注射器，将每列脱硝洗礼缓冲器的 1 个树脂体积 （0.75 mL） 移液器。
- 为了避免蛋白质发泡，在最低设置时打开真空泵。轻轻抬起 MCPA，检查没有留下任何东西滴入收集板。
注意：用真空或重力进行洗脱的替代方案是将 10 mL 注射器柱塞推入柱顶部，以轻轻推动洗发缓冲器穿过柱子。每列都这样做，在取出注射器柱塞时要小心，以免干扰柱底部的珠子。推入缓冲区后，轻轻地从最后一列中取出用于的注射器柱塞，并短暂打开真空泵以去除柱子上的最后一滴水。- 如果使用了 96 井收集板，则检查收集板，以确保从每个柱子流经长滴盘的物只流入一口井，并且没有任何东西流入收集板上的相邻井中。
- 对于下一个洗牌重复上述 2 个步骤，并收集在一个新的多井（不同的样品）或开放收集板（相同的样品）。
- 可选步骤，对每个精英进行 50μL 的引用，以进行纯度和浓度分析。
- 向每个柱子添加 2 mL 的 20% 乙醇，然后使用真空泵运行。然后在柱子上再加入 2 mL 的 20% 乙醇，使用新鲜的薄塑料搅拌器将 20% 乙醇和珠子混合，然后转移到 50 mL 管中，在 4 °C 下储存。 清洁柱子，检查水是否自由流动通过每个柱子，然后清洁所有东西并收起来供以后使用。
注意：某些列最终将阻止其过滤器，并且运行速度过慢，应更换这些列或清洁过滤器。因此，建议定期测试过滤器，去除树脂，并给柱子加满水，看看它是否快速流过。过滤器可以通过留下一个封闭的柱子来清洁，该柱子充满了脱硝的洗脱缓冲器，并在一夜之间摇晃。
2. 离子交换 - 单蛋白纯化
- 准备缓冲区
注：有关所有缓冲器的详细信息，请参阅表 1- 准备一个2升低盐缓冲：10米特里斯pH 8.1（5米特里斯酸，5米特里斯基地）。使用 0.22 μm 过滤器过滤解决方案。
- 准备一个 0.5 升高盐缓冲器： 10 米特里斯 ph 8.1， 4 M 纳克。测量 116.9 克的 NaCl， 并构成高达 0.5 L 与 10 mM 特里斯 pH 8.1 从上面.使用 0.22 μm 过滤器过滤解决方案。
- 制盐浓度系列：0-1 M 纳克。
注：盐浓度的范围可以调整为每种蛋白质。- 在机架中设置 24 x 50 mL 标记离心机管
- 使用上述缓冲区，准备 24 x 14 mL NaCl 稀释，范围从 0-1000 μM。 首先添加所需的 4 M NaCl 10 mM 三边形卷。这可以通过增加25mM或50m取决于蛋白质来完成。
- 然后将所需的 10 mM 三重奏卷添加到每个管中。将每个管子倒置数次以混合。
- 准备样品
- 通过离子交换获得样品进行净化。可选地，稍后使用50μL的别名进行分析。
注意：样品应始终保持冷：这些可能是乳化物，或者可能是后尼-NTA。脱硝缓冲器中的 Ni-NTA 样品需要在 10 mM Tris 缓冲区进行透析或缓冲交换。原生缓冲器中 Ni-NTA 的样品可以用 10 mM Tris 缓冲器稀释，以降低盐浓度，使蛋白质与 IEX 树脂结合。 - 旋转样品在18，000 x g 10分钟。
- 小心地把超自然人倒进称重船上。避免干扰颗粒。
- 小心地将超自然取剂放入 20 mL 注射器中，并附加 0.22 μm 过滤器。
- 慢慢地通过过滤器将超自然人弹出到一个新的50mL管中。
- 如果需要稀释，用上面制作的 10 mM Tris 缓冲器稀释超自然物（在此实验中，超纳特被稀释为 1 合 2）。同时存储在4°C。
- 通过离子交换获得样品进行净化。可选地，稍后使用50μL的别名进行分析。
- 准备真空净化设置和均衡设置
注：在此协议中，仅使用一个列用于 IEX 净化一个示例。有关多个净化，请参阅下一节。- 确定所需的树脂类型和体积。作为高达 20 毫克部分纯化的 SH3 域的经验法则，每列使用 0.4 mL 的 Q-sepharose 快速流树脂（参见步骤 2.4.8）。
- 将 24 个打开的空柱（底部没有过滤器的空柱）插入预组装的 MCPA 中。柱子应紧贴在被刺穿的密封垫孔中。
- 将 10 mL 注射器柱塞放入除第一个位置以外的每个空柱中，净化将开始。
- 将打开柱的底部（带过滤器）通过 5 mL 注射器柱塞橡胶垫片（已穿孔），在柱子末端形成橡胶环。当此列插入上面的每个空柱时，此橡胶环将确保良好的密封。目前，将此列插入 MCPA 上的第一个空列中。
- 拿一个打开的收集板，把这个盘子放到真空歧管的底部，靠近歧管的顶部。
- 将组装好的 MCPA（带柱子）放在真空歧管的顶部。
- 将真空泵系统的管子连接到真空底部的入口/喷嘴。
- 从底部切开一个蓝色的移液器尖端~2厘米，并用于吸收800微升的Q-sepharose珠子（或任何其他离子交换树脂），确保50/50珠乙醇溶液混合以避免分层。Pipette 800 μL 进入第一位置的一个打开柱（带过滤器），一旦珠子沉淀到柱子底部，就会打开真空，足以穿过 20% 的乙醇。
- 用 2 x 2 mL 的 10 mM 三轮车清洗包含生红珠的柱子。在 Tris 缓冲器运行之前关闭真空，以防止树脂干燥。逃跑可以丢弃。
注意：如果以前使用过树脂，则通过在步骤 2.4.9 之前清洗 5 个 4 M NaCl 的树脂体积，然后通过 5 个 10 mM Tris 的树脂体积进行再生。
- 装载、清洗和洗涤
- 将所有样品进行净化（见第 3 节）转移到第一位置的 Q sepharose 柱，使用小塑料环搅拌样品和珠子约 2 分钟，然后打开真空泵。
注意：在超标（>12 mL）的情况下，请提防过多地填充列。让样品通过，然后添加更多，混合，然后让再次运行通过。 - 存储/冻结流经，供以后分析。
- 将另一个打开的收集板放入真空歧管中，然后用 2 x 2 mL 的 10 mM Tris 和存储洗涤每个 sepharose 柱。
- 插入 96 井收集板，确保 A1 位于左上角。
- 要收集第一个洗发分数，请从下一列中取出注射器柱塞，将 Q sepharose 柱移到此位置，并将注射器柱塞放在前一位置。然后移液器1mL的第一个盐浓度进入Q塞法罗斯柱。打开泵并收集洗排。关闭泵，就像珠子附近的液体管路一样，以避免将珠子晾干。
- 要收集下一个洗发分数，请从下一列中取出注射器柱塞，将 Q sepharose 柱移到此位置，并将注射器柱塞放在前一位置。
- 将下一个盐浓度的 1 mL 添加到柱中，然后重复这个过程，直到使用所有浓度，并在 24 个单独的井中收集 24 个 elutions。检查没有液体进入任何邻近的油井。
- 用 2 mL 的 4 M 纳克 10 mM 三轮车清洗柱。让这个运行通过。
- 用2mL的20%乙醇清洗。让乙醇运行，直到它就在珠子和密封柱上方储存。
- 存储 96 井收集板，并通过紫外线光谱和 SDS PAGE 进行分析。
- 将所有样品进行净化（见第 3 节）转移到第一位置的 Q sepharose 柱，使用小塑料环搅拌样品和珠子约 2 分钟，然后打开真空泵。
3. 离子交换 - 24种不同蛋白质的同步纯化
注：有关制作缓冲器、一系列盐浓度和准备样品的详细信息，请参阅步骤 2.1-2.3
- 准备净化设置
注：如何建立净化系统在很大程度上取决于有多少蛋白质被净化，有多少盐条件将被使用。要同时净化 12 个样品，最多可清除 24 个样品，需要为用于稀释的每个盐浓度收集一个收集板。对于少于 12 个样本，在更改收集板之前，可以在同一 MCPA 中移动色谱列中的几个位置。在这种情况下，无需将柱子放置在空柱中，它们可以直接连接到 MCPA 密封垫上。以下协议用于 24 个同时进行离子交换净化。- 将组装的 MCPA 直接连接到 24 个空柱上，将过滤器放在真空歧管顶部，其中包含一个打开的收集板，并像上面单一的纯化方法一样准备和清洗 24 个离子交换柱。对于这种净化，使用埃彭多夫中继器或注射器快速将移液器放入柱子中是很方便的。
- 装载、清洗和洗涤
- 在安装 MCPA 之前，将 48 井收集板放入真空歧管的底座中（并附上洗净柱）。确保 A1 位于左上角。
- 将每个蛋白质样本（每次高达 5 mL）放入相应的列中。使用薄塑料循环搅拌每个柱子（每个柱子一个循环以避免污染）大约2分钟。然后打开真空泵，让超自然人流过。
注意：在超标的情况下，请小心过度填充列。让样品穿过其列，然后添加更多，混合，然后让再次运行。 - 存储/冻结 48 井收集板，供以后分析，因为这包含了每个蛋白质的流动。
- 将另一个 48 井收集板放入真空歧管中，然后用 2 x 2 mL 的 10 mM Tris 清洗每个 sepharose 柱。
- 将第一个 96 井收集板插入歧管中，确保 A1 位于左上角，然后将第一个盐浓度的 1 mL 移液器插入每个柱子，然后打开真空泵，通过柱子运行此功能。取下收集板，用胶片盖住，并存放在4°C进行分析。
- 重复步骤，用于稀释的每个连续盐浓度。确保每个画板都使用新的收集板，并且每个收集板都贴上标签并存储。
- 用 2 mL 的 10 mM 三轮、4 M NaCl 清洗每个列。
- 用2mL的20%乙醇清洗每个柱子。让乙醇运行，直到它就在珠子和密封柱上方储存。
- 存储 96 个井收集板，并通过紫外光谱和 SDS-PAGE 进行分析。
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Representative Results
例如，MCPA通过Ni-NTA（图2A）成功地在变性条件下净化了14个AbpSH3突变体。可以看到一种小污染物~25 kDa，但蛋白质基本上仍然是纯的。这种污染物被认为是YodA，一种常见的共同纯化蛋白，发现于大肠杆菌11。图 2B显示了 11 个不同的 SH3 域在原生条件下的净化。在致变条件下看到的小污染物在原生条件下被去除。这表明 MCPA 可用于比较表 1 中列出的由原生缓冲器或变性缓冲器组成的净化。
通过 IEX MCPA 净化化的代表性数据见 图 3中。这表明AbpSH3可以从大多数污染物中分离出来，因为它在425mM到700m之间回流。从柱子中去除蛋白质所需的盐浓度与蛋白质和树脂之间的静电相互作用的强度有关。大多数细菌蛋白的阴性低：然而，兴趣的蛋白质是非常负面的，似乎有一个较低的pI。相当纯的AbpSH3蛋白的良好产量被恢复与一些不同的高分子量污染物AbpSH3被视为波段在〜5 kDa。因此，通过 MCPA 的 IEX 可用作净化协议的第一步，因为它可以从唾水中的当前污染物中分离出足够数量的蛋白质。
IEX 使用 MCPA 进一步净化已成功地在 Ni-NTA MCPA 运行（图 4）中流出的分数上进行了演示。值得注意的是，两个主要山峰已经解决了最大在400和700米盐，这可能相当于分离N终端截断版本的这种蛋白质。通过进一步的DSF数据分析，可以明显看出，峰值1相对于峰值2稍差一些，Tm 略低。与 lysate 的 IEX 运行相比，分数整体上要干净得多，并且显示在 IEX 之前运行 Ni-NTA 步骤的好处。虽然分子重量较高的蛋白质受到轻微污染，但这些分数基本上仍然是纯的，并且使用NMR和热/化学变性测定产生了良好的生物物理数据。
图1：MCPA仪器的前视图。 （A） 附有24列的MCPA仪器正面视图。柱子均匀地间隔在 96 井密封垫内，以引导洗发进入 96、48 或打开的收集板。（B） 密封垫的顶部视图。 （C） 同一密封垫的底部视图。 （D） 附有柱子和注射器柱塞的 MCPA 前视图。这个数字已经从多明格斯等人10修改。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：1×24列配置的示例，在变性和原生条件下对各种SH3突变体进行净化。（A） 否认各种 Abpsh3 突变体的净化。每条车道上可发现约25 kDa的轻微污染。（B） 11种不同酵母SH3域的原生纯化。污染物已从每个车道上去除，在凝胶上不再可见。这个数字已经修改多明格斯等人10。请单击此处查看此图的较大版本。
图3：通过MCPA净化使用 IEX 的番茄酱。 （A） 离子交换 （IEX） 中所有 elutions 的吸收读数均由 LVis 板 （BMG） 测量。读数是针对相应的 NaCl 浓度绘制的。蛋白质浓度最高的峰值为 700 mM NaCl。（B） SDS-PAGE 分析（A） 中提出的 IEX 盐洗脱。分子重量标记显示在凝胶的左侧。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：通过MCPA系统净化使用IEX的VJM2池（后Ni-NTA）。
（A） 使用纳米滴测量离子交换 （IEX） 收集的 elution 的吸收读数。读数是针对相应的 NaCl 浓度绘制的。（B） SDS-PAGE 分析（A） 中提出的 IEX 盐洗脱。分子重量标记显示在凝胶的左侧。请单击此处查看此图的较大版本。
| 否认缓冲区组成 | 原生缓冲区组合 | |
| 裂解缓冲区 | 10米纳赫2PO4， 10 米特里斯， 6 M 古赫克， 10 米米伊米达佐尔， ph 8.0 | 20米特里斯，300米纳米纳克，10米米伊米达佐尔，pH 8.0 |
| 洗缓冲区 | 10 mM 纳赫2PO4， 10 米特里斯， 6 M 古赫克， 20 米米伊米达佐尔， ph 8.0 | 20米特里斯，300米纳米纳克，20米米伊米达佐尔，pH 8.0 |
| 埃卢蒂翁缓冲区 | 10 mM 纳赫2PO4， 10 米三轮车， 6 M 古赫克， 0.2 M 醋酸， pH 3.0 | 20米特里斯，300米纳米纳克，250米米米伊米达佐尔，pH 8.0 |
| 缓冲区组成 | ||
| 高盐 | 5米特里斯酸，5米特里斯基地，pH 8.1，4 M纳克 | |
| 低盐 | 5米特里斯酸，5米特里斯基地，pH 8.1 |
表1：缓冲器、Ni-NTA脱硝和原生净化和离子交换低盐和高盐缓冲的成分。
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Discussion
该方法是稳健和简单的使用相对缺乏经验的蛋白质生物化学家，但也有一些考虑要记住。
小心过度填充收集板
48 井收集板本身每口井仅容纳 5 mL，而每口 96 井仅持有 2 mL。在添加缓冲区并在列中运行样品时，需要牢记这一点，因为存在油井过多的风险。特别是，在将较大的样品转移到色谱柱进行净化时，需要小心谨慎。在超标超标的情况下，将部分分割，足以填充列，在添加下一部分之前应允许该列运行，以防止样品的任何过填和丢失。每次添加超自然后，柱子应与小塑料环混合，以增加蛋白质与珠子结合的可能性，然后打开泵。要跟踪板的方向，因此了解油井的内容，请确保标记的角"A1"始终位于板的左上角，然后开始净化。
洗脱蛋白
当在 IEX 和亲和力步骤中放荡时，真空用于最低设置，将洗脱缓冲器拉过柱子。与重力相比，这加快了流速，但如果蛋白质浓度高，它可能导致蛋白质溶液起泡并潜在脱构。如果是这样的话，另一种选择是在打开的柱子上使用注射器柱塞来推动缓冲区穿过柱子。在这种情况下，注射器柱塞应轻轻地（而不是用力）推入柱子，将液体推入下面的收集板中。取出收集板时应小心，以确保 MCPA 上剩余的任何洗牌不会溢出到邻近的油井中，造成污染。
树脂和柱子的维护
此协议中的一个关键步骤是尼脂和柱子的再生。柱应在净化协议的开头或末尾再生。如果再生发生在末端，树脂应储存在 20% 乙醇中，在 4 °C。 色谱柱过滤器可能会变得"阻塞"，导致样品以比它应该慢得多的速度流过柱子。如果是这样的话，柱子需要更换或过滤器删除和清洁浸泡在防渗缓冲过夜和用水冲洗。
正如第3步所证明的，MCPA仪器的多样性可以像单个样本一样有效地用于多种蛋白质的纯化。离子交换协议可以根据实验的需要量身定做，适应不同样品的数量和使用的盐浓度。例如，如果同时净化的样品少于 12 个，则涉及在同一板内每次洗牌后移动柱子和/或将收集板换成每个精英的任何组合。例如，如果只有4种蛋白质同时纯化，柱子可以在一个收集板上移动，在更换板之前收集高达4个盐浓度的盐。MCPA能够使用各种树脂净化 - 亲和力和离子交换已经讨论过，但疏水相互作用色谱也是可能的，并有进一步的潜力免疫亲和色谱12。虽然这种方法侧重于多个小规模净化，但 MCPA 仅可用于从几升细菌培养物中纯化的单个大色谱柱，而无需样品泵或昂贵的 FPLC。
使用MCPA进行高通量离子交换（如讨论的那样）需要多个，最多24个单独的收集板。这可能是不切实际的，需要大量的空间在标准的实验室台面和增加的人为错误的风险。此外，测量24个不同样本的精英蛋白质吸收量可能具有挑战性。在这种情况下，多通道移液器将是有益的，将使多个样品的传输更快，更容易。对于小容量，请考虑使用包含 16 微滴的 LVis 板 （BMG），因为它能够直接测量浓度，而无需使用任何其他试剂，如布拉德福德检测试剂。
虽然使用真空泵可以比使用重力10更快 3 倍的纯化速度，但不会影响树脂的完整性，但它确实会产生一些其他问题。例如，在净化过程中保持真空的强度，要求所有柱子都用 10 mL 注射器柱塞阻塞，在插入装有树脂的柱子之前，需要取出该柱子。一个接一个地取出柱塞也是一个及时的过程，真空的阻力会使它们难以从柱子上移除。
协议中提供了使用 MCPA 进行多蛋白 IEX 纯化的详细信息。这种高通量方法是时间效率高、可控的，每次净化的所有参数均可由用户操作。然而，在包括工业在内的大多数蛋白质生物化学实验室中，快速蛋白质液相色谱是蛋白质纯化的首选方法，在吞吐量、可重复性、方法转移和稳健性方面都优于蛋白质纯化。这些系统，如蛋白质生物溶解的蛋白质制造商和AKTA FPLC生物分子净化系统，可以缓解净化瓶颈问题，并取得了巨大成功。尽管这些系统取得了优异的结果，我们看到使用MCPA系统的分离仍然足以获得高纯度蛋白质。有趣的是，我们的实验室还使用AKTA启动FPLC来执行离子交换色谱，虽然分辨率可能更高，线性梯度能够与这台机器，它显然是更耗时运行多个样品，这是更具挑战性的培训缺乏经验的学生在这个系统上。
存在其他明显更便宜的板材净化替代品。例如，通用电气医疗保健生命科学（现为Cytiva）和西格玛奥尔德里希销售预包装的96个井过滤板和带特定纯化树脂的墨盒。这些滤芯板提供小规模的高通量净化，但仅在微克产量范围内进行净化。此外，QIAvac 24 Plus 来自 QIAGEN 使用真空下的旋转柱，但是，收集流过或清洗是不现实的。
MCPA 的灵活设计允许平行蛋白质纯化，尽管使用 MCPA 方法手动移动柱和板可能会比标准 FPLC 系统增加人为错误。但是，手动将样品加载到列上对于缺乏经验的用户来说比使用标准 FPLC 将样品加载到列上更可靠，因为其中的错误可能更容易发生，因为它涉及到需要更广泛培训的开关阀门和泵。显然，蛋白质纯化的全自动系统比MCPA更适合于通常从事纯化工作的行业和学术实验室的净化组。然而，对于负担不起昂贵的设备和维护费用，并希望避免广泛的培训或只是偶尔从事蛋白质纯化工作的小实验室，MCPA提供了一个有效的替代系统，仍然获得良好的分离，是廉价和容易建立。
MCPA 由简单而廉价的仪器组成，允许多个柱子接口同时进行并行纯化，以产生毫克蛋白质。此外，该技术还允许单个列的模块化，从而增加吞吐量。这是这种方法所独有的，不能使用当前基于板材的净化套件实现。
蛋白质纯化对于蛋白质的研究和定性以及治疗的发展仍然至关重要。生物物理技术，如NMR和蛋白质晶体学依赖于毫克的纯蛋白质量，因此目前的表达和纯化系统需要进一步发展，以提高成本和时间，以实现这2，13，14。正如所讨论的，自动化净化系统比非自动化方法具有许多优势，但对于需要昂贵仪器和培训的小型实验室来说，它们仍然过于昂贵。MCPA便宜得多，起价为4510美元。此外，此 MCPA 不需要广泛的培训或持续维护，如果出现任何问题，这些问题很容易解决。腐蚀性缓冲器（如用于 Ni-NTA 的脱硝缓冲器）如果清洁不当，可能会腐蚀净化系统。但是，MCPA 的灵活设计允许在必要时快速清洁、修理和更换隔间。最后，MCPA将促进更小实验室的有效、高通量蛋白质纯化，直到建立更实惠的自动化系统10。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
本出版物中报告的研究得到了国家卫生研究院国家普通医学研究所（IDeA）以P20GM103451的资助和利物浦大学的内部研究补助金支持的研究。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL/ well collection plate | Agilent technologies | 201240-100 | |
| 5 mL/ well collection plate | Agilent technologies | 201238-100 | |
| 12 mL chromatography columns | Bio-Rad | 7311550 | |
| 96 well long drip plate | Agilent technologies | 200919-100 | Come with 0.25 um filters which are to be removed. |
| 96 well plate seal/mat | Agilent technologies | 201158-100 | Should be peirceable |
| His60 Ni Superflow Resin | Takara Bio | 635660 | |
| HiTrap Q HP anion exchange column | GE Healthcare (Cytiva) | 17115301 | |
| Lvis plate reader | BMG LABTECH | Compatible with FLUOstar Omega plate reader | |
| Male leur plugs | Cole-Parmer | EW-45503-70 | |
| PlatePrep 96 well Vacuum Manifold Starter kit | Sigma-Aldrich | 575650-U | |
| Reservoir collection plate | Agilent technologies | 201244-100 | |
| The Repeater Plus | Eppendorf | 2226020 | With 5 mL and 50 mL syringes |
| VACUSAFE vacuum | INTEGRA | 158 320 | The vacusafe vacuum has a vacuum range from 300 mBar to 600 mBar and a 4 L waste collection bottle |
References
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