Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Utarbeidelsen av kylling ex ovo embryoer og chorioallantoic membranbeholdere som in vivo modell for kontrastforsterket ultralydavbildning og mikroboblemedierte legemiddelleveringsstudier

Published: February 9, 2021 doi: 10.3791/62076
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,2, 1
1Department of Biomedical Engineering, Thoraxcenter, Erasmus MC University Medical Center Rotterdam, 2Laboratory of Acoustical Wavefield Imaging, Faculty of Applied Sciences, Delft University of Technology

Summary

Denne protokollen beskriver tre metoder for hvordan man oppnår og bruker 5 til 8 dager gamle kyllingembryoer og deres chorioallantoic membran (CAM) som en in vivo-modell for å studere kontrastforsterket ultralydavbildning og mikroboblemediert legemiddellevering.

Abstract

Kyllingembryoet og den blodkarrike chorioallantoic membranen (CAM) er en verdifull in vivo-modell for å undersøke biomedisinske prosesser, nye ultralydpulserende ordninger eller nye transdusere for kontrastforsterket ultralydavbildning og mikroboblemediert legemiddellevering. Årsakene til dette er tilgjengeligheten til embryo- og karnettverket til CAM, samt de lave kostnadene ved modellen. Et viktig skritt for å få tilgang til embryoet og CAM-karene er å ta egginnholdet ut av eggeskallet. I denne protokollen beskrives tre metoder for å ta innholdet ut av eggeskallet mellom dag 5 og 8 av inkubasjonen, slik at embryoene kan utvikle seg inne i eggeskallet frem til i disse dager. De beskrevne metodene krever bare enkle verktøy og utstyr og gir en høyere overlevelsessuksessrate på 90% for 5-dagers, 75% for 6-dagers, 50% for 7-dagers og 60% for 8-dagers gamle rugede egg sammenlignet med ex ovo-dyrkede embryoer (~ 50%). Protokollen beskriver også hvordan man injiserer kavitasjonskjerner, for eksempel mikrobobler, i CAM-vaskulærsystemet, hvordan man separerer membranen som inneholder embryoet og CAM fra resten av egginnholdet for optisk gjennomsiktige studier, og hvordan man bruker kyllingembryoet og CAM i en rekke kortsiktige ultralydeksperimenter. In vivo kyllingembryo og CAM-modellen er ekstremt relevant for å undersøke nye bildeprotokoller, ultralydkontrastmidler og ultralydpulserende ordninger for kontrastforbedret ultralydavbildning, og for å løse mekanismene for ultralydmediert legemiddellevering.

Introduction

Ex ovo kyllingembryoer og den blodkarrike chorioallantoic membranen (CAM) har vist seg å være en egnet modell for å undersøke ulike biologiske og biomedisinske prosesser som embryogenese, onkologi og legemiddellevering 1,2,3,4. Ultralyd har blitt brukt til avbildning av embryonal hjerteutvikling 4,5 og for aktivering av kavitasjonskjerner ved injeksjon, for eksempel mikrobobler, for vaskulær legemiddellevering 6,7. Kyllingembryoer er billige, krever mindre infrastruktur og utstyr, og har mindre streng lovgivning sammenlignet med andre dyremodeller8. Kyllingembryoet og CAM-karene er lett tilgjengelige etter åpning av egget, mens dette viser seg å være mye vanskeligere med pattedyrembryoer og kar. I tillegg til dette gir kyllingembryoet og CAM-karene et hjerteslag og en pulserende blodstrøm. CAM viser likheter i fartøyets anatomi med pattedyr og kan brukes til narkotikascreening 8,9,10. På grunn av disse egenskapene har CAM-karene også vist seg å være en egnet modell for å undersøke kontrastforsterket ultralydavbildning (CEUS)11,12,13,14,15,16. I tillegg kan modellen brukes til optisk å undersøke oppførselen til ultralydkontrastmidler i et ultralydfelt ved hjelp av et ultrahøyhastighetskamera og effekten av akustisk strålingskraft på drivkraft, binding og ekstravasering av legemidler 7,17,18,19. Selv om kyllingembryoet og CAM er mindre egnet for langsiktige eksperimenter, kan de være gunstige for kortsiktige in vivo-eksperimenter.

For å øke synligheten og kontrollerbarheten over kyllingembryoet og CAM under eksperimenter, er det viktig å ta egginnholdet som inneholder embryoet og CAM ut av eggeskallet18. Tidligere kyllingembryostudier som involverte ultralydkontrastmidler brukte 5 til 6 dager gamle embryoer 7,11,12,17,19 og 14 til 18 dager gamle embryoer13,14,15,16. Flere tilnærminger har blitt beskrevet i detalj for å ta egginnholdet ut av skallet 18,20,21. Men så vidt vi vet, fokuserer de tidligere publiserte tilnærmingene på å ta egginnholdet ut av eggeskallet etter 3 dagers inkubasjon (dvs. Hamburger & Hamilton (HH) etappe 19-2022), og fortsette kulturen ex ovo. Denne ex ovo-kulturtilnærmingen har flere ulemper, inkludert økt risiko for dødsfall under kultur (~ 50%) 1,18, bruk av antibiotika18,20 og redusert total fartøylengde sammenlignet med i ovovekst 23. Siden dyrking av embryoet i eggeskallet gir det mest naturlige miljøet, er det lettest å inkubere embryoet i eggeskallet til dagen for forsøket. Av denne grunn vil en tilnærming der egginnholdet tas ut av eggeskallet ved 5 til 8 dagers inkubasjon, være gunstig, spesielt for eksperimenter på 5 til 8 dager gamle embryoer.

I denne protokollen beskriver vi tre metoder for å ta egginnholdet ut av eggeskallet når embryoet er på dag 5 til 8 av utviklingen (HH 26-3522), slik at embryoet kan utvikle seg i eggeskallet til dagen for forsøket. CAM-karstørrelsen varierer fra 10-15 μm i diameter, i de mindre kapillærene til et 8-dagers gammelt embryo 24, til 115-136 μm i diameter i det større karet på 6 og 8 dager gamle embryoer24,25. De tre beskrevne metodene krever bare grunnleggende laboratorieverktøy og reduserer risikoen for komplikasjoner før eksperimentet har begynt, og reduserer dermed unødvendige kostnader og arbeidskraft. Vi beskriver også en metode for å skille membranen som inneholder embryoet og CAM fra eggeplommesekken, noe som gjør CAM optisk gjennomsiktig for mikroskopistudier. Fordi membranen som inneholder embryoet og CAM kan festes på for eksempel en holder med en akustisk membran, kan oppsettet også gjøres akustisk gjennomsiktig26, slik at kombinasjonen av mikroskopi og ultralydstudier når lysbanen vil bli påvirket av eggeplommen. Til slutt beskriver vi flere andre ultralydoppsett som kan brukes til ultralyd eller CEUS-bildebehandling.

Protocol

Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med Netherlands Experiments on Animals Act og i samsvar med Det europeiske råd (2010/63/EU) om beskyttelse av dyrebruk til vitenskapelige formål.

1 . Protokoll for forberedelse av embryo

  1. Inkubasjon av befruktede kyllingegg
    1. Oppbevar ferskt befruktede kyllingegg ved 15 °C i opptil en uke.
    2. For å inkubere de befruktede eggene, plasser dem vertikalt med den spisse siden ned i en 37 ° C, fuktet inkubator. Å snu eggene under inkubasjon er ikke nødvendig.
      MERK: Skriv startdatoen for inkubasjon av toppen av egget ved hjelp av en permanent markør.
  2. Forbereder opptil 5 dagers (120 timer) gammelt embryo (HH stadium 26-28)22
    1. Forberedelse av arbeidsområde
      1. Varm opp en varmeplate til 37 °C.
      2. Plasser en metalleggholder (figur 1A, B), en metallveiebåtholder (figur 1C, D) og en 10 ml Erlenmeyer fylt med PBS på varmeplaten.
      3. Fyll en veiebåt (85 mm × 85 mm × 25 mm) med et 10 mm lag ultralydgel og plasser den fylte veiebåten i den forvarmede metallveiebåtholderen.
        MERK: Å fylle veiebåten med ultralydgel vil øke embryoet og CAM. Dette kan være gunstig for injeksjon eller avbildning av embryoet og CAM, men er ikke nødvendig for å ta embryoet og CAM ut av eggeskallet.
      4. Forbered noen stykker tape (rundt 3 cm lengde) med en del av den ene enden brettet tilbake på seg selv slik at det ikke fester seg lenger.
    2. Ta egginnholdet ut av eggeskallet
      1. Ta et 5 dager gammelt inkubert befruktet egg og overfør det til den forvarmede metalleggholderen (figur 1A, B). Sørg for å holde egget i samme retning (dvs. dato på toppen).
        MERK: Det er viktig å holde egget i samme retning for å holde luftsekken og embryoet og CAM på samme posisjon i toppen av egget.
      2. Bruk den spisse baksiden av en pinsett (eller lignende; Figur 1E) for å lage et lite innrykk helt øverst på egget (der datoen er skrevet) (figur 2A).
      3. Bruk den spisse baksiden av pinsetten til å lage et nytt innrykk på siden av egget rundt 2/3 ned i egget (figur 2B).
        MERK: Vær forsiktig så du ikke gjør innrykket for stort og lag et hull. Hvis det ved et uhell oppstår et hull, må du forsegle hullet med tape og ikke lage et nytt innrykk.
      4. Bruk den større pinsetten (figur 1E), ta ut et lite stykke eggeskall fra det innrykkede området på toppen av egget (med skriftlig dato). Pass på at luftsekken i toppen av eggeskallet kommer i kontakt med luften utenfor egget, men ikke penetrer skallet for dypt.
        MERK: Hvis skallet penetreres for dypt når du lager det øverste innrykket, kan embryoet og CAM bli skadet, og embryoet vil ikke overleve fjerningen fra skallet. Det er viktig at det lille hullet på toppen skaper luftkontakt mellom innsiden og utsiden av egget. Hvis dette ikke er gjort, vil det bli opprettet et vakuum i de neste trinnene i prosedyren, noe som vil resultere i at store luftbobler blir fanget under CAM, noe som gjør embryoet og CAM ubrukelig. For å sjekke posisjonen til luftsekken inne i egget, kan en lyskilde brukes siden posisjonen ikke alltid er nøyaktig øverst og også kan være mer til siden.
      5. Bruk en 5 ml sprøyte og 19 G kanyle til å trenge inn i skallet gjennom det andre innrykket på siden 2/3 ned i egget og trekk ut ~2 ml eggehvite (figur 2C).
        MERK: Forsikre deg om at nålen peker ned mot bunnen av egget for å forhindre sjansen for å skade embryoet og CAM. Dette trinnet skaper en større luftlomme i toppen av egget som trengs for fjerning av egginnholdet. Hvis et hull ved et uhell opprettes i stedet for et innrykk i trinn 1.2.2.3, punkterer du båndet med nålen for å trekke ut eggehviten. Forsegl punkteringen med et annet stykke tape.
      6. Ta ut kanylen og bruk tape for å tette spalten på siden (figur 2D).
        MERK: For å forhindre at eggehvite lekker ut av egget, kan det øverste hullet lukkes med en finger før du tar nålen ut. Hvis eggehvite fortsetter å lekke ut med tapen allerede på plass, må du først fjerne eggehviten med et stykke vev for å sikre at båndet fester seg ordentlig.
      7. Tøm sprøyten ved å legge eggehviten i veiebåten.
      8. Bruk den store pinsetten (figur 1E) til å forstørre den lille åpningen på toppen av egget (figur 2E). Når du ser inne i egget gjennom åpningen på toppen, er embryoet og CAM synlige. Fortsett å finne embryoet og CAM mens du tar bort så mye av eggeskallet som mulig (figur 2F).
        MERK: Fortsett å bevege egget for å opprettholde maksimal synlighet på embryoets posisjon og CAM inne i skallet. Forsikre deg om at kanten på åpningen i skallet ikke går lavere enn CAM. I tillegg til dette, ikke trenge inn i den indre membranen og forhindre skarpe kanter.
      9. Etter å ha opprettet åpningen, snu egget 180 ° og legg egget tilbake i eggholderen på en slik måte at den opprettede åpningen øverst på egget nå vender mot bunnen. Embryoet vil flyte opp og vil bli usynlig fra bunnen (Figur 2G) som tar 1-2 min. Forsikre deg om at hele embryoet og CAM (inkludert alle karene) har forsvunnet og at bare eggeplomme er synlig før du går videre til neste trinn (figur 2H).
        MERK: Hvis embryoet fortsatt er synlig fra bunnen etter 2 minutter, vri egget med klokken i 1-2 min. Dette vil hjelpe embryoet og CAM til å flyte opp.
      10. Fjern båndet fra sideåpningen. Se om innsiden av egget nå buler ut av bunnåpningen. Hvis dette er tilfelle, fortsett til neste trinn. Hvis ikke, bruk nålen på sprøyten til å punktere åpningen på siden igjen for å frigjøre vakuumet i egget. Sørg for å peke oppover med nålen for å forhindre sjansen for å punktere eggeplommesekken. Fortsett til egget buler ut av bunnåpningen.
      11. Mens du holder bunnen av egget nær veiebåten i metallvektholderen (figur 1C, D), gjør du forsiktig, men raskt en horisontal ripe i membranen over hele åpningens bredde ved hjelp av et av de skarpe punktene på den lille pinsetten (figur 1F) og slipp egginnholdet forsiktig ned i veiebåten (figur 2I).
        MERK: Hvis egginnholdet ikke kommer ut, bruk kanylen på sprøyten til å punktere sideåpningen igjen med kanylen pekende oppover.
      12. Hvis embryoet er i veiebåten sidelengs, vil det vanligvis gå opp av seg selv. Hvis dette ikke skjer, bruk et stykke silkepapir for å flytte embryoet. Legg den ene siden av silkepapiret på embryoet, dra silkepapiret til den andre enden, og slipp silkepapiret med noen dråper ~ 30 μL PBS (37 ° C) ved hjelp av en plast Pasteur-pipetter.
      13. Kontroller visuelt om embryoet er i live ved å sikre at hjerterytmen fortsatt er tilstede, CAM-karene er intakte og det er ingen blødning, og det er ingen lekkasje av eggeplomme. Hvis en av disse tingene ikke er riktig, kast embryoet og CAM fordi det ikke vil være levedyktig.
      14. Forsikre deg om at embryoet og CAM holdes ved 37 ° C og ikke tørker ut fordi dette vil gjøre at CAM-karene forverres og til slutt vil embryoet dø. For å forhindre dette, legg regelmessig små dråper på ~ 30 μL på 37 ° C PBS på embryoet og CAM.
  3. Forbereder 6 til 7-dagers (144-168 timer) gammelt embryo (HH stadium 28-32)22
    1. Forberedelse av arbeidsområde
      1. Forbered scenen som beskrevet i pkt. 1.2.1.
    2. Ta egginnholdet ut av eggeskallet
      1. To timer før forsøket, ta et 6 til 7 dager gammelt ruget egg og roter egget 180 ° inne i inkubatoren slik at toppen av egget vender mot bunnen. Etter 1 time, roter egget tilbake til sin opprinnelige posisjon og la det stå i ytterligere 1 time.
        MERK: Å rotere egget 2 timer i forkant av forsøket vil gjøre det lettere å ta egginnholdet ut av skallet.
      2. Etter rotering, ta egget fra inkubatoren.
      3. Utfør trinn 1.2.2.2 til trinn 1.2.2.4.
      4. Bruk en 5 ml sprøyte og 19 G kanyle til å trenge inn i skallet gjennom det andre innrykket på siden 2/3 ned i egget og trekk ut mellom 5-6 ml eggehvite. Forsikre deg om at nålen peker ned mot bunnen av egget.
        MERK: Med 5 ml sprøyten vi brukte, er det mulig å trekke ut opptil 6 ml, så bare en penetrasjon er nødvendig.
      5. Ta ut kanylen og bruk et stykke tape for å tette gapet på siden (figur 2D).
      6. Tøm sprøyten ved å legge eggehviten til ultralydgelen i veiebåten.
      7. Bruk den store pinsetten (figur 1E) til å forstørre den lille åpningen på toppen av egget (figur 2E). Prøv å gjøre åpningen så stor som mulig, men sørg for at kanten av åpningen i skallet ikke går lavere enn CAM. I tillegg til dette, ikke trenge inn i den indre membranen og prøv å forhindre skarpe kanter.
      8. Fyll en sprøyte med ~1 ml mer av 37 °C PBS enn det opptrukne volumet i trinn 1.3.2.4.
      9. Ta av båndet fra sidegapet, penetrer gapet med den fylte sprøyten og tøm den inn i skallet. Forsikre deg om at nålen peker ned mot bunnen av egget.
        MERK: Siden eggehvite har høyere viskositet (~ 160 cP) 27 enn PBS (~ 1 cP), reduserer eggehviten med PBS både spenning og stress på embryoet og CAM mens du tar egginnholdet ut av skallet.
      10. Ta ut kanylen og lukk raskt hullet igjen med et stykke tape (figur 2D).
      11. Snu egget 180° og legg egget tilbake i eggholderen på en slik måte at den opprettede åpningen øverst på egget nå vender mot bunnen. Vri egget med klokken til hele embryoet og CAM (inkludert alle karene) har forsvunnet og bare eggeplomme er synlig.
      12. Utfør trinn 1.2.2.10 til trinn 1.2.2.14.
  4. Forbereder 8-dagers (192 timer) gammelt embryo (HH stadium 32-35)22
    1. Forberedelse av arbeidsområde
      1. Varm opp en varmeplate til 37 °C.
      2. Plasser en båtholder av metall (figur 1C,D) og en 10 ml Erlenmeyer fylt med PBS på varmeplaten.
      3. Ta en grunn beholder på 170 x 110 x 70 mm, eller lignende, og fyll beholderen med 1 l på 37 °C PBS.
      4. Plasser en veiebåt (85 × 85 × 25 mm) i en petriskål med diameter på 90 mm. Plasser petriskålen og veiebåten i bunnen av beholderen og sørg for at de er helt nedsenket.
    2. Ta egginnholdet ut av eggeskallet
      1. To timer før forsøket, ta et 8 dager gammelt ruget egg og roter egget 180 ° inne i inkubatoren slik at toppen av egget vender mot bunnen. Etter 1 time, roter egget tilbake til sin opprinnelige posisjon og la det stå i ytterligere 1 time.
        MERK: Å rotere egget 2 timer i forkant av forsøket vil gjøre det lettere å ta egginnholdet ut av skallet.
      2. Ta et 8 dager gammelt inkubert egg fra inkubatoren.
      3. Hold egget horisontalt og bruk den spisse baksiden av den store pinsetten (figur 1E) for å lage et lite innrykk 1/2 nedover egget. Fortsett å lage små innrykk i et ringmønster 360° rundt eggeskallet. Bruk en avstand på ~10 mm mellom innrykkene.
        MERK: Under denne prosedyren kan små sprekker begynne å danne seg mellom innrykkene.
      4. Etter å ha laget de små innrykkene rundt skallet, lag et større hull ved å knekke skallet mellom to små innrykk ved hjelp av den spisse baksiden av den store pinsetten.
      5. Senk egget helt ned i 37 °C PBS og hold det nedsenket i 5 minutter. Etter 5 min, hold egget nær veiebåten inne i beholderen. Legg toppen av begge tommelen i det store hullet og åpne egget forsiktig. Egget vil sprekke langs de små innrykkene.
      6. Når sprekken dannes hele veien rundt eggeskallet, prøv forsiktig å trekke de to eggeskallbitene fra hverandre og fortsett forsiktig å flytte de to stykkene frem og tilbake til egginnholdet er skilt fra skallet. Slipp deretter egginnholdet forsiktig ned i veiebåten.
        MERK: Ved å flytte de to bitene eggeskall frem og tilbake, vil mer PBS strømme inn i eggeskallet, noe som vil bidra til å skille egginnholdet fra skallet. Noen ganger vil litt eggehvite holde seg til innsiden av eggeskallet. Når dette skjer, bruk pinsetten til å skille eggehviten fra skallet.
      7. Løft petriskålen sakte som inneholder veiebåten og egginnholdet fra PBS. Når du er ute av PBS, vipper du veiebåten litt for å fjerne overflødig PBS.
      8. Plasser veiebåten som inneholder egginnholdet i metallvektholderen og gå til ønsket eksperimentelt oppsett.

2. Utvalgte applikasjoner

  1. Injisering av mikrobobler og/eller andre oppløsninger i CAM-karene
    1. Klargjøre injeksjonsoppsettet
      1. Trekk glassnåler fra glasskapillærrør ved hjelp av en mikrosmie (figur 3A) eller kjøp trukket glasskapillærnåler.
      2. Hvis spissen av glasskapillærnålen ikke er skråstilt, bryt av en liten del av spissen av nålen. Fyll glassnålen med mineralolje og legg den i et mikroinjeksjonssystem. Pass på at det ikke er luftbobler i mineraloljen i glassnålen.
        MERK: Mineraloljen tilsettes i henhold til instruksjonene fra produsenten av injeksjonssystemet vi brukte.
      3. Tøm kapillærnålen i trukket glass så langt mikroinjeksjonssystemet tillater det, og fyll glassnålen delvis med luft.
        MERK: Den lille biten av luft vil forhindre blandingen av mineralolje og løsningen som skal injiseres.
      4. Sett 10 μL av ønsket løsning, i denne protokollen mikrobobler, på et stykke voksaktig film (figur 3B). Hvis det er behov for mer enn én løsning, kan oppløsninger blandes før pipettering7.
        MERK: Før du fyller nålen med mikrobobler, la mikroboblen falle på den voksaktige filmen i ~ 1 min, slik at mikroboblene flyter til toppen av dråpen og blir konsentrert. For F-type skreddersydd ultralydkontrastmiddel28, vil dette konsentrasjonstrinnet øke mikroboblekonsentrasjonen som skal injiseres med ~ 30%. Konsentrasjonen etter injeksjon i kyllingembryoblodet vil være mellom 32 x 103 mikrobobler/μL for 5 dager gamle embryoer og 19 x 103 mikrobobler/μL for 6 dager gamle embryoer.
      5. Fyll glassnålen med mikroboblen og/eller annen oppløsning ved å plassere kanylespissen i dråpen på den voksaktige filmen. Når du aspirerer mikrobobler, må du sørge for å plassere nålespissen i toppen av væskedråpen for å aspirere den mikrobobleberikede løsningen.
        MERK: Før du injiserer mikrobobler, løft spissen av glassnålen til sitt høyeste punkt og vent i ~ 2 minutter. Dette vil sikre at mikroboblene vil konsentrere seg i spissen av glassnålen.
  2. Injeksjon i CAM-karene
    1. Før injeksjon, se på CAM under et stereomikroskop og velg det beste karet å injisere. Injiser alltid i en av embryoets årer . Dette er fartøyene der blodstrømmen beveger seg mot embryoet. Venene er lysere i fargen enn arteriene på grunn av oksygenert blod29. I tillegg er vener alltid på toppen av arterien med to unntak, nemlig de fremre og bakre vitellinske venene (dvs. de mindre forgrenede venene, indikert med stjerner i figur 6A, B) som ikke har en arterie i omgivelsene.
      MERK: Injeksjon i en av grenene vil begrense obstruksjonen av blodstrømmen under injeksjonen. Gode injeksjonssteder er indikert med pilspisser i figur 6A,B. Det er avgjørende å injisere i venen, da dette vil tvinge det injiserte stoffet til å strømme mot embryoet. I tillegg til dette vil injeksjon i arterien resultere i en massiv blødning når du fjerner glassnålen som vil drepe embryoet.
    2. Plasser glassnålen og embryoet på en slik måte at glassnålspissen og den valgte venen er i samme fokalplan og i samme retningslinje. Prøv å plassere nålen så horisontal som mulig parallelt med den valgte venen. Kanylespissen skal berøre karveggen.
      MERK: Ved å plassere glassnålen så horisontal som mulig, er sjansen for å stikke gjennom hele karet lavere.
    3. Etter posisjonering går du sakte fremover og trenger inn i karveggen med glassnålen. Under penetrasjon vil CAM først bli skjøvet bort ved bevegelse av glassnålen. Fortsett å fremme glassnålen til karveggen er penetrert.
      MERK: Hvis fartøyet ved et uhell blir gjennomboret gjennom og gjennom, trekker du sakte nålen tilbake for å komme tilbake i lumen. Når du er tilbake inne i lumen, løft nålen litt opp og beveg deg fremover langs karet for å plassere nålen.
    4. Etter penetrasjon, trekk glassnålen litt tilbake for bedre å plassere spissen inne i fartøyets lumen og flytt glassnålen sidelengs for å kontrollere at den ikke er festet til karveggen. Injiser langsomt en liten mengde av oppløsningen for å bekrefte at spissen er plassert inne i karlumen (figur 3C).
    5. Forsikre deg om at den injiserte oppløsningen følger blodstrømmen. Hvis den ikke gjør det, beveg glassnålen litt og fortsett å injisere små mengder til glassnålen er riktig plassert17.
    6. Når ønsket mengde injiseres, la glassnålen ligge i karet i ~ 15 s for å forhindre massiv blødning. Flytt deretter glassnålen litt sidelengs, opp og ned, og frem og tilbake et par ganger for å tillate en forsiktig tilbaketrekning av glassnålen.
      MERK: Noen blødninger er normale. For hver injeksjon bruk en ny glassnål fordi glassnålen lett blir tilstoppet og stump fra eggehvite.
  3. Mikroskopiavbildning av embryoet og/eller karene
    1. Forbereder holder med akustisk membran
      1. Ta et cellekulturkammer bestående av en firkantet plastholder med to parallelle 50 μm tykke akustisk gjennomsiktige polykarbonatmembraner26, videre referert til som holder med akustisk membran. Lukk begge portene med et lokk.
      2. Bruk en skalpell for å fjerne en av de to membranene fra holderen med akustisk membran.
        MERK: For å fjerne membranen, kutt membranen like ved siden av limlinjen på plasten. Vær forsiktig så du ikke glir av fra kanten for å forhindre skade på den andre membranen.
      3. Forbered ~ 15 ml 2% agarose i demi vannløsning ved oppvarming til mellom 80-95 ° C i et lite glassbeger. Avkjøl glassbegeret med den oppløste agaroseoppløsningen under en rennende kaldtvannskran.
        MERK: Hvis agarose er for varm, vil den smelte den akustiske membranen som vil skape en ujevn overflate.
      4. Når oppløsningen er avkjølt til rundt 37 °C, hell oppløsningen sakte i holderen med akustisk membran til den fyller opp hele holderen. Vipp holderen litt med akustisk membran slik at agaroselaget fordeler seg jevnt inne i plastrammen (figur 4A). Forsikre deg om at agaroselaget er flatt og la agarose stivne ved romtemperatur.
    2. Fjerne embryo og CAM fra eggeplommesekk og plassere på holder med akustisk membran
      1. Trekk egginnholdet ut av egget som beskrevet i pkt. 1.2, 1.3 eller 1.4.
      2. Hvis nødvendig, injiser alternativ behandling med mikrobobler og/eller andre oppløsninger som beskrevet i pkt. 2.1.2.
      3. Fyll en 1 l petriskål med ~500 ml 37 °C PBS og plasser holderen med akustisk membran med agarose på bunnen av fatet. Forsikre deg om at agaroselaget vender opp.
      4. Bruk en liten saks til raskt å skjære i membranen på plommesekken, også kalt Vitellus-membranen, rundt hele CAM mens egginnholdet er i veiebåten (figur 4B). Hold saksen i samme posisjon og roter veiebåten mens du klipper for bedre presisjon og mer fart.
        MERK: Fra det øyeblikket det første kuttet er gjort, begynner eggeplommen å lekke. Dette reduserer synligheten av embryoet og CAM. Prøv å kutte hele veien rundt CAM innen 6-7 kutt. Dette bør ikke ta mye lengre tid enn 20 s. Den lille pinsetten (figur 1F) kan brukes til å holde kanten av vitellinmembranen og forhindre kutting i CAM.
      5. Bruk en spiseskje til å øse opp den utskårne membranen som inneholder embryoet og CAM fra veiebåten. Løft skjeen sakte fra veiebåten og inspiser visuelt om den utskårne membranen som inneholder embryoet og CAM fortsatt er festet til resten av plommesekkmembranen. Når dette er tilfelle, bruk saksen til å lage et ekstra kutt. Mens du øser, vipp skjeen litt for å bli kvitt så mye eggeplomme som mulig, men ikke la den tørke ut. Overfør den utskårne membranen som inneholder embryoet og CAM til 1 l petriskålen, senk ned i 37 °C PBS, og fjern skjeen.
      6. Når membranen som inneholder embryoet og CAM er nedsenket i 37 ° C PBS, bruk den lille pinsetten (figur 1F) til å ta tak i den ene kanten av membranen og forsiktig virvle rundt membranen for å kvitte seg med eggeplommen som fortsatt er festet.
      7. Når all eggeplommen er fjernet, bruk den lille pinsetten til å bevege membranen som inneholder embryoet og CAM og plasser den over holderen med akustisk membran.
      8. Bruk en insektprøvepinne for å feste membranen som inneholder embryoet og CAM i det ene hjørnet. Unngå piercing fartøyene i CAM og bare pin ned membranen.
      9. Bruk en annen insektprøvepinne for å feste membranen som inneholder embryoet og CAM på diagonalt motsatt hjørne.
      10. Løft holderen sakte med den akustiske membranen som inneholder embryoet og CAM fra 37 °C PBS. Vipp holderen litt for å kvitte seg med det meste av PBS.
      11. Bruk den lille pinsetten (figur 1F) til å strekke og jevnt fordele membranen som inneholder embryoet og CAM-en over holderen med akustisk membran og feste resten av membranen. Forsikre deg om at membranen som inneholder embryoet og CAM er litt strukket for å sikre at den er flat (figur 4C).
      12. Plasser holderen med akustisk membran med den låste membranen som inneholder embryoet og CAM i et mikroskopioppsett som holdes ved 37 °C.
      13. Plasser et deksel eller en akustisk og optisk gjennomsiktig membran (avhengig av ønsket mål og bruk av ultralyd eller ikke) på toppen av interesseområdet på embryoet eller CAM (figur 4D) for å tillate optisk visualisering.
  4. Ultralydavbildning av kyllingembryoet og/eller CAM-karene
    1. Ultralydavbildning fra siden av kyllingembryoet og CAM-karene
      1. Ta ut egginnholdet som beskrevet i pkt. 1.2, 1.3 eller 1.4. Bruk imidlertid ikke en standard veiebåt. Bruk i stedet en skreddersydd veiebåt med en akustisk gjennomsiktig vegg.
        MERK: Standard veiebåt ble justert ved å kutte av den ene siden av veiebåten og erstatte den med et vindu med polyesterfolie som ble limt sammen med epoksylim.
      2. Senk den foretrukne ultralydtransduseren i et 37 ° C vannbad og posisjon på ønsket sted med ønsket avstand.
      3. Plasser veiebåten i vannbadet på en slik måte at den gjennomsiktige veggen vender mot transduseren. Forsikre deg om at veiebåten er dyp nok til å være på nivå med svingeren, men unngå at vann kommer inn i veiebåten (figur 5A).
      4. Hvis ønskelig, legg til et annet oppsett på toppen av embryoet eller CAM-karene, som et mikroskop eller en laser (figur 5A).
    2. Ultralydavbildning fra toppen av embryoet og CAM-karene uten akustisk interferens
      1. Fyll et 2-liters begerglass med 37 °C PBS. Plasser et 500 ml begerglass opp ned på bunnen av 2-liters begerglasset. Unngå luft inne i 500 ml begerglasset.
        MERK: 500 ml begerglasset er ment å heve veiebåten som inneholder egginnholdet nærmere PBS-overflaten. Ved å erstatte begeret med gjenstander med andre størrelser, kan avstanden mellom transduseren og egginnholdet varieres.
      2. Plasser det fylte 2-liters begerglasset med 500 ml begerglasset inni i et 37 °C vannbad.
      3. Ta ut egginnholdet som beskrevet i pkt. 1.2, 1.3 eller 1.4.
      4. Fukt egginnholdet med 37 °C PBS og dekk embryoet med klar klamfilm. Dette kan gjøres for å holde embryoet i samme posisjon og forhindre at det roterer eller flyter bort.
        MERK: Ved å fukte egginnholdet med PBS, blir det mindre klebrig, noe som gjør det lettere å dekke egginnholdet med klar klamfilm.
      5. Plasser veiebåten med egginnholdet i en petriskål med diameter på 90 mm og senk petriskålen sakte ned i PBS (figur 5B).
        MERK: Ved å bruke to klemmer på sidene av petriskålen motsatt hverandre, blir det lettere å senke petriskålen.
      6. Plasser ultralydtransduseren med ønsket avstand.
    3. Ultralydavbildning av kyllingembryoet og CAM-karene med en bevegelig svinger
      1. Ta ut egginnholdet som beskrevet i pkt. 1.2, 1.3 eller 1.4.
      2. Forbered en 2% agaroseoppløsning i demivann ved å varme opp oppløsningen til mellom 80-95 °C i et lite glassbeger. Avkjøl glassbegeret med den oppløste agaroseoppløsningen under en rennende kaldtvannsfane.
      3. Hell agaroseoppløsningen i en flat beholder for å lage en ca. 1 mm tykk agarosepute. Når den er helt avkjølt og stivnet, kutt agaroseputen til ønsket størrelse ved hjelp av en skalpell.
        NOTAT: Tykkelsen på agaroseputen kan endres for å oppnå ønsket brennvidde som er nødvendig for riktig funksjon av ultralydtransduseren.
      4. Plasser agaroseputen oppå embryoet og alternativ behandling (figur 5C). Tilsett noen dråper ~ 30 μL på 37 ° C PBS på toppen av agaroseputen for å skape et tynt PBS-lag mellom agaroseputen og transduseren.
        MERK: Bruk av PBS forhindrer at transduseren fester seg til agaroseputen. Dette er gunstig når du for eksempel bruker en motor til å mekanisk flytte en todimensjonal svinger for å lage en tredimensjonal skanning (figur 9B) 11. Når transduseren ikke trenger å flyttes, kan PBS også erstattes med ultralydgel.
      5. Plasser ønsket ultralydtransduser.

Representative Results

I denne protokollen beskriver vi tre metoder for å ta egginnholdet ut av skallet på dag 5-8 av inkubasjon (HH 26-3522). Figur 6 viser egginnholdet i veiebåter etter at det ble tatt ut av skallet. Det 5 dager gamle embryoet og alternativ behandling (figur 6A) ble tatt ut med metoden beskrevet i pkt. 1.2. De 6 og 7 dager gamle embryoene og alternativ behandling (figur 6B,C) ble tatt ut med metoden beskrevet i pkt. 1.3. Det 8 dager gamle embryoet og alternativ behandling (figur 6D) ble tatt ut med metoden beskrevet i pkt. 1.4. Ingen blødning eller skade på embryoet eller CAM kan observeres, noe som indikerer at disse metodene kan brukes til å trygt få egginnholdet ut av skallet uten å skade embryoet eller CAM-karene. Når den utføres riktig, vil metoden for de 5-dagers gamle embryoene gi et levedyktig embryo og intakt CAM i 90% av alle prosedyrer. Levedyktighetsgraden er basert på det totale antall befruktede egg som vellykket ekstraheres fra eggeskallet. Med den andre metoden, for 6 og 7-dagers inkuberte egg, er sjansen for et levedyktig embryo og intakt CAM rundt 75% for 6 dager gammel og rundt 50% for 7 dager gammel. Med den tredje metoden som er beskrevet for 8 dager gamle embryoer, er sjansen for et levedyktig embryo og intakt CAM rundt 60%. Forskjeller i utviklingsstadier mellom de 5 og 8 dager gamle embryoene kan observeres som er enige med Hamburger og Hamilton22. Både størrelsen på embryoet og kompleksiteten til CAM-karene øker under utviklingen (figur 6A-D). Figur 6C viser en tynn flekk agarose på toppen av egginnholdet som gjør at embryoet og CAM kan avbildes ved hjelp av ultralydoppsettet vist i figur 5C. Etter at egginnholdet er tatt ut av skallet, er hjerteslaget til embryoet synlig med det blotte øye. Hjertefrekvensen til disse ex ovo-embryoene er lik i ovo-embryoer ved 183 slag per minutt (bpm) på dag 5 opp til ~ 208 bpm på dag 830. Når det holdes fuktet og ved 37 °C, vil embryoet opprettholde denne hjertefrekvensen i ~ 5 timer i de eksperimentelle ultralydoppsettene.

Flere komplikasjoner kan oppstå under de tidligere beskrevne tre metodene. Figur 7A viser fanget luft under CAM som gjør embryoet uegnet for ultralydavbildning, og trykket fra luftboblen (e) kan også skade embryoet og / eller CAM. Dette problemet oppstår når luftsekken inne i skallet ikke kommer i kontakt med luften utenfor skallet når du tar egginnholdet ut av skallet. Figur 7B viser en liten lekkasje av eggeplomme fra plommesekken øverst til høyre i bildet. Dette kan skje mens du tar egginnholdet ut av skallet når eggeplommesekken blir skadet av skarpe kanter på skallet eller når eggeplommesekken penetreres av pinsetten. Lekkasje av eggeplommen kan påvirke synligheten til embryoet og CAM-karene. Figur 7C viser et embryo der en luftboble er fanget under CAM. Dette skjer noen ganger i den embryonale utviklingen. En annen komplikasjon som kan oppstå er skade på fartøyene. Denne skaden kan oppstå mens du tar egginnholdet ut av skallet eller når du utfører en injeksjon (figur 7D). I tillegg til dette kan embryoet og karene også tørke ut over tid (figur 7E). Dette skjer når egginnholdet ikke er drysset med PBS. Uttørking av embryoet kan resultere i massive kapillære hindringer (figur 7F) som påvirker embryoets levedyktighet. De massive kapillære hindringene kan også forekomme under utvikling eller når hjerteslaget til embryoet ikke er stabilt.

Etter at egginnholdet er tatt ut av skallet uten komplikasjoner, kan embryoet injiseres med for eksempel ultralydkontrastmidler som mikrobobler (figur 3C). Figur 8 viser sirkulerende mikrobobler i blodkarets lumen ved injeksjon. Disse mikroboblene bæres sammen med blodstrømmen og forblir tilstede i blodsirkulasjonen i flere timer (Supplemental Video 1). Tilstedeværelsen av disse mikroboblene i sirkulasjonen skaper muligheten til å utføre forskjellige typer CEUS og legemiddelleveringseksperimenter 7,11,12. CAM er ideell for å undersøke nye ultralydkontrastdeteksjonsmetoder som vi viser tre eksempler på. Figur 9A viser høyfrekvent ultralyd subharmonisk avbildning av et 6 dager gammelt kyllingembryo i B-modus og CEUS før og etter mikrobobleinjeksjon. Her ble CAM-karene injisert med 5 μL ultralydkontrastmiddel og avbildning ble utført med en preklinisk dyreultralydmaskin med en MS250-sonde (30 MHz overføring og 15 MHz mottaksfrekvens, 10% effekt). Før mikrobobleinjeksjon kan man allerede se kontrast inne i embryonalt hjerte i B-modus-bildene (figur 9A-I). Dette fenomenet skyldes tilstedeværelsen av en kjerne i aviær rød blodcelle som øker blodkontrasten i ultralydavbildning 5,31. Tilsetningen av mikroboblene økte kontrasten og synligheten til embryoet, både i B-modus og CEUS-avbildning. Figur 9B viser et optisk og et høyfrekvent 3D subharmonisk bilde av et 6 dager gammelt embryo og de omkringliggende karene. CAM ble injisert med 5 μL ultralydkontrastmiddel og avbildning ble utført med en preklinisk dyreultralydmaskin med MS550s sonde (overføringsfrekvens på 40 MHz, topp negativt trykk ~ 300 kPa). Disse resultatene viser at CEUS-avbildningen kombinert med et kontrastmiddel også kan brukes til å lage høyfrekvente 3D-subharmoniske bilder og til å avbilde blodkarene utenfor embryoet. Figur 9C viser et optisk bilde og et ultraharmonisk intravaskulært ultralydbilde (IVUS) laget med en tilpasset sonde av CAM-mikrovesseler av et 6 dager gammelt embryo (26 MHz overføring og 39 og 65 MHz mottaksfrekvens). CAM-kar ble injisert med 4 ± 1 μL ultralydkontrastmiddel. Det optiske bildet og IVUS-bildet er fra samme embryo og samme interesseområde som viser tilsvarende fartøynettverk.

Kyllingembryoet og CAM-karene kan også brukes til å undersøke ultralydmediert legemiddellevering som vi viser ett eksempel på. Siden eggeplommen hindrer lysbanen under avbildning, er fjerning av eggeplommesekken nødvendig for optisk å undersøke legemiddellevering i embryo- og CAM-karene. For denne studien ble embryoet og CAM klargjort for mikroskopisk avbildning som forklart i pkt. 2.2 ved å separere membranen som inneholder embryoet og CAM fra plommesekken (figur 4C). I disse embryoene er hjertefrekvensen stabil rundt 80 slag per minutt, og embryoene holder seg i live i opptil 2 timer når de holdes ved 37 °C7. Figur 10 viser en ultralyd- og mikroboblemediert legemiddelleveringsstudie i endotelceller i CAM-karene. Lipidbelagte mikrobobler, målrettet mot karveggen ved hjelp av αvβ 3-antistoffer og farget med det fluorescerende fargestoffet DiI7, ble injisert i CAM-karene (figur 10A, C). CAM-fartøyets endotelcellekjerner ble farget med Hoechst 33342 (figur 10B) og modellmedikamentet Propidiumiodid (PI) ble brukt til å visualisere sonoporasjon7. Begge disse fargestoffene ble injisert samtidig med mikroboblene. Ved ultralydbehandling (1 MHz, 200 kPa topp negativt trykk, enkeltutbrudd på 1000 sykluser) ble PI-opptak observert i kjernene nærmest de målrettede mikroboblene (figur 10D). Dette viser at ultralydinduserte svingninger av de målrettede mikroboblene var i stand til å skape en pore i endotelcellemembranen.

Figure 1
Figur 1. Utstyr for forberedelse av embryoer. (AB) topp- og sidevisning av metalleggholderen og (C-D) topp- og sidevisningen av metallveiebåtholderen. (E-F) pinsett trengte å ta egginnholdet ut av skallet. Skala i cm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2. Prosedyre for fjerning av embryo. (A) Lite innrykk på toppen av egget, indikert med den svarte sirkelen. (B) Lite innrykk 2/3 nedover egget, indikert med den svarte sirkelen. (C) Uttak ~ 2 ml eggehvite. (D) Forseglet gap på siden med tape. (E) Forstørre den lille åpningen på toppen av egget. (F) Embryoet blir synlig etter fjerning av en del av skallet. (G-H) Etter å ha rotert egget 180°, flyter embryoet opp og blir usynlig (pilene indikerer bevegelsesretningen til embryoet). Etter 1-2 minutter er embryoet usynlig fra bunnen. (I) Etter å ha skrapt membranen, faller egginnholdet ned i veiebåten. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3. Injeksjon av mikrobobler i CAM-karene. (A) Kapillærnål av glass. Skala i cm. ( B ) Propidiumjodid (PI) oppløsning (venstre dråpe) og mikrobobler (høyre dråpe) før aspirasjon før injeksjon. Kanylen (beskrevet i svart) kan ses øverst til høyre (C) Microbubble injeksjon. Kapillærnålspissen er plassert inne i lumen i en av venene (venstre). Mikrobobler, den hvite skyen indikert med en pil, injiseres og spres etter blodstrømmen (høyre). Skalalinjen representerer 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4. Fjerning av embryo og CAM fra eggeplommesekk og plassering på holder med akustisk membran. (A) Holder med akustisk membran fylt med agaroselag. (B) Kyllingembryo og CAM-fartøy i veiebåt før kutting. Stiplet linje angir skjærelinjen rundt CAM. (C) Kyllingembryo og CAM separert fra eggeplomme og festet på akustisk membran. (D ) Festet kyllingembryo med en akustisk og optisk gjennomsiktig membran i en holder (blå) plassert på toppen av CAM. Holderen kan fylles med demi vann slik at en vanndyping mål kan brukes. Alle skalastenger representerer 1 cm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5. Ulike oppsett for kyllingembryo og CAM ultralydbilder. (A) Oppsett for ultralydavbildning fra siden. Kyllingembryoet ble plassert i en spesialtilpasset veiebåt med en akustisk gjennomsiktig vegg og plassert i et 37 °C vannbad. Ultralydtransduseren ble plassert på venstre (a) side ved siden av den akustisk gjennomsiktige veggen og laseren (b) for fotoakustisk avbildning på toppen. (B) Oppsett for ultralydavbildning fra toppen. Embryo og CAM ble nedsenket i et beger av PBS som ble plassert i et 37 ° C vannbad. Stiplet omriss viser 2 L glassbeger (a) med 500 ml glassbeger (b) inni. (C) Oppsett for ultralydavbildning fra toppen med en bevegelig transduser. En tynn agarosepute (stiplet linje) ble plassert på toppen av embryoet med et tynt lag PBS som kobling mellom transduseren og agaroseoverflaten. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6. Egginnhold utenfor skallet. (A) Egginnhold tatt ut av skallet etter 5 dagers inkubasjon. Chorioallantoic membran (CAM), embryo kropp (EB), fremre og bakre vitelline vener (*), og passende injeksjonssteder (pilspisser) er indikert. (B) Egginnhold tatt ut av skallet etter 6 dagers inkubasjon. Fremre og bakre vener (*) og egnede injeksjonssteder (pilspisser) er indikert. (C) Egginnhold tatt ut av skallet etter 7 dagers inkubasjon. En av agarose er plassert på toppen for å tillate ultralydavbildning. Hjørnene på agaroseplasteret er indikert med svarte sirkler. (D) Egginnhold tatt ut av skallet etter 8 dagers inkubasjon. Alle skalastenger representerer 1 cm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7. Komplikasjoner som kan oppstå under prosedyrene med kyllingembryoet og CAM-modellen. (A ) Luftbobler fanget under CAM når du tar egginnholdet ut av skallet ved hjelp av metode 1.2 (5 dager gammelt embryo) eller 1.3 (6 til 7 dager gammelt embryo). (B) Liten lekkasje av eggeplomme indikert med en pil øverst til høyre (6 dager gammelt embryo). (C) Luft fanget under CAM, indikert med den svarte stiplede sirkelen (7 dager gammelt embryo). (D) Blødning, indikert med de svarte pilene (5 dager gammelt embryo. (E) Tørket ut embryo og CAM (5 dager gammelt embryo). (F) Massive kapillære hindringer (5 dager gammelt embryo). Alle skalastenger representerer 1 cm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8. Mikrobobler i CAM blodkar. Fartøyets vegg er indikert med en stiplet linje og enkle mikrobobler er indikert med piler. Skalastangen representerer 20 μm. Det tilsvarende mikroskopiopptaket finner du i Supplemental Video 1. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 9
Figur 9. Kontrastforsterket ultralydavbildning i kyllingembryoer og CAM-kar. (A) Maksimal intensitetsprojeksjon av B-modus (I, III) og sanntids subharmoniske (II, IV) bilder (preklinisk ultralydmaskin fra dyr med MS250-sonde, 30 MHz-overføring og 15 MHz mottaksfrekvens, 10% effekt) av et 6-dagers gammelt embryo med en av agarose på toppen. Toppbilder (I, II) viser resultater før og nederst (III, IV) etter injeksjon av 5 μL ultralydkontrastmiddel. Skalalinjen representerer 1 mm. Dette bildet er endret med tillatelse fra Daeichin et al. 201511 (B) Optisk (venstre) og 3D subharmonisk avbildning (høyre) av et 6 dager gammelt kyllingembryo med en agarose på toppen. CAM-kar ble injisert med 5 μL ultralydkontrastmiddel og avbildning ble utført med en høyfrekvent sonde (preklinisk dyreultralydmaskin med MS550s-sonde, overføringsfrekvens på 40 MHz, topp undertrykk ~ 300 kPa, gjengitt i preklinisk dyreultralydmaskin 3-D-modus). Skalastangen representerer 5 mm. Dette bildet er endret med tillatelse fra Daeichin et al. 201511. (C) Optisk bilde (venstre) og gjennomsnittlig intensitetsprojeksjon av ultraharmonisk intravaskulær ultralyd (IVUS) (høyre) av CAM-mikrovaskulaturen til et 6 dager gammelt embryo. CAM-kar ble injisert med 4 ± 1 μL kontrastmiddel. Ultraharmonisk IVUS-avbildning ble utført med en tilpasset IVUS-sonde (transmisjonsfrekvens 35 MHz, topp undertrykk 600 kPa). Begge bildene er laget av samme embryo og region av interesse. Pilene indikerer tilsvarende fartøy i de to bildene. Skalalinjen representerer 1 mm. Dette bildet er endret med tillatelse fra Maresca et al. 201412. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren. 

Figure 10
Figur 10. Legemiddellevering til CAM-fartøyets endotelceller i 6 dager gammelt embryo. (A) Brightfield-bilde av seks αvβ3-målrettede mikrobobler, indikert med hvite piler, som fester seg til karveggen før ultralydbehandling. (B) Endotelcellekjerner fluorescerende farget før ultralydbehandling. (C) Fluorescerende bilde av de fargede målrettede mikroboblene, indikert med hvite piler, før ultralydbehandling. (D) Opptak av modellmedikamentet propidiumjodid (PI) i cellekjernene under de målrettede mikroboblene etter ultralydbehandling (1 MHz, 200 kPa topp negativt trykk, enkelt utbrudd på 1000 sykluser). Skalalinjen representerer 10 μm og gjelder for alle bilder. Dette bildet er endret med tillatelse fra Skachkov et al. 20147. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

TILLEGGSFILER

Tilleggsvideo 1. Mikrobobler i CAM blodkar. Skalalinjen representerer 20 μm. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Discussion

Denne protokollen beskriver tre metoder for hvordan man oppnår og bruker 5 til 8 dager gamle kyllingembryoer og deres CAM som en in vivo-modell for å studere kontrastforsterket ultralydavbildning og mikroboblemediert legemiddellevering. De mest kritiske trinnene for å ta 5 dager gamle (seksjon 1.2) og 6 til 7 dager gamle (seksjon 1.3) embryoer ut av skallet er: 1) gjør det lille hullet i toppen av egget for å gå gjennom hele eggeskallet i luftsekken før du trekker eggehvite; 2) Lag glatte kanter for den store åpningen i skallet. For metoden for å ta 8 dager gamle embryoer ut av skallet (seksjon 1.4) er de mest kritiske trinnene: 1) Lag et tilstrekkelig antall innrykk for å skape en fin sprekk langs egget; 2) Hold egget nedsenket i PBS. For å sikre embryoets levedyktighet for alle metoder er det viktig å holde egget og dets innhold ved 37 °C. I tillegg unngå å injisere i en CAM-arterie. Visuell overvåking av hjertefrekvensen til embryoet under studiene anbefales for å sikre embryo vitalitet. For å bekrefte det nøyaktige utviklingsstadiet av embryoet, kan indikasjonen på Hamburger & Hamilton22 brukes.

Det er viktig å forhindre skade på embryoet, CAM og eggeplommesekken. Denne skaden kan påvirke levedyktigheten, blodstrømmen og synligheten til embryoet og CAM. I tillegg gjør skade på eggeplommesekken og dermed en lav stivhet i membranen en injeksjon i CAM-karene umulig. Et 5 dager gammelt embryo har en relativt liten luftsekk, slik at for å kunne lage et tilstrekkelig stort hull i skallet gjennom hvilket egginnholdet kan fjernes, må 2 ml eggehvite trekkes tilbake. Som et resultat opprettes mer plass mellom eggeskallet og embryoet. Etter tilbaketrekking av eggehviten må et stykke tape lukke hullet der nålen gikk inn. Hvis eggehvite fortsatt lekker ut, bruk et annet stykke tape. Ved siden av dette skaper påføring av tape på hullet på siden et vakuum inne i egget som forhindrer at egginnholdet faller ut på grunn av sin egen vekt når det store hullet opprettes i trinn 1.2.2.8. Skader på embryoet eller CAM kan også oppstå når eggeskallets kant var for skarp eller når egginnholdet slippes for hardt ned i veiebåten, så eggeskallet bør holdes svært nær veiebåten. Mellom dag 5 og 6 av utviklingen begynner CAM å feste seg til skallmembranen32. Dette vedlegget øker risikoen for å skade embryoet og CAM når du tar egginnholdet ut av eggeskallet. Ved å åpne egget etter injeksjon av PBS i det for et 6 til 7-dagers inkubert egg eller i en PBS-fylt beholder som beskrevet for et 8-dagers inkubert egg, reduseres risikoen for skade. Når det gjelder en injeksjon i en CAM-vene: Hvis den første injeksjonen mislykkes, kan en andre injeksjon gjøres lenger oppstrøms i samme vene hvis skaden var liten eller i en annen CAM-vene. Separasjon av embryoet og CAM fra eggeplommen gjør embryoet og CAM-karene optisk gjennomsiktige. Som en konsekvens mister embryoet sin primære kilde til næringsstoffer33. Dette tapet av næringsstoffer kan være en forklaring på den observerte lavere hjertefrekvensen på 80 bpm sammenlignet med ~ 190 for et 6 dager gammelt embryo som fortsatt er i kontakt med eggeplommen30 og den reduserte overlevelsestiden på 2 timer etter denne separasjonsprosedyren. En annen faktor som kan spille en rolle i redusert hjertefrekvens og overlevelsestid er utfordringen med å holde eggeplommeseparert embryo og CAM-kar på 37 ° C. Et mikroskop stadium inkubator kan være til hjelp. I tillegg til dette fører løsningen av CAM fra eggeplommen sannsynligvis til mekaniske forandringer i vevet siden membranspenningen blir mindre. Den lavere membranspenningen kan føre til økt skjærhastighet i det indre karet, noe som fører til lavere hjertefrekvens.

Ex ovo kyllingembryo og CAM-fartøy har noen begrensninger som in vivo-modell, inkludert kun korttidsobservasjoner, for kontrastforbedret ultralydavbildning og mikroboblemedierte legemiddelleveringsstudier. På grunn av det lille blodvolumet på 100±23 μL ved dag 5 og 171±23 μL på dag 634, kan et maksimalt volum på ~5 μL injiseres. I de senere utviklingsstadiene (dag 7 og eldre) øker fartøyets stivhet og eggeplommeelastisiteten minker. Dette kan komplisere en vellykket injeksjon i eldre embryoer. Når mikroboblene er injisert, sirkulerer de i flere timer fordi kyllingembryoet ikke har et fullt utviklet immunsystem på dette stadiet35. Derfor blir mikrobobler ikke ryddet innen ~ 6 min som hos mennesker36,37, noe som gjør typiske ultralydmolekylære bildebehandlingsstudier med en 5-10 min ventetid for ikke-bundne målrettede mikrobobler som skal ryddes38 ikke mulig. For å målrette mikrobobler må egnede ligander som kan binde seg til aviære endotelceller brukes som tidligere beskrevet for angiogenesemarkøren αvβ37. Andre aspekter å vurdere for denne modellen er den økte vanskeligheten med å skille embryoet og CAM-karene fra eggeplommen i eldre embryoer (> 8 dager) og lavere hematokrit på ~ 20% 39 i forhold til mennesker. Sistnevnte kan påvirke mikrobobleoscillasjoner fordi det er kjent at mikrobobleoscillasjoner dempes i et mer viskøst miljø40. CAM-arterier er mindre oksygenerte enn CAM-vener41,42. Denne forskjellen bør tas i betraktning når man for eksempel studerer fotoakustisk avbildning av oksygenering i blodet.

Metodene beskrevet her tillater egginnholdet å bli tatt ut av eggeskallet på dagen for ultralydavbildning eller legemiddelleveringsstudie, vanligvis på dag 5 til 8 av inkubasjon. Dette er forskjellig fra eksisterende metoder der egginnholdet tas ut av skallet etter en 3-dagers inkubasjon og videreutvikles som ex ovo-kultur 18,20,21. Fordelene er en høyere overlevelsesrate på 90% for 5-dagers, 75% for 6-dagers, 50% for 7-dagers og 60% for 8-dagers gamle inkuberte egg sammenlignet med ~ 50% for 3-dagers gamle embryoer tatt ut av eggeskallet og videre inkubert ex ovo1,18 unngåelse av antibiotika under kultur18, 20 og stor steril inkubator for ex ovo-kulturen. Overlevelsen av de 6-til-8-dagers gamle embryoene er lavere fordi CAM begynner å feste seg til skallet21 som etterlater CAM-membranen mer utsatt for brudd ved ekstraksjon. Separasjonen av embryoet med CAM-formen eggeplommen er også beskrevet, noe som gjør embryoet og CAM optisk gjennomsiktig.

Ved å plassere egginnholdet i forskjellige oppsett, kan kyllingembryoet og CAM brukes til en rekke ultralydbildestudier, som IVUS, fotoakustisk, uten eller med ultralydkontrastmidler i 2D og 3D. Fokuset kan være på å utvikle nye ultralydpulserende ordninger eller teste ut nye transdusere. I tillegg til dette kan modellen også brukes til å undersøke nye ultralydkontrastmidler og deres oppførsel i blodkar under strømning. Siden mekanismen for mikroboblemediert legemiddellevering fortsatt er ukjent43, kan bruken av in vivo CAM-modellen bidra til å belyse mekanismen ved å studere mikrobobleoppførselen i forhold til den cellulære responsen. Endelig har CAM-karene vist seg å være et egnet system for å undersøke xenografttumortransplantasjon44. Dette skaper muligheten til å bruke CAM-karet som en modell for å undersøke tumoravbildning ved hjelp av ultralyd og for å undersøke blodstrømmen inne i svulsten ved hjelp av CEUS. Svulstene blir vanligvis podet på CAM-karene til 8 eller 9 dager gamle embryoer 1,14,45, for hvilket embryoet tas ut av eggeskallet på dag 3 av inkubasjon og videreutvikles ex ovo. Metodene beskrevet i denne protokollen kan brukes til å dyrke embryoer i ovo til dagen for tumortransplantasjon.

Forfatterne stoler på at dette papiret vil være nyttig for forskere som ønsker å bruke kyllingembryoer og deres chorioallantoic membran (CAM) som en in vivo modell for anvendelser av kontrastmidler og strømningsstudier.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Applied and Engineering Sciences (TTW) (Vidi-prosjektet 17543), en del av NWO. Forfatterne vil gjerne takke Robert Beurskens, Luxi Wei og Reza Pakdaman Zangabad fra Institutt for biomedisinsk ingeniørfag og Michiel Manten og Geert Springeling fra Institutt for eksperimentell medisinsk instrumentering for teknisk assistanse, alle fra Erasmus MC University Medical Center Rotterdam, Nederland.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Sigma-Aldrich A9539
Clamp (Kocher clamp)
Cling film
Holder with acoustic membrane (CLINIcell 25 cm2) MABIO, Tourcoing, France CLINIcell25-50-T FER 00106
Demi water
Disposable plastic Pasteur pipets VWR 612-1747
Eggs Drost Pluimveebedrijf Loenen BV, the Netherlands Freshly fertilized
Fridge 15 °C
Glass capillary needles Drummond 1-000-1000 Inside diameter: 0.0413 inch
Heating plate 37 °C
Humidified incubator 37 °C
Insect specimen pins
Metal egg holder Custom made by Experimental Medical Instrumentation at Erasmus MC. See figure 1 A,B
Metal weighing boat holder Custom made by Experimental Medical Instrumentation at Erasmus MC. See figure 1 C,D
Microinjection system FUJIFILM VisualSonics
Mineral oil Sigma-Aldrich M8410-100ML
Needle, 19 G VWR (TERUMO) 613-5392
Phosphate-bufferes saline (PBS), 1x ThermoFisher 10010023
Petri dish, 1 L Glass
Petri dish, 90 mm diameter VWR 391-0559
Preclinical animal ultrasound machine (Vevo 2100) FUJIFILM VisualSonics
Probe (MS250) FUJIFILM VisualSonics 30 MHz transmit and 15 MHz receive frequency
Probe (MS550s) FUJIFILM VisualSonics transmission frequency of 40 MHz
Scalpel VWR (SWANN-MORTON) 233-5363
Scissors, small Fine Science Tools (FST) 14558-09
Syringe, 5 mL VWR (TERUMO) 613-0973
Table spoon
Tape (Scotch Magic tape) Scotch
Tissue paper Tork
Tweezers large  VWR (USBECK Laborgeräte) 232-0107 See figure 1E
Tweezers small DUMONT Medical, Switzerland 0103-5/45 See figure 1F
Ultrasound contrast agent (custum made F-type) Produced as described by: Daeichin, V. et al. Microbubble Composition and Preparation for Imaging : In Vitro and In Vivo Evaluation. IEEE TRANSACTIONS ON ULTRASONICS. 64 (3), 555–567 (2017).
Ultrasound contrast agent (MicroMarker) FUJIFILM VisualSonics, Inc.
Ultrasound contrast agent (Definity) Lantheus medical imaging, United States
Ultrasound gel Aquasonic
Waxi film (Parafilm) Parafilm
Weighing boats (85 × 85 × 24 mm) VWR 611-0094

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Martowicz, A., Kern, J., Gunsilius, E., Untergasser, G. Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis. Journal of Visualized Experiments. (99), e1 (2015).
  2. Schmitz, M., Nelemans, B. K. A., Smit, T. H. A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos. Journal of Visualized Experiments. (118), e1 (2016).
  3. Brauer, R., Chen, P. Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs. Journal of Visualized Experiments. (97), e1 (2015).
  4. Oosterbaan, A. M., Ursem, N. T. C., Struijk, P. C., Bosch, J. G., van der Steen, A. F. W., Steegers, E. A. P. Doppler flow velocity waveforms in the embryonic chicken heart at developmental stages corresponding to 5-8 weeks of human gestation. Ultrasound in Obstetrics and Gynecology. 33 (6), 638-644 (2009).
  5. McQuinn, T. C., Bratoeva, M., DeAlmeida, A., Remond, M., Thompson, R. P., Sedmera, D. High-Frequency Ultrasonographic Imaging of Avian Cardiovascular Development. Developmental Dynamics. 236 (12), 3503-3513 (2007).
  6. Stieger, S. M., Caskey, C. F., Adamson, R. H., Curry, F. E., Wisner, E. R., Ferrara, K. W. Enhancement of Vascular Permeability with Low-Frequency Contrast-enhanced Ultrasound in the Chorioallantoic Membrane Model. Radiology. 243 (1), 112-121 (2007).
  7. Skachkov, I., Luan, Y., van der Steen, A. F. W., De Jong, N., Kooiman, K. Targeted microbubble mediated sonoporation of endothelial cells in vivo. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 61 (10), 1661-1667 (2014).
  8. Vargas, A., Zeisser-Labouèbe, M., Lange, N., Gurny, R., Delie, F. The chick embryo and its chorioallantoic membrane (CAM) for the in vivo evaluation of drug delivery systems. Advanced Drug Delivery Reviews. 59 (11), 1162-1176 (2007).
  9. Rytelewski, M., Buensuceso, A., Leong, H. S., Deroo, B. J., Chambers, A. F., Koropatnick, J. Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In vivo. Journal of Visualized Experiments. (96), e1 (2015).
  10. Schmitd, L. B., Liu, M., Scanlon, C. S., Banerjee, R., Silva, N. J. D. The Chick Chorioallantoic Membrane In vivo Model to Assess Perineural Invasion in Head and Neck Cancer. Journal of Visualized Experiments. (148), e1 (2019).
  11. Daeichin, V., Bosch, J. G., Needles, A., Foster, F. S., van der Steen, A., de Jong, N. Subharmonic, non-linear fundamental and ultraharmonic imaging of microbubble contrast at high frequencies. Ultrasound in Medicine and Biology. 41 (2), 486-497 (2015).
  12. Maresca, D., et al. Imaging microvasculature with contrast-enhanced ultraharmonic ultrasound. Ultrasound in Medicine and Biology. 40 (6), 1318-1328 (2014).
  13. Lindsey, B. D., et al. High Resolution Ultrasound Superharmonic Perfusion Imaging: In vivo Feasibility and Quantification of Dynamic Contrast-Enhanced Acoustic Angiography. Annals of Biomedical Engineering. 45 (4), 939-948 (2017).
  14. Paproski, R. J., Jovel, J., Wong, G. K. S., Lewis, J. D., Zemp, R. J. Enhanced detection of cancer biomarkers in blood-borne extracellular vesicles using nanodroplets and focused ultrasound. Cancer Research. 77 (1), 3-13 (2017).
  15. Huang, C., et al. Short Acquisition Time Super-Resolution Ultrasound Microvessel Imaging via Microbubble Separation. Scientific Reports. 10, 1-13 (2020).
  16. Lowerison, M. R., Huang, C., Kim, Y., Lucien, F., Chen, S., Song, P. In vivo Confocal Imaging of Fluorescently Labeled Microbubbles: Implications for Ultrasound Localization Microscopy. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 67 (9), 1811-1819 (2020).
  17. Faez, T., Skachkov, I., Versluis, M., Kooiman, K., de Jong, N. In vivo Characterization of Ultrasound Contrast Agents: Microbubble Spectroscopy in a Chicken Embryo. Ultrasound in Medicine and Biology. 38 (9), 1608-1617 (2012).
  18. Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications. Journal of Visualized Experiments. (44), e4 (2010).
  19. Kokhuis, T. J. A., et al. Intravital microscopy of localized stem cell delivery using microbubbles and acoustic radiation force. Biotechnology and Bioengineering. 112 (1), 220-227 (2015).
  20. Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development. Journal of Visualized Experiments. (95), e6 (2015).
  21. Dohle, D. S., et al. Chick ex ovo Culture and ex ovo CAM Assay: How it Really Works. Journal of Visualized Experiments. (33), e2 (2010).
  22. Hamburger, V., Hamilton, H. A Series Of Normal Stages In The Developent Of The Chick Embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 231-272 (1951).
  23. Ribatti, D. A morphometric study of the expansion of the chick vasculosa in shell-less culture. Journal of Anatomy. 186, 639-644 (1995).
  24. Ribatti, D., Nico, B., Vacca, A., Roncali, L., Burri, P. H., Djonov, V. Chorioallantoic Membrane Capillary Bed: A Useful Target for Studying Angiogenesis and Anti-Angiogenesis In vivo. Anatomical Record. 324, 317-324 (2001).
  25. DeFouw, D. O., Rizzo, V. J., Steinfeld, R., Feinberg, R. N. Mapping of the Microcirculation in the Chick Chorioallantoic Membrane during Normal Angiogenesis. Microvascular research. 38, 136-147 (1989).
  26. Beekers, I., van Rooij, T., van der Steen, A. F. W., de Jong, N., Verweij, M. D., Kooiman, K. Acoustic characterization of the CLINIcell for ultrasound contrast agent studies. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 66 (1), 244-246 (2019).
  27. Lang, E. R., Rha, C. Apparent shear viscosity of native egg white. Journal of Food Science and Technology. 17, 595-606 (1982).
  28. Daeichin, V., et al. Microbubble Composition and Preparation for Imaging: In Vitro and In vivo Evaluation. IEEE TRANSACTIONS ON ULTRASONICS. 64 (3), 555-567 (2017).
  29. Mcferrin, H. E., Olson, S. D., Gutschow, M. V., Semon, J. A., Sullivan, D. E., Prockop, D. J. Rapidly Self-Renewing Human Multipotent Marrow Stromal Cells (hMSC) Express Sialyl Lewis X and Actively Adhere to Arterial Endothelium in a Chick Embryo Model System. PLoS ONE. 9 (8), 1-11 (2014).
  30. Akiyama, R., Mitsubayashi, H., Tazawa, H., Burggren, W. W. Heart rate responses to altered ambient oxygen in early (days 3-9) chick embryos in the intact egg. Journal of Comparative Physiology - B Biochemical, Systemic, and Environmental Physiology. 169 (2), 85-92 (1999).
  31. Foster, F. S., Hossack, J., Adamson, S. L. Micro-ultrasound for preclinical imaging. Interface Focus. 1, 576-601 (2011).
  32. Gabrielli, M. G., Accili, D. The Chick Chorioallantoic Membrane: A Model of Molecular, Structural, and Functional Adaptation to Transepithelial Ion Transport and Barrier Function during Embryonic Development. Journal of Biomedicine and Biotechnology. , 1-12 (2010).
  33. van der Wagt, I., de Jong, I. C., Mitchell, M. A., Molenaar, R., van den Brand, H. A review on yolk sac utilization in poultry. Poultry Science. 99, 2162-2175 (2020).
  34. Kind, C. The development of the circulating blood volume of the chick embryo. Anatomy and Embryology. 147, 127-132 (1975).
  35. Ribatti, D. Chick Embryo Chorioallantoic Membrane as a Useful Tool to Study Angiogenesis. International Review of Cell and Molecular Biology. 270, 181-224 (2008).
  36. Schneider, M. Characteristics of SonoVue(TM). Echocardiography. 16 (7), 743-746 (1999).
  37. Kitzman, D. W., Goldman, M. E., Gillam, L. D., Cohen, J. L., Aurigemma, G. P., Gottdiener, J. S. Efficacy and Safety of the Novel Ultrasound Contrast Agent Perflutren (Definity) in Patients With Suboptimal Baseline Left Ventricular Echocardiographic Images. American Journal of Cardiology. 86, 669-674 (2000).
  38. Kosareva, A., Abou-Elkacem, L., Chowdhury, S., Lindner, J. R., Kaufmann, B. A. Seeing the Invisible-Ultrasound Molecular Imaging. Ultrasound in Medicine and Biology. 46 (3), 479-497 (2020).
  39. Al-Roubaie, S., Jahnsen, E. D., Mohammed, M., Henderson-Toth, C., Jones, E. A. V. Rheology of embryonic avian blood. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 301 (6), 2473-2481 (2011).
  40. Helfield, B., Chen, X., Qin, B., Villanueva, F. S. Individual lipid encapsulated microbubble radial oscillations: Effects of fluid viscosity. The Journal of the Acoustical Society of America. 139 (1), 204-214 (2016).
  41. Metcalfe, J., Stock, M. K. Oxygen exchange in the chorioallantoic membrane, avian homologue of the mammalian placenta. Placenta. 14, 605-613 (1993).
  42. Tazawa, H. Oxygen and CO2 exchange and acid-base regulation in the avian embryo. American Journal of Zoology. 20, 395-404 (1980).
  43. Kooiman, K., et al. Ultrasound-Responsive Cavitation Nuclei for Therapy and Drug Delivery. Ultrasound in Medicine and Biology. 46 (6), 1296-1325 (2020).
  44. Li, M., Pathak, R. R., Lopez-rivera, E., Friedman, S. L., Aguirre-ghiso, J. A., Sikora, A. G. The In ovo Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma. Journal of Visualized Experiments. (104), e1 (2015).
  45. Sys, G. M. L., et al. The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma. Journal of Visualized Experiments. (77), e1 (2013).

Tags

Bioengineering utgave 168 ultralydavbildning kontrastforsterket ultralydavbildning mikrobobler legemiddellevering ex ovo kyllingembryo chorioallantoic membran (CAM) fartøy
Utarbeidelsen av kylling ex ovo embryoer og chorioallantoic membranbeholdere som in vivo modell for kontrastforsterket ultralydavbildning og mikroboblemedierte legemiddelleveringsstudier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Meijlink, B., Skachkov, I., van der… More

Meijlink, B., Skachkov, I., van der Steen, A. F. W., de Jong, N., Kooiman, K. The Preparation of Chicken Ex Ovo Embryos and Chorioallantoic Membrane Vessels as In Vivo Model for Contrast-Enhanced Ultrasound Imaging and Microbubble-Mediated Drug Delivery Studies. J. Vis. Exp. (168), e62076, doi:10.3791/62076 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter