Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Fremstilling af kylling ex ovo-embryoner og chorioallantoiske membrankar som in vivo-model til kontrastforstærket ultralydsbilleddannelse og mikroboblemedierede lægemiddelafgivelsesundersøgelser

Published: February 9, 2021 doi: 10.3791/62076
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,2, 1
1Department of Biomedical Engineering, Thoraxcenter, Erasmus MC University Medical Center Rotterdam, 2Laboratory of Acoustical Wavefield Imaging, Faculty of Applied Sciences, Delft University of Technology

Summary

Denne protokol beskriver tre metoder til, hvordan man opnår og bruger 5 til 8 dage gamle kyllingembryoner og deres chorioallantoiske membran (CAM) som en in vivo-model til at studere kontrastforstærket ultralydsbilleddannelse og mikroboblemedieret lægemiddelafgivelse.

Abstract

Kyllingembryoet og den blodkarrige chorioallantoiske membran (CAM) er en værdifuld in vivo-model til at undersøge biomedicinske processer, nye ultralydpulserende ordninger eller nye transducere til kontrastforbedret ultralydsbilleddannelse og mikroboblemedieret lægemiddelafgivelse. Årsagerne til dette er tilgængeligheden af CAM's embryo- og fartøjsnetværk samt de lave omkostninger ved modellen. Et vigtigt skridt for at få adgang til embryoet og CAM-karrene er at tage ægindholdet ud af æggeskallen. I denne protokol beskrives tre metoder til at tage indholdet ud af æggeskallen mellem dag 5 og 8 af inkubationen, således at embryonerne kan udvikle sig inde i æggeskallen indtil i dag. De beskrevne metoder kræver kun enkle værktøjer og udstyr og giver en højere overlevelsessuccesrate på 90% i 5-dages, 75% i 6-dages, 50% i 7-dages og 60% for 8-dages gamle inkuberede æg sammenlignet med ex ovo-dyrkede embryoner (~ 50%). Protokollen beskriver også, hvordan man injicerer kavitationskerner, såsom mikrobobler, i CAM-vaskulærsystemet, hvordan man adskiller membranen, der indeholder embryoet og CAM, fra resten af ægindholdet til optisk gennemsigtige undersøgelser, og hvordan man bruger kyllingembryoet og CAM i en række kortvarige ultralydsforsøg. In vivo kyllingembryo og CAM-modellen er yderst relevant for at undersøge nye billeddannelsesprotokoller, ultralydkontrastmidler og ultralydpulserende ordninger til kontrastforstærket ultralydsbilleddannelse og for at opklare mekanismerne for ultralydmedieret lægemiddelafgivelse.

Introduction

Ex ovo kyllingembryoner og den blodkarrige chorioallantoiske membran (CAM) har vist sig at være en passende model til at undersøge forskellige biologiske og biomedicinske processer som embryogenese, onkologi og lægemiddelafgivelse 1,2,3,4. Ultralyd er blevet brugt til billeddannelse af den embryonale hjerteudvikling4,5 og til aktivering af kavitationskerner ved injektion, såsom mikrobobler, til vaskulær lægemiddelafgivelse 6,7. Kyllingembryoner er billige, kræver mindre infrastruktur og udstyr og har mindre streng lovgivning sammenlignet med andre dyremodeller8. Kyllingeembryoet og CAM-karrene er let tilgængelige efter åbning af ægget, mens dette viser sig at være meget vanskeligere med pattedyrembryoner og kar. Udover dette giver kyllingembryoet og CAM-karrene et hjerteslag og en pulserende blodgennemstrømning. CAM viser ligheder i fartøjets anatomi med pattedyr og kan bruges til lægemiddelscreening 8,9,10. På grund af disse egenskaber har CAM-fartøjerne også vist sig at være en passende model til at undersøge kontrastforbedret ultralydsbilleddannelse (CEUS)11,12,13,14,15,16. Derudover kan modellen bruges til optisk at undersøge opførsel af ultralydskontrastmidler i et ultralydsfelt ved hjælp af et ultrahøjhastighedskamera og effekten af akustisk strålingskraft på fremdrivning, binding og ekstravasation af lægemidler 7,17,18,19. Selvom kyllingembryoet og CAM er mindre egnede til langsigtede eksperimenter, kan de være gavnlige for kortvarige in vivo-eksperimenter.

For at øge synligheden og kontrollerbarheden over kyllingembryoet og CAM under forsøg er det vigtigt at tage ægindholdet indeholdende embryoet og CAM ud af æggeskallen18. Tidligere kyllingembryoundersøgelser, der involverede ultralydskontrastmidler, brugte 5 til 6 dage gamle embryoner 7,11,12,17,19 og 14 til 18 dage gamle embryoner13,14,15,16. Flere tilgange er blevet beskrevet detaljeret for at tage ægindholdet ud af skallen 18,20,21. Men så vidt vi ved, fokuserer de tidligere offentliggjorte tilgange på at tage ægindholdet ud af æggeskallen efter 3 dages inkubation (dvs. Hamburger & Hamilton (HH) etape 19-2022) og fortsætte kulturen ex ovo. Denne ex ovo-kulturtilgang har flere ulemper, herunder øget risiko for dødsfald under dyrkning (~ 50%)1,18, brugen af antibiotika18,20 og nedsat total karlængde i forhold til i ovo-vækst 23. Da dyrkning af embryoet i æggeskallen giver det mest naturlige miljø, er det nemmest at inkubere embryoet i æggeskallen indtil forsøgsdagen. Af denne grund ville en tilgang, hvor ægindholdet tages ud af æggeskallen ved 5 til 8 dages inkubation, være gavnlig, især til forsøg på 5 til 8 dage gamle embryoner.

I denne protokol beskriver vi tre metoder til at tage ægindholdet ud af æggeskallen, når embryoet er på dag 5 til 8 i udviklingen (HH 26-3522), så embryoet kan udvikle sig i æggeskallen indtil forsøgsdagen. CAM-beholderstørrelsen varierer fra 10-15 μm i diameter, i de mindre kapillærer i et 8 dage gammelt embryo 24, til 115-136 μm i diameter i det større kar på 6 og 8 dage gamle embryoner24,25. De tre beskrevne metoder kræver kun grundlæggende laboratorieværktøjer og reducerer risikoen for komplikationer, før eksperimentet er begyndt, hvilket reducerer unødvendige omkostninger og arbejdskraft. Vi beskriver også en metode til at adskille membranen indeholdende embryoet og CAM fra æggeblommesækken, hvilket gør CAM optisk gennemsigtig til mikroskopiundersøgelser. Fordi membranen, der indeholder embryoet og CAM, kan fastgøres på for eksempel en holder med en akustisk membran, kan opsætningen også gøres akustisk gennemsigtig26, hvilket muliggør kombinationen af mikroskopi og ultralydsundersøgelser, når lysbanen vil blive påvirket af æggeblommen. Endelig beskriver vi flere andre ultralydsopsætninger, der kan bruges til ultralyd eller CEUS-billeddannelse.

Protocol

Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med den nederlandske lov om dyreforsøg og i overensstemmelse med Det Europæiske Råd (2010/63/EU) om beskyttelse af dyrs anvendelse til videnskabelige formål.

1 . Protokol for forberedelse af embryoner

  1. Inkubation af de befrugtede kyllingæg
    1. Opbevares friskbefrugtede kyllingæg ved 15 °C i op til en uge.
    2. For at inkubere de befrugtede æg skal du placere dem lodret med den spidse side nedad i en 37 ° C, befugtet inkubator. Det er ikke nødvendigt at dreje æggene under inkubation.
      BEMÆRK: Skriv startdatoen for inkubation af toppen af ægget ved hjælp af en permanent markør.
  2. Forberedelse af op til 5-dages (120 timer) gamle embryoner (HH trin 26-28)22
    1. Forberedelse af arbejdsområde
      1. Varm en varmeplade op til 37 °C.
      2. Anbring en metalægholder (figur 1A, B), en metalvejningsbådholder (figur 1C, D) og en 10 ml Erlenmeyer fyldt med PBS på varmepladen.
      3. Fyld en vejebåd (85 mm × 85 mm × 25 mm) med et 10 mm lag ultralydsgel, og læg den fyldte vejebåd i den forvarmede metalvejningsbådholder.
        BEMÆRK: Fyldning af vejebåden med ultralydsgel hæver embryoet og CAM. Dette kan være gavnligt for injektion eller billeddannelse af embryoet og CAM, men er ikke nødvendigt for at tage embryoet og CAM ud af æggeskallen.
      4. Forbered et par stykker tape (ca. 3 cm længde) med en del af den ene ende foldet tilbage på sig selv, så den ikke klæber længere.
    2. At tage ægindholdet ud af æggeskallen
      1. Tag et 5 dage gammelt inkuberet befrugtet æg og overfør det til den forvarmede metalægholder (figur 1A, B). Sørg for at holde ægget i samme retning (dvs. dato øverst).
        BEMÆRK: Det er vigtigt at holde ægget i samme retning for at holde luftsækken og embryoet og CAM i samme position i toppen af ægget.
      2. Brug den spidse bagside af en pincet (eller lignende; Figur 1E) at lave et lille indryk helt øverst på ægget (hvor datoen er skrevet) (figur 2A).
      3. Brug den spidse bagside af pincetten til at lave et andet indrykning på siden af ægget omkring 2/3 ned i ægget (figur 2B).
        BEMÆRK: Pas på ikke at gøre indrykningen for stor og skabe et hul. Hvis der ved et uheld oprettes et hul, forsegles hullet med tape og laver ikke et andet indrykning.
      4. Brug den større pincet (figur 1E) til at tage et lille stykke æggeskal ud af det indrykkede område oven på ægget (med skriftlig dato). Sørg for, at luftsækken i toppen af æggeskallen kommer i kontakt med luften uden for ægget, men trænger ikke for dybt ind i skallen.
        BEMÆRK: Hvis skallen trænger for dybt ind, når den øverste indrykning foretages, kan embryoet og CAM blive beskadiget, og embryoet overlever ikke fjernelsen fra skallen. Det er vigtigt, at det lille hul på toppen skaber luftkontakt mellem indersiden og ydersiden af ægget. Hvis dette ikke gøres, vil der blive skabt et vakuum i de næste trin i proceduren, hvilket vil resultere i, at store luftbobler bliver fanget under CAM, hvilket gør embryoet og CAM ubrugeligt. For at kontrollere placeringen af luftsækken inde i ægget kan en lyskilde bruges, da dens position ikke altid er nøjagtigt øverst og også kan være mere til siden.
      5. Brug en 5 ml sprøjte og 19 G nål til at trænge ind i skallen gennem det andet led på siden 2/3 ned i ægget og trække ~ 2 ml æggehvide (figur 2C).
        BEMÆRK: Sørg for, at nålen peger ned mod bunden af ægget for at forhindre risikoen for at beskadige embryoet og CAM. Dette trin skaber en større luftlomme i toppen af ægget, der er nødvendigt for at fjerne ægindholdet. Hvis der ved et uheld oprettes et hul i stedet for et indrykning i trin 1.2.2.3, skal du punktere båndet med nålen til tilbagetrækning af æggehviden. Forsegl punkteringen igen med et andet stykke tape.
      6. Tag nålen ud og brug tape til at forsegle hullet på siden (figur 2D).
        BEMÆRK: For at forhindre æggehvide i at lække ud af ægget, kan det øverste hul lukkes med en finger, før nålen tages ud. Hvis æggehvide bliver ved med at lække ud med båndet allerede på plads, skal du først fjerne æggehviden med et stykke væv for at sikre, at båndet klæber ordentligt.
      7. Tøm sprøjten ved at tilføje æggehviden til vejebåden.
      8. Brug den store pincet (figur 1E) til at forstørre den lille åbning på toppen af ægget (figur 2E). Når man ser inde i ægget gennem åbningen på toppen, er embryoet og CAM synlige. Bliv ved med at lokalisere embryoet og CAM, mens du fjerner så meget af æggeskallen som muligt (figur 2F).
        BEMÆRK: Fortsæt med at flytte ægget for at opretholde maksimal synlighed på embryoets og CAM's position inde i skallen. Sørg for, at kanten af åbningen i skallen ikke går lavere end CAM. Udover dette må du ikke trænge ind i den indre membran og forhindre skarpe kanter.
      9. Når du har skabt åbningen, skal du dreje ægget 180° og placere ægget tilbage i ægholderen på en sådan måde, at den oprettede åbning øverst på ægget nu vender mod bunden. Embryoet vil flyde op og blive usynligt fra bunden (figur 2G), hvilket tager 1-2 min. Sørg for, at hele embryoet og CAM (inklusive alle karrene) er forsvundet, og kun æggeblomme er synlig, før du fortsætter til næste trin (figur 2H).
        BEMÆRK: Hvis embryoet stadig er synligt fra bunden efter 2 min, skal du dreje ægget med uret i 1-2 min. Dette vil hjælpe embryoet og CAM til at flyde op.
      10. Fjern båndet fra sideåbningen. Se om indersiden af ægget nu buler ud af den nederste åbning. Hvis dette er tilfældet, skal du fortsætte til næste trin. Hvis ikke, skal du bruge nålen på sprøjten til at punktere åbningen på siden igen for at frigøre vakuumet i ægget. Sørg for at pege opad med nålen for at forhindre risikoen for at punktere æggeblommesækken. Fortsæt, indtil ægget buler ud af den nederste åbning.
      11. Mens du holder bunden af ægget tæt på vejebåden i metalvejningsbådholderen (figur 1C, D), skal du forsigtigt, men hurtigt lave en vandret ridse i membranen over hele åbningens bredde ved hjælp af et af de skarpe punkter på den lille pincet (figur 1F) og forsigtigt slippe ægindholdet i vejebåden (figur 2I).
        BEMÆRK: Hvis ægindholdet ikke kommer ud, skal du bruge nålen på sprøjten til at punktere sideåbningen igen med nålen pegende opad.
      12. Hvis embryoet er i vejebåden sidelæns, vil det normalt gå op af sig selv. Hvis dette ikke sker, skal du bruge et stykke silkepapir til at flytte embryoet. Sæt den ene side af silkepapiret på embryoet, træk silkepapiret til den anden ende, og slip silkepapiret med et par dråber ~ 30 μL PBS (37 ° C) ved hjælp af en plastik Pasteur-pipet.
      13. Kontroller visuelt, om embryoet er i live ved at sikre, at hjerteslaget stadig er til stede, CAM-karrene er intakte, og der er ingen blødning, og der er ingen lækage af æggeblomme. Hvis en af disse ting ikke er korrekt, skal du kassere embryoet og CAM, fordi det ikke vil være levedygtigt.
      14. Sørg for, at embryoet og CAM holdes ved 37 ° C og ikke tørrer ud, fordi dette vil få CAM-karrene til at forringes, og til sidst vil embryoet dø. For at forhindre dette skal du regelmæssigt lægge små dråber på ~ 30 μL 37 ° C PBS på embryoet og CAM.
  3. Forberedelse af 6 til 7-dages (144-168 timer) gamle embryoner (HH-trin 28-32)22
    1. Forberedelse af arbejdsområde
      1. Etapen forberedes som beskrevet i punkt 1.2.1.
    2. At tage ægindholdet ud af æggeskallen
      1. To timer før eksperimentet skal du tage et 6 til 7 dage gammelt inkuberet æg og dreje ægget 180 ° inde i inkubatoren, så toppen af ægget vender mod bunden. Efter 1 time drejes ægget tilbage til sin oprindelige position og efterlades i yderligere 1 time.
        BEMÆRK: Rotation af ægget 2 timer før eksperimentet vil gøre det lettere at tage ægindholdet ud af skallen.
      2. Efter rotation skal du tage ægget fra inkubatoren.
      3. Udfør trin 1.2.2.2 indtil trin 1.2.2.4.
      4. Brug en 5 ml sprøjte og 19 G nål til at trænge ind i skallen gennem det andet led på siden 2/3 ned i ægget og trække mellem 5-6 ml æggehvide. Sørg for, at nålen peger ned mod bunden af ægget.
        BEMÆRK: Med den 5 ml sprøjte, vi brugte, er det muligt at trække op til 6 ml ud, så der kun er behov for en penetration.
      5. Tag nålen ud og brug et stykke tape til at forsegle hullet på siden (figur 2D).
      6. Tøm sprøjten ved at tilføje æggehviden til ultralydgelen i vejebåden.
      7. Brug den store pincet (figur 1E) til at forstørre den lille åbning på toppen af ægget (figur 2E). Prøv at gøre åbningen så stor som muligt, men sørg for, at kanten af åbningen i skallen ikke går lavere end CAM. Udover dette må du ikke trænge ind i den indre membran og forsøge at forhindre skarpe kanter.
      8. En sprøjte fyldes med ~1 ml mere end 37 °C PBS end det udtrukne volumen i trin 1.3.2.4.
      9. Tag båndet af sidegabet, penetrer hullet med den fyldte sprøjte, og tøm det i skallen. Sørg for, at nålen peger ned mod bunden af ægget.
        BEMÆRK: Da æggehvide har en højere viskositet (~ 160 cP)27 end PBS (~ 1 cP), reducerer udskiftning af æggehviden med PBS både spænding og stress på embryoet og CAM, mens ægindholdet tages ud af skallen.
      10. Tag nålen ud og forsegl hurtigt hullet igen med et stykke tape (figur 2D).
      11. Vend ægget 180° og læg ægget tilbage i ægholderen på en sådan måde, at den skabte åbning øverst på ægget nu vender mod bunden. Drej ægget med uret, indtil hele embryoet og CAM (inklusive alle karrene) er forsvundet, og kun æggeblomme er synlig.
      12. Udfør trin 1.2.2.10 indtil trin 1.2.2.14.
  4. Forberedelse af 8-dages (192 timer) gamle embryoner (HH trin 32-35)22
    1. Forberedelse af arbejdsområde
      1. Varm en varmeplade op til 37 °C.
      2. Anbring en metalvejningsbådholder (figur 1C, D) og en 10 ml Erlenmeyer fyldt med PBS på varmepladen.
      3. Tag en lav beholder på 170 x 110 x 70 mm eller lignende, og fyld beholderen med 1 L 37 °C PBS.
      4. Anbring en vejebåd (85 × 85 × 25 mm) i en petriskål med en diameter på 90 mm. Placer petriskålen og vejebåden i bunden af beholderen, og sørg for, at de er helt nedsænket.
    2. At tage ægindholdet ud af æggeskallen
      1. To timer før eksperimentet skal du tage et 8 dage gammelt inkuberet æg og dreje ægget 180° inde i inkubatoren, så toppen af ægget vender mod bunden. Efter 1 time drejes ægget tilbage til sin oprindelige position og efterlades i yderligere 1 time.
        BEMÆRK: Rotation af ægget 2 timer før eksperimentet vil gøre det lettere at tage ægindholdet ud af skallen.
      2. Tag et 8 dage gammelt inkuberet æg fra inkubatoren.
      3. Hold ægget vandret og brug den spidse bagside af den store pincet (figur 1E) til at lave et lille indryk 1/2 ned i ægget. Fortsæt med at lave små fordybninger i et ringmønster 360° rundt om æggeskallen. Brug en afstand på ~10 mm mellem indrykningerne.
        BEMÆRK: Under denne procedure kan der begynde at dannes små revner mellem indrykningerne.
      4. Når du har oprettet de små fordybninger rundt om skallen, skal du lave et større hul ved at knække skallen mellem to små fordybninger ved hjælp af den spidse bagside af den store pincet.
      5. Nedsænk ægget helt i 37 °C PBS og hold det nedsænket i 5 min. Efter 5 min skal du holde ægget tæt på vejebåden inde i beholderen. Læg toppen af begge tommelfingre i det store hul og åbn forsigtigt ægget. Ægget vil knække langs de små fordybninger.
      6. Når revnen er dannet hele vejen rundt om æggeskallen, skal du forsigtigt forsøge at trække de to æggeskalsstykker fra hinanden og fortsætte forsigtigt med at bevæge de to stykker frem og tilbage, indtil ægindholdet er adskilt fra skallen. Slip derefter forsigtigt ægindholdet i vejebåden.
        BEMÆRK: Ved at flytte de to stykker æggeskal frem og tilbage vil mere PBS strømme ind i æggeskallen, hvilket vil hjælpe med at adskille ægindholdet fra skallen. Nogle gange vil en smule æggehvide klæbe til indersiden af æggeskallen. Når dette sker, skal du bruge pincetten til at adskille æggehviden fra til skallen.
      7. Hæv langsomt petriskålen med vejebåd og ægindhold fra PBS. Når du er ude af PBS, skal du vippe vejebåden let for at fjerne den overskydende PBS.
      8. Anbring vejebåden med ægindholdet i metalvejningsbådholderen, og flyt til den ønskede forsøgsopsætning.

2. Udvalgte applikationer

  1. Indsprøjtning af mikrobobler og/eller andre opløsninger i CAM-beholderne
    1. Forberedelse af injektionsopsætningen
      1. Træk glasnåle fra glaskapillarrør ved hjælp af en mikrosmedje (figur 3A) eller køb kapillærnåle af trukket glas.
      2. Hvis spidsen af glaskapillærnålen ikke er skrå, skal du afbryde en lille del af nålens spids. Fyld glasnålen med mineralolie og læg den i et mikroinjektionssystem. Sørg for, at der ikke er luftbobler i mineralolien i glasnålen.
        BEMÆRK: Mineralolien tilsættes i henhold til instruktion fra producenten af det injektionssystem, vi brugte.
      3. Tøm kapillærnålen i trukket glas, så vidt mikroinjektionssystemet tillader det, og genopfyld delvist glasnålen med luft.
        BEMÆRK: Den lille smule luft forhindrer blandingen af mineralolien og den opløsning, der skal injiceres.
      4. Sæt 10 μL af den ønskede opløsning, i denne protokol mikrobobler, på et stykke voksagtig film (figur 3B). Hvis der er behov for mere end én opløsning, kan opløsninger blandes inden pipettering7.
        BEMÆRK: Før du fylder nålen med mikrobobler, skal du lade mikrobobledråben stå på den voksagtige film i ~ 1 minut, så mikroboblerne flyder til toppen af dråben og bliver koncentreret. For det specialfremstillede ultralydskontrastmiddel af F-typen28 vil dette koncentrationstrin øge den mikroboblekoncentration, der skal injiceres, med ~ 30%. Koncentrationen efter injektion i kyllingeembryoblodet vil være mellem 32 x 10 3 mikrobobler/μL for 5 dage gamle embryoner og 19 x 103 mikrobobler/μL for 6 dage gamle embryoner.
      5. Fyld glasnålen med mikroboblen og/eller anden opløsning ved at placere glasnålspidsen i dråben på voksfilmen. Når du opsuger mikrobobler, skal du sørge for at placere nålespidsen i toppen af væskedråben for at opsuge den mikrobobleberigede opløsning.
        BEMÆRK: Før du injicerer mikrobobler, skal du hæve spidsen af glasnålen til sit højeste punkt og vente i ~ 2 min. Dette vil sikre, at mikroboblerne koncentrerer sig i spidsen af glasnålen.
  2. Injektion i CAM-beholderne
    1. Før injektion skal du se på CAM under et stereomikroskop og vælge den bedste beholder, der skal injiceres. Injicer altid i en af embryoets vener . Dette er de kar, hvor blodgennemstrømningen bevæger sig mod embryoet. Vener er lysere i farve end arterierne på grund af det iltede blod29. Derudover er vener altid oven på arterien med to undtagelser, nemlig de forreste og bageste vitellinvener (dvs. de mindre forgrenede vener, angivet med stjerner i figur 6A, B), som ikke har en arterie i deres omgivelser.
      BEMÆRK: Injektion i en af grenene vil begrænse obstruktionen af blodgennemstrømningen under injektionen. Gode injektionssteder er angivet med pilespidser i figur 6A,B. Det er afgørende at injicere i venen, da dette vil tvinge det injicerede stof til at strømme mod embryoet. Udover dette vil injektion i arterien resultere i en massiv blødning, når glasnålen fjernes, hvilket vil dræbe embryoet.
    2. Glasnålen og embryonet anbringes på en sådan måde, at glasnålens spids og den valgte vene befinder sig i samme brændplan og i samme retning. Prøv at placere nålen så vandret som muligt parallelt med den valgte vene. Nålespidsen skal røre ved karvæggen.
      BEMÆRK: Ved at placere glasnålen så vandret som muligt er chancen for at gennembore hele karret lavere.
    3. Efter positionering skal du langsomt gå videre og trænge ind i karvæggen med glasnålen. Under penetration vil CAM først blive skubbet væk ved bevægelse af glasnålen. Bliv ved med at fremme glasnålen, indtil karvæggen er trængt ind.
      BEMÆRK: Hvis fartøjet ved et uheld gennembores og igennem, skal du langsomt trække nålen tilbage for at komme tilbage i lumen. Når du er inde i lumen igen, skal du løfte nålen lidt op og bevæge dig fremad langs karret for at flytte nålen.
    4. Efter penetration skal du trække glasnålen lidt tilbage for bedre at placere spidsen inde i karets lumen og flytte glasnålen sidelæns for at kontrollere, at den ikke er fastgjort til karvæggen. Injicer langsomt en lille mængde af opløsningen for at bekræfte, at spidsen er placeret inde i beholderens lumen (figur 3C).
    5. Sørg for, at den injicerede opløsning følger blodgennemstrømningen. Hvis den ikke gør det, skal du flytte glasnålen lidt og fortsætte med at injicere små mængder, indtil glasnålen er placeret korrekt17.
    6. Når den ønskede mængde injiceres, skal du lade glasnålen stå i beholderen i ~ 15 s for at forhindre en massiv blødning. Flyt derefter glasnålen lidt sidelæns, op og ned og frem og tilbage et par gange for at tillade en forsigtig tilbagetrækning af glasnålen.
      BEMÆRK: Nogle blødninger er normale. Til hver injektion skal du bruge en ny glasnål, fordi glasnålen let bliver tilstoppet med og stump fra æggehvide.
  3. Mikroskopibilleddannelse af embryonet og/eller CAM-beholderne
    1. Klargøringsholder med akustisk membran
      1. Tag et cellekulturkammer bestående af en firkantet plastholder med to parallelle 50 μm tykke akustisk gennemsigtige polycarbonatmembraner26, yderligere benævnt holder med akustisk membran. Luk begge porte med låg.
      2. Brug en skalpel til at fjerne en af de to membraner fra holderen med akustisk membran.
        BEMÆRK: For at fjerne membranen skal du skære membranen lige ved siden af limlinjen på plasten. Pas på ikke at glide af fra kanten for at forhindre beskadigelse af den anden membran.
      3. Der fremstilles ~15 ml 2% agarose i demi-vandopløsning ved opvarmning til mellem 80-95 °C i et lille glasbægerglas. Glasbægerglasset afkøles med opløsningen opløst agarose under en rindende koldtvandshane.
        BEMÆRK: Hvis agarosen er for varm, smelter den akustiske membran, hvilket vil skabe en ujævn overflade.
      4. Når opløsningen er afkølet til ca. 37 °C, hældes langsomt opløsningen i holderen med akustisk membran, indtil den fylder hele holderen op. Vip holderen let med akustisk membran, så agaroselaget fordeler sig jævnt inde i plastrammen (figur 4A). Sørg for, at agaroselaget er fladt, og lad agarosen indstille sig ved stuetemperatur.
    2. Fjernelse af embryo og CAM fra æggeblommesæk og placering på holder med akustisk membran
      1. Tag ægindholdet ud af ægget som beskrevet i punkt 1.2, 1.3 eller 1.4.
      2. Om nødvendigt injiceres CAM med mikrobobler og/eller anden opløsning(er) som beskrevet i pkt. 2.1.2.
      3. Fyld en 1 L petriskål med ~500 ml 37 °C PBS og placer holderen med akustisk membran med agarose i bunden af fadet. Sørg for, at agaroselaget vender opad.
      4. Brug en lille saks til hurtigt at skære i æggeblommesækkens membran, også kaldet Vitellus-membranen, rundt om hele CAM, mens ægindholdet er i vejebåden (figur 4B). Hold saksen i samme position, og drej vejebåden, mens du klipper for bedre præcision og mere hastighed.
        BEMÆRK: Fra det øjeblik det første snit er lavet, begynder æggeblommen at lække. Dette reducerer synligheden af embryoet og CAM. Prøv at skære hele vejen rundt om CAM inden for 6-7 snit. Dette bør ikke tage meget længere tid end 20 s. Den lille pincet (figur 1F) kan bruges til at holde kanten af vitellinmembranen og forhindre skæring i CAM.
      5. Brug en spiseskefuld til at øse den udskårne membran, der indeholder embryoet og CAM, op fra vejebåden. Løft langsomt skeen fra vejebåden, og inspicer visuelt, om den udskårne membran, der indeholder embryoet og CAM, stadig er fastgjort til resten æggeblommesækmembran. Når dette er tilfældet, skal du bruge saksen til at lave et ekstra klip. Mens du øser, skal du vippe skeen lidt for at slippe af med så meget æggeblomme som muligt, men lad den ikke tørre ud. Overfør den udskårne membran indeholdende embryoet og CAM til 1 L petriskålen, nedsænk i 37 °C PBS, og fjern skeen.
      6. Når membranen, der indeholder embryoet og CAM, er nedsænket i 37 °C PBS, skal du bruge den lille pincet (figur 1F) til at gribe fat i den ene kant af membranen og forsigtigt hvirvle rundt om membranen for at slippe af med æggeblommen, der stadig er fastgjort.
      7. Når al æggeblommen er fjernet, skal du bruge den lille pincet til at flytte membranen, der indeholder embryoet og CAM, og placere den over holderen med akustisk membran.
      8. Brug en insektprøvestift til at fastgøre membranen, der indeholder embryoet, og CAM i det ene hjørne. Undgå at gennembore karrene i CAM'en, og fastgør kun membranen.
      9. Brug en anden insektprøvestift til at fastgøre membranen, der indeholder embryoet, og CAM på det diagonalt modsatte hjørne.
      10. Løft langsomt holderen med den akustiske membran, der indeholder embryoet og CAM'et, fra PBS ved 37 °C. Vip holderen lidt for at slippe af med det meste af PBS.
      11. Brug den lille pincet (figur 1F) til at strække og jævnt fordele membranen indeholdende embryoet og CAM over holderen med akustisk membran og fastgøre resten af membranen. Sørg for, at membranen, der indeholder embryoet og CAM, er let strakt for at sikre, at den er flad (figur 4C).
      12. Holderen med akustisk membran med den fastgjorte membran, der indeholder embryoet og CAM, anbringes i en mikroskopiopsætning, der holdes ved 37 °C.
      13. Placer en dæksel eller en akustisk og optisk gennemsigtig membran (afhængigt af det ønskede mål og brug af ultralyd eller ej) oven på interesseområdet på embryoet eller CAM (figur 4D) for at muliggøre optisk visualisering.
  4. Ultralydsbilleddannelse af kyllingembryoet og / eller CAM-karrene
    1. Ultralydsbilleddannelse fra siden af kyllingembryoet og CAM-karrene
      1. Ægindholdet udtages som beskrevet i punkt 1.2, 1.3 eller 1.4. Brug dog ikke en standard vejebåd. Brug i stedet en specialfremstillet vejebåd med en akustisk gennemsigtig væg.
        BEMÆRK: Standardvejebåden blev justeret ved at afskære den ene side af vejebåden og erstatte den med et vindue af polyesterfolie, der blev limet sammen ved hjælp af epoxylim.
      2. Nedsænk den foretrukne ultralydstransducer i et 37 °C vandbad, og placer den på det ønskede sted med den krævede afstand.
      3. Placer vejebåden i vandbadet på en sådan måde, at den gennemsigtige væg vender mod transduceren. Sørg for, at vejebåden er dyb nok til at være i niveau med transduceren, men undgå at der kommer vand ind i vejebåden (figur 5A).
      4. Hvis det ønskes, skal du tilføje en anden opsætning til toppen af embryoet eller CAM-karrene, som et mikroskop eller en laser (figur 5A).
    2. Ultralydsbilleddannelse fra toppen af embryoet og CAM-karrene uden akustisk interferens
      1. Fyld et 2 L bægerglas med 37 °C PBS. Placer et 500 ml bægerglas på hovedet i bunden af 2 L bægerglasset. Undgå luft inde i 500 ml bægerglas.
        BEMÆRK: Bægerglasset på 500 ml er beregnet til at hæve vejebåden med ægindholdet tættere på PBS-overfladen. Ved at erstatte bægerglasset med genstande med andre størrelser kan afstanden mellem transduceren og ægindholdet varieres.
      2. Det fyldte 2 L bægerglas med 500 ml bægerglas indeni anbringes i et 37 °C vandbad.
      3. Ægindholdet udtages som beskrevet i punkt 1.2, 1.3 eller 1.4.
      4. Ægindholdet fugtes med 37 °C PBS, og embryoet dækkes med klar husholdningsfilm. Dette kan gøres for at holde embryoet i samme position og forhindre det i at rotere eller flyde væk.
        BEMÆRK: Ved at fugte ægindholdet med PBS bliver det mindre klæbrigt, hvilket gør det lettere at dække ægindholdet med klar klæbende film.
      5. Vejebåden med ægindholdet anbringes i et petriskål med en diameter på 90 mm, og petriskålen nedsænkes langsomt i PBS (figur 5B).
        BEMÆRK: Brug af to klemmer på siderne af petriskålen modsat hinanden gør det lettere at nedsænke petriskålen.
      6. Placer ultralydstransduceren med den ønskede standoff-afstand.
    3. Ultralydsbilleddannelse af kyllingembryoet og CAM-karrene med en bevægelig transducer
      1. Ægindholdet udtages som beskrevet i punkt 1.2, 1.3 eller 1.4.
      2. Der fremstilles en 2% agaroseopløsning i demivand ved at opvarme opløsningen til mellem 80-95 °C i et lille glasbægerglas. Glasbægerglasset afkøles med opløsningen opløst agarose under en rindende koldtvandsfane.
      3. Hæld agaroseopløsningen i en flad beholder for at skabe en ca. 1 mm tyk agarosepude. Når den er helt afkølet og indstillet, skal du skære agarosepuden til den ønskede størrelse ved hjælp af en skalpel.
        BEMÆRK: Tykkelsen af agarosepuden kan ændres for at opnå den ønskede brændvidde, der er nødvendig for korrekt funktion af ultralydstransduceren.
      4. Placer agarosepuden oven på embryoet og CAM (figur 5C). Tilsæt et par dråber ~30 μL 37 °C PBS på toppen af agarosepuden for at skabe et tyndt PBS-lag mellem agarosepuden og transduceren.
        BEMÆRK: Brug af PBS forhindrer transduceren i at klæbe til agarosepuden. Dette er gavnligt, når man for eksempel bruger en motor til mekanisk at flytte en todimensionel transducer for at foretage en tredimensionel scanning (figur 9B)11. Når transduceren ikke skal flyttes, kan PBS også erstattes med ultralydsgel.
      5. Placer den ønskede ultralydstransducer.

Representative Results

I denne protokol beskriver vi tre metoder til at tage ægindholdet ud af skallen på dag 5-8 af inkubation (HH 26-3522). Figur 6 viser ægindholdet i vejebåde, efter at det blev taget ud af skallen. Det 5 dage gamle embryo og CAM (figur 6A) blev taget ud ved hjælp af metoden beskrevet i pkt. 1.2. De 6 og 7 dage gamle embryoner og CAM (figur 6B,C) blev taget ud efter metoden beskrevet i pkt. 1.3. Det 8 dage gamle embryo og CAM (figur 6D) blev taget ud ved hjælp af metoden beskrevet i pkt. 1.4. Der kan ikke observeres blødning eller beskadigelse af embryoet eller CAM, hvilket indikerer, at disse metoder kan bruges til sikkert at få ægindholdet ud af skallen uden at skade embryoet eller CAM-karrene. Når den udføres korrekt, vil metoden til de 5 dage gamle embryoner give et levedygtigt embryo og intakt CAM i 90% af alle procedurer. Levedygtighedsgraden er baseret på det samlede antal befrugtede æg, der med succes ekstraheres fra æggeskallen. Med den anden metode, for 6 og 7-dages inkuberede æg, er chancen for et levedygtigt embryo og intakt CAM omkring 75% for 6-dages gammel og omkring 50% for 7-dages gammel. Med den tredje metode, der er beskrevet for 8 dage gamle embryoner, er chancen for et levedygtigt embryo og intakt CAM omkring 60%. Forskelle i udviklingsstadier mellem de 5 og 8 dage gamle embryoner kan observeres, hvilket stemmer overens med Hamburger og Hamilton22. Både embryonets størrelse og CAM-fartøjernes kompleksitet øges under udviklingen (figur 6A-D). Figur 6C viser en tynd plet agarose oven på ægindholdet, der gør det muligt at afbilde embryoet og CAM ved hjælp af ultralydsopsætningen vist i figur 5C. Efter at ægindholdet er taget ud af skallen, er embryoets hjerteslag synligt med det blotte øje. Pulsen for disse ex ovo-embryoner svarer til i ovo-embryoner ved 183 slag i minuttet (bpm) på dag 5 op til ~ 208 bpm på dag 830. Når det holdes befugtet og ved 37 ° C, vil embryoet opretholde denne puls i ~ 5 timer i de eksperimentelle ultralydsopsætninger.

Flere komplikationer kan forekomme under de tidligere beskrevne tre metoder. Figur 7A viser fanget luft under CAM, hvilket gør embryoet uegnet til ultralydsbilleddannelse, og trykket fra luftboblen (e) kan også beskadige embryoet og / eller CAM. Dette problem opstår, når luftsækken inde i skallen ikke kommer i kontakt med luften uden for skallen, når ægindholdet tages ud af skallen. Figur 7B viser en lille lækage af æggeblomme fra æggeblommesækken øverst til højre på billedet. Dette kan ske, mens ægindholdet tages ud af skallen, når æggeblommesækken bliver beskadiget af skarpe kanter af skallen, eller når æggeblommesækken trænger ind af pincetten. Lækage af æggeblommen kan påvirke synligheden af embryoet og CAM-karrene. Figur 7C viser et embryon, hvori en luftboble er fanget under CAM. Dette sker undertiden i den embryonale udvikling. En anden komplikation, der kan opstå, er skader på skibene. Denne skade kan skabes, mens ægindholdet tages ud af skallen eller når du udfører en injektion (figur 7D). Udover dette kan embryoet og karrene også tørre ud over tid (figur 7E). Dette sker, når ægindholdet ikke drysses med PBS. Udtørring af embryoet kan resultere i massive kapillærobstruktioner (figur 7F), som påvirker embryonets levedygtighed. De massive kapillærobstruktioner kan også forekomme under udviklingen, eller når embryoets hjerteslag ikke er stabilt.

Efter at ægindholdet er taget ud af skallen uden komplikationer, kan embryoet injiceres med for eksempel ultralydskontrastmidler såsom mikrobobler (figur 3C). Figur 8 viser cirkulerende mikrobobler i blodkarets lumen ved injektion. Disse mikrobobler bæres sammen med blodgennemstrømningen og forbliver til stede i blodcirkulationen i flere timer (supplerende video 1). Tilstedeværelsen af disse mikrobobler i cirkulationen skaber mulighed for at udføre forskellige typer CEUS- og lægemiddelafgivelseseksperimenter 7,11,12. CAM er ideel til at undersøge nye ultralydskontrastdetekteringsmetoder, som vi viser tre eksempler på. Figur 9A viser højfrekvent ultralyd subharmonisk billeddannelse af et 6 dage gammelt kyllingembryo i B-tilstand og CEUS før og efter mikrobobleinjektion. Her blev CAM-beholderne injiceret med 5 μL ultralydskontrastmiddel, og billeddannelse blev udført med en præklinisk dyre-ultralydsmaskine med en MS250-sonde (30 MHz transmission og 15 MHz modtagefrekvens, 10% effekt). Før mikrobobleinjektion kan kontrast allerede ses inde i det embryonale hjerte i B-Mode-billederne (figur 9A-I). Dette fænomen skyldes tilstedeværelsen af en kerne i fugleblodlegemerne, som øger blodets kontrast i ultralydsbilleddannelse 5,31. Tilsætningen af mikroboblerne øgede embryonets kontrast og synlighed, både i B-tilstand og CEUS-billeddannelse. Figur 9B viser et optisk og et højfrekvent 3D subharmonisk billede af et 6 dage gammelt embryo og de omkringliggende kar. CAM blev injiceret med 5 μL ultralydskontrastmiddel, og billeddannelse blev udført med en præklinisk dyr ultralydsmaskine med MS550s sonde (transmissionsfrekvens på 40 MHz, maksimalt undertryk ~ 300 kPa). Disse resultater viser, at CEUS-billeddannelse kombineret med et kontrastmiddel også kan bruges til at skabe højfrekvente 3D-subharmoniske billeder og til at afbilde blodkarrene uden for embryoet. Figur 9C viser et optisk billede og et ultraharmonisk intravaskulært ultralydsbillede (IVUS) lavet med en brugerdefineret sonde af CAM-mikrofartøjer af et 6-dages gammelt embryo (26 MHz transmission og 39 og 65 MHz modtagefrekvens). CAM-fartøjer blev injiceret med 4 ± 1 μL ultralydskontrastmiddel. Det optiske billede og IVUS-billedet er fra samme embryo og samme interesseområde, der viser tilsvarende fartøjsnetværk.

Kyllingembryoet og CAM-karrene kan også bruges til at undersøge ultralydmedieret lægemiddelafgivelse, som vi viser et eksempel på. Da æggeblommen blokerer lysvejen under billeddannelse, er fjernelsen af æggeblommesækken nødvendig for optisk at undersøge lægemiddelafgivelse i embryo- og CAM-karrene. Til denne undersøgelse blev embryoet og CAM forberedt til mikroskopisk billeddannelse som forklaret i pkt. 2.2 ved at adskille membranen indeholdende embryoet og CAM fra æggeblommesækken (figur 4C). I disse embryoner er pulsen stabil omkring 80 bpm, og embryonerne forbliver i live i op til 2 timer, når de opbevares ved en 37 ° C7. Figur 10 viser en ultralyds- og mikroboblemedieret lægemiddelafgivelsesundersøgelse i endotelceller i CAM-karrene. Lipidbelagte mikrobobler, målrettet mod karvæggen ved hjælp af αvβ3-antistoffer og farvet med det fluorescerende farvestof DiI7, blev injiceret i CAM-karrene (figur 10A, C). CAM-karendotelcellekerner blev farvet med Hoechst 33342 (figur 10B), og modellægemidlet Propidium Iodide (PI) blev brugt til at visualisere sonoporation7. Begge disse farvestoffer blev injiceret samtidigt med mikroboblerne. Ved ultralydsbehandling (1 MHz, 200 kPa peak undertryk, enkelt udbrud på 1000 cyklusser) blev PI-optagelse observeret i kernerne tættest på de målrettede mikrobobler (figur 10D). Dette viser, at de ultralydsinducerede svingninger af de målrettede mikrobobler var i stand til at skabe en pore i endotelcellemembranen.

Figure 1
Figur 1. Embryo forberedelse udstyr. (A-B) øverste og sidebillede af metalægholderen og (C-D) top- og sidebillede af metalvejningsbådholderen. (E-F) pincet skulle tage ægindholdet ud af skallen. Skala i cm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2. Embryo fjernelse procedure. (A) Lille fordybning oven på ægget, angivet med den sorte cirkel. (B) Lille led 2/3 ned i ægget, angivet med den sorte cirkel. (C) Tilbagetrækning af ~ 2 ml æggehvide. (D) Forseglet hul på siden med tape. (E) Udvidelse af den lille åbning på toppen af ægget. (F) embryoet bliver synligt efter fjernelse af en del af skallen. (G-H) Efter rotation af ægget 180° flyder embryoet op og bliver usynligt (pile angiver embryonets bevægelsesretning). Efter 1-2 min er embryoet usynligt fra bunden. (I) Efter ridsning af membranen falder ægindholdet ned i vejebåden. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3. Injektion af mikrobobler i CAM-karrene. (A) Kapillærnål af glas. Skala i cm. ( B ) Propidiumiodid (PI) opløsning (venstre dråbe) og mikrobobler (højre dråbe) før aspiration før injektion. Nål (skitseret i sort) kan ses i øverste højre hjørne (C) Microbubble injektion. Kapillærnålspidsen er placeret inde i lumen i en af venerne (til venstre). Mikrobobler, den hvide sky angivet med en pil, injiceres og spredes efter blodstrømmen (højre). Skalabjælken repræsenterer 1 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4. Fjernelse af embryo og CAM fra æggeblommesæk og placering på holder med akustisk membran. (A) Holder med akustisk membran fyldt med agaroselag. (B) Kyllingembryo og CAM-fartøj i vejebåd inden skæring. Stiplet linje angiver skærelinjen omkring CAM'et. (C) Kyllingembryo og CAM adskilt fra æggeblomme og fastgjort på akustisk membran. (D ) Fastgjort kyllingembryo med en akustisk og optisk gennemsigtig membran i en holder (blå) placeret oven på CAM. Holderen kan fyldes med demivand, så der kan anvendes et vanddypningsmål. Alle skalastænger repræsenterer 1 cm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5. Forskellige opsætninger til kyllingembryo og CAM ultralydsbilleddannelse. (A) Opsætning til ultralydsbilleddannelse fra siden. Kyllingeembryo blev anbragt i en specialjusteret vejebåd med en akustisk gennemsigtig væg og anbragt i et 37 °C vandbad. Ultralydstransduceren var placeret på venstre (a) side ved siden af den akustisk gennemsigtige væg og laseren (b) til fotoakustisk billeddannelse ovenpå. (B) Opsætning til ultralydsbilleddannelse fra toppen. Embryo og CAM blev nedsænket i et bægerglas af PBS, der blev anbragt i et 37 °C vandbad. Stiplet kontur viser 2 L glasbægerglas (a) med 500 ml glasbægerglas (b) indeni. (C) Opsætning til ultralydsbilleddannelse fra toppen med en bevægelig transducer. En tynd agarosepude (stiplet linje) blev anbragt oven på embryoet med et tyndt lag PBS som kobling mellem transduceren og agaroseoverfladen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6. Ægindhold uden for skallen. (A) Ægindhold taget ud af skallen efter 5 dages inkubation. Den chorioallantoiske membran (CAM), embryolegemet (EB), forreste og bageste vitellinvener (*) og passende injektionssteder (pilespidser) er angivet. (B) Ægindhold taget ud af skallen efter 6 dages inkubation. De forreste og bageste vitellinvener (*) og passende injektionssteder (pilespidser) er angivet. (C) Ægindhold taget ud af skallen efter 7 dages inkubation. Et plaster af agarose placeres ovenpå for at muliggøre ultralydsbilleddannelse. Hjørnerne af agaroseplasteret er angivet med sorte cirkler. (D) Ægindhold taget ud af skallen efter 8 dages inkubation. Alle skalastænger repræsenterer 1 cm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7. Komplikationer, der kan opstå under procedurerne med kyllingembryoet og CAM-modellen. (A) Luftbobler, der er fanget under CAM'et, når ægindholdet tages ud af skallen ved hjælp af metode 1.2 (5 dage gammelt embryo) eller 1.3 (6 til 7 dage gammelt embryo). (B) Lille lækage af æggeblomme angivet med en pil øverst til højre (6 dage gammelt embryo). (C) Luft fanget under CAM, angivet med den sorte stiplede cirkel (7 dage gammelt embryo). (D) Blødning, angivet med de sorte pile (5 dage gammelt embryo. (E) Udtørret embryo og CAM (5 dage gammelt embryo). (F) Massive kapillærobstruktioner (5 dage gammelt embryo). Alle skalastænger repræsenterer 1 cm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 8
Figur 8. Mikrobobler i CAM blodkar. Karvæggen er angivet med en stiplet linje, og enkelte mikrobobler er angivet med pile. Skalalinjen repræsenterer 20 μm. Den tilsvarende mikroskopioptagelse findes i supplerende video 1. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 9
Figur 9. Kontrastforstærket ultralydsbilleddannelse i kyllingembryoner og CAM-kar. (A) Maksimal intensitetsprojektion af B-mode (I, III) og subharmoniske (II, IV) billeder i realtid (præklinisk ultralydsmaskine til dyr med MS250-sonde, 30 MHz-transmission og 15 MHz modtagefrekvens, 10% effekt) af et 6 dage gammelt embryo med et plaster af agarose på toppen. Topbilleder (I, II) viser resultater før og nederst (III, IV) efter injektion af 5 μL ultralydskontrastmiddel. Skalabjælken repræsenterer 1 mm. Dette billede er blevet ændret med tilladelse fra Daeichin et al. 201511 (B) Optisk (venstre) og 3D subharmonisk billeddannelse (højre) af et 6 dage gammelt kyllingembryo med et plaster af agarose på toppen. CAM-fartøjer blev injiceret med 5 μL ultralydskontrastmiddel, og billeddannelse blev udført med en højfrekvent sonde (præklinisk dyr ultralydsmaskine med MS550s sonde, transmissionsfrekvens på 40 MHz, maksimalt undertryk ~ 300 kPa, gengivet i præklinisk dyr ultralydsmaskine 3-D-tilstand). Skalabjælken repræsenterer 5 mm. Dette billede er blevet ændret med tilladelse fra Daeichin et al. 201511. (C) Optisk billede (venstre) og gennemsnitlig intensitetsprojektion af ultraharmonisk intravaskulær ultralyd (IVUS) (højre) af CAM-mikrovaskulaturen af et 6 dage gammelt embryo. CAM-beholdere blev injiceret med 4 ± 1 μL kontrastmiddel. Ultraharmonisk IVUS-billeddannelse blev udført med en brugerdefineret IVUS-sonde (transmissionsfrekvens 35 MHz, maksimalt undertryk 600 kPa). Begge billeder er lavet af samme embryo og interesseområde. Pile angiver tilsvarende fartøjer på de to billeder. Skalabjælken repræsenterer 1 mm. Dette billede er blevet ændret med tilladelse fra Maresca et al. 201412. Klik her for at se en større version af denne figur. 

Figure 10
Figur 10. Lægemiddellevering til CAM-karendotelceller i 6 dage gammelt embryo. (A) Brightfield-billede af seks αvβ3-målrettede mikrobobler, angivet med hvide pile, der klæber til karvæggen før ultralydbehandling. (B) Endotelcellekerner fluorescerende farvet før ultralydbehandling. (C) Fluorescerende billede af de farvede målrettede mikrobobler, angivet med hvide pile, før ultralydsbehandling. (D) Optagelse af modellægemidlet propidiumiodid (PI) i cellekernerne under de målrettede mikrobobler efter ultralydsbehandling (1 MHz, 200 kPa maksimalt undertryk, enkelt udbrud på 1000 cyklusser). Skalalinjen repræsenterer 10 μm og gælder for alle billeder. Dette billede er blevet ændret med tilladelse fra Skachkov et al. 20147. Klik her for at se en større version af denne figur.

SUPPLERENDE FILER

Supplerende video 1. Mikrobobler i CAM blodkar. Skalabjælken repræsenterer 20 μm. Klik her for at downloade denne video.

Discussion

Denne protokol beskriver tre metoder til, hvordan man får og bruger 5 til 8 dage gamle kyllingembryoner og deres CAM som en in vivo-model til at studere kontrastforstærket ultralydsbilleddannelse og mikroboblemedieret lægemiddelafgivelse. De mest kritiske trin til at tage 5 dage gamle (punkt 1.2) og 6 til 7 dage gamle (punkt 1.3) embryoner ud af skallen er: 1) lav det lille hul i toppen af ægget for at gå gennem hele æggeskallen i luftsækken, før æggehviden trækkes ud; 2) Skab glatte kanter til den store åbning i skallen. For metoden til at tage 8 dage gamle embryoner ud af skallen (punkt 1.4) er de mest kritiske trin: 1) Lav et tilstrækkeligt antal fordybninger til at skabe en dejlig revne langs ægget; 2) Hold ægget nedsænket i PBS. For at sikre embryonens levedygtighed for alle metoder er det vigtigt at holde ægget og dets indhold ved 37 °C. Derudover skal du undgå at injicere i en CAM-arterie. Visuel overvågning af embryonets puls under undersøgelserne anbefales for at sikre embryoets vitalitet. For at bekræfte embryonets nøjagtige udviklingsstadium kan indikationen af Hamburger & Hamilton22 anvendes.

Det er vigtigt at forhindre skade på embryoet, CAM og æggeblommesækken. Denne skade kan påvirke levedygtigheden, blodgennemstrømningen og synligheden af embryoet og CAM. Derudover gør skader på æggeblommesækken og følgelig en lav stivhed af membranen en injektion i CAM-karrene umulig. Et 5 dage gammelt embryo har en relativt lille luftsæk, så for at kunne lave et tilstrækkeligt stort hul i skallen, hvorigennem ægindholdet kan fjernes, skal 2 ml æggehvide trækkes tilbage. Som et resultat skabes mere plads mellem æggeskallet og embryoet. Efter tilbagetrækning af æggehviden skal et stykke tape lukke hullet, hvor nålen gik ind. Hvis æggehvide stadig lækker ud, skal du anvende et andet stykke tape. Derudover skaber påføringen af tape på hullet på siden et vakuum inde i ægget, som forhindrer ægindholdet i at falde ud på grund af sin egen vægt, når det store hul oprettes i trin 1.2.2.8. Skader på embryoet eller CAM kan også opstå, når æggeskallens kant var for skarp, eller når ægindholdet falder for hårdt ned i vejebåden, så æggeskallen skal holdes meget tæt på vejebåden. Mellem dag 5 og 6 af udviklingen begynder CAM at fastgøres til skalmembranen32. Denne vedhæftning øger risikoen for at beskadige embryoet og CAM, når ægindholdet tages ud af æggeskallen. Ved at åbne ægget efter injektion af PBS i det i et 6 til 7-dages inkuberet æg eller i en PBS-fyldt beholder som beskrevet for et 8-dages inkuberet æg, reduceres risikoen for skade. Med hensyn til en injektion i en CAM-vene: Hvis den første injektion mislykkes, kan en anden injektion udføres længere opstrøms i samme vene, hvis skaden var mindre eller i en anden CAM-vene. Adskillelse af embryoet og CAM fra æggeblommen gør embryoet og CAM-karrene optisk gennemsigtige. Som følge heraf mister embryoet sin primære kilde til næringsstoffer33. Dette tab af næringsstoffer kan være en forklaring på den observerede lavere puls på 80 bpm sammenlignet med ~ 190 for et 6 dage gammelt embryo, der stadig er i kontakt med æggeblommen30 og den reducerede overlevelsestid på 2 timer efter denne separationsprocedure. En anden faktor, der kan spille en rolle i den reducerede puls og overlevelsestid, er udfordringen med at holde æggeblommesepareret embryo og CAM-kar ved 37 ° C. En mikroskoptrinkubator kan være til hjælp. Ud over dette fører løsrivelsen af CAM fra æggeblommen sandsynligvis til mekaniske ændringer i vævet, da membranspændingen bliver mindre. Den lavere membranspænding kan forårsage en øget forskydningshastighed i det indre kar, hvilket fører til en lavere puls.

Ex ovo-kyllingeembryoet og CAM-beholderne har nogle begrænsninger som in vivo-modellen, herunder kun observationer af kort tid, til kontrastforbedret ultralydsbilleddannelse og mikroboblemedierede lægemiddelafgivelsesundersøgelser. På grund af det lille blodvolumen på 100±23 μL på dag 5 og 171±23 μL på dag 634 kan et maksimalt volumen på ~ 5 μL injiceres. I de senere udviklingsstadier (dag 7 og ældre) øges karstivheden, og æggeblommeelasticiteten falder. Dette kan komplicere en vellykket injektion i ældre embryoner. Når mikroboblerne er injiceret, cirkulerer de i timevis, fordi kyllingembryoet ikke har et fuldt udviklet immunsystem på dette stadium35. Derfor ryddes mikrobobler ikke inden for ~ 6 minutter som hos mennesker 36,37, hvilket gør typiske ultralydmolekylære billeddannelsesundersøgelser med en 5-10 minutters ventetid for ikke-bundne målrettede mikrobobler, der skal ryddes38 ikke mulige. For at kunne målrette mikrobobler er det nødvendigt at anvende egnede ligander, der kan binde til aviære endotelceller, som tidligere beskrevet for angiogenesemarkøren αvβ37. Andre aspekter at overveje for denne model er den øgede vanskelighed ved at adskille embryoet og CAM-karrene fra æggeblommen i ældre embryoner (> 8 dage) og lavere hæmatokrit på ~ 20%39 sammenlignet med mennesker. Sidstnævnte kan påvirke mikroboblesvingninger, fordi det er kendt, at mikrobobleoscillationer dæmpes i et mere tyktflydende miljø40. CAM arterier er mindre iltet end CAM vener41,42. Denne forskel bør tages i betragtning, når man for eksempel studerer fotoakustisk billeddannelse af iltning i blodet.

De metoder, der er beskrevet her, gør det muligt at tage ægindholdet ud af æggeskallen på dagen for ultralydsbilleddannelses- eller lægemiddelafgivelsesundersøgelsen, typisk på dag 5 til 8 af inkubation. Dette adskiller sig fra eksisterende metoder, hvor ægindholdet tages ud af skallen efter en 3-dages inkubation og videreudvikles som ex ovo-kultur 18,20,21. Fordelene er en højere overlevelsesrate på 90% i 5 dage, 75% i 6 dage, 50% i 7 dage og 60% for 8 dage gamle rugede æg sammenlignet med ~50% for 3 dage gamle embryoner taget ud af æggeskallen og yderligere inkuberet ex ovo1,18 undgåelse af antibiotika under dyrkning18, 20 og stor steril inkubator til ex ovo-kulturen. Overlevelsen af de 6 til 8 dage gamle embryoner er lavere, fordi CAM begynder at fastgøre sig til skallen21, hvilket efterlader CAM-membranen mere tilbøjelig til at briste ved ekstraktion. Adskillelsen af embryoet med CAM-formen æggeblommen er også beskrevet, hvilket gør embryoet og CAM optisk gennemsigtigt.

Ved at placere ægindholdet i forskellige opsætninger kan kyllingembryoet og CAM bruges til en lang række ultralydsbilleddannelsesundersøgelser, som IVUS, fotoakustisk, uden eller med ultralydskontrastmidler i 2D og 3D. Fokus kan være på at udvikle nye ultralydspulserende ordninger eller teste nye transducere. Udover dette kan modellen også bruges til at undersøge nye ultralydskontrastmidler og deres adfærd i blodkar under flow. Da mekanismen for mikroboblemedieret lægemiddelafgivelse stadig er ukendt43, kan brugen af in vivo CAM-modellen hjælpe med at belyse mekanismen ved at studere mikrobobleadfærden i forhold til det cellulære respons. Endelig har CAM-skibene vist sig at være et egnet system til at undersøge xenografttumortransplantation44. Dette skaber mulighed for at bruge CAM-fartøjet som en model til at undersøge tumorbilleddannelse ved hjælp af ultralyd og undersøge blodgennemstrømningen inde i tumoren ved hjælp af CEUS. Tumorerne podes typisk på CAM-karrene af 8 eller 9 dage gamle embryoner 1,14,45, for hvilke embryoet tages ud af æggeskallen på dag 3 af inkubation og videreudvikles ex ovo. De metoder, der er beskrevet i denne protokol, kan bruges til at dyrke embryoner i ovo indtil dagen for tumortransplantation.

Forfatterne stoler på, at dette papir vil være nyttigt for forskere, der ønsker at bruge kyllingembryoner og deres chorioallantoiske membran (CAM) som en in vivo-model til anvendelse af kontrastmidler og flowstudier.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Applied and Engineering Sciences (TTW) (Vidi-projektet 17543), en del af NWO. Forfatterne vil gerne takke Robert Beurskens, Luxi Wei og Reza Pakdaman Zangabad fra Institut for Biomedicinsk Teknik og Michiel Manten og Geert Springeling fra Institut for Eksperimentel Medicinsk Instrumentering for teknisk bistand, alle fra Erasmus MC University Medical Center Rotterdam, Holland.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Sigma-Aldrich A9539
Clamp (Kocher clamp)
Cling film
Holder with acoustic membrane (CLINIcell 25 cm2) MABIO, Tourcoing, France CLINIcell25-50-T FER 00106
Demi water
Disposable plastic Pasteur pipets VWR 612-1747
Eggs Drost Pluimveebedrijf Loenen BV, the Netherlands Freshly fertilized
Fridge 15 °C
Glass capillary needles Drummond 1-000-1000 Inside diameter: 0.0413 inch
Heating plate 37 °C
Humidified incubator 37 °C
Insect specimen pins
Metal egg holder Custom made by Experimental Medical Instrumentation at Erasmus MC. See figure 1 A,B
Metal weighing boat holder Custom made by Experimental Medical Instrumentation at Erasmus MC. See figure 1 C,D
Microinjection system FUJIFILM VisualSonics
Mineral oil Sigma-Aldrich M8410-100ML
Needle, 19 G VWR (TERUMO) 613-5392
Phosphate-bufferes saline (PBS), 1x ThermoFisher 10010023
Petri dish, 1 L Glass
Petri dish, 90 mm diameter VWR 391-0559
Preclinical animal ultrasound machine (Vevo 2100) FUJIFILM VisualSonics
Probe (MS250) FUJIFILM VisualSonics 30 MHz transmit and 15 MHz receive frequency
Probe (MS550s) FUJIFILM VisualSonics transmission frequency of 40 MHz
Scalpel VWR (SWANN-MORTON) 233-5363
Scissors, small Fine Science Tools (FST) 14558-09
Syringe, 5 mL VWR (TERUMO) 613-0973
Table spoon
Tape (Scotch Magic tape) Scotch
Tissue paper Tork
Tweezers large  VWR (USBECK Laborgeräte) 232-0107 See figure 1E
Tweezers small DUMONT Medical, Switzerland 0103-5/45 See figure 1F
Ultrasound contrast agent (custum made F-type) Produced as described by: Daeichin, V. et al. Microbubble Composition and Preparation for Imaging : In Vitro and In Vivo Evaluation. IEEE TRANSACTIONS ON ULTRASONICS. 64 (3), 555–567 (2017).
Ultrasound contrast agent (MicroMarker) FUJIFILM VisualSonics, Inc.
Ultrasound contrast agent (Definity) Lantheus medical imaging, United States
Ultrasound gel Aquasonic
Waxi film (Parafilm) Parafilm
Weighing boats (85 × 85 × 24 mm) VWR 611-0094

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Martowicz, A., Kern, J., Gunsilius, E., Untergasser, G. Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis. Journal of Visualized Experiments. (99), e1 (2015).
  2. Schmitz, M., Nelemans, B. K. A., Smit, T. H. A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos. Journal of Visualized Experiments. (118), e1 (2016).
  3. Brauer, R., Chen, P. Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs. Journal of Visualized Experiments. (97), e1 (2015).
  4. Oosterbaan, A. M., Ursem, N. T. C., Struijk, P. C., Bosch, J. G., van der Steen, A. F. W., Steegers, E. A. P. Doppler flow velocity waveforms in the embryonic chicken heart at developmental stages corresponding to 5-8 weeks of human gestation. Ultrasound in Obstetrics and Gynecology. 33 (6), 638-644 (2009).
  5. McQuinn, T. C., Bratoeva, M., DeAlmeida, A., Remond, M., Thompson, R. P., Sedmera, D. High-Frequency Ultrasonographic Imaging of Avian Cardiovascular Development. Developmental Dynamics. 236 (12), 3503-3513 (2007).
  6. Stieger, S. M., Caskey, C. F., Adamson, R. H., Curry, F. E., Wisner, E. R., Ferrara, K. W. Enhancement of Vascular Permeability with Low-Frequency Contrast-enhanced Ultrasound in the Chorioallantoic Membrane Model. Radiology. 243 (1), 112-121 (2007).
  7. Skachkov, I., Luan, Y., van der Steen, A. F. W., De Jong, N., Kooiman, K. Targeted microbubble mediated sonoporation of endothelial cells in vivo. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 61 (10), 1661-1667 (2014).
  8. Vargas, A., Zeisser-Labouèbe, M., Lange, N., Gurny, R., Delie, F. The chick embryo and its chorioallantoic membrane (CAM) for the in vivo evaluation of drug delivery systems. Advanced Drug Delivery Reviews. 59 (11), 1162-1176 (2007).
  9. Rytelewski, M., Buensuceso, A., Leong, H. S., Deroo, B. J., Chambers, A. F., Koropatnick, J. Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In vivo. Journal of Visualized Experiments. (96), e1 (2015).
  10. Schmitd, L. B., Liu, M., Scanlon, C. S., Banerjee, R., Silva, N. J. D. The Chick Chorioallantoic Membrane In vivo Model to Assess Perineural Invasion in Head and Neck Cancer. Journal of Visualized Experiments. (148), e1 (2019).
  11. Daeichin, V., Bosch, J. G., Needles, A., Foster, F. S., van der Steen, A., de Jong, N. Subharmonic, non-linear fundamental and ultraharmonic imaging of microbubble contrast at high frequencies. Ultrasound in Medicine and Biology. 41 (2), 486-497 (2015).
  12. Maresca, D., et al. Imaging microvasculature with contrast-enhanced ultraharmonic ultrasound. Ultrasound in Medicine and Biology. 40 (6), 1318-1328 (2014).
  13. Lindsey, B. D., et al. High Resolution Ultrasound Superharmonic Perfusion Imaging: In vivo Feasibility and Quantification of Dynamic Contrast-Enhanced Acoustic Angiography. Annals of Biomedical Engineering. 45 (4), 939-948 (2017).
  14. Paproski, R. J., Jovel, J., Wong, G. K. S., Lewis, J. D., Zemp, R. J. Enhanced detection of cancer biomarkers in blood-borne extracellular vesicles using nanodroplets and focused ultrasound. Cancer Research. 77 (1), 3-13 (2017).
  15. Huang, C., et al. Short Acquisition Time Super-Resolution Ultrasound Microvessel Imaging via Microbubble Separation. Scientific Reports. 10, 1-13 (2020).
  16. Lowerison, M. R., Huang, C., Kim, Y., Lucien, F., Chen, S., Song, P. In vivo Confocal Imaging of Fluorescently Labeled Microbubbles: Implications for Ultrasound Localization Microscopy. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 67 (9), 1811-1819 (2020).
  17. Faez, T., Skachkov, I., Versluis, M., Kooiman, K., de Jong, N. In vivo Characterization of Ultrasound Contrast Agents: Microbubble Spectroscopy in a Chicken Embryo. Ultrasound in Medicine and Biology. 38 (9), 1608-1617 (2012).
  18. Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications. Journal of Visualized Experiments. (44), e4 (2010).
  19. Kokhuis, T. J. A., et al. Intravital microscopy of localized stem cell delivery using microbubbles and acoustic radiation force. Biotechnology and Bioengineering. 112 (1), 220-227 (2015).
  20. Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development. Journal of Visualized Experiments. (95), e6 (2015).
  21. Dohle, D. S., et al. Chick ex ovo Culture and ex ovo CAM Assay: How it Really Works. Journal of Visualized Experiments. (33), e2 (2010).
  22. Hamburger, V., Hamilton, H. A Series Of Normal Stages In The Developent Of The Chick Embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 231-272 (1951).
  23. Ribatti, D. A morphometric study of the expansion of the chick vasculosa in shell-less culture. Journal of Anatomy. 186, 639-644 (1995).
  24. Ribatti, D., Nico, B., Vacca, A., Roncali, L., Burri, P. H., Djonov, V. Chorioallantoic Membrane Capillary Bed: A Useful Target for Studying Angiogenesis and Anti-Angiogenesis In vivo. Anatomical Record. 324, 317-324 (2001).
  25. DeFouw, D. O., Rizzo, V. J., Steinfeld, R., Feinberg, R. N. Mapping of the Microcirculation in the Chick Chorioallantoic Membrane during Normal Angiogenesis. Microvascular research. 38, 136-147 (1989).
  26. Beekers, I., van Rooij, T., van der Steen, A. F. W., de Jong, N., Verweij, M. D., Kooiman, K. Acoustic characterization of the CLINIcell for ultrasound contrast agent studies. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 66 (1), 244-246 (2019).
  27. Lang, E. R., Rha, C. Apparent shear viscosity of native egg white. Journal of Food Science and Technology. 17, 595-606 (1982).
  28. Daeichin, V., et al. Microbubble Composition and Preparation for Imaging: In Vitro and In vivo Evaluation. IEEE TRANSACTIONS ON ULTRASONICS. 64 (3), 555-567 (2017).
  29. Mcferrin, H. E., Olson, S. D., Gutschow, M. V., Semon, J. A., Sullivan, D. E., Prockop, D. J. Rapidly Self-Renewing Human Multipotent Marrow Stromal Cells (hMSC) Express Sialyl Lewis X and Actively Adhere to Arterial Endothelium in a Chick Embryo Model System. PLoS ONE. 9 (8), 1-11 (2014).
  30. Akiyama, R., Mitsubayashi, H., Tazawa, H., Burggren, W. W. Heart rate responses to altered ambient oxygen in early (days 3-9) chick embryos in the intact egg. Journal of Comparative Physiology - B Biochemical, Systemic, and Environmental Physiology. 169 (2), 85-92 (1999).
  31. Foster, F. S., Hossack, J., Adamson, S. L. Micro-ultrasound for preclinical imaging. Interface Focus. 1, 576-601 (2011).
  32. Gabrielli, M. G., Accili, D. The Chick Chorioallantoic Membrane: A Model of Molecular, Structural, and Functional Adaptation to Transepithelial Ion Transport and Barrier Function during Embryonic Development. Journal of Biomedicine and Biotechnology. , 1-12 (2010).
  33. van der Wagt, I., de Jong, I. C., Mitchell, M. A., Molenaar, R., van den Brand, H. A review on yolk sac utilization in poultry. Poultry Science. 99, 2162-2175 (2020).
  34. Kind, C. The development of the circulating blood volume of the chick embryo. Anatomy and Embryology. 147, 127-132 (1975).
  35. Ribatti, D. Chick Embryo Chorioallantoic Membrane as a Useful Tool to Study Angiogenesis. International Review of Cell and Molecular Biology. 270, 181-224 (2008).
  36. Schneider, M. Characteristics of SonoVue(TM). Echocardiography. 16 (7), 743-746 (1999).
  37. Kitzman, D. W., Goldman, M. E., Gillam, L. D., Cohen, J. L., Aurigemma, G. P., Gottdiener, J. S. Efficacy and Safety of the Novel Ultrasound Contrast Agent Perflutren (Definity) in Patients With Suboptimal Baseline Left Ventricular Echocardiographic Images. American Journal of Cardiology. 86, 669-674 (2000).
  38. Kosareva, A., Abou-Elkacem, L., Chowdhury, S., Lindner, J. R., Kaufmann, B. A. Seeing the Invisible-Ultrasound Molecular Imaging. Ultrasound in Medicine and Biology. 46 (3), 479-497 (2020).
  39. Al-Roubaie, S., Jahnsen, E. D., Mohammed, M., Henderson-Toth, C., Jones, E. A. V. Rheology of embryonic avian blood. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 301 (6), 2473-2481 (2011).
  40. Helfield, B., Chen, X., Qin, B., Villanueva, F. S. Individual lipid encapsulated microbubble radial oscillations: Effects of fluid viscosity. The Journal of the Acoustical Society of America. 139 (1), 204-214 (2016).
  41. Metcalfe, J., Stock, M. K. Oxygen exchange in the chorioallantoic membrane, avian homologue of the mammalian placenta. Placenta. 14, 605-613 (1993).
  42. Tazawa, H. Oxygen and CO2 exchange and acid-base regulation in the avian embryo. American Journal of Zoology. 20, 395-404 (1980).
  43. Kooiman, K., et al. Ultrasound-Responsive Cavitation Nuclei for Therapy and Drug Delivery. Ultrasound in Medicine and Biology. 46 (6), 1296-1325 (2020).
  44. Li, M., Pathak, R. R., Lopez-rivera, E., Friedman, S. L., Aguirre-ghiso, J. A., Sikora, A. G. The In ovo Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma. Journal of Visualized Experiments. (104), e1 (2015).
  45. Sys, G. M. L., et al. The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma. Journal of Visualized Experiments. (77), e1 (2013).

Tags

Bioengineering udgave 168 ultralydsbilleddannelse kontrastforstærket ultralydsbilleddannelse mikrobobler lægemiddellevering ex ovo kyllingembryo chorioallantoiske membran (CAM) fartøjer
Fremstilling af kylling ex ovo-embryoner og chorioallantoiske membrankar som in vivo-model til kontrastforstærket ultralydsbilleddannelse og mikroboblemedierede lægemiddelafgivelsesundersøgelser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Meijlink, B., Skachkov, I., van der… More

Meijlink, B., Skachkov, I., van der Steen, A. F. W., de Jong, N., Kooiman, K. The Preparation of Chicken Ex Ovo Embryos and Chorioallantoic Membrane Vessels as In Vivo Model for Contrast-Enhanced Ultrasound Imaging and Microbubble-Mediated Drug Delivery Studies. J. Vis. Exp. (168), e62076, doi:10.3791/62076 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter