Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Et økonomisk og alsidigt proteinrensningssystem med høj gennemløb ved hjælp af en pladeadapter med flere kolonner

Published: May 21, 2021 doi: 10.3791/62075
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1
1School of Life Sciences, University of Liverpool, 2Health Sciences Center, Texas Tech University

Summary

En multi-kolonne plade adapter gør det muligt kromatografi kolonner, der skal interfaces med multi-well indsamling plader til parallel affinitet eller ion udveksling rensning giver en økonomisk høj gennemløb protein rensning metode. Det kan bruges under tyngdekraften eller vakuum giver milligram mængder af protein via overkommelig instrumentering.

Abstract

Proteinrensning er afgørende for studiet af proteinstruktur og -funktion og bruges normalt i kombination med biofysiske teknikker. Det er også et centralt element i udviklingen af nye behandlingsfaktorer. Den udviklende æra af funktionelle proteomics giver næring til efterspørgslen efter højoverførselsproteinrensning og forbedrede teknikker til at lette dette. Det blev antaget, at en multi kolonne plade adapter (MCPA) kan interface flere kromatografi kolonner af forskellige harpikser med multi-well plader til parallel rensning. Denne metode tilbyder en økonomisk og alsidig metode til proteinrensning, der kan bruges under tyngdekraften eller vakuum, der konkurrerer med hastigheden på et automatiseret system. MCPA kan bruges til at genvinde milligram udbytter af protein ved en overkommelig og tidseffektiv metode til efterfølgende karakterisering og analyse. MCPA er blevet brugt til høj overførselshastigheds-affinitetsrensning af SH3-domæner. Ionudveksling er også blevet påvist via MCPA for at rense protein efter Ni-NTA-affinitetskromatografi, hvilket indikerer, hvordan dette system kan tilpasses andre rensningstyper. På grund af sin opsætning med flere kolonner kan individuel tilpasning af parametre foretages i samme rensning, der ikke kan opnås ved de nuværende pladebaserede metoder.

Introduction

Proteinrensningsteknikker til at opnå milligrammængder af rensede proteiner er afgørende for deres karakterisering og analyse, især for biofysiske metoder som NMR. Proteinrensning er også central på tværs af andre studieområder såsom lægemiddelopdagelsesprocesser og interaktionsundersøgelser af proteinprotein; men at opnå sådanne mængder rent protein kan blive en flaskehals for disse teknikker1,2,3. Den vigtigste metode til proteinrensning er kromatografi, som omfatter en række metoder, der er afhængige af proteiners individuelle egenskaber og deres tags. I affinitetskromatografi har proteiner et ekstra protein- eller peptidmotiv, der fungerer som et tag, der har en affinitet for et bestemt substrat på kromatografiharpiksen4. Den mest almindelige affinitetsmetode er immobiliseret metal affinitetskromatografi (IMAC) ved hjælp af his-mærkede proteiner, mens en anden populær metode er ionbytningskromatografi, der adskiller proteiner baseret på deres ladning. For højeste renhed, en kombination af affinitet kromatografi og ion udveksling bruges ofte sammen, som regel kræver dyrt laboratorieudstyr til høj-gennemløb.

Den udviklende æra af funktionelle proteomics giver næring til efterspørgslen efter højoverførselshastighedsteknikker til rensning af ikke enestående proteiner til specifik analyse, men et stort antal proteiner samtidig til omfattende analyse og genomdækkende undersøgelser5. Immobiliseret metal affinitet kromatografi (IMAC) er en af de mest anvendte metoder til højoverførselsproteinrensning6,7 mendets automatiserede systemer er dyre og uoverkommelige for mindrelaboratorier 8. De mere overkommelige pladebaserede alternativer, der i øjeblikket er tilgængelige, anvender brugen af tilgængeligt laboratoriebaseret udstyr, såsom et vakuum. Selv om disse metoder har succes med at forbedre rensningshastigheden, kan det kun opnå højgennemstrømningsrensning i mindre skala, hvilket kun giver protein i mikrogramområdet. Disse begrænsninger betyder, at de færdigpakkede 96 brøndfilterplader (f.eks. fra GE Healthcare, der nu ejes af Cytiva) ikke kan anvendes før biofysiske teknikker9. Gravity kromatografi er den mest omkostningseffektive metode til rensning; Det er dog ubelejligt at oprette flere kolonner og kan være tilbøjelige til fejl for flere proteiner.

En multi kolonne plade adapter (MCPA) er blevet udviklet og vist sig at kunne med succes og bekvemt køre parallelle affinitet kromatografi kolonner på én gang for at rense His-tagged gær SH3 domæner10. MCPA tilbyder en omkostningseffektiv højgennemstrømningsrensningsmetode, der ikke afhænger af dyre instrumentering. Dens fleksible design kan effektivt rense milligram protein ved flere affinitet kromatografi kolonner under tyngdekraften eller vakuum mangfoldighed. Desuden kan harpikstype, volumen og andre parametre justeres for hver enkelt kolonne for hurtigere optimering. Denne undersøgelse viser, at MCPA's ionudvekslingskromatografi kan bruges sammen med AFFINITY-kromatografien af MCPA til at forbedre rensningen af Abp1 SH3-domænet. Derudover kan op til 24 forskellige proteiner adskilles parallelt ved hjælp af disse metoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Denaturering Af Ni-NTA-kromatografi

  1. Forbereder buffere
    BEMÆRK: Se tabel 1 for at få yderligere oplysninger om alle buffere.
    1. Udgør 500 mL af 0,5 M NaOH, og sørg for at tilføje Milli-Q vand først og derefter tilføje NaOH langsomt, mens bægeret er på en omrører. Filtrer med et filter på 0,22 μm.
    2. Der fremstilles 100 mL nikkelsulfat på 0,1 M og filtreres med et filter på 0,22 μm.
    3. Der fremstilles 50 mL 2 M imidazol, og der filtreres med et filter på 0,22 μm.
    4. Forbered og 0,22 μm filter 1,5 L denatureringsbuffer ved pH 8,0 bestående af 5,3 mM Tris-HCl 4,7 mM Tris-base (Tris (hydroxymethyl)methylamin), 13,7 mM NaH2PO4,86,3 mM Na2HPO4 og 6 M guanidinhydrochlorid.
    5. 500 ml lysis bufferopløsning på 10 mM imidazol opløst i denatureringsbuffer (se 1.1.4) ved hjælp af 2 M imidazolbestanden.
    6. 500 ml vaskebufferopløsning på 10 mM imidazol opløst i denatureringsbuffer (se 1.1.4) ved hjælp af 2 M imidazolbestanden.
    7. Forbered og 0,22 μm filter 500 mL 100 mM EDTA buffer, juster pH til 8 ved hjælp af 1 M NaOH.
    8. 1,22 μm filter 500 ml elueringsbuffer bestående af 7 ml 99% iseddike i 6 M guanidinhydrochlorid.
      BEMÆRK: Hvis du bruger indbyggede buffere, skal du tilpasse dig i henhold til tabel 1.
  2. Lysing af celler (denatureringsmetode)
    1. Der tilsættes 2 mL lysis buffer til hver 1 g høstede E. coli cellepiller, der indeholder det overudtalte His-tagged protein. Vortex i flere minutter, indtil cellerne er suspenderet igen. Prøverne efterlades på en vippe i 30 minutter ved 4 °C.
    2. Centrifuge lysede pellets ved 18.000 x g i 30 minutter. Der må være 50 μL til side i -20 °C fryseren for senere at analysere en SDS-PAGE gel.
    3. Hæld forsigtigt supernatanterne af, og sørg for, at pellet ikke forstyrres. Lysater skal være en klar, lysegul farve. Hvis lysater er uklare, udtages centrifugeprøven igen. overveje sonikering, hvis det er muligt at nedbryde nukleinsyre.
    4. Filtrer supernatanterne gennem en tom kolonne (uden harpiks, men med filter) og opsamles i en åben opsamlingsbakke. Derefter overføres til et rør til brug i trin 1.3.
      BEMÆRK: Hvis du bruger de oprindelige buffere, skal prøverne efter trin 1.2.1 behandles til 3 fryse-/optøningscyklusser ved -80 °C eller behandles ved sonikering eller fransk tryk på lyse celler.
  3. Forberedelse af opsætning af vakuumrensning og ekvilibrering af kolonner
    BEMÆRK: Se Figur 1 for en opsætning af MCPA med 24 kolonner.
    1. Bestem, hvor mange kolonner der er behov for, samt den ønskede harpikstype og -diskenhed. Som tommelfingerregel for 100 mL autoinduktionskultur (~2 g pellet), der udtrykker His-tagged SH3-domæner ved hjælp af T7-baserede plasmider, skal du bruge 0,6 mL Ni-NTA harpiks pr. kolonne til at give ca. 3 mg protein fra ca. 6 mL lysat.
    2. Det ønskede antal på 12 mL kolonner (uden harpiks, men med filter) indsættes i en formonteret MCPA (lang drypplade med punkteret tætningsmåtte). Søjlerne skal passe tæt i hullerne i tætningsmåtten, der er punkteret.
    3. Hvis der bruges mindre end 24 kolonner, skal du lukke tomme huller med en tom lukket kolonne.
    4. Tag en åben opsamlingsplade og læg denne plade i bunden af vakuummanifolden og luk med toppen af manifolden.
    5. Placer den samlede MCPA med søjler oven på vakuummanifolden.
    6. Fastgør slangen fra et vakuumpumpesystem til indløbet/dysen i bunden af vakuummanifolden.
    7. Sørg for, at Ni-NTA perlerne er i en 50% opløsning med 20% ethanol. Før du gør noget med perlerne forsigtigt ryste / blande perle / ethanol løsning til at genbruge jævnt. Derefter pipetter 1,2 ml af 50% opløsningen ind i kolonnerne ved hjælp af en 5 ml pipette. Mens pipettering sørg for perlerne forbliver fuldt blandet.
    8. Efter pipettering i alle 24 kolonner, tænde vakuumpumpen og køre 20% ethanol gennem kolonnen og ind i indsamlingen pladen nedenfor.
    9. Sluk for pumpen, når alle 20% ethanol har kørt gennem alle kolonner (Ni-NTA harpiks kan tåle kort tørring, hvis vakuumet stadig påføres efter buffer har passeret gennem kolonnen). Det, der er i den åbne opsamlingsplade, bortskaffes i en affaldskasse.
      ADVARSEL: Alle affaldsprodukter fra Ni-NTA perlerne er farlige, når de håndterer perlerne eller bortskaffer affaldet, bærer handsker, beskyttelsesbriller og andre PERSONLIGE VÆRNEmidler. Desuden bortskaffes alt nikkelsulfataffald i en separat beholder til individuel bortskaffelse senere.
      BEMÆRK: Hvis harpiksen er ny eller for nylig regenereret, kan resten af disse trin ignoreres, skal du gå til næste afsnit.
    10. Der tilsættes 3 harpiksvolumener (1,8 mL) på 100 mM EDTA-buffer ved hjælp af en 20 mL sprøjte eller en repeater sprøjteenhed med en 50 mL sprøjte. Tænd derefter vakuumpumpen for at lade EDTA-bufferen skylle igennem og slukke for pumpen, når den er skyllet igennem.
      BEMÆRK: Denne vask skal fjerne den nikkelblå farve, men hvis dette ikke er tilfældet, skal du gentage dette trin, indtil alle kolonner har mistet deres blå farve. Sluk for pumpen og hæld indholdet af den åbne opsamlingsplade i affaldskassen.
    11. Tilføj 3 harpiksvolumener (1,8 mL) på 0,5 M NaOH-buffer i hver kolonne, før du tænder for pumpen og kører dette gennem hver kolonne. Tom opsamlingsplade.
    12. Der tilsættes 4 harpiksvolumener (2,4 mL) på 100 mM nikkelsulfat i hver kolonne. Tænd vakuumpumpen og kør den igen gennem kolonnen.
    13. Tilsæt 10 harpiksvolumener (~6000 μL) milli-Q vand og kør dette gennem søjlerne. Sluk for pumpen, og hæld indholdet af indsamlingspladen af i affaldskassen.
    14. Kolonnerne vaskes to gange med 4 harpiksvolumener (2,4 mL) på 10 mM imidazol i vaskebuffer (denaturering eller indfødt) hver gang for at fjerne overskydende nikkel og ekvilibrering. Tom opsamlingsplade.
      BEMÆRK: Hvis nogen kolonner kører betydeligt langsommere, kan afmontere kolonnen og kontrollere luften skubbes gennem MCPA ved hjælp af en stor sprøjte. Hvis blokeringen ikke er blokeret, skal du bruge en anden kolonne med et nyt filter.
    15. Hvis flere forskellige prøver/proteiner skal renses på MCPA, skal den åbne opsamlingsplade udskiftes med en opsamlingsplade på 48 x (5 mL/brønd). Men når du kun kører de samme proteinprøver på hver kolonne, er det fint at fortsætte med at bruge en åben opsamlingsplade.
  4. Lastning, vask og udring
    1. Når vakuumet er slukket, indlæses lysater i kolonner (mængden af lysat varierer typisk fra 1 til 12 mL eller mere og kan være forpligtet til at indlæse i flere partier). Brug en tynd plastomrører til forsigtigt at blande perlerne og lysatet i kolonnen for at maksimere bindingen.
    2. Efter forsigtigt at blande hver kolonne i et par minutter, tænde vakuumpumpen og køre lysater gennem kolonnerne. Hvis der køres flere proteinprøver, skal du bruge en 48 brøndopsamlingsplade og sørge for at udskifte opsamlingspladen med yderligere 48 brøndplade, efter at 4 ml er løbet igennem, da brøndene i disse plader kun kan rumme 4 ml opløsning. Fortsæt med at køre lysate, indtil alle lysater er kørt gennem en kolonne. Frys opsamlingsplader, der indeholder gennemstrømningen.
      BEMÆRK: Kolonner kan blive "blokeret", hvilket får lysatet til at strømme gennem kolonnen meget langsommere, end det burde. Dette er let at opdage, da de nærliggende kolonner flyder med en normal hastighed. Hvis dette sker, anbefales det, at lysat/harpiksblandingen overføres til en kolonne, der indeholder et nyt filter.
    3. Udskift opsamlingspladen med en tom åben opsamlingsplade, og tilsæt derefter 9 harpiksvolumener (5,4 mL) på 10 mM imidazolvaskbuffer til hver kolonne, og tænd for vakuumet, og kør vasken igennem. Gentag dette 4-5 gange. For at undgå overløb skal affaldspladen tømmes med jævne mellemrum.
      1. Udskift derefter opsamlingspladen med en ren passende plade (åben plade til kun et protein og 96 godt, hvis der er flere proteiner, hvilket sikrer, at A1 er i øverste venstre hjørne).
    4. Ved hjælp af en repeatersprøjte med en 12,5 mL sprøjte pipette ~1 harpiksvolumen (0,75 mL) denatureringsepuffer i hver kolonne.
    5. For at undgå proteinskumning skal du tænde vakuumpumpen ved den laveste indstilling. Løft forsigtigt MCPA'en for at kontrollere, at der ikke er noget tilbage at dryppe ind i opsamlingspladen.
      BEMÆRK: Et alternativ til udring med vakuum eller tyngdekraft skubber en 10 mL sprøjte stemplet ind i toppen af kolonnen for forsigtigt at skubbe elution bufferen gennem kolonnen. Gør dette for hver kolonne, og vær forsigtig, når du fjerner sprøjtestemplet for ikke at forstyrre perlerne i bunden af kolonnen. Når elueringsbufferen er blevet skubbet igennem, skal du forsigtigt fjerne sprøjtestemplet fra den sidste kolonne, den blev brugt i, og kortvarigt tænde vakuumpumpen for at fjerne de sidste dråber fra søjlerne.
      1. Hvis der er brugt en 96-brønds opsamlingsplade, skal du kontrollere opsamlingspladen for at sikre, at det, der strømmer fra hver søjle gennem den lange drypplade, kun strømmer ind i en brønd, og at der ikke elver noget ind i nabobrøndene på opsamlingspladen.
    6. Til den næste eluering gentages ovenstående 2 trin og samles i en frisk multibrønd (forskellige prøver) eller åben indsamlingsplade (samme prøver).
    7. Valgfrit trin, tag en 50 μL aliquot af hver eluering for renhed og koncentrationsanalyse.
    8. Tilsæt 2 mL 20% ethanol til hver kolonne og kør dette igennem ved hjælp af vakuumpumpen. Derefter tilsættes yderligere 2 mL 20% ethanol til søjlerne og brug en frisk tynd plastomrører til at blande 20% ethanol og perlerne, før de overføres til et 50 mL rør til opbevaring ved 4 °C. Rengør søjlerne og kontroller, at vandet strømmer frit gennem hver kolonne, og rengør derefter alt og læg det væk til senere brug.
      BEMÆRK: Nogle kolonner vil i sidste ende have deres filtre blokeret og vil køre for langsomt, disse kolonner skal udskiftes, eller filtre rengøres. Som sådan anbefales det at teste filtre med jævne mellemrum ved at fjerne harpiks og fylde kolonnen med vand for at se, om den strømmer hurtigt igennem. Filtre kan rengøres ved at efterlade en lukket kolonne fyldt med denaturering elution buffer og ryste natten over.

2. Ionbytning - Rensning af enkeltprotein

  1. Forberedelse af bufferne
    BEMÆRK: Se tabel 1 for at få yderligere oplysninger om alle buffere
    1. Forbered en 2 L lav salt buffer: 10 mM Tris pH 8,1 (5 mM Tris Acid, 5 mM Tris Base). Filteropløsning med et filter på 0,22 μm.
    2. Forbered en 0,5 L høj salt buffer: 10 mM Tris pH 8,1, 4 M NaCl. Foranstaltning 116,9 g NaCl og udgør op til 0,5 L med 10 mM Tris pH 8,1 ovenfra. Filteropløsning med et filter på 0,22 μm.
  2. Gør salt koncentration serien: 0-1 M NaCl.
    BEMÆRK: Saltkoncentrationerne kan justeres for hvert protein.
    1. Opstilling af 24 x 50 mL med etiket på centrifugerør i et stativ
    2. Ved hjælp af bufferne fremstillet ovenfor skal du forberede 24 x 14 mL NaCl-fortyndinger fra 0-1000 μM. Start med at tilføje de krævede mængder på 4 M NaCl 10 mM Tris. Dette kan gøres ved intervaller på 25 mM eller 50 mM afhængigt af protein.
    3. Derefter tilsættes de nødvendige mængder på 10 mM Tris til hvert rør. Inverter hvert rør flere gange for at blande.
  3. Forberede eksempler
    1. Få de prøver, der skal renses ved Ion-udveksling. Du kan også tage en 50 μL aliquot til analyse senere.
      BEMÆRK: Prøverne skal altid holdes kolde. disse kan være lysater, eller måske efter Ni-NTA. Prøver fra Ni-NTA i denatureringsbuffere kræver opkald eller bufferudveksling i 10 mM Tris-buffer. Prøver fra Ni-NTA i indfødte buffere kan fortyndes med 10 mM Tris buffer for at reducere saltkoncentrationen, så proteinet kan binde sig til IEX-harpiks.
    2. Spin prøver på 18.000 x g i 10 minutter.
    3. Hæld forsigtigt supernatanten af i en vejebåd. Undgå at forstyrre pellet.
    4. Supernatanten optages forsigtigt i en 20 mL sprøjte og fastgøres et 0,22 μm filter.
    5. Skub langsomt supernatanten ud gennem filteret i et friskt 50 mL rør.
    6. Hvis fortynding er påkrævet, fortyndes supernatant med 10 mM Tris buffer lavet ovenfor (I dette forsøg blev supernatanten fortyndet 1 ud af 2). Opbevares i mellemtiden ved 4 °C.
  4. Forberedelse af opsætningen af vakuumrensning og ækvilibrering
    BEMÆRK: I denne protokol anvendes kun én kolonne til IEX-rensning af en prøve. Du kan finde flere rensninger i næste afsnit.
    1. Bestem den ønskede harpikstype og -diskenhed. Som tommelfingerregel for op til 20 mg delvist rene His-mærkede SH3-domæner skal du bruge 0,4 mL Q-sepharose hurtigstrømsharpiks pr. kolonne (se trin 2.4.8).
    2. Indsæt 24 åbne tomme kolonner (tomme uden filter nederst) i en formonteret MCPA. Søjlerne skal passe tæt i hullerne i tætningsmåtten, der er punkteret.
    3. Placer en 10 mL sprøjte stemplet i hver tom kolonne undtagen den første position, hvor rensningen vil starte.
    4. Skub bunden af en åben kolonne (med filter) gennem en 5 mL sprøjte stemplet gummipakning (der er blevet gennemboret) for at danne en gummiring i slutningen af kolonnen. Denne gummiring sikrer en god forsegling, når denne kolonne indsættes i hver tom kolonne ovenfor. Indtil videre skal du indsætte denne kolonne i den første tomme kolonne i MCPA-aftalen.
    5. Tag en åben opsamlingsplade og læg denne plade i bunden af vakuummanifolden og luk med toppen af manifolden.
    6. Placer den samlede MCPA (med søjler) oven på vakuummanifolden.
    7. Fastgør slangen fra et vakuumpumpesystem til indløbet/dysen i bunden af vakuumet.
    8. Skær en blå pipettespids ~ 2 cm fra bunden og brug den til at optage op 800 μL Q-sepharose perler (eller enhver anden ionbytterharpiks), hvilket sikrer, at 50/50 perle-ethanolopløsningen blandes for at undgå lagdeling. Pipette 800 μL ind i den ene åbne kolonne (med filter) i første position, og når perlerne sætter sig til bunden af kolonnerne, tændes vakuumet nok til at løbe gennem 20% ethanol.
    9. Kolonnen med sepharoseperler vaskes med 2 x 2 mL på 10 mM Tris. Sluk for støvsugeren lige før Tris buffer løber igennem for at forhindre harpiksen udtørring. Afstrømning kan kasseres.
      BEMÆRK: Hvis harpiks tidligere har været anvendt, regenereres ved vask i 5 harpiksvolumener på 4 M NaCl og derefter 5 harpiksvolumener på 10 mM Tris før trin 2.4.9.
  5. Lastning, vask og udring
    1. Alle prøver, der skal renses (se afsnit 3), overføres til kolonnen Q sepharose i første position, der anvendes en lille plastsløjfe til at omrøre prøven og perlerne i ca. ~2 minutter, før vakuumpumpen tændes.
      BEMÆRK: I tilfælde af overskydende supernatant (>12 mL) skal du passe på at overfylde kolonnen. Lad prøven løbe igennem og tilsæt derefter mere, bland, før du lader løbe igennem igen.
    2. Gem/frys gennemløbet til analyse senere.
    3. Placer en anden åben opsamlingsplade i vakuummanifolden, og vask derefter hver sepharose-søjle med 2 x 2 mL på 10 mM Tris og opbevar.
    4. Indsæt en 96 brøndsamlingsplade, og sørg for, at A1 er i øverste venstre hjørne.
    5. For at indsamle den første elueringsfraktion skal du fjerne sprøjtestemplet fra den næste kolonne langs, flytte Q-sepharose-kolonnen i denne position og sætte sprøjtestemplet i den tidligere position. Derefter pipettes 1 mL af den første saltkoncentration i Q sepharose-kolonnen. Tænd for pumpen og saml elueringen. Sluk for pumpen ligesom væskeledningerne i nærheden af perlerne for at undgå udtørring af perlerne.
    6. For at opsamle den næste elueringsfraktion skal du fjerne sprøjtestemplet fra den næste kolonne, flytte Q-sepharose-kolonnen i denne position og sætte sprøjtestemplet i den tidligere position.
    7. Der tilsættes 1 mL af den næste saltkoncentration til kolonnen, og processen gentages, indtil alle koncentrationer er anvendt, og der er indsamlet 24 udbøjelser i 24 separate brønde. Kontroller, at der ikke er kommet væske ind i nogen nabobrønde.
    8. Vask kolonnen med 2 mL på 4 M NaCl 10 mM Tris. Lad det løbe igennem.
    9. Vask med 2 mL 20% ethanol. Lad ethanol køre, indtil det er lige over perlerne og tætningskolonnen til opbevaring.
    10. Store 96 brøndsamlingsplade og analyser ved UV-spektroskopi og SDS PAGE.

3. Ionbytning - Samtidig rensning af 24 forskellige proteiner

BEMÆRK: Se trin 2.1-2.3 for nærmere oplysninger om fremstilling af buffere, en række saltkoncentrationer og tilberedning af prøver

  1. Forberedelse af rensningsopsætningen
    BEMÆRK: Hvordan rensningssystemet er sat op, afhænger i høj grad af, hvor mange proteiner der renses, og hvor mange saltforhold der vil blive brugt. For at rense 12 prøver op til maksimalt 24 prøver samtidig kræves en opsamlingsplade for hver saltkoncentration, der anvendes til at elute. For mindre end 12 prøver er det muligt at flytte kromatografisøjlerne et par positioner inden for samme MCPA, før du skifter opsamlingsplader. I dette tilfælde er det ikke nødvendigt at placere kolonnerne i tomme kolonner, og de kan fastgøres direkte til MCPA-tætningsmåtten. Nedenstående protokol gælder for 24 samtidige ionbytningsrensninger.
    1. Placer den samlede MCPA direkte fastgjort til 24 tomme søjler med filtre oven på vakuummanifolden, der indeholder en åben opsamlingsplade, og forbered og vask 24 ionbytterkolonner som i enkeltrensningsmetode ovenfor. Til denne rensning er det praktisk at bruge en Eppendorf repeater eller sprøjte til hurtigt at pipette ind i søjler.
  2. Lastning, vask og udring
    1. Placer en 48-brønds opsamlingsplade i bunden af vakuummanifolden, før MCPA monteres (med de vaskede rensningssøjler fastgjort). Sørg for, at A1 er i øverste venstre hjørne.
    2. Pipetter hver proteinprøve (op til 5 mL ad gangen) i den tilsvarende kolonne. Rør hver kolonne ved hjælp af en tynd plastiksløjfe (en løkke for hver kolonne for at undgå forurening) i ca. 2 minutter. Tænd derefter vakuumpumpen og lad supernatanten strømme igennem.
      BEMÆRK: I tilfælde af overskydende supernatant skal du passe på at overfylde kolonnerne. Lad prøven løbe gennem kolonnen og derefter tilføje mere, blande, før du lader løbe igennem igen.
    3. Opbevar/frys 48-brønds kollektionspladen til senere analyse, da den indeholder gennemstrømningen for hvert protein.
    4. Placer en anden 48-brønds opsamlingsplade i vakuummanifolden, og vask derefter hver sepharose-søjle med 2 x 2 mL på 10 mM Tris.
    5. Sæt den første 96-brønds opsamlingsplade ind i manifolden, sørg for, at A1 er i øverste venstre hjørne, og pipette 1 mL af den første saltkoncentration i hver kolonne og tænd derefter vakuumpumpen for at køre dette gennem søjlerne. Kollektionspladen fjernes, dækslet med parafilm og opbevares i ved 4 °C til analyse.
    6. Gentag trin for hver på hinanden følgende saltkoncentration, der bruges til at luske. Sørg for, at der anvendes en ny kollektionsplade til hver eluering, og at hver opsamlingsplade er mærket og opbevaret.
    7. Vask hver kolonne med 2 mL på 10 mM Tris, 4 M NaCl.
    8. Vask hver kolonne med 2 mL 20% ethanol. Lad ethanol køre, indtil det er lige over perlerne og forsegle kolonner til opbevaring.
    9. Gem 96 brøndsamlingsplader og analyser ved UV-spektroskopi og SDS-PAGE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Som et eksempel har MCPA med succes renset 14 AbpSH3-mutanter under denatureringsforhold via Ni-NTA (Figur 2A). Et lille forurenende stof ~ 25 kDa kan ses, men proteinet er stadig stort set ren. Dette forurenende stof menes at være YodA, et almindeligt medrenset protein, der findes i E. coli11. Figur 2B viser rensningen af 11 forskellige SH3-domæner under oprindelige forhold. Det lille forurenende stof, der ses under denatureringsforhold, fjernes under oprindelige forhold. Dette viser, at MCPA kan anvendes til sammenligning af rensninger, der består af indfødte eller denaturerende buffere som anført i tabel 1. 

Repræsentative data for rensning af et lysat via IEX MCPA er vist i figur 3. Dette tyder på, at AbpSH3 kan adskilles fra de fleste af de forurenende stoffer, da det elutes senere mellem 425 mM til 700 mM. Koncentrationen af salt, der er nødvendig for at elute proteinet fra kolonnen, vedrører styrken af elektrostatisk interaktion mellem proteinet og harpiksen. Størstedelen af bakterielle proteiner har lave PIs; men protein af interesse er meget negativ og synes at have en lavere pI. Gode udbytter af betydeligt ren AbpSH3 protein blev genvundet med nogle forskellige højere molekylvægt forurenende stoffer AbpSH3 ses som bands på ~ 5 kDa. IEX via MCPA kan derfor bruges som det første skridt i en rensningsprotokol, da det kan isolere tilstrækkelige mængder protein fra de nuværende forurenende stoffer i et lysat.

Yderligere rensning af IEX ved hjælp af MCPA er blevet påvist med succes på fraktioner, der er udråbt fra en Ni-NTA MCPA-kørsel (figur 4). Mærkbart er to hovedtoppe blevet løst med maxima ved 400 og 700 mM salt, hvilket kan svare til at adskille en N-terminal afkortet version af dette protein. Gennem yderligere DSF-dataanalyse blev det gjort klart, at top 1 var lidt mindre stabil og havde en lidt lavere Tm i forhold til top 2. I forhold til IEX-løbet af lysatet er fraktionerne generelt meget renere og viser fordelen ved at køre et Ni-NTA-trin før IEX. Selv om der er let forurening med proteiner med en højere molekylvægt, er fraktionerne stadig stort set rene og har givet gode biofysiske data ved hjælp af NMR og termiske / kemiske denatureringsanalyser.

Figure 1
Figur 1:Et forbillede af MCPA-instrumentet. (A)Forfra af MCPA-instrumentet med 24 kolonner vedlagt. Søjlerne er fordelt jævnt inden for 96 godt forsegling måtten til at guide elutions i en 96, 48 eller åben indsamling plade. (B) Forfra af lukkemåtten. Dette tal er blevet ændret fra Dominguez et al.10. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Et eksempel på en 1 x 24 kolonne konfiguration, rensning af forskellige SH3 mutanter under denaturering og indfødte forhold. (A)Denaturering rensning af forskellige AbpSH3 mutanter. En lille forurening kan ses af ~ 25 kDa på tværs af hver vognbane. (B) Native rensning af 11 forskellige gær SH3 domæner. De forurenende stoffer er blevet fjernet fra hver vognbane og ikke længere synlige på gel. Dette tal er blevet ændret Dominguez et al.10. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Rensning af lysat ved hjælp af IEX via MCPA. (A) Absorbansaflæsninger af alle udvninger fra ionbytningen (IEX) blev målt ved hjælp af en LVis-plade (BMG). Aflæsningerne er afbildet mod den tilsvarende NaCl koncentration af elution. Toppen med den højeste proteinkoncentration ses ved 700 mM NaCl. (b) SDS-PAGE-analyse af de IEX-salte udvninger, der er beskrevet i (A). Molekylvægtmarkøren vises til venstre for gelen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4:Rensning af VJM2 Pool (post Ni-NTA) ved hjælp af IEX via MCPA-systemet.

(A) Absorbansaflæsninger af de indsamlede eliksirer fra ionbytningen (IEX) blev målt ved hjælp af en NanoDrop. Aflæsningerne er afbildet mod den tilsvarende NaCl koncentration af elution. (b) SDS-PAGE-analyse af de IEX-salte udvninger, der er beskrevet i (A). Molekylvægtmarkøren vises til venstre for gelen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Denatureringsbuffersammensætning Oprindelig bufferkomposition
Lysis-buffer 10 mM NaH2PO4,10 mM Tris, 6 M GuHCl, 10 mM imidazol, pH 8,0 20 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol, pH 8,0
Vask buffer 10 mM NaH2PO4,10 mM Tris, 6 M GuHCl, 20 mM imidazol, pH 8,0 20 mM Tris, 300 mM NaCl, 20 mM imidazol, pH 8,0
Elution-buffer 10 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 6 M GuHCl, 0,2 M eddikesyre, pH 3,0 20 mM Tris, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol, pH 8,0
Buffersammensætning
Højt saltindhold 5 mM Tris syre, 5 mM Tris base, pH 8,1, 4 M NaCl
Lavt saltindhold 5 mM Tris syre, 5 mM Tris base, pH 8,1

Tabel 1: Sammensætningen af buffere, Ni-NTA denaturering og indfødte rensninger og Ion udveksling lav og høj salt buffere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metoden er robust og enkel at bruge til relativt uerfarne proteinbiokemikere, men der er et par overvejelser at huske på.

Forsigtig med overfyldning af opsamlingsplader

Selve 48-brønds kollektionspladen holder kun 5 mL pr. brønd, mens hver 96-brønd kun holder 2 mL. Dette skal holdes for øje, når du tilføjer buffer og kører prøve gennem kolonnen, da der er risiko for overfyldning af brøndene. Der skal især udvises forsigtighed ved overførsel af de større prøver til kromatografikolonnen til rensning. I tilfælde, hvor der er overskydende supernatant, opdeles i dele, tilstrækkelig til at fylde kolonnen, som skal have lov til at løbe igennem, før du tilføjer den næste del for at forhindre overfyldning og tab af prøve. Efter hver tilsætning af supernatant skal kolonnen blandes med en lille plastsløjfe for at øge sandsynligheden for proteinbinding til perlerne, før pumpen tændes. For at holde styr på pladens retning og dermed indholdet af brøndene skal det sikres, at det mærkede hjørne 'A1' altid er i øverste venstre hjørne af pladen, før rensningen påbegyndes.

Eluting Protein

Når der udråbes i IEX og affinitetstrinnet, bruges vakuumet på den laveste indstilling til at trække elueringsbufferen gennem kolonnen. Dette fremskynder strømningshastigheden sammenlignet med tyngdekraften, men hvis proteinkoncentrationen er høj, kan det føre til proteinopløsningen til skum og potentielt denaturering. Hvis dette er tilfældet, er et alternativ at bruge en sprøjte stemplet på toppen af den åbne kolonne til at skubbe bufferen gennem kolonnen. I dette tilfælde skal sprøjtestemplet forsigtigt (ikke kraftigt) skubbes ned i kolonnen for at skubbe væsken igennem og ind i opsamlingspladen nedenunder. Vær forsigtig, når opsamlingspladen fjernes for at sikre, at eventuelle elueringsdråber, der er tilbage på MCPA, ikke spildes i nabobrønde, hvilket forårsager forurening.

Vedligeholdelse af harpiks og søjler

Et kritisk trin i denne protokol er regenereringen af Ni-harpikser og -kolonner. Kolonnerne skal regenereres ved enten starten eller slutningen af renseprotokollen. Hvis regenerering sker i slutningen, skal harpiksen opbevares i 20% ethanol ved 4 °C. Kromatografikolonnefiltrene kan blive "blokeret", hvilket får prøven til at strømme gennem kolonnen i et meget langsommere tempo, end den burde. Hvis dette er tilfældet, skal søjler udskiftes eller filtre fjernes og rengøres ved at blødgøre i denatureringsbuffer natten over og skylning med vand.

Som det fremgår af trin 3, kan MCPA-instrumentets mangfoldighed udnyttes til rensning af flere proteiner lige så effektivt som en enkelt prøve. Ionudvekslingsprotokollen kan skræddersys til forsøgets behov og tilpasses antallet af forskellige prøver og antallet af anvendte saltkoncentrationer. Hvis mindre end 12 prøver f.eks. Hvis der for eksempel kun blev renset 4 proteiner parallelt, kan søjlerne flyttes over en opsamlingsplade for at indsamle udtagninger på op til 4 saltkoncentrationer, før der skiftes plader. MCPA er i stand til rensning ved hjælp af forskellige harpikser - affinitet og ionudveksling er allerede blevet diskuteret, men hydrofob interaktionskromatografi er også mulig, og der er yderligere potentiale for immunoaffinitetskromatografi12. Selv om denne metode har fokuseret på flere små rensninger, kan MCPA bruges til blot en enkelt stor kromatografi kolonne til rensning fra flere liter bakteriel kultur, uden behov for en prøve pumpe eller en dyr FPLC.

Brug af MCPA til high-throughput ion udveksling som diskuteret ville kræve flere, op til 24, separate indsamling plader. Dette kan være upraktisk og kræver meget plads på en standard laboratoriebænktop og øget risiko for menneskelige fejl. Desuden kan det være en udfordring at måle proteinabsorberende af udvninger fra 24 forskellige prøver. I denne situation en multi-kanal pipette ville være gavnligt og ville gøre overførslen af flere prøver hurtigere og lettere. For små mængder skal du overveje at anvende en LVis-plade (BMG), der indeholder 16 mikrodråber, da den gør det muligt at måle koncentrationerne direkte, uden at det er nødvendigt at anvende andre reagenser såsom Bradford-assayreagenset.

Mens brugen af en vakuumpumpe giver mulighed for en 3x hurtigere rensningshastighed end hvad der opnås ved hjælp af kuntyngdekraften 10, uden at gå på kompromis med harpiksens integritet, skaber det nogle andre problemer. Opretholdelse af vakuumets styrke under rensningen kræver for eksempel, at alle søjlerne blokeres med en 10 mL sprøjtedyst, som skal tages ud, før kolonnen indsættes pakket med harpiks. At tage stemplet ud en efter en er også en rettidig proces, og vakuumets modstand kan gøre dem vanskelige at fjerne fra kolonnen.

Nærmere oplysninger om en multiprotein IEX rensning ved hjælp af MCPA er angivet i protokollen. Denne højere gennemløbsmetode er tidseffektiv og kontrollerbar, alle parametre for hver rensning kan manipuleres af brugeren. Men i de fleste proteinbiokemilaboratorier, herunder industrien, er hurtig proteinvæskekromatografi den foretrukne metode til proteinrensning, som er overlegen med hensyn til overførselshastighed, reproducerbarhed og metodeoverførsel og robusthed. Disse systemer såsom Protein Maker af Protein Biosolutions og AKTA FPLC biomolekyle rensningssystem kan afhjælpe rensning flaskehals problem med stor succes. På trods af at disse systemer opnår overlegne resultater, er den adskillelse, vi ser ved hjælp af MCPA-systemet, stadig god nok til at opnå protein med høj renhed. Interessant nok bruger vores laboratorium også AKTA-start FPLC til at udføre ionudvekslingskromatografi, og selvom opløsningen kan være højere med en lineær gradient, der er i stand til denne maskine, er det især mere tidskrævende at køre flere prøver, og det er meget mere udfordrende at træne uerfarne studerende på dette system.

Andre betydeligt billigere pladebaserede rensningsalternativer findes. For eksempel sælger GE Healthcare biovidenskab (nu Cytiva) og Sigma Aldrich færdigpakkede 96 godt filterplader og patroner med specifikke rense harpikser. Disse filterplader tilbyder mindre højkapacitetsrensning, men kun rensende i mikrogramudbytteområdet. Desuden bruger QIAvac 24 Plus fra QIAGEN spinsøjler under vakuum, men det er ikke praktisk til opsamling af flow igennem eller vask.

Mcpa's fleksible design giver mulighed for parallel proteinrensning, selvom manuel flytning af søjler og plader ved hjælp af MCPA-metoden potentielt øger menneskelige fejl sammenlignet med standard FPLC-systemer. Manuel indlæsning af prøverne på kolonner er imidlertid mere pålidelig for uerfarne brugere end at indlæse prøver på kolonner ved hjælp af standard FPLCs, hvor fejl lettere kan laves, da det involverer skift af ventiler og pumper, der kræver mere omfattende træning. Det er klart, at fuldautomatiske systemer til proteinrensning er bedre egnet end MCPA til rensningsgrupper i industrien og akademiske laboratorier, der rutinemæssigt arbejder med rensning. Men for små laboratorier, der ikke har råd til dyrt udstyr og vedligeholdelse og ønsker at undgå omfattende uddannelse eller kun lejlighedsvis arbejde med proteinrensning, tilbyder MCPA et effektivt alternativt system, der stadig opnår god adskillelse og er billigt og let at etablere.

MCPA består af enkle og billige instrumentering, som gør det muligt at forbinde flere kolonner til samtidig parallel rensning for at producere milligrammængder af proteiner. Desuden giver denne teknik mulighed for modularitet af de enkelte kolonner, der øger gennemløbet. Dette er unikt for denne metode og kan ikke opnås ved hjælp af strømpladebaserede rensningssæt.

Proteinrensning vil fortsat være afgørende i undersøgelsen og karakteriseringen af proteiner og udviklingen af terapeutiske. Biofysiske teknikker som NMR og proteinkrystallografi er afhængige af milligrammængder af rent protein, derfor har de nuværende ekspressions - og rensningssystemer brug for yderligere udvikling for at forbedre omkostningerne og tiden for at opnå denne2,13,14. Som diskuteret har automatiserede rensningssystemer mange fordele i forhold til uautomatiske metoder, men de forbliver for dyre for mindre laboratorier, der kræver dyr instrumentering og uddannelse. MCPA er betydeligt billigere med en startpris på $ 4510. Derudover har denne MCPA ikke brug for omfattende træning eller kontinuerlig vedligeholdelse, og skulle der opstå problemer, kan disse let løses. Ætsende buffere som denatureringsbuffere, der bruges til Ni-NTA, kan korrodere rensningssystemer, hvis de ikke rengøres korrekt. McPa's fleksible design giver dog mulighed for hurtig rengøring, reparation og udskiftning af rum, hvis det er nødvendigt. Afslutningsvis vil MCPA lette effektiv, højere gennemløb proteinrensning for mindre laboratorier, indtil mere overkommelige automatiserede systemer er etableret10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af en Institutional Development Award (IDeA) fra National Institute of General Medical Sciences af National Institutes of Health under tilskud nummer P20GM103451 og en intern forskning tilskud fra University of Liverpool.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2 mL/ well collection plate Agilent technologies 201240-100
5 mL/ well collection plate Agilent technologies 201238-100
12 mL chromatography columns Bio-Rad 7311550
96 well long drip plate Agilent technologies 200919-100 Come with 0.25 um filters which are to be removed.
96 well plate seal/mat Agilent technologies 201158-100 Should be peirceable
His60 Ni Superflow Resin Takara Bio 635660
HiTrap Q HP anion exchange column GE Healthcare (Cytiva) 17115301
Lvis plate reader BMG LABTECH Compatible with FLUOstar Omega plate reader
Male leur plugs Cole-Parmer EW-45503-70
PlatePrep 96 well Vacuum Manifold Starter kit Sigma-Aldrich 575650-U
Reservoir collection plate Agilent technologies 201244-100
The Repeater Plus Eppendorf 2226020 With 5 mL and 50 mL syringes
VACUSAFE vacuum INTEGRA 158 320 The vacusafe vacuum has a vacuum range from 300 mBar to 600 mBar and a 4 L waste collection bottle

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhang, C., et al. Development of an Automated Mid-Scale Parallel Protein Purification System for Antibody Purification and Affinity Chromatography. Protein Expression and Purification. , 128 (2016).
  2. Renaud, J. P., et al. Biophysics in Drug Discovery: Impact, Challenges and Opportunities. Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (10), (2016).
  3. Kim, Y., et al. High-throughput Protein Purification and Quality Assessment for Crystallization. Methods (San Diego, Calif). 55 (1), (2011).
  4. Pan, W., Wang, Y. A New Metal Affinity NCTR 25 Tag as a Better Alternative to the His-tag for the Expression of Recombinant Fused Proteins. Protein Expression and Purification. , 164 (2019).
  5. Locatelli-Hoops, S., Sheen, F. C., Zoubak, L., Gawrisch, K., Yeliseev, A. A. Application of HaloTag Technology to Expression and Purification of Cannabinoid Receptor CB2. Protein Expression and Purification. 89 (1), 62-72 (2013).
  6. Pina, A. S., Lowe, C. R., Roque, A. C. A. Challenges and Opportunities in the Purification of Recombinant Tagged Proteins. Biotechnology Advances. 32 (2), (2014).
  7. Gaberc-Porekar, V., Menart, V. Perspectives of Immobilized-Metal Affinity Chromatography. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 49 (1-3), (2001).
  8. Anderson, A. C. The Process of Structure-Based Drug Design. Chemistry & Biology. 10 (9), (2003).
  9. Cummin, E., et al. A Simple High-Throughput Purification Method for Hit Identification in Protein Screening. Journal of Immunological Methods. 339 (1), (2008).
  10. Dominguez, M. J., et al. A Multi-Column Plate Adapter Provides an Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System. Protein Expression and Purification. , 152 (2018).
  11. Bolanos-Garcia, V. M., Davies, O. R. Structural Analysis and Classification of Native Proteins From E. Coli Commonly Co-Purified by Immobilised Metal Affinity Chromatography. Biochimica et Biophysica Acta. 1760 (9), (2006).
  12. Ayyar, B. V., Arora, S., Murphy, C., O'Kennedy, R. Affinity Chromatography for Antibody Purification. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). , (1129).
  13. Jubb, H., Higueruelo, A. P., Winter, A., Blundell, T. L. Structural Biology and Drug Discovery for Protein-Protein Interactions. Trends in Pharmacological Sciences. 33 (5), (2012).
  14. Grabowski, M., Niedzialkowska, E., Zimmerman, M. D., Minor, W. The Impact of Structural Genomics: the First Quindecennial. Journal of Structural and Functional Genomics. 17 (1), 1-16 (2016).

Tags

Biokemi Høj gennemløbsrensning Affinitetskromatografi Ion udveksling kromatografi MCPA økonomisk proteinrensning SH3 domæne
Et økonomisk og alsidigt proteinrensningssystem med høj gennemløb ved hjælp af en pladeadapter med flere kolonner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kineavy, F. B., Davies, A. A.,… More

Kineavy, F. B., Davies, A. A., Mitchell, M. R., Lay, D., Dominguez, M. J., Stollar, E. J. An Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System Using a Multi-Column Plate Adapter. J. Vis. Exp. (171), e62075, doi:10.3791/62075 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter