Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

تحضير أجنة الدجاج ex ovo والأوعية الغشائية المشيمية كما هو الحال في نموذج الجسم الحي للتصوير بالموجات فوق الصوتية المعززة بالتباين ودراسات توصيل الأدوية بوساطة الفقاعات الدقيقة

Published: February 9, 2021 doi: 10.3791/62076
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,2, 1
1Department of Biomedical Engineering, Thoraxcenter, Erasmus MC University Medical Center Rotterdam, 2Laboratory of Acoustical Wavefield Imaging, Faculty of Applied Sciences, Delft University of Technology

Summary

يصف هذا البروتوكول ثلاث طرق حول كيفية الحصول على أجنة الدجاج التي يبلغ عمرها من 5 إلى 8 أيام واستخدامها وغشاءها المشيمي (CAM) كنموذج في الجسم الحي لدراسة التصوير بالموجات فوق الصوتية المعزز بالتباين وتوصيل الأدوية بوساطة الفقاعات الدقيقة.

Abstract

يعد جنين الدجاج والغشاء المشيمي الغني بالأوعية الدموية (CAM) نموذجا قيما في الجسم الحي للتحقيق في العمليات الطبية الحيوية ، أو مخططات النبض بالموجات فوق الصوتية الجديدة ، أو محولات الطاقة الجديدة للتصوير بالموجات فوق الصوتية المعززة بالتباين وتوصيل الأدوية بوساطة الفقاعات الدقيقة. أسباب ذلك هي إمكانية الوصول إلى شبكة الأجنة والأوعية الدموية في CAM بالإضافة إلى التكاليف المنخفضة للنموذج. خطوة مهمة للوصول إلى الجنين والأوعية الطبية التكميلي والبديل هي إخراج محتوى البيض من قشر البيض. في هذا البروتوكول ، يتم وصف ثلاث طرق لإخراج المحتوى من قشر البيض بين اليوم 5 و 8 من الحضانة مما يسمح للأجنة بالتطور داخل قشر البيض حتى هذه الأيام. لا تتطلب الطرق الموصوفة سوى أدوات ومعدات بسيطة وتحقق معدل نجاح أعلى للبقاء على قيد الحياة بنسبة 90٪ لمدة 5 أيام ، و 75٪ لمدة 6 أيام ، و 50٪ لمدة 7 أيام ، و 60٪ للبيض المحتضن لمدة 8 أيام مقارنة بالأجنة المستزرعة خارج البويضة (~ 50٪). يصف البروتوكول أيضا كيفية حقن نوى التجويف ، مثل الفقاعات الدقيقة ، في نظام الأوعية الدموية CAM ، وكيفية فصل الغشاء الذي يحتوي على الجنين و CAM عن بقية محتوى البويضة للدراسات الشفافة بصريا ، وكيفية استخدام جنين الدجاج و CAM في مجموعة متنوعة من تجارب الموجات فوق الصوتية قصيرة المدى. يعد نموذج جنين الدجاج في الجسم الحي ونموذج الطب التكميلي والبديل وثيق الصلة بالتحقيق في بروتوكولات التصوير الجديدة ، وعوامل التباين بالموجات فوق الصوتية ، ومخططات النبض بالموجات فوق الصوتية للتصوير بالموجات فوق الصوتية المحسنة بالتباين ، ولكشف آليات توصيل الأدوية بوساطة الموجات فوق الصوتية.

Introduction

أثبتت أجنة الدجاج خارج البيض والغشاء المشيمي الغني بالأوعية الدموية (CAM) أنها نموذج مناسب للتحقيق في مختلف العمليات البيولوجية والطبية الحيوية مثل التطور الجنيني والأورام وتوصيل الأدوية1،2،3،4. تم استخدام الموجات فوق الصوتية لتصوير نمو القلب الجنيني4,5 ولتنشيط نوى التجويف عند الحقن ، مثل الفقاعات الدقيقة ، لتوصيل الأدوية الوعائية 6,7. أجنة الدجاج غير مكلفة ، وتتطلب بنية تحتية ومعدات أقل ، ولديها تشريعات أقل صرامة مقارنة بالنماذج الحيوانية الأخرى8. يمكن الوصول بسهولة إلى جنين الدجاج والأوعية الطبية التكميلي والبديل بعد فتح البويضة في حين أن هذا يثبت أنه أكثر صعوبة مع أجنة وأوعية الثدييات. إلى جانب ذلك ، يوفر جنين الدجاج والأوعية الطبية التكميلي والبديل نبضات القلب وتدفق الدم النابض. يظهر CAM أوجه تشابه في تشريح الأوعية الدموية مع الثدييات ويمكن استخدامه لفحص المخدرات8،9،10. بسبب هذه الخصائص ، أثبتت أوعية CAM أيضا أنها نموذج مناسب للتحقيق في التصوير بالموجات فوق الصوتية المعزز بالتباين (CEUS)11،12،13،14،15،16. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام النموذج للتحقيق بصريا في سلوك عوامل التباين بالموجات فوق الصوتية في مجال الموجات فوق الصوتية باستخدام كاميرا فائقة السرعة وتأثير قوة الإشعاع الصوتي على دفع الأدوية وربطهاوتسربها 7،17،18،19. على الرغم من أن جنين الدجاج والطب التكميلي والبديل أقل ملاءمة للتجارب طويلة المدى ، إلا أنهما يمكن أن يكونا مفيدين للتجارب قصيرة المدى في الجسم الحي.

لزيادة الرؤية والقدرة على التحكم في جنين الدجاج والطب التكميلي والبديل أثناء التجارب ، من المهم إخراج محتوى البيض الذي يحتوي على الجنين و CAM من قشر البيض18. استخدمت دراسات أجنة الدجاج السابقة التي تتضمن عوامل تباين بالموجات فوق الصوتية أجنة عمرهامن 5 إلى 6 أيام 7،11،12،17،19 وأجنة عمرها 14 إلى 18 يوما13،14،15،16. تم وصف طرق متعددة بالتفصيل لإخراج محتوى البيض من القشرة18،20،21. ومع ذلك ، على حد علمنا ، تركز الأساليب المنشورة سابقا على إخراج محتوى البيض من قشر البيض بعد 3 أيام من الحضانة (أي ، هامبرغر وهاميلتون (HH) المرحلة 19-2022) ، ومواصلة الثقافة ex ovo. هذا النهج خارج ثقافة البويضة له عيوب متعددة بما في ذلك زيادة خطر الوفيات أثناء الزراعة (~ 50٪) 1،18 ، واستخدام المضادات الحيوية 18،20 ، وانخفاض إجمالي طول الوعاء مقارنة بنمو البويضات 23. نظرا لأن زراعة الجنين داخل قشر البيض توفر البيئة الأكثر طبيعية ، فمن الأسهل احتضان الجنين داخل قشر البيض حتى يوم التجربة. لهذا السبب ، فإن النهج الذي يتم فيه إخراج محتوى البيض من قشر البيض في 5 إلى 8 أيام من الحضانة سيكون مفيدا بشكل خاص للتجارب على الأجنة التي تتراوح أعمارها بين 5 و 8 أيام.

في هذا البروتوكول ، نصف ثلاث طرق لإخراج محتوى البويضة من قشر البيض عندما يكون الجنين في اليوم 5 إلى 8 من التطور (HH 26-3522) مما يسمح للجنين بالتطور داخل قشر البيض حتى يوم التجربة. يتراوح حجم وعاء CAM من 10-15 ميكرومتر في القطر ، في الشعيرات الدموية الأصغر للجنين البالغ من العمر 8 أيام 24 ، إلى 115-136 ميكرومتر في الوعاء الأكبر من الأجنة البالغة من العمر 6 و 8 أيام24,25. تتطلب الطرق الثلاث الموصوفة فقط أدوات معملية أساسية وتقلل من خطر حدوث مضاعفات قبل بدء التجربة ، وبالتالي تقليل التكاليف والعمالة غير الضرورية. نقوم أيضا بتفصيل طريقة لفصل الغشاء الذي يحتوي على الجنين و CAM عن كيس الصفار مما يجعل CAM شفافا بصريا لدراسات الفحص المجهري. نظرا لأنه يمكن تثبيت الغشاء الذي يحتوي على الجنين و CAM على سبيل المثال على حامل بغشاء صوتي ، يمكن أيضا جعل الإعداد شفافا صوتيا26 ، مما يسمح بالجمع بين الفحص المجهري ودراسات الموجات فوق الصوتية عندما يتأثر مسار الضوء بصفار البيض. أخيرا ، نصف العديد من إعدادات الموجات فوق الصوتية الأخرى التي يمكن استخدامها للتصوير بالموجات فوق الصوتية أو CEUS.

Protocol

أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا لقانون التجارب الهولندية على الحيوانات ووفقا للمجلس الأوروبي (2010/63 / EU) بشأن حماية استخدام الحيوانات للأغراض العلمية.

1 . بروتوكول تحضير الأجنة

  1. حضانة بيض الدجاج المخصب
    1. قم بتخزين بيض الدجاج المخصب حديثا في درجة حرارة 15 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
    2. لاحتضان البيض المخصب، ضعيه عموديا بحيث يكون الجانب المدبب لأسفل في حاضنة رطبة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. تحويل البيض أثناء الحضانة ليس ضروريا.
      ملاحظة: اكتب تاريخ بدء حضانة أعلى البيضة باستخدام علامة دائمة.
  2. تحضير ما يصل إلى 5 أيام (120 ساعة) من عمر الجنين (مرحلة HH 26-28)22
    1. إعداد منطقة العمل
      1. قم بتسخين طبق التسخين إلى 37 درجة مئوية.
      2. ضع حامل بيض معدني (الشكل 1 أ ، ب) ، وحامل قارب وزن معدني (الشكل 1 ج ، د) ، و 10 مل إرلنماير مملوء ب PBS على لوحة التسخين.
      3. املأ قارب وزن (85 مم × 85 مم × 25 مم) بطبقة 10 مم من هلام الموجات فوق الصوتية وضع وعاء الوزن المملوء في حامل قارب الوزن المعدني المسخن مسبقا.
        ملاحظة: سيؤدي ملء قارب الوزن بهلام الموجات فوق الصوتية إلى رفع الجنين و CAM. يمكن أن يكون هذا مفيدا لحقن أو تصوير الجنين والطب التكميلي والبديل ولكنه ليس ضروريا لإخراج الجنين والطب التكميلي والبديل من قشر البيض.
      4. قم بإعداد بضع قطع من الشريط (طولها حوالي 3 سم) مع طي جزء من أحد طرفيها مرة أخرى على نفسها حتى لا تلتصق بعد الآن.
    2. إخراج محتوى البيض من قشر البيض
      1. خذ بويضة مخصبة محتضنة عمرها 5 أيام وانقلها إلى حامل البيض المعدني المسخن مسبقا (الشكل 1 أ ، ب). تأكد من إبقاء البيضة في نفس الاتجاه (أي التاريخ في الأعلى).
        ملاحظة: من المهم الحفاظ على البويضة في نفس الاتجاه للحفاظ على كيس الهواء والجنين والطب التكميلي والبديل في نفس الموضع في الجزء العلوي من البويضة.
      2. استخدم الجزء الخلفي المدبب من الملقط (أو ما شابه ذلك ؛ الشكل 1 ه) لعمل مسافة بادئة صغيرة في الجزء العلوي من البيضة (حيث يتم كتابة التاريخ) (الشكل 2 أ).
      3. استخدم الجزء الخلفي المدبب من الملقط لعمل مسافة بادئة ثانية على جانب البيضة حوالي 2/3 أسفل البيضة (الشكل 2 ب).
        ملاحظة: احرص على عدم جعل المسافة البادئة كبيرة جدا وإنشاء ثقب. إذا تم إنشاء ثقب عن طريق الصدفة ، فقم بإغلاق الفتحة بشريط ولا تقم بعمل مسافة بادئة أخرى.
      4. باستخدام الملقط الأكبر (الشكل 1E) ، أخرج قطعة صغيرة من قشر البيض من المنطقة ذات المسافة البادئة أعلى البيضة (مع تاريخ مكتوب). تأكد من أن كيس الهواء الموجود في الجزء العلوي من قشر البيض يتلامس مع الهواء خارج البيضة ، لكن لا تخترق القشرة بعمق كبير.
        ملاحظة: إذا تم اختراق القشرة بعمق كبير عند عمل المسافة البادئة العلوية ، فقد يتلف الجنين و CAM ولن ينجو الجنين من الإزالة من القشرة. من المهم أن يخلق الثقب الصغير الموجود في الأعلى اتصالا بالهواء بين داخل وخارج البويضة. إذا لم يتم ذلك ، إنشاء فراغ في الخطوات التالية من الإجراء مما سيؤدي إلى حبس فقاعات هواء كبيرة تحت الطب التكميلي والبديل مما يجعل الجنين والطب التكميلي والبديل عديم الفائدة. للتحقق من موضع كيس الهواء داخل البيضة ، يمكن استخدام مصدر ضوء لأن موضعه ليس دائما في الأعلى تماما ويمكن أن يكون أيضا أكثر على الجانب.
      5. استخدم حقنة سعة 5 مل وإبرة 19 جم لاختراق القشرة من خلال المسافة البادئة الثانية على الجانب 2/3 أسفل البيضة وسحب ~ 2 مل من بياض البيض (الشكل 2 ج).
        ملاحظة: تأكد من أن الإبرة تشير لأسفل نحو قاع البويضة لمنع فرصة إتلاف الجنين و CAM. تخلق هذه الخطوة جيبا هوائيا أكبر في الجزء العلوي من البيضة اللازمة لإزالة محتوى البيض. إذا تم إنشاء ثقب عن طريق الخطأ بدلا من المسافة البادئة في الخطوة 1.2.2.3 ، فقم بثقب الشريط بالإبرة لسحب بياض البيض. أعد إغلاق البزل بقطعة أخرى من الشريط.
      6. أخرج الإبرة واستخدم شريطا لسد الفجوة على الجانب (الشكل 2 د).
        ملاحظة: لمنع بياض البيض من التسرب من البويضة ، يمكن إغلاق الفتحة العلوية باستخدام إصبع قبل إخراج الإبرة. إذا استمر بياض البيض في التسرب مع وجود الشريط في مكانه بالفعل ، فقم أولا بإزالة بياض البيض بقطعة من الأنسجة للتأكد من أن الشريط يلتصق بشكل صحيح.
      7. أفرغ المحقنة بإضافة بياض البيض إلى قارب الوزن.
      8. استخدم الملقط الكبير (الشكل 1E) لتكبير الفتحة الصغيرة الموجودة أعلى البيضة (الشكل 2E). عند النظر داخل البويضة من خلال الفتحة الموجودة في الأعلى ، يكون الجنين و CAM مرئيين. استمر في تحديد موقع الجنين والطب التكميلي والبديل مع أخذ أكبر قدر ممكن من قشر البيض (الشكل 2F).
        ملاحظة: استمر في تحريك البويضة للحفاظ على أقصى قدر من الرؤية حول موضع الجنين والطب التكميلي والبديل داخل القشرة. تأكد من أن حافة الفتحة في الغلاف لا تقل عن CAM. إلى جانب ذلك ، لا تخترق الغشاء الداخلي وتمنع الحواف الحادة.
      9. بعد إنشاء الفتحة ، أدر البيضة 180 درجة وضع البيضة مرة أخرى في حامل البيض بحيث تكون الفتحة التي تم إنشاؤها في الجزء العلوي من البيضة تواجه الآن نحو الأسفل. سوف يطفو الجنين لأعلى وسيصبح غير مرئي من الأسفل (الشكل 2G) الذي يستغرق 1-2 دقيقة. تأكد من اختفاء الجنين بأكمله و CAM (بما في ذلك جميع الأوعية) وأن صفار البيض فقط مرئي قبل الانتقال إلى الخطوة التالية (الشكل 2H).
        ملاحظة: إذا كان الجنين لا يزال مرئيا من الأسفل بعد دقيقتين ، أدر البيضة في اتجاه عقارب الساعة لمدة 1-2 دقيقة. هذا سوف يساعد الجنين و CAM على الطفو.
      10. قم بإزالة الشريط من الفتحة الجانبية. انظر ما إذا كان الجزء الداخلي من البيضة ينتفخ الآن من الفتحة السفلية. إذا كانت هذه هي الحالة ، فانتقل إلى الخطوة التالية. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فاستخدم الإبرة الموجودة على المحقنة لثقب الفتحة الموجودة على الجانب مرة أخرى لتحرير الفراغ في البويضة. تأكد من الإشارة إلى الأعلى باستخدام الإبرة لمنع فرصة ثقب كيس الصفار. استمر حتى تنتفخ البيضة من الفتحة السفلية.
      11. أثناء إمساك قاع البيضة بالقرب من قارب الوزن في حامل قارب الوزن المعدني (الشكل 1 ج ، د) ، قم بعمل خدش أفقي برفق ولكن بسرعة في الغشاء على كامل عرض الفتحة باستخدام إحدى النقاط الحادة للملقط الصغير (الشكل 1F) وقم بإسقاط محتوى البيض برفق في قارب الوزن (الشكل 2I).
        ملاحظة: إذا لم يخرج محتوى البيض ، فاستخدم الإبرة الموجودة على المحقنة لثقب الفتحة الجانبية مرة أخرى مع توجيه الإبرة لأعلى.
      12. إذا كان الجنين في قارب الوزن جانبيا، فعادة ما يرتفع من تلقاء نفسه. إذا لم يحدث هذا ، استخدم قطعة من المناديل الورقية لإعادة وضع الجنين. ضع جانبا واحدا من المناديل الورقية على الجنين ، واسحب المناديل الورقية إلى الطرف الآخر ، وحرر المناديل الورقية ببضع قطرات من ~ 30 ميكرولتر من PBS (37 °C) باستخدام ماصة باستور بلاستيكية.
      13. تحقق بصريا مما إذا كان الجنين على قيد الحياة من خلال التأكد من أن نبضات القلب لا تزال موجودة ، وأن أوعية الطب التكميلي والبديل سليمة ولا يوجد نزيف ، ولا يوجد تسرب للصفار. إذا كان أحد هذه الأشياء غير صحيح ، فتخلص من الجنين والطب التكميلي والبديل لأنه لن يكون قابلا للحياة.
      14. تأكد من الاحتفاظ بالجنين والطب التكميلي والبديل عند 37 درجة مئوية وعدم جفافهما لأن هذا سيجعل أوعية الطب التكميلي والبديل تتدهور وفي النهاية سيموت الجنين. لمنع ذلك ، ضع بانتظام قطرات صغيرة من ~ 30 ميكرولتر من 37 °C PBS على الجنين و CAM.
  3. تحضير الجنين القديم من 6 إلى 7 أيام (144-168 ساعة) (HH المرحلة 28-32)22
    1. إعداد منطقة العمل
      1. قم بإعداد المرحلة كما هو موضح في القسم 1.2.1.
    2. إخراج محتوى البيض من قشر البيض
      1. قبل ساعتين من التجربة ، خذ بيضة محتضنة عمرها من 6 إلى 7 أيام وقم بتدوير البويضة 180 درجة داخل الحاضنة بحيث يكون الجزء العلوي من البيضة متجها نحو الأسفل. بعد 1 ساعة ، قم بتدوير البويضة مرة أخرى إلى موضعها الأصلي واتركها لمدة 1 ساعة أخرى.
        ملاحظة: تدوير البيضة قبل 2 ساعة من التجربة سيجعل من السهل إخراج محتوى البيض من القشرة.
      2. بعد الدوران ، خذ البويضة من الحاضنة.
      3. قم بتنفيذ الخطوة 1.2.2.2 حتى الخطوة 1.2.2.4.
      4. استخدم حقنة سعة 5 مل وإبرة 19 جم لاختراق القشرة من خلال المسافة البادئة الثانية على الجانب 2/3 أسفل البيضة وسحب ما بين 5-6 مل من بياض البيض. تأكد من أن الإبرة تشير لأسفل نحو قاع البيضة.
        ملاحظة: مع حقنة 5 مل التي استخدمناها ، من الممكن سحب ما يصل إلى 6 مل لذلك هناك حاجة إلى اختراق واحد فقط.
      5. أخرج الإبرة واستخدم قطعة من الشريط لسد الفجوة على الجانب (الشكل 2 د).
      6. أفرغ المحقنة بإضافة بياض البيض إلى هلام الموجات فوق الصوتية في قارب الوزن.
      7. استخدم الملقط الكبير (الشكل 1E) لتكبير الفتحة الصغيرة الموجودة أعلى البيضة (الشكل 2E). حاول أن تجعل الفتحة كبيرة قدر الإمكان ولكن تأكد من أن حافة الفتحة في الغلاف لا تقل عن CAM. إلى جانب ذلك ، لا تخترق الغشاء الداخلي وحاول منع الحواف الحادة.
      8. املأ حقنة ب ~ 1 مل أكثر من 37 °C PBS من الحجم المسحوب خلال الخطوة 1.3.2.4.
      9. انزع الشريط من الفجوة الجانبية ، واخترق الفجوة بالمحقنة المملوءة ، وأفرغها في الغلاف. تأكد من أن الإبرة تشير لأسفل نحو قاع البيضة.
        ملاحظة: نظرا لأن بياض البيض له لزوجة أعلى (~ 160 cP)27 من PBS (~ 1 cP) ، فإن استبدال بياض البيض ب PBS يقلل من التوتر والضغط على الجنين و CAM أثناء إخراج محتوى البيض من القشرة.
      10. أخرج الإبرة وأعد سد الفجوة بسرعة بقطعة من الشريط (الشكل 2D).
      11. اقلب البيضة 180 درجة وضع البيضة مرة أخرى في حامل البيض بحيث تكون الفتحة التي تم إنشاؤها في الجزء العلوي من البيضة متجهة الآن نحو القاع. اقلب البيضة في اتجاه عقارب الساعة حتى يختفي الجنين بأكمله و CAM (بما في ذلك جميع الأوعية) ويظهر صفار البيض فقط.
      12. قم بتنفيذ الخطوة 1.2.2.10 حتى الخطوة 1.2.2.14.
  4. تحضير الجنين البالغ من العمر 8 أيام (192 ساعة) (مرحلة HH 32-35)22
    1. إعداد منطقة العمل
      1. قم بتسخين طبق التسخين إلى 37 درجة مئوية.
      2. ضع حامل قارب وزن معدني (الشكل 1C ، D) و 10 مل Erlenmeyer مملوء ب PBS على لوحة التسخين.
      3. خذ حاوية ضحلة بحجم 170 × 110 × 70 مم ، أو ما شابه ذلك ، واملأ الحاوية ب 1 لتر من 37 درجة مئوية PBS.
      4. ضع قارب وزن (85 × 85 × 25 مم) في طبق بتري بقطر 90 مم. ضع طبق بتري وقارب الوزن في قاع الحاوية وتأكد من غمرهما بالكامل.
    2. إخراج محتوى البيض من قشر البيض
      1. قبل ساعتين من التجربة ، خذ بيضة محتضنة عمرها 8 أيام وقم بتدوير البيضة 180 درجة داخل الحاضنة بحيث يكون الجزء العلوي من البيضة مواجها نحو الأسفل. بعد 1 ساعة ، قم بتدوير البويضة مرة أخرى إلى موضعها الأصلي واتركها لمدة 1 ساعة أخرى.
        ملاحظة: تدوير البيضة قبل 2 ساعة من التجربة سيجعل من السهل إخراج محتوى البيض من القشرة.
      2. خذ بيضة محتضنة عمرها 8 أيام من الحاضنة.
      3. امسك البيضة أفقيا واستخدم الجزء الخلفي المدبب للملقط الكبير (الشكل 1E) لعمل مسافة بادئة صغيرة أسفل البيضة. استمر في عمل مسافات بادئة صغيرة بنمط حلقة 360 درجة حول قشر البيض. استخدم تباعد ~ 10 مم بين المسافات البادئة.
        ملاحظة: خلال هذا الإجراء ، يمكن أن تبدأ الشقوق الصغيرة في التكون بين المسافات البادئة.
      4. بعد إنشاء المسافات البادئة الصغيرة في جميع أنحاء الغلاف ، قم بعمل ثقب أكبر عن طريق تكسير القشرة بين اثنين من المسافات البادئة الصغيرة باستخدام الجزء الخلفي المدبب من الملقط الكبير.
      5. اغمر البيضة تماما في برنامج تلفزيوني 37 درجة مئوية واحتفظ بها مغمورة لمدة 5 دقائق. بعد 5 دقائق ، احتفظ بالبيضة بالقرب من قارب الوزن داخل الحاوية. ضع الجزء العلوي من كلا الإبهام في الفتحة الكبيرة وافتح البيضة برفق. سوف تتشقق البيضة على طول المسافات البادئة الصغيرة.
      6. عندما يتشكل الكراك على طول الطريق حول قشر البيض ، حاول برفق فصل قطعتي قشر البيض عن بعضهما البعض واستمر في تحريك القطعتين برفق ذهابا وإيابا حتى يتم فصل محتوى البيض عن القشرة. ثم قم بإسقاط محتوى البيض برفق في قارب الوزن.
        ملاحظة: عن طريق تحريك قطعتين من قشر البيض ذهابا وإيابا ، سوف يتدفق المزيد من برنامج تلفزيوني إلى قشر البيض ، مما سيساعد في فصل محتوى البيض عن القشرة. في بعض الأحيان ، يلتصق القليل من بياض البيض بداخل قشر البيض. عندما يحدث هذا ، استخدم الملقط لفصل بياض البيض عن القشرة.
      7. ارفع ببطء طبق بتري الذي يحتوي على قارب الوزن ومحتوى البيض من برنامج تلفزيوني. عند الخروج من PBS ، قم بإمالة قارب الوزن قليلا لإزالة PBS الزائد.
      8. ضع وعاء الوزن الذي يحتوي على محتوى البيض في حامل قارب الوزن المعدني وانتقل إلى الإعداد التجريبي المطلوب.

2. التطبيقات المختارة

  1. حقن الفقاعات الدقيقة و / أو المحاليل الأخرى في أوعية CAM
    1. تحضير إعداد الحقن
      1. اسحب الإبر الزجاجية من الأنابيب الشعرية الزجاجية باستخدام صياغة صغيرة (الشكل 3 أ) أو اشتر إبر شعرية زجاجية مسحوبة.
      2. في حالة عدم مشطوف طرف الإبرة الشعرية الزجاجية ، قم بقطع جزء صغير من طرف الإبرة. املأ الإبرة الزجاجية بالزيت المعدني وضعها في نظام الحقن الدقيق. تأكد من عدم وجود فقاعات هواء في الزيت المعدني في الإبرة الزجاجية.
        ملاحظة: يضاف الزيت المعدني وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لنظام الحقن الذي استخدمناه.
      3. أفرغ الإبرة الشعرية الزجاجية المسحوبة بقدر ما يسمح به نظام الحقن الدقيق وأعد ملء الإبرة الزجاجية جزئيا بالهواء.
        ملاحظة: سيمنع جزء الهواء الصغير خليط الزيت المعدني والمحلول المراد حقنه.
      4. ضع 10 ميكرولتر من المحلول المطلوب ، في هذا البروتوكول microbubbles ، على قطعة من فيلم شمعي (الشكل 3B). إذا كانت هناك حاجة إلى أكثر من حل واحد ، يمكن خلط المحاليل قبل السحب7.
        ملاحظة: قبل ملء الإبرة بالفقاعات الدقيقة ، اترك قطرة الفقاعة الدقيقة على الفيلم الشمعي لمدة ~ 1 دقيقة حتى تطفو الفقاعات الدقيقة إلى أعلى القطرة وتركز. بالنسبة لعامل التباين بالموجات فوق الصوتية من النوع F28 ، ستزيد خطوة التركيز هذه من تركيز الفقاعات الدقيقة المراد حقنها بنسبة ~ 30٪. سيكون تركيز ما بعد الحقن في دم جنين الدجاج بين 32 × 10 3 فقاعات دقيقة / ميكرولتر للأجنة البالغة من العمر 5 أيام و 19 × 103 فقاعات دقيقة / ميكرولتر للأجنة البالغة من العمر 6 أيام.
      5. املأ الإبرة الزجاجية بالفقاعة الدقيقة و / أو أي محلول آخر عن طريق وضع طرف الإبرة الزجاجية في القطرة الموجودة على الفيلم الشمعي. عند شفط الفقاعات الدقيقة ، تأكد من وضع طرف الإبرة في الجزء العلوي من قطرة السائل لشفط المحلول المخصب بالفقاعات الدقيقة.
        ملاحظة: قبل حقن الفقاعات الدقيقة ، ارفع طرف الإبرة الزجاجية إلى أعلى نقطة لها وانتظر ~ 2 دقيقة. سيضمن ذلك تركيز الفقاعات الدقيقة في طرف الإبرة الزجاجية.
  2. الحقن في أوعية CAM
    1. قبل الحقن ، انظر إلى CAM تحت مجهر ستيريو واختر أفضل وعاء للحقن. حقن دائما في أحد عروق الجنين. هذه هي الأوعية التي يتحرك فيها تدفق الدم نحو الجنين. الأوردة أفتح في اللون من الشرايين بسبب الدم المؤكسج29. بالإضافة إلى ذلك ، تكون الأوردة دائما أعلى الشريان مع استثناءين هما الأوردة الأمامية والخلفية (أي الأوردة الأقل تشعبا ، المشار إليها بالعلامات النجمية في الشكل 6 أ ، ب) التي لا تحتوي على شريان في محيطها.
      ملاحظة: الحقن في أحد الفروع سيحد من انسداد تدفق الدم أثناء الحقن. تمت الإشارة إلى مواقع الحقن الجيدة برؤوس الأسهم في الشكل 6 أ ، ب. من الضروري الحقن في الوريد ، لأن هذا سيجبر المادة المحقونة على التدفق نحو الجنين. إلى جانب ذلك ، سيؤدي الحقن في الشريان إلى نزيف حاد عند إزالة الإبرة الزجاجية التي ستقتل الجنين.
    2. ضع الإبرة الزجاجية والجنين بحيث يكون طرف الإبرة الزجاجية والوريد المحدد في نفس المستوى البؤري وفي نفس خط الاتجاه. حاول وضع الإبرة أفقيا قدر الإمكان بالتوازي مع الوريد المحدد. يجب أن يلمس طرف الإبرة جدار الوعاء.
      ملاحظة: من خلال وضع الإبرة الزجاجية أفقيا قدر الإمكان ، تكون فرصة اختراق الوعاء بأكمله أقل.
    3. بعد تحديد المواقع ، تقدم ببطء واخترق جدار الوعاء بإبرة زجاجية. أثناء الاختراق ، سيتم أولا دفع CAM بعيدا عن طريق حركة الإبرة الزجاجية. استمر في تقدم الإبرة الزجاجية حتى يتم اختراق جدار الوعاء.
      ملاحظة: إذا تم ثقب الوعاء عن طريق الصدفة من خلاله وعبره ، فقم بسحب الإبرة ببطء للعودة إلى التجويف. عند العودة إلى داخل التجويف ، ارفع الإبرة قليلا لأعلى وتحرك للأمام على طول الوعاء لإعادة وضع الإبرة.
    4. بعد الاختراق ، اسحب الإبرة الزجاجية قليلا لوضع الطرف بشكل أفضل داخل تجويف الوعاء وحرك الإبرة الزجاجية جانبا للتحقق من عدم توصيلها بجدار الوعاء. قم بحقن كمية صغيرة من المحلول ببطء للتأكد من وضع الطرف داخل تجويف الوعاء (الشكل 3C).
    5. تأكد من أن المحلول المحقون يتبع تدفق الدم. إذا لم يحدث ذلك ، حرك الإبرة الزجاجية قليلا واستمر في حقن كميات صغيرة حتى يتم وضع الإبرة الزجاجية بشكل صحيح17.
    6. عندما يتم حقن الكمية المطلوبة ، اترك الإبرة الزجاجية في الوعاء لمدة ~ 15 ثانية لمنع حدوث نزيف حاد. بعد ذلك ، حرك الإبرة الزجاجية جانبا قليلا ، لأعلى ولأسفل ، وذهابا وإيابا عدة مرات للسماح بسحب الإبرة الزجاجية برفق.
      ملاحظة: بعض النزيف أمر طبيعي. لكل حقنة ، استخدم إبرة زجاجية جديدة لأن الإبرة الزجاجية تسد بسهولة وتنفجر من بياض البيض.
  3. التصوير المجهري للجنين و / أو أوعية الطب التكميلي والبديل
    1. تحضير حامل بغشاء صوتي
      1. خذ غرفة زراعة الخلايا التي تتكون من حامل بلاستيكي مربع مع أغشية متوازية من البولي كربونات بسمك 50 ميكرومتر26 ، يشار إليها أيضا باسم الحامل مع الغشاء الصوتي. أغلق كلا المنفذين بغطاء.
      2. استخدم مشرطا لإزالة أحد الغشاءين من الحامل بغشاء صوتي.
        ملاحظة: لإزالة الغشاء ، قم بقطع الغشاء بجوار خط الغراء على البلاستيك. احرص على عدم الانزلاق من الحافة لمنع تلف الغشاء الآخر.
      3. تحضير ~ 15 مل من 2٪ أغاروز في محلول ماء ديمي عن طريق التسخين إلى ما بين 80-95 درجة مئوية في دورق زجاجي صغير. قم بتبريد الكأس الزجاجية بمحلول الأغاروز المذاب تحت صنبور الماء البارد الجاري.
        ملاحظة: إذا كان الأغاروز ساخنا جدا ، فسوف يذوب الغشاء الصوتي مما يخلق سطحا غير مستو.
      4. عندما يبرد المحلول إلى حوالي 37 درجة مئوية ، صب المحلول ببطء في الحامل بغشاء صوتي حتى يملأ الحامل بالكامل. قم بإمالة الحامل قليلا بغشاء صوتي بحيث يتم توزيع طبقة الأغاروز بالتساوي داخل الإطار البلاستيكي (الشكل 4 أ). تأكد من أن طبقة الأغاروز مسطحة واترك الأغاروز في درجة حرارة الغرفة.
    2. إزالة الجنين والطب التكميلي والبديل من كيس الصفار ووضعه على الحامل بغشاء صوتي
      1. أخرج محتوى البيض من البويضة كما هو موضح في القسم 1.2 أو 1.3 أو 1.4.
      2. إذا لزم الأمر ، قم بحقن CAM بفقاعات دقيقة و / أو محلول (حلول) أخرى كما هو موضح في القسم 2.1.2.
      3. املأ طبق بتري سعة 1 لتر ب ~ 500 مل من 37 درجة مئوية PBS وضع الحامل بغشاء صوتي مع أغاروز في قاع الطبق. تأكد من أن طبقة الأغاروز متجهة لأعلى.
      4. استخدم مقصا صغيرا لقطع غشاء كيس الصفار بسرعة ، ويسمى أيضا غشاء Vitellus ، حول CAM بأكمله أثناء وجود محتوى البيض في قارب الوزن (الشكل 4 ب). حافظ على المقص في نفس الموضع وقم بتدوير قارب الوزن أثناء القطع للحصول على دقة أفضل وسرعة أكبر.
        ملاحظة: من لحظة إجراء القطع الأول ، سيبدأ صفار البيض في التسرب. هذا يقلل من رؤية الجنين و CAM. حاول قطع كل الطريق حول CAM في غضون 6-7 قطع. هذا لا ينبغي أن يستغرق وقتا أطول من 20 ثانية. يمكن استخدام الملقط الصغير (الشكل 1F) لتثبيت حافة غشاء vitelline ومنع القطع في CAM.
      5. استخدم ملعقة كبيرة لسحب الغشاء المقطوع الذي يحتوي على الجنين والطب التكميلي والبديل من قارب الوزن. ارفع الملعقة ببطء من قارب الوزن وافحص بصريا ما إذا كان الغشاء المقطوع الذي يحتوي على الجنين والطب التكميلي والبديل لا يزال متصلا بغشاء كيس الصفار المتبقي. عندما تكون هذه هي الحالة ، استخدم المقص لعمل قطع إضافي. أثناء التجريف ، قم بإمالة الملعقة قليلا للتخلص من أكبر قدر ممكن من صفار البيض ولكن لا تدعه يجف. انقل الغشاء المقطوع الذي يحتوي على الجنين و CAM إلى طبق بتري سعة 1 لتر ، ثم اغمسه في برنامج تلفزيوني 37 درجة مئوية ، وأزل الملعقة.
      6. عندما يتم غمر الغشاء الذي يحتوي على الجنين و CAM في برنامج تلفزيوني 37 درجة مئوية ، استخدم الملقط الصغير (الشكل 1F) للاستيلاء على حافة واحدة من الغشاء والدوران برفق حول الغشاء للتخلص من صفار البيض الذي لا يزال متصلا.
      7. عند إزالة كل صفار البيض ، استخدم الملقط الصغير لتحريك الغشاء الذي يحتوي على الجنين و CAM ووضعه فوق الحامل بغشاء صوتي.
      8. استخدم دبوس عينة حشرة واحد لتثبيت الغشاء الذي يحتوي على الجنين و CAM في زاوية واحدة. تجنب ثقب الأوعية في CAM وقم فقط بتثبيت الغشاء.
      9. استخدم دبوس عينة حشرة ثان لتثبيت الغشاء الذي يحتوي على الجنين و CAM في الزاوية المقابلة قطريا.
      10. ارفع الحامل ببطء بالغشاء الصوتي الذي يحتوي على الجنين و CAM من 37 درجة مئوية PBS. قم بإمالة الحامل قليلا للتخلص من معظم برنامج تلفزيوني.
      11. استخدم الملقط الصغير (الشكل 1F) لتمديد وتوزيع الغشاء الذي يحتوي على الجنين و CAM بالتساوي على الحامل بغشاء صوتي وتثبيت بقية الغشاء. تأكد من أن الغشاء الذي يحتوي على الجنين والطب التكميلي والبديل ممتد قليلا للتأكد من أنه مسطح (الشكل 4 ج).
      12. ضع الحامل مع الغشاء الصوتي مع الغشاء المثبت الذي يحتوي على الجنين والطب التكميلي والبديل في إعداد الفحص المجهري الذي يتم الاحتفاظ به عند 37 درجة مئوية.
      13. ضع غطاء أو غشاء شفاف صوتيا وبصريا (اعتمادا على الهدف المنشود واستخدام الموجات فوق الصوتية أم لا) أعلى المنطقة محل الاهتمام على الجنين أو الطب التكميلي والبديل (الشكل 4D) للسماح بالتصور البصري.
  4. التصوير بالموجات فوق الصوتية لجنين الدجاج و / أو أوعية الطب التكميلي والبديل
    1. التصوير بالموجات فوق الصوتية من جانب جنين الدجاج والأوعية الطبية التكميلي والبديل
      1. أخرج محتوى البيض كما هو موضح في القسم 1.2 أو 1.3 أو 1.4. ومع ذلك ، لا تستخدم قارب وزن قياسي. بدلا من ذلك، استخدم قارب وزن مصنوع خصيصا بجدار واحد شفاف صوتيا.
        ملاحظة: تم ضبط قارب الوزن القياسي عن طريق قطع جانب واحد من وعاء الوزن واستبداله بنافذة من رقائق البوليستر التي تم لصقها معا باستخدام غراء الإيبوكسي.
      2. اغمر محول الطاقة بالموجات فوق الصوتية المفضل في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية وضعه في المكان المطلوب مع مسافة المواجهة المطلوبة.
      3. ضع قارب الوزن في حمام مائي بحيث يواجه الجدار الشفاف محول الطاقة. تأكد من أن قارب الوزن عميق بما يكفي ليكون مستويا مع محول الطاقة ولكن تجنب دخول الماء إلى قارب الوزن (الشكل 5 أ).
      4. إذا رغبت في ذلك ، أضف إعدادا آخر إلى الجزء العلوي من الجنين أو أوعية الطب التكميلي والبديل ، مثل المجهر أو الليزر (الشكل 5 أ).
    2. التصوير بالموجات فوق الصوتية من أعلى الجنين والأوعية الطبية التكميلي والبديل دون تدخل صوتي
      1. املأ كوب دورق سعة 2 لتر ب 37 درجة مئوية PBS. ضع كوب دورق سعة 500 مل رأسا على عقب في الجزء السفلي من كأس زجاجية سعة 2 لتر. تجنب الهواء داخل كوب الدورق سعة 500 مل.
        ملاحظة: يهدف زجاج الدورق سعة 500 مل إلى رفع قارب الوزن الذي يحتوي على محتوى البيض بالقرب من سطح PBS. باستبدال الكأس الزجاجية بأجسام ذات أحجام أخرى، يمكن أن تتنوع المسافة بين محول الطاقة ومحتوى البيضة.
      2. ضع كوب الدورق المملوء سعة 2 لتر مع كوب الدورق سعة 500 مل بالداخل في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية.
      3. أخرج محتوى البيض كما هو موضح في القسم 1.2 أو 1.3 أو 1.4.
      4. بلل محتوى البيض بدرجة حرارة 37 درجة مئوية وقم بتغطية الجنين بغشاء شفاف. يمكن القيام بذلك للحفاظ على الجنين في نفس الوضع ومنعه من الدوران أو الطفو بعيدا.
        ملاحظة: عن طريق ترطيب محتوى البيض باستخدام PBS ، سيصبح أقل لزوجة مما يسهل تغطية محتوى البيض بغشاء شفاف.
      5. ضع وعاء الوزن مع محتوى البيض في طبق بتري بقطر 90 مم واغمر طبق بتري ببطء في برنامج تلفزيوني (الشكل 5 ب).
        ملاحظة: استخدام اثنين من المشابك على جانبي طبق بتري مقابل بعضها البعض يجعل من السهل غمر طبق بتري.
      6. ضع محول الطاقة بالموجات فوق الصوتية مع مسافة المواجهة المطلوبة.
    3. التصوير بالموجات فوق الصوتية لجنين الدجاج والأوعية CAM مع محول متحرك
      1. أخرج محتوى البيض كما هو موضح في القسم 1.2 أو 1.3 أو 1.4.
      2. تحضير محلول أغاروز 2٪ في ماء ديمي عن طريق تسخين المحلول حتى 80-95 درجة مئوية في دورق زجاجي صغير. قم بتبريد الدورق الزجاجي بمحلول الأغاروز المذاب تحت لسان الماء البارد الجاري.
      3. صب محلول الأغاروز في وعاء مسطح لإنشاء وسادة أغاروز بسمك حوالي 1 مم. عندما تبرد تماما وتوضع ، قم بقص وسادة الأغاروز إلى الحجم المطلوب باستخدام مشرط.
        ملاحظة: يمكن تغيير سمك وسادة الأغاروز للحصول على المسافة البؤرية المطلوبة اللازمة للتشغيل الصحيح لمحول الموجات فوق الصوتية.
      4. ضع وسادة الأغاروز فوق الجنين و CAM (الشكل 5C). أضف بضع قطرات من ~ 30 ميكرولتر من 37 °C PBS على الجزء العلوي من وسادة الأغاروز لإنشاء طبقة PBS رقيقة بين وسادة الأغاروز ومحول الطاقة.
        ملاحظة: سيؤدي استخدام PBS إلى منع محول الطاقة من الالتصاق بوسادة الأغاروز. يكون هذا مفيدا ، على سبيل المثال ، عند استخدام محرك لتحريك محول طاقة ثنائي الأبعاد ميكانيكيا لإجراء مسح ثلاثي الأبعاد (الشكل 9 ب)11. عندما لا يحتاج محول الطاقة إلى التحرك ، يمكن أيضا استبدال PBS بهلام الموجات فوق الصوتية.
      5. ضع محول الموجات فوق الصوتية المطلوب.

Representative Results

في هذا البروتوكول ، نصف ثلاث طرق لإخراج محتوى البيض من القشرة في اليوم 5-8 من الحضانة (HH 26-3522). يوضح الشكل 6 محتوى البيض في قوارب الوزن بعد إخراجها من القشرة. تم إخراج الجنين البالغ من العمر 5 أيام و CAM (الشكل 6 أ) باستخدام الطريقة الموضحة في القسم 1.2. تم إخراج الأجنة البالغة من العمر 6 و 7 أيام و CAM (الشكل 6B ، C) باستخدام الطريقة الموضحة في القسم 1.3. تم إخراج الجنين البالغ من العمر 8 أيام و CAM (الشكل 6D) باستخدام الطريقة الموضحة في القسم 1.4. لا يمكن ملاحظة أي نزيف أو تلف للجنين أو الطب التكميلي والبديل، مما يشير إلى أنه يمكن استخدام هذه الطرق لإخراج محتوى البويضة بأمان من القشرة دون الإضرار بالجنين أو أوعية الطب التكميلي والبديل. عند تنفيذها بشكل صحيح ، فإن طريقة الأجنة البالغة من العمر 5 أيام ستوفر جنينا قابلا للحياة و CAM سليمة في 90٪ من جميع الإجراءات. يعتمد معدل الصلاحية على العدد الإجمالي للبيض المخصب المستخرج بنجاح من قشر البيض. مع الطريقة الثانية ، بالنسبة للبيض المحتضن لمدة 6 و 7 أيام ، تكون فرصة وجود جنين قابل للحياة و CAM سليم حوالي 75٪ لعمر 6 أيام وحوالي 50٪ لعمر 7 أيام. مع الطريقة الثالثة الموصوفة للأجنة البالغة من العمر 8 أيام ، تبلغ فرصة وجود جنين قابل للحياة و CAM سليم حوالي 60٪. يمكن ملاحظة الاختلافات في مراحل النمو بين الأجنة البالغة من العمر 5 و 8 أيام والتي تتفق مع هامبرغر وهاملتون22. يزداد كل من حجم الجنين وتعقيد أوعية الطب التكميلي والبديل أثناء التطور (الشكل 6A-D). يوضح الشكل 6C رقعة رقيقة من الأغاروز أعلى محتوى البويضة تسمح بتصوير الجنين والطب التكميلي والبديل باستخدام إعداد الموجات فوق الصوتية الموضح في الشكل 5C. بعد إخراج محتوى البويضة من القشرة ، يمكن رؤية نبضات الجنين بالعين المجردة. معدل ضربات القلب لهذه الأجنة السابقة للبيض مشابه لأجنة البويضات عند 183 نبضة في الدقيقة (نبضة في الدقيقة) في اليوم 5 حتى ~ 208 نبضة في الدقيقة في اليوم 830. عندما يبقى مرطبا وعند 37 درجة مئوية ، سيحافظ الجنين على معدل ضربات القلب هذا لمدة ~ 5 ساعات في إعدادات الموجات فوق الصوتية التجريبية.

يمكن أن تحدث مضاعفات متعددة خلال الطرق الثلاث الموصوفة سابقا. يوضح الشكل 7 أ الهواء المحبوس تحت الطب التكميلي والبديل مما يجعل الجنين غير مناسب للتصوير بالموجات فوق الصوتية ويمكن أن يؤدي ضغط فقاعة (فقاعات) الهواء أيضا إلى إتلاف الجنين و / أو CAM. تنشأ هذه المشكلة عندما لا يتلامس كيس الهواء داخل القشرة مع الهواء خارج القشرة عند إخراج محتوى البيض من القشرة. يوضح الشكل 7B تسربا صغيرا للصفار من كيس الصفار في أعلى يمين الصورة. يمكن أن يحدث هذا أثناء إخراج محتوى البيض من القشرة عندما يتلف كيس الصفار بسبب الحواف الحادة للقشرة أو عندما يتم اختراق كيس الصفار بواسطة الملقط. يمكن أن يؤثر تسرب صفار البيض على رؤية الجنين والأوعية الطبية البديلة. يوضح الشكل 7C جنينا تحتجز فيه فقاعة هواء تحت CAM. يحدث هذا في بعض الأحيان في التطور الجنيني. المضاعفات الأخرى التي يمكن أن تحدث هي تلف الأوعية. يمكن أن يحدث هذا الضرر أثناء إخراج محتوى البيض من القشرة أو عند إجراء الحقن (الشكل 7 د). إلى جانب ذلك ، يمكن أن يجف الجنين والأوعية أيضا بمرور الوقت (الشكل 7 ه). يحدث هذا عندما لا يتم رش محتوى البيض مع برنامج تلفزيوني. يمكن أن يؤدي جفاف الجنين إلى عوائق شعرية هائلة (الشكل 7F) مما يؤثر على صلاحية الجنين. يمكن أن تحدث العوائق الشعرية الضخمة أيضا أثناء النمو أو عندما تكون نبضات قلب الجنين غير مستقرة.

بعد إخراج محتوى البويضة من القشرة دون أي مضاعفات ، يمكن حقن الجنين ، على سبيل المثال ، بعوامل تباين الموجات فوق الصوتية مثل الفقاعات الدقيقة (الشكل 3C). يوضح الشكل 8 الفقاعات الدقيقة المنتشرة في تجويف الوعاء الدموي عند الحقن. يتم حمل هذه الفقاعات الدقيقة مع تدفق الدم وتبقى موجودة في الدورة الدموية لعدة ساعات (فيديو تكميلي 1). وجود هذه الفقاعات الدقيقة في الدورة الدموية يخلق إمكانية لإجراء أنواع مختلفة من CEUS وتجارب توصيل الدواء7،11،12. يعد CAM مثاليا للتحقيق في طرق الكشف عن التباين بالموجات فوق الصوتية الجديدة التي نعرض لها ثلاثة أمثلة. يوضح الشكل 9A التصوير دون التوافقي بالموجات فوق الصوتية عالي التردد لجنين دجاج يبلغ من العمر 6 أيام في B-Mode و CEUS قبل وبعد حقن الفقاعات الدقيقة. هنا ، تم حقن أوعية CAM ب 5 ميكرولتر من عامل التباين بالموجات فوق الصوتية وتم إجراء التصوير باستخدام جهاز الموجات فوق الصوتية للحيوانات قبل السريرية مع مسبار MS250 (إرسال 30 ميجاهرتز وتردد استقبال 15 ميجاهرتز ، طاقة 10٪). قبل حقن الفقاعات الدقيقة ، يمكن بالفعل رؤية التباين داخل القلب الجنيني في صور B-Mode (الشكل 9A-I). ترجع هذه الظاهرة إلى وجود نواة في خلايا الدم الحمراء للطيور مما يزيد من تباين الدم في التصوير بالموجات فوق الصوتية 5,31. أدت إضافة الفقاعات الدقيقة إلى زيادة تباين الجنين ورؤيته ، سواء في التصوير B-Mode أو CEUS. يوضح الشكل 9B صورة دون توافقية بصرية وعالية التردد ثلاثية الأبعاد لجنين عمره 6 أيام والأوعية المحيطة. تم حقن CAM ب 5 ميكرولتر من عامل التباين بالموجات فوق الصوتية وتم إجراء التصوير باستخدام جهاز الموجات فوق الصوتية للحيوانات قبل السريرية مع مسبار MS550s (تردد الإرسال 40 ميجاهرتز ، ذروة الضغط السلبي ~ 300 كيلو باسكال). تظهر هذه النتائج أنه يمكن أيضا استخدام تصوير CEUS جنبا إلى جنب مع عامل التباين لإنشاء صور دون توافقية 3D عالية التردد ولتصوير الأوعية الدموية خارج الجنين. يوضح الشكل 9C صورة بصرية وصورة الموجات فوق الصوتية داخل الأوعية الدموية فائقة التوافق (IVUS) مصنوعة من مسبار مخصص للأوعية الدقيقة CAM لجنين عمره 6 أيام (إرسال 26 ميجاهرتز وتردد استقبال 39 و 65 ميجاهرتز). تم حقن أوعية CAM بعامل تباين الموجات فوق الصوتية 4 ± 1 ميكرولتر. الصورة البصرية وصورة IVUS من نفس الجنين ونفس المنطقة محل الاهتمام تظهر شبكات الأوعية المقابلة.

يمكن أيضا استخدام جنين الدجاج والأوعية الطبية التكميلي والبديل للتحقيق في توصيل الدواء بوساطة الموجات فوق الصوتية والذي نعرض مثالا واحدا عليه. نظرا لأن صفار البيض يعيق مسار الضوء أثناء التصوير ، فإن إزالة كيس الصفار ضروري للتحقيق بصريا في توصيل الدواء في أوعية الجنين و CAM. لهذه الدراسة ، تم تحضير الجنين والطب التكميلي والبديل للتصوير المجهري كما هو موضح في القسم 2.2 عن طريق فصل الغشاء الذي يحتوي على الجنين و CAM من كيس الصفار (الشكل 4C). في هذه الأجنة ، يكون معدل ضربات القلب مستقرا حول 80 نبضة في الدقيقة وتبقى الأجنة على قيد الحياة لمدة تصل إلى 2 ساعة عند 37 درجة مئوية7. يوضح الشكل 10 دراسة توصيل الدواء بوساطة الموجات فوق الصوتية والفقاعات الدقيقة في الخلايا البطانية لأوعية الطب التكميلي والبديل. تم حقن الفقاعات الدقيقة المغلفة بالدهون ، والتي تستهدف جدار الوعاء باستخدام αvβ3-antibodies وملطخة بصبغة الفلورسنت DiI7 ، في أوعية CAM (الشكل 10A ، C). تم تلطيخ نوى الخلايا البطانية لأوعية CAM باستخدام Hoechst 33342 (الشكل 10B) وتم استخدام نموذج الدواء Propidium Iodide (PI) لتصور sonoporation7. تم حقن كل من هذه الأصباغ في وقت واحد مع microbubbles. عند العلاج بالموجات فوق الصوتية (1 ميجاهرتز ، 200 كيلو باسكال ذروة الضغط السلبي ، انفجار واحد من 1000 دورة) ، لوحظ امتصاص PI في النوى الأقرب إلى الفقاعات الدقيقة المستهدفة (الشكل 10D). هذا يدل على أن التذبذبات التي تسببها الموجات فوق الصوتية للفقاعات الدقيقة المستهدفة كانت قادرة على إنشاء مسام في غشاء الخلية البطانية.

Figure 1
الشكل 1. معدات تحضير الأجنة. (أ-ب) منظر علوي وجانبي لحامل البيض المعدني ومنظر علوي وجانبي (C-D) لحامل قارب الوزن المعدني. (E-F) ملاقط اللازمة لإخراج محتوى البيض من القشرة. مقياس في سم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2. إجراء إزالة الأجنة. أ: مسافة بادئة صغيرة أعلى البيضة، يشار إليها بالدائرة السوداء. (ب) مسافة بادئة صغيرة 2/3 أسفل البيضة، ويشار إليها بالدائرة السوداء. ج: سحب ~ 2 مل من بياض البيض. (د) فجوة محكمة الغلق على الجانب بشريط. ه: تكبير الفتحة الصغيرة الموجودة أعلى البيضة. (و) يصبح الجنين مرئيا بعد إزالة جزء من القشرة. (G-H) بعد تدوير البويضة 180 درجة ، يطفو الجنين لأعلى ويصبح غير مرئي (تشير الأسهم إلى الاتجاه المتحرك للجنين). بعد 1-2 دقيقة ، يكون الجنين غير مرئي من الأسفل. (ط) بعد خدش الغشاء ، ينخفض محتوى البيض في قارب الوزن. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3. حقن الفقاعات الدقيقة في أوعية CAM. أ: إبرة الشعيرات الدموية الزجاجية. مقياس في سم. ( ب ) محلول بروبيديوم يوديد (PI) (قطرة يسرى) وفقاعات دقيقة (قطرة يمنية) قبل الشفط قبل الحقن. يمكن رؤية الإبرة (الموضحة باللون الأسود) في الزاوية اليمنى العليا (C) حقن الفقاعات الدقيقة. يتم وضع طرف الإبرة الشعرية داخل تجويف أحد الأوردة (يسار). يتم حقن الفقاعات الدقيقة ، السحابة البيضاء المشار إليها بسهم ، وتتشتت بعد مجرى الدم (يمين). يمثل شريط المقياس 1 مم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4. إزالة الجنين والطب التكميلي والبديل من كيس الصفار ووضعه على الحامل بغشاء صوتي. (أ) حامل بغشاء صوتي مملوء بطبقة الأغاروز. (ب) جنين الدجاج ووعاء CAM في قارب الوزن قبل التقطيع. يشير الخط المنقط إلى خط القطع حول CAM. (ج) جنين الدجاج والطب التكميلي والبديل ينفصلان عن صفار البيض ويثبتان على الغشاء الصوتي. (د ) مثبت جنين الدجاج بغشاء شفاف صوتيا وبصريا في حامل (أزرق) يوضع أعلى CAM. يمكن ملء الحامل بماء ديمي بحيث يمكن استخدام هدف غمس الماء. تمثل جميع أشرطة المقياس 1 سم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 5
الشكل 5. إعدادات مختلفة لجنين الدجاج والتصوير بالموجات فوق الصوتية CAM. (أ) الإعداد للتصوير بالموجات فوق الصوتية من الجانب. تم وضع جنين الدجاج في قارب وزن معدل حسب الطلب بجدار واحد شفاف صوتيا ووضعه في حمام مائي 37 درجة مئوية. تم وضع محول الموجات فوق الصوتية على الجانب الأيسر (أ) بجوار الجدار الشفاف صوتيا والليزر (ب) للتصوير الصوتي الضوئي في الأعلى. (ب) الإعداد للتصوير بالموجات فوق الصوتية من الأعلى. تم غمر الجنين والطب التكميلي والبديل في دورق من PBS تم وضعه في حمام مائي 37 درجة مئوية. يوضح المخطط المتقطع الكأس الزجاجية سعة 2 لتر (أ) والكأس الزجاجية سعة 500 مل (ب) بداخلها. (ج) الإعداد للتصوير بالموجات فوق الصوتية من الأعلى باستخدام محول طاقة متحرك. تم وضع وسادة أغاروز رقيقة (خط منقط) فوق الجنين بطبقة رقيقة من PBS كاقتران بين محول الطاقة وسطح الأغاروز. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 6
الشكل 6. محتوى البيض خارج القشرة. (أ) إخراج محتوى البيض من القشرة بعد 5 أيام من الحضانة. يشار إلى الغشاء المشيمي (CAM) ، وجسم الجنين (EB) ، والأوردة الزجاجية الأمامية والخلفية (*) ، والمواقع المناسبة للحقن (رؤوس الأسهم). (ب) محتوى البيض المأخوذ من القشرة بعد 6 أيام من الحضانة. يشار إلى الأوردة الزجاجية الأمامية والخلفية (*) والمواقع المناسبة للحقن (رؤوس الأسهم). (ج) إخراج محتوى البيض من القشرة بعد 7 أيام من الحضانة. يتم وضع رقعة من الأغاروز في الأعلى للسماح بالتصوير بالموجات فوق الصوتية. يشار إلى زوايا رقعة agarose بدوائر سوداء. د: إخراج محتوى البيض من القشرة بعد 8 أيام من التحضين. تمثل جميع أشرطة المقياس 1 سم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 7
الشكل 7. المضاعفات التي يمكن أن تحدث أثناء الإجراءات مع جنين الدجاج ونموذج الطب التكميلي والبديل. (أ ) فقاعات الهواء المحبوسة تحت CAM عند إخراج محتوى البيض من القشرة باستخدام الطريقة 1.2 (جنين عمره 5 أيام) أو 1.3 (جنين عمره 6 إلى 7 أيام). (ب) تسرب صغير من صفار البيض يشار إليه بسهم في أعلى اليمين (جنين عمره 6 أيام). (ج) الهواء المحبوس تحت CAM ، المشار إليه بالدائرة السوداء المنقطة (الجنين البالغ من العمر 7 أيام). د: النزيف، المشار إليه بالأسهم السوداء (جنين عمره 5 أيام. ه: الجنين المجفف والطب التكميلي والبديل (الجنين البالغ من العمر 5 أيام). (و) عوائق شعرية ضخمة (جنين عمره 5 أيام). تمثل جميع أشرطة المقياس 1 سم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 8
الشكل 8. فقاعات دقيقة في الأوعية الدموية CAM. يشار إلى جدار الوعاء بخط منقط ويشار إلى الفقاعات الدقيقة المفردة بالأسهم. يمثل شريط المقياس 20 ميكرومتر. يمكن العثور على تسجيل الفحص المجهري المقابل في الفيديو التكميلي 1. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 9
الشكل 9. التصوير بالموجات فوق الصوتية المعززة بالتباين في أجنة الدجاج والأوعية الطبية البديلة. (أ) إسقاط أقصى كثافة للصور B-Mode (I ، III) والصور دون التوافقية في الوقت الفعلي (II ، IV) (آلة الموجات فوق الصوتية للحيوانات قبل السريرية مع مسبار MS250 ، إرسال 30 ميجاهرتز وتردد استقبال 15 ميجاهرتز ، طاقة 10٪) لجنين عمره 6 أيام مع رقعة من الأغاروز في الأعلى. تظهر الصور العلوية (I ، II) النتائج قبل وأسفل (III ، IV) بعد حقن عامل تباين الموجات فوق الصوتية 5 ميكرولتر. شريط مقياس يمثل 1 مم. تم تعديل هذه الصورة بإذن من Daeichin et al. 201511 (B) التصوير البصري (يسار) و 3D subharmonic (يمين) لجنين دجاج عمره 6 أيام مع رقعة من الأغاروز في الأعلى. تم حقن أوعية CAM بعامل تباين بالموجات فوق الصوتية 5 ميكرولتر وتم إجراء التصوير باستخدام مسبار عالي التردد (آلة الموجات فوق الصوتية للحيوانات قبل السريرية مع مسبار MS550s ، تردد الإرسال 40 ميجاهرتز ، ذروة الضغط السلبي ~ 300 كيلو باسكال ، المقدمة في وضع 3-D قبل السريرية لآلة الموجات فوق الصوتية الحيوانية). شريط المقياس يمثل 5 مم. تم تعديل هذه الصورة بإذن من Daeichin et al. 201511. (ج) الصورة البصرية (يسار) وإسقاط متوسط الشدة للموجات فوق الصوتية داخل الأوعية الدموية فائقة التوافق (IVUS) (يمين) للأوعية الدموية الدقيقة CAM لجنين عمره 6 أيام. تم حقن أوعية CAM بعامل تباين 4 ± 1 ميكرولتر. تم إجراء تصوير IVUS فائق التوافق باستخدام مسبار IVUS مخصص (تردد الإرسال 35 ميجاهرتز ، ذروة الضغط السلبي 600 كيلو باسكال). كلتا الصورتين مصنوعة من نفس الجنين والمنطقة محل الاهتمام. تشير الأسهم إلى الأوعية المقابلة في الصورتين. شريط مقياس يمثل 1 مم. تم تعديل هذه الصورة بإذن من Maresca et al. 201412. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. 

Figure 10
الشكل 10. توصيل الدواء إلى الخلايا البطانية الوعائية CAM في الجنين البالغ من العمر 6 أيام. (أ) صورة برايتفيلد لستة αvβ3 فقاعات دقيقة مستهدفة ، يشار إليها بسهام بيضاء ، تلتصق بجدار الوعاء قبل العلاج بالموجات فوق الصوتية. (ب) نوى الخلايا البطانية ملطخة بالفلورسنت قبل العلاج بالموجات فوق الصوتية. (ج) صورة فلورية للفقاعات الدقيقة المستهدفة الملطخة ، المشار إليها بأسهم بيضاء ، قبل العلاج بالموجات فوق الصوتية. (د) امتصاص يوديد البروبيديوم النموذجي للدواء (PI) في نوى الخلية تحت الفقاعات الدقيقة المستهدفة بعد العلاج بالموجات فوق الصوتية (1 ميجاهرتز ، 200 كيلو باسكال ذروة الضغط السلبي ، دفعة واحدة من 1000 دورة). يمثل شريط المقياس 10 ميكرومتر وينطبق على جميع الصور. تم تعديل هذه الصورة بإذن من Skachkov et al. 20147. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الملفات التكميلية

فيديو تكميلي 1. فقاعات دقيقة في الأوعية الدموية CAM. يمثل شريط المقياس 20 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.

Discussion

يصف هذا البروتوكول ثلاث طرق حول كيفية الحصول على أجنة الدجاج التي يبلغ عمرها من 5 إلى 8 أيام واستخدامها والطب التكميلي والبديل كنموذج في الجسم الحي لدراسة التصوير بالموجات فوق الصوتية المعزز بالتباين وتوصيل الأدوية بوساطة الفقاعات الدقيقة. الخطوات الأكثر أهمية لإخراج الأجنة التي يبلغ عمرها 5 أيام (القسم 1.2) ومن 6 إلى 7 أيام (القسم 1.3) من القشرة هي: 1) جعل الثقب الصغير في الجزء العلوي من البيضة يمر عبر قشر البيض بأكمله إلى كيس الهواء قبل سحب بياض البيض ؛ 2) إنشاء حواف ناعمة للفتحة الكبيرة في القشرة. بالنسبة لطريقة إخراج الأجنة البالغة من العمر 8 أيام من القشرة (القسم 1.4) ، فإن أهم الخطوات هي: 1) اصنع عددا كافيا من المسافات البادئة لإنشاء صدع لطيف على طول البويضة ؛ 2) الحفاظ على البيض مغمورة في برنامج تلفزيوني. لضمان صلاحية الجنين لجميع الطرق ، من المهم الحفاظ على البويضة ومحتوياتها عند 37 درجة مئوية. بالإضافة إلى ذلك، تجنب الحقن في شريان الطب التكميلي والبديل. يوصى بمراقبة معدل ضربات قلب الجنين بصريا أثناء الدراسات لضمان حيوية الجنين. لتأكيد مرحلة النمو الدقيقة للجنين ، يمكن استخدام إشارة Hamburger & Hamilton22.

من المهم منع تلف الجنين ، CAM ، وكيس صفار البيض. يمكن أن يؤثر هذا الضرر على صلاحية الجنين و CAM وتدفق الدم ورؤيتهما. بالإضافة إلى ذلك ، فإن تلف كيس الصفار وبالتالي انخفاض صلابة الغشاء يجعل الحقن في أوعية CAM مستحيلا. يحتوي الجنين البالغ من العمر 5 أيام على كيس هوائي صغير نسبيا حتى يتمكن من إحداث ثقب كبير بما فيه الكفاية في القشرة يمكن من خلاله إزالة محتوى البيض ، يجب سحب 2 مل من بياض البيض. نتيجة لذلك ، يتم إنشاء مساحة أكبر بين قشر البيض والجنين. بعد سحب بياض البيض ، تحتاج قطعة من الشريط إلى إغلاق الفتحة التي دخلت فيها الإبرة. إذا استمر تسرب بياض البيض ، ضع قطعة أخرى من الشريط. بجانب ذلك ، يؤدي تطبيق الشريط اللاصق على الفتحة الموجودة على الجانب إلى حدوث فراغ داخل البيضة مما يمنع محتوى البيض من السقوط بسبب وزنه عند إنشاء الثقب الكبير في الخطوة 1.2.2.8. يمكن أن يحدث تلف الجنين أو الطب التكميلي والبديل أيضا عندما تكون حافة قشر البيض حادة جدا أو عندما يتم إسقاط محتوى البيض في قارب الوزن بشكل صارم للغاية، لذلك يجب إبقاء قشر البيض قريبا جدا من قارب الوزن. بين اليوم 5 و 6 من التطوير ، يبدأ CAM في الالتصاق بغشاء القشرة32. يزيد هذا المرفق من خطر إتلاف الجنين والطب التكميلي والبديل عند إخراج محتوى البيض من قشر البيض. عن طريق فتح البويضة بعد حقن PBS فيها لبيضة محتضنة لمدة 6 إلى 7 أيام أو في حاوية مملوءة ب PBS كما هو موضح للبيضة المحتضنة لمدة 8 أيام ، يتم تقليل خطر التلف. فيما يتعلق بالحقن في الوريد CAM: إذا فشلت الحقنة الأولى ، يمكن إجراء حقنة ثانية في اتجاه المنبع في نفس الوريد إذا كان الضرر طفيفا أو في وريد CAM آخر. إن فصل الجنين والطب التكميلي والبديل عن صفار البيض يجعل الجنين وأوعية الطب التكميلي والبديل شفافة بصريا. نتيجة لذلك ، يفقد الجنين مصدره الأساسي للمغذيات33. يمكن أن يكون هذا الفقدان للعناصر الغذائية تفسيرا لانخفاض معدل ضربات القلب الملحوظ البالغ 80 نبضة في الدقيقة مقارنة ب ~ 190 للجنين البالغ من العمر 6 أيام والذي لا يزال على اتصال مع صفارالبيض 30 وانخفاض وقت البقاء على قيد الحياة لمدة 2 ساعة بعد إجراء الفصل هذا. هناك عامل آخر يمكن أن يلعب دورا في انخفاض معدل ضربات القلب ووقت البقاء على قيد الحياة وهو التحدي المتمثل في الحفاظ على الجنين المنفصل عن الصفار والأوعية الطبية التكميلي والبديل عند 37 درجة مئوية. قد تكون حاضنة مرحلة المجهر مفيدة. بالإضافة إلى ذلك ، من المحتمل أن يؤدي انفصال CAM عن صفار البيض إلى تغييرات ميكانيكية في الأنسجة لأن توتر الغشاء يصبح أقل. قد يتسبب توتر الغشاء المنخفض في زيادة معدل قص الأوعية الداخلية مما يؤدي إلى انخفاض معدل ضربات القلب.

لدى جنين الدجاج خارج البويضة والأوعية الطبية التكميلي والبديل بعض القيود كما هو الحال في نموذج الجسم الحي ، بما في ذلك الملاحظات القصيرة الوقت فقط ، للتصوير بالموجات فوق الصوتية المعززة على النقيض ودراسات توصيل الأدوية بوساطة الفقاعات الدقيقة. نظرا لحجم الدم الصغير البالغ 100±23 ميكرولتر في اليوم 5 و 171±23 ميكرولتر في اليوم 634 ، يمكن حقن حجم أقصى يبلغ ~ 5 ميكرولتر. في المراحل اللاحقة من التطور (اليوم 7 وما فوق) ، يزداد تصلب الوعاء وتقل مرونة صفار البيض. هذا يمكن أن يعقد الحقن الناجح في الأجنة الأكبر سنا. بمجرد حقن الفقاعات الدقيقة ، فإنها تدور لساعات لأن جنين الدجاج ليس لديه نظام مناعي متطور بالكامل في هذه المرحلة35. لذلك ، لا يتم مسح الفقاعات الدقيقة في غضون ~ 6 دقائق كما هو الحال في البشر 36,37 مما يجعل دراسات التصوير الجزيئي بالموجات فوق الصوتية النموذجية مع فترة انتظار 5-10 دقائق لإزالة الفقاعات الدقيقة المستهدفة غير المرتبطة38 غير مجدية. من أجل استهداف الفقاعات الدقيقة ، يجب استخدام روابط مناسبة قادرة على الارتباط بالخلايا البطانية للطيور مثل الموصوفة سابقا لعلامة تكوين الأوعية الدموية αvβ37. الجوانب الأخرى التي يجب مراعاتها لهذا النموذج هي الصعوبة المتزايدة لفصل الجنين والأوعية الطبية التكميلي والبديل عن صفار البيض في الأجنة الأكبر سنا (> 8 أيام) وانخفاض الهيماتوكريت ~ 20٪ 39 مقارنة بالبشر. قد يؤثر هذا الأخير على تذبذبات الفقاعات الدقيقة لأنه من المعروف أن تذبذبات الفقاعات الدقيقة تخمد في بيئة أكثر لزوجة40. الشرايين CAM أقل أكسجة من الأوردة CAM41,42. يجب أن يؤخذ هذا الاختلاف في الاعتبار عند دراسة التصوير الصوتي الضوئي لأكسجة الدم على سبيل المثال.

تسمح الطرق الموضحة هنا بإخراج محتوى البويضة من قشر البيض في يوم التصوير بالموجات فوق الصوتية أو دراسة توصيل الدواء ، عادة في اليوم 5 إلى 8 من الحضانة. هذا يختلف عن الطرق الحالية حيث يتم إخراج محتوى البيض من القشرة بعد حضانة لمدة 3 أيام ويتم تطويره بشكل أكبر كثقافة خارج البيض 18،20،21. المزايا هي معدل بقاء أعلى بنسبة 90٪ لمدة 5 أيام ، و 75٪ لمدة 6 أيام ، و 50٪ لمدة 7 أيام ، و 60٪ للبيض المحتضن لمدة 8 أيام مقارنة ب ~ 50٪ للأجنة البالغة من العمر 3 أيام المأخوذة من قشر البيض والمحتضنة خارج البويضة 1,18 تجنب المضادات الحيوية أثناء الثقافة 18 ، 20 وحاضنة معقمة كبيرة لثقافة Ex OVO. يكون بقاء الأجنة التي يتراوح عمرها من 6 إلى 8 أيام أقل لأن الطب التكميلي والبديل يبدأ في الالتصاق بالقشرة21 مما يترك غشاء الطب التكميلي والبديل أكثر عرضة للتمزق عند الاستخراج. يوصف أيضا انفصال الجنين مع CAM من صفار البيض مما يجعل الجنين و CAM شفافين بصريا.

من خلال وضع محتوى البويضة في إعدادات مختلفة ، يمكن استخدام جنين الدجاج و CAM للعديد من دراسات التصوير بالموجات فوق الصوتية ، مثل IVUS ، الصوتية الضوئية ، بدون أو مع عوامل تباين الموجات فوق الصوتية في 2D و 3D. يمكن أن يكون التركيز على تطوير مخططات جديدة للنبض بالموجات فوق الصوتية أو اختبار محولات طاقة جديدة. إلى جانب ذلك ، يمكن أيضا استخدام النموذج للتحقيق في عوامل التباين بالموجات فوق الصوتية الجديدة وسلوكها في الأوعية الدموية تحت التدفق. نظرا لأن آلية توصيل الدواء بوساطة الفقاعات الدقيقة لا تزال غير معروفة43 ، فإن استخدام نموذج CAM في الجسم الحي قد يساعد في توضيح الآلية من خلال دراسة سلوك الفقاعات الدقيقة فيما يتعلق بالاستجابة الخلوية. أخيرا ، أثبتت أوعية CAM أنها نظام مناسب للتحقيق في زرع ورم xenograft44. هذا يخلق إمكانية استخدام وعاء الطب التكميلي والبديل كنموذج للتحقيق في تصوير الورم باستخدام الموجات فوق الصوتية والتحقيق في تدفق الدم داخل الورم باستخدام CEUS. عادة ما يتم تطعيم الأورام على أوعية الطب التكميلي والبديل للأجنة البالغة من العمر 8 أو 9 أيام1،14،45 ، والتي يتم إخراج الجنين من قشر البيض في اليوم 3 من الحضانة وتطويرها خارج البيض. يمكن استخدام الطرق الموضحة في هذا البروتوكول لنمو الأجنة في البويضة حتى يوم تطعيم الورم.

يثق المؤلفون في أن هذه الورقة ستكون مفيدة للباحثين الذين يرغبون في استخدام أجنة الدجاج وغشاء المشيمية الألانتويك (CAM) كنموذج في الجسم الحي لتطبيقات عوامل التباين ودراسات التدفق.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من قبل العلوم التطبيقية والهندسية (TTW) (مشروع Vidi 17543) ، وهو جزء من NWO. يود المؤلفون أن يشكروا روبرت بورسكينز ، لوكسي وي ، ورضا باكدامان زانغاباد من قسم الهندسة الطبية الحيوية وميشيل مانتن وجيرت سبرينجيلينغ من قسم الأجهزة الطبية التجريبية على المساعدة الفنية ، وجميعهم من المركز الطبي بجامعة إيراسموس إم سي روتردام ، هولندا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Sigma-Aldrich A9539
Clamp (Kocher clamp)
Cling film
Holder with acoustic membrane (CLINIcell 25 cm2) MABIO, Tourcoing, France CLINIcell25-50-T FER 00106
Demi water
Disposable plastic Pasteur pipets VWR 612-1747
Eggs Drost Pluimveebedrijf Loenen BV, the Netherlands Freshly fertilized
Fridge 15 °C
Glass capillary needles Drummond 1-000-1000 Inside diameter: 0.0413 inch
Heating plate 37 °C
Humidified incubator 37 °C
Insect specimen pins
Metal egg holder Custom made by Experimental Medical Instrumentation at Erasmus MC. See figure 1 A,B
Metal weighing boat holder Custom made by Experimental Medical Instrumentation at Erasmus MC. See figure 1 C,D
Microinjection system FUJIFILM VisualSonics
Mineral oil Sigma-Aldrich M8410-100ML
Needle, 19 G VWR (TERUMO) 613-5392
Phosphate-bufferes saline (PBS), 1x ThermoFisher 10010023
Petri dish, 1 L Glass
Petri dish, 90 mm diameter VWR 391-0559
Preclinical animal ultrasound machine (Vevo 2100) FUJIFILM VisualSonics
Probe (MS250) FUJIFILM VisualSonics 30 MHz transmit and 15 MHz receive frequency
Probe (MS550s) FUJIFILM VisualSonics transmission frequency of 40 MHz
Scalpel VWR (SWANN-MORTON) 233-5363
Scissors, small Fine Science Tools (FST) 14558-09
Syringe, 5 mL VWR (TERUMO) 613-0973
Table spoon
Tape (Scotch Magic tape) Scotch
Tissue paper Tork
Tweezers large  VWR (USBECK Laborgeräte) 232-0107 See figure 1E
Tweezers small DUMONT Medical, Switzerland 0103-5/45 See figure 1F
Ultrasound contrast agent (custum made F-type) Produced as described by: Daeichin, V. et al. Microbubble Composition and Preparation for Imaging : In Vitro and In Vivo Evaluation. IEEE TRANSACTIONS ON ULTRASONICS. 64 (3), 555–567 (2017).
Ultrasound contrast agent (MicroMarker) FUJIFILM VisualSonics, Inc.
Ultrasound contrast agent (Definity) Lantheus medical imaging, United States
Ultrasound gel Aquasonic
Waxi film (Parafilm) Parafilm
Weighing boats (85 × 85 × 24 mm) VWR 611-0094

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Martowicz, A., Kern, J., Gunsilius, E., Untergasser, G. Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis. Journal of Visualized Experiments. (99), e1 (2015).
  2. Schmitz, M., Nelemans, B. K. A., Smit, T. H. A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos. Journal of Visualized Experiments. (118), e1 (2016).
  3. Brauer, R., Chen, P. Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs. Journal of Visualized Experiments. (97), e1 (2015).
  4. Oosterbaan, A. M., Ursem, N. T. C., Struijk, P. C., Bosch, J. G., van der Steen, A. F. W., Steegers, E. A. P. Doppler flow velocity waveforms in the embryonic chicken heart at developmental stages corresponding to 5-8 weeks of human gestation. Ultrasound in Obstetrics and Gynecology. 33 (6), 638-644 (2009).
  5. McQuinn, T. C., Bratoeva, M., DeAlmeida, A., Remond, M., Thompson, R. P., Sedmera, D. High-Frequency Ultrasonographic Imaging of Avian Cardiovascular Development. Developmental Dynamics. 236 (12), 3503-3513 (2007).
  6. Stieger, S. M., Caskey, C. F., Adamson, R. H., Curry, F. E., Wisner, E. R., Ferrara, K. W. Enhancement of Vascular Permeability with Low-Frequency Contrast-enhanced Ultrasound in the Chorioallantoic Membrane Model. Radiology. 243 (1), 112-121 (2007).
  7. Skachkov, I., Luan, Y., van der Steen, A. F. W., De Jong, N., Kooiman, K. Targeted microbubble mediated sonoporation of endothelial cells in vivo. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 61 (10), 1661-1667 (2014).
  8. Vargas, A., Zeisser-Labouèbe, M., Lange, N., Gurny, R., Delie, F. The chick embryo and its chorioallantoic membrane (CAM) for the in vivo evaluation of drug delivery systems. Advanced Drug Delivery Reviews. 59 (11), 1162-1176 (2007).
  9. Rytelewski, M., Buensuceso, A., Leong, H. S., Deroo, B. J., Chambers, A. F., Koropatnick, J. Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In vivo. Journal of Visualized Experiments. (96), e1 (2015).
  10. Schmitd, L. B., Liu, M., Scanlon, C. S., Banerjee, R., Silva, N. J. D. The Chick Chorioallantoic Membrane In vivo Model to Assess Perineural Invasion in Head and Neck Cancer. Journal of Visualized Experiments. (148), e1 (2019).
  11. Daeichin, V., Bosch, J. G., Needles, A., Foster, F. S., van der Steen, A., de Jong, N. Subharmonic, non-linear fundamental and ultraharmonic imaging of microbubble contrast at high frequencies. Ultrasound in Medicine and Biology. 41 (2), 486-497 (2015).
  12. Maresca, D., et al. Imaging microvasculature with contrast-enhanced ultraharmonic ultrasound. Ultrasound in Medicine and Biology. 40 (6), 1318-1328 (2014).
  13. Lindsey, B. D., et al. High Resolution Ultrasound Superharmonic Perfusion Imaging: In vivo Feasibility and Quantification of Dynamic Contrast-Enhanced Acoustic Angiography. Annals of Biomedical Engineering. 45 (4), 939-948 (2017).
  14. Paproski, R. J., Jovel, J., Wong, G. K. S., Lewis, J. D., Zemp, R. J. Enhanced detection of cancer biomarkers in blood-borne extracellular vesicles using nanodroplets and focused ultrasound. Cancer Research. 77 (1), 3-13 (2017).
  15. Huang, C., et al. Short Acquisition Time Super-Resolution Ultrasound Microvessel Imaging via Microbubble Separation. Scientific Reports. 10, 1-13 (2020).
  16. Lowerison, M. R., Huang, C., Kim, Y., Lucien, F., Chen, S., Song, P. In vivo Confocal Imaging of Fluorescently Labeled Microbubbles: Implications for Ultrasound Localization Microscopy. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 67 (9), 1811-1819 (2020).
  17. Faez, T., Skachkov, I., Versluis, M., Kooiman, K., de Jong, N. In vivo Characterization of Ultrasound Contrast Agents: Microbubble Spectroscopy in a Chicken Embryo. Ultrasound in Medicine and Biology. 38 (9), 1608-1617 (2012).
  18. Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications. Journal of Visualized Experiments. (44), e4 (2010).
  19. Kokhuis, T. J. A., et al. Intravital microscopy of localized stem cell delivery using microbubbles and acoustic radiation force. Biotechnology and Bioengineering. 112 (1), 220-227 (2015).
  20. Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development. Journal of Visualized Experiments. (95), e6 (2015).
  21. Dohle, D. S., et al. Chick ex ovo Culture and ex ovo CAM Assay: How it Really Works. Journal of Visualized Experiments. (33), e2 (2010).
  22. Hamburger, V., Hamilton, H. A Series Of Normal Stages In The Developent Of The Chick Embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 231-272 (1951).
  23. Ribatti, D. A morphometric study of the expansion of the chick vasculosa in shell-less culture. Journal of Anatomy. 186, 639-644 (1995).
  24. Ribatti, D., Nico, B., Vacca, A., Roncali, L., Burri, P. H., Djonov, V. Chorioallantoic Membrane Capillary Bed: A Useful Target for Studying Angiogenesis and Anti-Angiogenesis In vivo. Anatomical Record. 324, 317-324 (2001).
  25. DeFouw, D. O., Rizzo, V. J., Steinfeld, R., Feinberg, R. N. Mapping of the Microcirculation in the Chick Chorioallantoic Membrane during Normal Angiogenesis. Microvascular research. 38, 136-147 (1989).
  26. Beekers, I., van Rooij, T., van der Steen, A. F. W., de Jong, N., Verweij, M. D., Kooiman, K. Acoustic characterization of the CLINIcell for ultrasound contrast agent studies. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 66 (1), 244-246 (2019).
  27. Lang, E. R., Rha, C. Apparent shear viscosity of native egg white. Journal of Food Science and Technology. 17, 595-606 (1982).
  28. Daeichin, V., et al. Microbubble Composition and Preparation for Imaging: In Vitro and In vivo Evaluation. IEEE TRANSACTIONS ON ULTRASONICS. 64 (3), 555-567 (2017).
  29. Mcferrin, H. E., Olson, S. D., Gutschow, M. V., Semon, J. A., Sullivan, D. E., Prockop, D. J. Rapidly Self-Renewing Human Multipotent Marrow Stromal Cells (hMSC) Express Sialyl Lewis X and Actively Adhere to Arterial Endothelium in a Chick Embryo Model System. PLoS ONE. 9 (8), 1-11 (2014).
  30. Akiyama, R., Mitsubayashi, H., Tazawa, H., Burggren, W. W. Heart rate responses to altered ambient oxygen in early (days 3-9) chick embryos in the intact egg. Journal of Comparative Physiology - B Biochemical, Systemic, and Environmental Physiology. 169 (2), 85-92 (1999).
  31. Foster, F. S., Hossack, J., Adamson, S. L. Micro-ultrasound for preclinical imaging. Interface Focus. 1, 576-601 (2011).
  32. Gabrielli, M. G., Accili, D. The Chick Chorioallantoic Membrane: A Model of Molecular, Structural, and Functional Adaptation to Transepithelial Ion Transport and Barrier Function during Embryonic Development. Journal of Biomedicine and Biotechnology. , 1-12 (2010).
  33. van der Wagt, I., de Jong, I. C., Mitchell, M. A., Molenaar, R., van den Brand, H. A review on yolk sac utilization in poultry. Poultry Science. 99, 2162-2175 (2020).
  34. Kind, C. The development of the circulating blood volume of the chick embryo. Anatomy and Embryology. 147, 127-132 (1975).
  35. Ribatti, D. Chick Embryo Chorioallantoic Membrane as a Useful Tool to Study Angiogenesis. International Review of Cell and Molecular Biology. 270, 181-224 (2008).
  36. Schneider, M. Characteristics of SonoVue(TM). Echocardiography. 16 (7), 743-746 (1999).
  37. Kitzman, D. W., Goldman, M. E., Gillam, L. D., Cohen, J. L., Aurigemma, G. P., Gottdiener, J. S. Efficacy and Safety of the Novel Ultrasound Contrast Agent Perflutren (Definity) in Patients With Suboptimal Baseline Left Ventricular Echocardiographic Images. American Journal of Cardiology. 86, 669-674 (2000).
  38. Kosareva, A., Abou-Elkacem, L., Chowdhury, S., Lindner, J. R., Kaufmann, B. A. Seeing the Invisible-Ultrasound Molecular Imaging. Ultrasound in Medicine and Biology. 46 (3), 479-497 (2020).
  39. Al-Roubaie, S., Jahnsen, E. D., Mohammed, M., Henderson-Toth, C., Jones, E. A. V. Rheology of embryonic avian blood. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 301 (6), 2473-2481 (2011).
  40. Helfield, B., Chen, X., Qin, B., Villanueva, F. S. Individual lipid encapsulated microbubble radial oscillations: Effects of fluid viscosity. The Journal of the Acoustical Society of America. 139 (1), 204-214 (2016).
  41. Metcalfe, J., Stock, M. K. Oxygen exchange in the chorioallantoic membrane, avian homologue of the mammalian placenta. Placenta. 14, 605-613 (1993).
  42. Tazawa, H. Oxygen and CO2 exchange and acid-base regulation in the avian embryo. American Journal of Zoology. 20, 395-404 (1980).
  43. Kooiman, K., et al. Ultrasound-Responsive Cavitation Nuclei for Therapy and Drug Delivery. Ultrasound in Medicine and Biology. 46 (6), 1296-1325 (2020).
  44. Li, M., Pathak, R. R., Lopez-rivera, E., Friedman, S. L., Aguirre-ghiso, J. A., Sikora, A. G. The In ovo Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma. Journal of Visualized Experiments. (104), e1 (2015).
  45. Sys, G. M. L., et al. The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma. Journal of Visualized Experiments. (77), e1 (2013).

Tags

الهندسة الحيوية ، العدد 168 ، التصوير بالموجات فوق الصوتية ، التصوير بالموجات فوق الصوتية المعززة بالتباين ، الفقاعات الدقيقة ، توصيل الدواء ، جنين الدجاج السابق ، أوعية الغشاء المشيمي (CAM)
تحضير أجنة الدجاج ex ovo والأوعية الغشائية المشيمية كما هو الحال في نموذج الجسم الحي للتصوير بالموجات فوق الصوتية المعززة بالتباين ودراسات توصيل الأدوية بوساطة الفقاعات الدقيقة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Meijlink, B., Skachkov, I., van der… More

Meijlink, B., Skachkov, I., van der Steen, A. F. W., de Jong, N., Kooiman, K. The Preparation of Chicken Ex Ovo Embryos and Chorioallantoic Membrane Vessels as In Vivo Model for Contrast-Enhanced Ultrasound Imaging and Microbubble-Mediated Drug Delivery Studies. J. Vis. Exp. (168), e62076, doi:10.3791/62076 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter