Summary
哺乳动物大脑的发展需要在翻译水平上正确控制基因表达。在这里，我们描述了一个多体分析系统，该系统具有易于组装的蔗糖梯度制作和分馏平台，以评估 mRNA 在发育中的大脑中的转化状态。
Abstract
哺乳动物大脑的正常发育依赖于神经干细胞增殖和分化成不同神经细胞类型的精细平衡。这种平衡由基因表达紧密控制，基因表达在多个级别进行微调，包括转录、转录后和翻译。在这方面，越来越多的证据突出了转化调节在协调神经干细胞命运决定方面的关键作用。多体分馏是评估全球和单个基因水平的 mRNA 转化状态的有力工具。在这里，我们提出了一个内部聚体分析管道，以评估细胞的转化效率从正在发育的老鼠大脑皮层。我们描述了蔗糖梯度制备、组织裂解、超中心化和基于分数的 mRNA 转化状态分析的协议。
Introduction
在哺乳动物大脑发育过程中，神经干细胞增殖和分化产生神经元和胶质1，2。这个过程的扰动会导致大脑结构和功能的改变，如许多神经发育障碍3，4。神经干细胞的正确行为需要特定基因5的精心表达。虽然对这些基因的表观遗传学和转录控制进行了深入的研究，但最近的发现表明，其他层面的基因调控也有助于协调神经干细胞增殖和分化6、7、8、9、10。因此，解决转化控制程序将极大地促进我们对神经干细胞命运决定和大脑发育背后的机制的理解。
三种具有不同优势的主要技术已被广泛应用于评估 mRNA 的转化状态，包括核糖体分析、翻译核糖体亲和力纯化 （TRAP） 和多体分析。Ribosome 分析使用 RNA 测序来确定受核糖体保护的 mRNA 片段，从而允许对每个成绩单上转译核糖体的数量和位置进行全球分析，通过将其与成绩单丰度11进行比较间接推断翻译率。TRAP利用表位标记的核糖体蛋白来捕获与核糖体结合的mRNA12。鉴于标记的核糖核蛋白可以使用遗传方法在特定的细胞类型中表达，TRAP 允许以特定于细胞类型的方式分析翻译。相比之下，多体分析，它使用蔗糖密度梯度分馏分离自由和翻译不良的部分（较轻的单体）与那些被积极翻译的核糖体（较重的多体），提供了直接测量核糖体密度在mRNA13。这项技术提供的一个优点是其多功能性，以研究翻译特定的mRNA的兴趣，以及全基因组的转学分析14。
本文描述了一个详细的多体特征分析方案，以分析正在发育的老鼠大脑皮层。我们使用家庭组装系统来准备蔗糖密度梯度，并为下游应用收集分数。这里提出的协议可以很容易地适应分析其他类型的组织和生物体。
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Protocol
所有动物的使用都由卡尔加里大学动物护理委员会监督。用于实验的CD1小鼠是从商业供应商那里购买的。
1. 准备解决方案
注意防止RNA降解，喷洒工作台和所有设备与RNASE净化溶液。实验中使用无鼻塞提示。所有解决方案均在无 RNase 水中准备。
- 在 DMSO 中准备环氧化物库存解决方案 （100 毫克/mL），并存储在 -20 °C。
- 通过在无 RNase 水中加入 75.3 克蔗糖，并将体积加到 100 mL（用于 16 毫分梯度制备），准备 220 万蔗糖库存解决方案。解决方案可保持在-20°C以进行长期存储。
- 准备10倍盐溶液（1 M纳克;200米特里斯-HCl，pH 7.5;50毫克M毫克2）。
- 准备 60% （w/v） 蔗糖追逐溶液，包含 30 克蔗糖、5 mL 的 10 倍盐溶液，并使用无 RNase 水将体积加到 50 mL。
- 可选地，在无 RNase 水中加入溴酚蓝色斑点或大约 5μL 的 1% 溴酚蓝色到追逐解决方案中。1.6. 在 4 °C 下存储解决方案。
2. 蔗糖梯度准备
注：蔗糖梯度的准备精度对于获得一致且可重复的结果至关重要。
- 要准备六个10-50%蔗糖梯度，稀释2.2米蔗糖溶液如表1。
| 蔗糖解决方案 | 10% | 20% | 30% | 40% | 50% |
| 2.2 米蔗糖 | 2升 | 4升 | 6升 | 8升 | 10升 |
| 10倍盐溶液 | 1.5升 | 1.5升 | 1.5升 | 1.5升 | 1.5升 |
| 放线菌酮 | 15 微升 | 15 微升 | 15 微升 | 15 微升 | 15 微升 |
| 水 | 11.5升 | 9.5升 | 7.5升 | 5.5升 | 3.5升 |
| 总容量 | 15升 | 15升 | 15升 | 15升 | 15升 |
表1：蔗糖稀释，用于准备蔗糖梯度。
注意：始终准备双倍蔗糖梯度，以平衡超中心过程中的重量。
- 用 RNase 净化溶液擦拭金属钝端针。使用无 RNase 水短暂冲洗超中心管、管子和注射器。空气干燥管，使没有水滴留在管中，因为任何剩余的水将改变蔗糖浓度。
- 将金属针放在夹架上，将离心机管放在电动舞台上。为了持续准备梯度，使用了包含电动舞台的自组装系统来容纳超中性管和注射器泵以注入蔗糖溶液（图1，详情见第 9 步）。
- 用 10% 蔗糖 （足够 6 个梯度） 的 ~16 mL 填充 30 mL 注射器，将其放在注射器泵上并将其连接到针头。确保注射器、管子和针头中没有气泡。擦去针头的尖端，去除任何残留的溶液。
- 将电动舞台向上移动，使针尖接触底部管的中心。
- 将注射器泵设置为 2 mL/min 的流量，体积为 2.3 mL。
- 分配 2.3 mL 的 10% 蔗糖溶液后，向下移动机动阶段，并重复所有六个梯度的过程。
- 重复步骤 2.4-2.7，将 20% 蔗糖溶液添加到管子底部，然后以类似方式添加 30% 、40% 和 50% 蔗糖溶液。
- 准备梯度后，用石蜡膜密封超中福管。
- 将管子在 4 °C 过夜，使不同的蔗糖层扩散在一起，以产生连续的梯度。
3. 组织解剖
注：怀孕小鼠在麻醉前被子宫颈错位安乐死，5%为异氟兰。
- 在胚胎第12天或其他需要的时间点收集CD1小鼠胚胎，并将胚胎放在冰上含有冰冷汉克平衡盐溶液（HBSS）的+10厘米板中，以保持细胞存活性。
- 在解剖范围下，将一个胚胎转移到含有冰冷 HBSS 的 + 6 厘米板中。
- 使用 21-23 G 针头以大约 45° 的角度穿透眼睛来固定头部位置，并施加力确保针头固定在板上（图 2A）。
- 使用5号钳子去除皮肤和头骨，从中间到两侧。
- 使用钳子切开嗅球，去除脑膜，露出皮质组织。 3.6.使用弯曲的钳子将皮质组织切成冰上2-3 mL的神经巴萨介质（图2B）。根据需要从不同胚胎中提取皮质组织。来自8-10个胚胎的组织通常给出~200μg的总RNA。
4. 细胞裂解
- 在组织解剖当天，准备 如表2所述的新鲜细胞裂解缓冲器。
| 溶液 | 最终浓度 | 卷 |
| 特里斯-赫克 （pH 7.5） | 20立方米 | 100μL |
| 氯化钾 | 100立方米 | 250μL |
| 毫克2 | 5米 | 25 微升 |
| 特里顿X-100 | 1% （v/v） | 500μL |
| 脱氧酸钠 | 0.5% （带/ v） | 500μL |
| 迪西奥特雷托尔 （Dtt） | 1立方米 | 5 微升 |
| 放线菌酮 | 100微克/升 | 5 微升 |
| 无鼻水 | 充值至5升 | |
| 总 | 5升 | 5升 |
表2：准备多体溶解缓冲器。
注意：补充裂解缓冲剂与蛋白酶和磷酸盐抑制剂。
- 将环丙酰胺加入神经巴萨介质，解剖组织最终浓度为100微克/mL，在37°C孵育10分钟。环素酰胺阻止翻译拉长，因此，防止核糖体径流15。
- 离心机在 500 x g 5 分钟在 4 °C 和丢弃超自然。
- 用冰冷磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 清洗组织两次，并辅以 100 微克/mL 环磷酰胺。
- 加入500μL的细胞裂解缓冲器，辅以4μL的RNase抑制剂。上下移液以在溶解缓冲中恢复组织。使用胰岛素针轻轻解洗组织。
- 将组织在冰上孵化10分钟，每2-3分钟短暂旋转一次。
注意：为了防止组织退化，确保组织裂解的所有步骤都在冰上进行。 - 离心机在2，000 x g 5分钟在4°C。
- 将超自然体转移到冰上的新离心管。
- 离心机在~13，000 x g 5分钟在4°C。
- 将超自然体转移到冰上的新离心管。
- 使用紫外线-维斯光谱光谱仪测量组织测定聚合物中的RNA浓度。
注意：如果实验中包含多个样本，则用额外的细胞裂解缓冲器将样品稀释到相同的浓度，以尽量减少变化。
5. 样品装载和超集中式
- 将超中心化转子和摆动桶预冷至 4 °C，并将超中心变速器的温度设置为 4 °C。
- 将组织化盐的20μL作为RNA总输入。
- 通过将利萨特慢慢分配到超中心管的墙壁上，将样品（体积相等的 50-300 μg RNA）加载到蔗糖梯度顶部。
- 轻轻地将超中心管放在秋千桶中。确保所有截然相反的存储桶均平衡。
- 将摆动桶加载到转子上。将超中心燃料设置为 190，000 x g（+39，000 rpm），在 4 °C 下 90 分钟。
- 离心后轻轻将梯度放在冰上。
6. 分数和样本收集
注：家庭组装的分馏、记录和收集系统用于分析和收集梯度样本（图3，见设备组件）。
- 在管穿孔器上放置一个空的超中心管，然后用针头从底部轻轻穿透管子。
- 打开紫外线显示器，打开数字信号记录软件。
- 用 25 mL 的 60% 蔗糖追逐解决方案填充 30 mL 注射器。轻轻按压注射器，使追逐液填满空管，并通过 254 nm UV 监视器设置基线进行检测。
- 在紫外线监视器上按自动零，以注册检测基线。按下软件播放以开始录制。
- 一旦系统建立基线，暂停在软件上录制并收回追逐解决方案。确保系统中没有残余追逐解决方案。
注意：用无 RNase 水冲洗系统，以去除上次运行中剩余的蔗糖溶液。 - 将一个样品管加载到管穿孔器中。用针头从底部轻轻穿透管子。
- 开始在软件上录制。启动注射器泵（流量为 1 mL/min，体积为 25 mL）和分数收集器以收集多体分数。将分数设置设置设置为30秒。
注意：每次运行前，通过轻轻按压注射器，确保注射器或管子中无气泡，让追逐液持续流过针头。 - 使用分数收集器将分数收集到 1.5 mL 管（每个 500μL）中。
- 分数可以立即处理或存储在 -80 °C。
- 在收集分数后，用无 RNase 水冲洗系统，以去除任何残余蔗糖。
7. 提取RNA
- 到每个分数中，添加 10 ng 的路西法酶 mRNA 尖峰控制。
- 在每份分馏中加入三卷基于氢胆酸的商用RNA隔离试剂。
- 漩涡短暂地为15s。
- 使用与 7.2 中使用的解决方案兼容的 RNA 提取套件提取 RNA。
8. 反向转录和实时 PCR
- 使用紫外线-维斯光谱光谱仪测量RNA的浓度。
- 根据制造商的协议，将RNA与使用cDNA合成套件进行反向转录。
- 以定量实时 PCR （qPCR） 为例，检查 gapdh mRNA 的多体分布。qPCR 使用 qPCR 检测系统和 qPCR 主混合试剂执行，其循环条件如下：10 分钟 95 °C，然后 40 个周期 95 °C 代表 15 秒，60 °C 代表 30 秒，72 °C 代表 40s，然后是 95 °C 代表 60s。
- 从放大图获取阈值（Ct），并用于使用ΔΔCt方法计算折叠变化。
9. 蔗糖梯度制造系统组装
注意：按照步骤组装蔗糖梯度制造商的每个组件（如表3所述）（图1）。
- 在基本面包板 （A1） 上安装两个垂直支架 （A2）。
- 使用两个纤细的直角支架 （B2） 将线性舞台执行器安装到基础面包板 （A1）。
- 使用 12.7 mm 铝柱 （C2） 上的套管将其固定在管架基面包板 （C1） 上，作为管架的支架。
- 将直角 +1+2" 与柱 （C2） 和迷你系列光学柱 （C4） 组装到 6 mm 后夹 （C3）。
- 使用光学柱 （C4） 上的设置拧合器连接一个小 V 夹 （C5） 作为管架。
- 将离心管放入管架中，并调整角度使其垂直。标记管的位置，并将基座柱架 （C6） 安装在基面包板 （C1） 上以支持管子。
- 在面包板 （A1） 的另一边，使用 +12.7 mm 铝柱 （D1） 的套件将其修复，并使用直角 +1+2" 连接到 6 mm 柱夹 （D2） 连接迷你系列光学柱 （D3）。
- 将微型 V 夹 （D4） 与钝端针 （D5） 连接到柱子 （D3）。调整夹子的角度，将针头垂直设置，并调整柱长，以确保针头与离心机管相符合。
- 将执行器 （B1） 连接到步进电机驱动程序 （E1），并使用 UNO R3 控制器板和 UNO 入门套件 （E2） 中的操纵杆模块控制执行器。电源适配器（例如 9-24 V AC/DC 可调功率适配器）可用于单独驱动电机。
- 将注射器泵 （F） 放在梯度制造站旁边，并将注射器与针头连接起来。
- 使用操纵杆上下控制管架。
| 元件 | 项目 |
| B1 | 线性阶段执行器 |
| E1 | 步进电机驱动程序 |
| E2 | 联合国组织项目超级启动套件 |
| A1 | 面包板 |
| A2 | 垂直支架 |
| B2 | 纤细直角支架 |
| C1 | 迷你系列面包板 |
| C5 | 小型 V 夹 |
| D4 | 微型 V 夹 |
| C2 | +12.7 毫米铝柱 |
| C4， D3 | 迷你系列光学柱 |
| D1 | +12.7 毫米铝柱 |
| C3， D2 | 直角 +1±2" 至 +6 mm 后夹 |
| C6 | 迷你系列基座柱架底座 |
| D5 | 钝端针 |
| F | 注射器泵 |
表3：梯度制作系统组件。
10. 分馏和检测系统装配（图2）。
- 使用常规的圆下巴毛刺夹在管穿孔器上安装紫外线监视器的光学模块。将管子的一端（1 厘米长，0.56 毫米内部直径）连接到管穿孔器的连接器上，另一端连接到光学模块的流体在端口。将流体外端口连接到分馏器。
- 根据制造商手册，将光学模块与紫外线监视器的控制单元连接起来。
- 根据制造商手册，使用分组电缆将信号输出插座连接到地面的数字转换器和模拟输入连接。
- 使用普通 USB 电缆将数字转换器连接到笔记本电脑，并使用数据采集软件记录转换的数字信号。
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Representative Results
作为证明，含有75μgRNA（从8个胚胎中汇集）的皮质分析被蔗糖梯度分成12个分数。紫外线吸收峰值在254纳米识别分数包含40S亚单位，60S亚单位，80S单体和多体（图4A）。Rpl10通过对大型核糖体亚单位的西色斑点进行分析，显示其存在60S子单元（分数3）、单体（分数4）和多体（分数5-12）（图4B）。相比之下，细胞质蛋白Gapdh和Csde1与核糖体无关，而是富含自由RNA（分数1）（图4B）的分数。与不同分数的蛋白质分离一致，我们发现gadh和sex2 mRNA在含有重聚体的分数中高度丰富（分数7-12中超过三个核糖体），这表明gapdh和sex2 mRNA在发育中的皮层中被有效地转化（图4C，D）。相比之下，rpl7和rpl34 mRNA在包含单体的分数中得到了丰富，这暗示了压抑的翻译（图4E，F）16。这些结果验证了我们的多体分馏协议。
图1：蔗糖梯度制备装置。（A）家庭组装的蔗糖梯度制造商，包括线性舞台执行器、电动舞台的管架、舞台控制器、安装在针架上的金属钝端针头以及带注射器连接到针头的自动注射器泵（见表3）。（B） 为了准备蔗糖梯度，将超中性管放置在管架中。蔗糖溶液通过钝端针使用注射器泵分配。请单击此处查看此图的较大版本。
图2：从发育小鼠胚胎中分离皮质组织。 （A） 图像显示使用21G-23G针固定在+6厘米板上的E12.5 CD1胚胎。（B） 图像显示皮肤、头骨和脑膜切除后解剖的皮层（标有白色虚线）。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：用于分馏、记录和取样的设置。 图像描绘了家庭组装的分馏、记录和样品收集系统，该系统由自动注射器泵、管穿孔机、分数收集器和带数字转换器的紫外线监视器组成，可连接到笔记本电脑，以便持续监控紫外线吸收。数据获取由商业数据采集软件处理。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：正在发育的鼠标皮层的多体特征分析（A） 紫外线吸收显示包含自由RNA （分数 1）、 40S 子单位 （分数 2）、 60S 子单位 （分数 3）、 80S 单体 （分数 4） 和多体 （分数 5-12） 的分数。使用了从8个胚胎中汇集的75μg总RNA。（B） 显示 Gapdh、Rpl10 和 Csde1 蛋白质分布的西斑分。qPCR分析显示分馏中间隙（C）、sox2（D）、rpl7（E）和rpl34 （F）mRNA 的分布。 请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
多体特征分析是一种常用和强大的技术，用于评估单个基因和全基因组14 级的转化状态。在本报告中，我们提出了一个多体分析协议，使用家庭组装的平台及其应用来分析正在发育的鼠标皮层。这个经济高效的平台易于组装和生成坚固、可重复的蔗糖梯度和具有高灵敏度的多体剖析。
值得注意的是，制备一致和优质蔗糖梯度对于获得可重复的多体剖析结果至关重要。梯度制备过程中10-50%蔗糖溶液体积的变化可能导致多体峰的移动和下游分析结果的不一致。此外，在插入和去除针头过程中干扰梯度可能导致梯度制备不一致。与其他方法和商业设备相比，我们自制的梯度制造系统采用电动阶段来减少制备过程中梯度干扰，并使用注射器泵精确分配蔗糖溶液，为梯度制备提供了廉价而简单的解决方案。
将此处的多体分析平台和协议应用于正在发育的鼠标皮层，我们发现核糖核酸蛋白 Rpl10 和细胞质蛋白 Gapdh 和 Csde1 分布在正确的分数中。此外，高翻译的 gapdh 和 sox2 mRNA 在多色素部分中得到了丰富，而被翻译压抑的 rpl34 和 rpl7 mRNA 在聚体中的丰富性较低，这验证了我们的平台和协议。通过类似的方法，其他基因在发育皮层中的转化状态可以通过实时PCR单独确定。值得注意的是，多体特征分析已用于分析全基因组水平上发育中大脑的转化状态。在这方面，可以结合含有多体的分数，并利用深测序分析提取RNA。这里存在的平台和协议可以调整和进一步优化，以适应使用其他细胞类型和组织的跨拉托米学研究。考虑到受实验条件限制的皮质组织的可用性（例如，<50 μg RNA），协议的进一步优化可能会进一步提高实验的效率和可重复性。
虽然聚体分析提供了对mRNA在发育皮层中的转化状态的见解，但在存在不同神经细胞类型时，在以后的发育阶段分析特定的细胞类型是有局限性的。为了解决这个问题，多体特征分析可以通过在组织特定促进剂11下表达的表皮标记核糖体蛋白的拉下与TRAP集成。
总之，我们在这里报告的蔗糖梯度制造和分馏的平台和协议为大脑发育和其他生物环境中的多体剖析实验提供了经济的解决方案。
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Disclosures
作者声明没有相互竞争的利益。
Acknowledgments
这项工作由国家SERC发现基金（RGPIN/04246-2018至纽约）资助。G.Y.是加拿大研究主席。S.K. 由米塔克斯全球研究生奖学金和 ACHRI 研究生奖学金资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL RNA free microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 10 cm dish | Greiner-Bio | 664160 | |
| 1M MgCl2 | Invitrogen | AM9530G | |
| 21-23G needle | BD | 305193 | |
| 2M KCl | Invitrogen | AM8640G | |
| 30 mL syringe | BD | 302832 | |
| Blunt end needle | VWR | 20068-781 | |
| Breadboard | Thorlabs | MB2530/M | |
| Bromophenol blue | Sigma | 115-39-9 | |
| CD1 mouse | Charles River Laboratory | ||
| Curved tip forceps | Sigma | #Z168785 | |
| Cycloheximide | Sigma | 66-81-9 | |
| Data acquisition software TracerDAQ | Measurement Computing | ||
| Digital converter | Measurement Computing | USB-1208LS | |
| Direct-zol RNA miniprep kit | Zymo | R2070 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-basic | 12-03-3483 | |
| DMSO | Bioshop | 67-68-5 | |
| Dumont No.5 forceps | Sigma | #F6521 | |
| Fraction collector | Bio-Rad | Model 2110 | |
| HBSS | Wisent | 311-513-CL | |
| Linear stage actuator | Rattmmotor | CBX1605-100A | |
| Luciferase control RNA | Promega | L4561 | |
| Maxima first strand cDNA synthesis kit | Themo Fisher | M1681 | |
| Miniature V-clamp | Thorlabs | VH1/M | |
| Mini-series breadboard | Thorlabs | MSB7515/M | |
| Mini-series optical post | Thorlabs | MS2R/M | |
| Mini-series pedestal post holder base | Thorlabs | MBA1 | |
| NaCl | Bio-basic | 7647-14-5 | |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| Ø12.7 mm aluminum post | Thorlabs | TRA150/M | |
| Parafilm | Bemis | PM992 | |
| PerfeCTa SYBR green fastmix | Quanta Bio | CA101414-274 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Wisent | 311-010-CL | |
| Puromycin | Bioshop | 58-58-2 | |
| Right-angle clamp | Thorlabs | RA90/M | |
| Right-angle Ø1/2" to Ø6 mm post clamp | Thorlabs | RA90TR/M | |
| Rnase AWAY | Molecular BioProducts | 7002 | |
| RNase free tips | Frogga Bio | FT10, FT200, FT1000 | |
| RNase free water | Wisent | 809-115-CL | |
| RNasin | Promega | N2111 | |
| Slim right-angle bracket | Thorlabs | AB90B/M | |
| Small V-clamp | Thorlabs | VC1/M | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 302-95-4 | |
| Stepper motor driver | SongHe | TB6600 | |
| Sucrose | Bioshop | 57501 | |
| SW 41 Ti rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| Triton-X-100 | Bio-basic | 9002-93-1 | |
| Trizol | Thermofisher Scientific | 15596018 | |
| Tube piercer | Brandel | BR-184 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | L8-70M | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
| UNO project super starter kit | Elegoo | EL-KIT-003 | |
| UV monitor | Bio-Rad | EM-1 Econo | |
| Vertical bracket | Thorlabs | VB01A/M |
References
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