Summary
Utvecklingen av däggdjurshjärnan kräver korrekt kontroll av genuttryck på översättningsnivå. Här beskriver vi ett polysome profileringssystem med en lättmonterade sackarosgradienttillverknings- och fraktioneringsplattform för att bedöma mRNAs translationella status i den utvecklande hjärnan.
Abstract
Den korrekta utvecklingen av däggdjurshjärnan bygger på en fin balans mellan neural stamcellsproliferation och differentiering i olika neurala celltyper. Denna balans styrs tätt av genuttryck som finjusteras på flera nivåer, inklusive transkription, post-transkription och översättning. I detta avseende belyser en växande mängd bevis en kritisk roll av translationell reglering i samordningen av neurala stamcell öde beslut. Polysome fraktionering är ett kraftfullt verktyg för bedömning av mRNA translationell status på både globala och individuella gennivåer. Här presenterar vi en in-house polysome profilering pipeline för att bedöma translationell effektivitet i celler från den utvecklande mus hjärnbarken. Vi beskriver protokollen för sackaros gradient beredning, vävnad lysis, ultracentrifugation och fraktionering-baserade analys av mRNA translationell status.
Introduction
Under utvecklingen av däggdjurshjärnan förökar neurala stamceller och differentierar för att generera nervceller och glia1,2 . Störningen av denna process kan leda till förändringar i hjärnans struktur och funktion, som ses i många neurodevelopmental störningar3,4. Det korrekta beteendet hos neurala stamceller kräver orkestrerat uttryck för specifika gener5. Medan den epigenetiska och transkriptionella kontrollen av dessa gener har studerats intensivt, tyder nya resultat på att genreglering på andra nivåer också bidrar till samordningen av neural stamcellsproliferation och differentiering6,7,8,9,10. Således, ta itu med translationella kontroll program kommer kraftigt att främja vår förståelse av mekanismerna bakom neurala stamcell öde beslut och hjärnans utveckling.
Tre huvudtekniker med olika styrkor har tillämpats i stor utsträckning för att bedöma översättningsstatusen för mRNA, inklusive ribosomprofilering, översättning av ribosom affinitet rening (TRAP) och polysome profilering. Ribosomprofilering använder RNA-sekvensering för att bestämma ribosomskyddade mRNA-fragment, vilket gör det möjligt att jämföra den globala analysen av antalet och platsen för översättning av ribosomer på varje transkript för att indirekt härleda översättningshastigheten genom att jämföra den med transkriptförekomst11. TRAP drar nytta av epitopmärkta ribosomproteiner för att fånga ribosombundna mRNAs12. Med tanke på att de märkta ribosomala proteinerna kan uttryckas i specifika celltyper med hjälp av genetiska metoder, tillåter TRAP analys av översättning på ett celltypspecifikt sätt. I jämförelse ger polysome profilering, som använder sackaros densitet gradient fraktionering för att separera fri och dåligt översatt del (lättare monosomer) från de som aktivt översätts av ribosomer (tyngre polysomes), en direkt mätning av ribosomtäthet på mRNA13. En fördel som denna teknik erbjuder är dess mångsidighet att studera översättningen av specifika mRNA av intresse samt genomomfattande översättningsanalys14.
I detta dokument beskriver vi ett detaljerat protokoll av polysome profilering för att analysera den utvecklande mus hjärnbarken. Vi använder ett hemmonterat system för att förbereda sackarosgradienter och samla in fraktioner för nedströmsapplikationer. Protokollet som presenteras här kan enkelt anpassas för att analysera andra typer av vävnader och organismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Allt djurbruk övervakades av djurvårdskommittén vid University of Calgary. CD1 möss som användes för experimentet köptes från kommersiell leverantör.
1. Utarbetande av lösningar
OBS För att förhindra RNA-nedbrytning, spray arbetsbänk och all utrustning med RNase dekontamineringslösning. RNase-fria tips används för experimentet. Alla lösningar är förberedda i RNase-fritt vatten.
- Förbered cykloheximidlagerlösning (100 mg/ml) i DMSO och förvara vid -20 °C.
- Förbered 2,2 M sackarosbuljonglösning genom att tillsätta 75,3 g sackaros till RNase-fritt vatten och fylla på volymen till 100 ml (för ~16 gradientberedning). Lösningen kan hållas vid -20 °C för långtidslagring.
- Förbered 10x saltlösning (1 M NaCl; 200 mM Tris-HCl, pH 7,5; 50 mM MgCl2).
- Förbered 60% (w/v) sackarosjaktlösning, som innehåller 30 g sackaros, 5 ml 10x saltlösning och toppa volymen upp till 50 ml med RNase-fritt vatten.
- Alternativt, tillsätt en fläck av bromophenol blå eller cirka 5 μL av 1% bromophenol blå i RNase-fritt vatten till jaktlösningen. 1.6. Förvara lösningar vid 4 °C.
2. Beredning av sackarosgradient
OBS: Noggrannhet vid beredning av sackarosgradienter är avgörande för att uppnå konsekventa och reproducerbara resultat.
- För att förbereda sex 10-50% sackarosgradienter, späd 2,2 M sackaroslösning enligt tabell 1.
| Sackaroslösning | 10% | 20% | 30% | 40% | 50% |
| 2,2 M sackaros | 2 ml | 4 ml | 6 ml | 8 ml | 10 ml |
| 10X saltlösning | 1,5 ml | 1,5 ml | 1,5 ml | 1,5 ml | 1,5 ml |
| Cykloheximid | 15 μL | 15 μL | 15 μL | 15 μL | 15 μL |
| Vatten | 11,5 ml | 9,5 ml | 7,5 ml | 5,5 ml | 3,5 ml |
| Total volym | 15 ml | 15 ml | 15 ml | 15 ml | 15 ml |
Tabell 1: Sackarosutspädningar för preparat av sackarosgradienter.
OBS: Förbered alltid sackarosgradienter i multiplar om två för att balansera vikt under ultracentrifugation.
- Torka av den trubbiga ändnålen i metall med RNase dekontamineringslösning. Skölj kort ultracentrifugrören, slangarna och sprutan med RNase-fritt vatten. Lufttorka rören så att ingen vattendroppe finns kvar i rören eftersom eventuellt återstående vatten kommer att förändra sackaroskoncentrationen.
- Placera metallnålen på klämhållaren och centrifugröret på det motoriserade stadiet. För att förbereda lutningar konsekvent användes ett hemmonterat system som innehåller ett motoriserat steg för att hålla ultracentrifugröret och en sprutpump för att injicera sackaroslösningar(figur 1, se steg 9 för detaljer).
- Fyll en 30 ml spruta med ~16 ml 10% sackaros (tillräckligt för sex gradienter), placera den på sprutpumpen och anslut den till nålen. Se till att det inte finns några luftbubblor i sprutan, slangen och nålen. Torka av spetsen från nålen för att ta bort eventuell restlösning.
- Flytta upp det motoriserade stadiet så att nålens spets vidrör rörets mitt i botten.
- Ställ in sprutpumpen med ett flöde på 2 ml/min för en volym på 2,3 ml.
- Efter dispensering 2,3 ml 10% sackaroslösning, flytta ner det motoriserade stadiet och upprepa processen för alla sex lutningar.
- Upprepa steg 2,4-2,7 för att lägga till 20% sackaroslösning i botten av rören, följt av 30%, 40% och 50% sackaroslösningar på samma sätt.
- Efter beredning av lutningen, försegla ultracentrifugeröret med hjälp av en paraffinfilm.
- Låt rören vara 4 °C över natten så att de olika sackaroslagren sprids ihop för att ge en kontinuerlig lutning.
3. Dissekering av vävnad
OBS: Gravida möss avlivades av massundersökning förskjutning föregås av anestesi med 5% isofluran.
- Samla CD1-musembryon på embryonal dag 12, eller andra tidspunkter efter behov, och placera embryon i en Ø 10 cm-tallrik som innehåller iskallt Hanks balanced salt solution (HBSS) på is för att bibehålla cellens livskraft.
- Överför ett embryo till en Ø 6 cm-platta som innehåller iskall HBSS under dissekeringsområdet.
- Använd nålar på 21-23 G för att fästa huvudets position genom att penetrera genom ögonen i ungefär 45° vinkel och applicera kraft för att se till att nålarna är fixerade på plattan (Figur 2A).
- Använd nr 5 tång för att ta bort hud och skalle, från mitten till sidorna.
- Använd tång för att skära olfaktoriska glödlampor och ta bort hjärnhinnorna för att exponera de kortikala vävnaderna.3.6.Använd böjda tångar för att skära de kortikala vävnaderna i 2-3 ml neurobasalt medium på is (Figur 2B). Poola kortikala vävnader från olika embryon efter behov. Vävnader från 8-10 embryon ger vanligtvis ~ 200 μg totalt RNA.
4. Celllys
- På dagen för vävnadsdesektion bereder du buffert för färsk celllys enligt beskrivningen i tabell 2.
| lösning | Slutlig koncentration | volym |
| Tris-HCl (pH 7.5) | 20 mM | 100 μL |
| KCl (kcl) | 100 mM | 250 μL |
| MgCl2 | 5 mM | 25 μL |
| Triton X-100 | 1% (v/v) | 500 μL |
| Natrium deoxycholat | 0,5% (w/v) | 500 μL |
| Dithiothreitol (DTT) | 1 mM | 5 μL |
| Cykloheximid | 100 μg/ml | 5 μL |
| RNase fritt vatten | Fylla på upp till 5 ml | |
| total | 5 ml | 5 ml |
Tabell 2: Beredning av polysome lysbuffert.
OBS: Komplettera lysbufferten med proteas- och fosfatashämmare.
- Tillsätt cykloheximid till det neurobasala mediet med dissekerade vävnader till en slutlig koncentration på 100 μg/ml och inkubera vid 37 °C i 10 min. Cycloheximide blockerar översättningsförlängning och förhindrar därför ribosomutkörning 15.
- Centrifug vid 500 x g i 5 min vid 4 °C och kassera supernaten.
- Tvätta vävnaderna två gånger med iskyld fosfatbuffrad saltlösning (PBS) kompletterad med 100 μg/ml cykloheximid.
- Tillsätt 500 μL celllysbuffert kompletterad med 4 μL RNase-hämmare. Pipett upp och ner för att återanvända vävnaden i lysbufferten. Använd en insulinnål för att försiktigt lysa vävnaden.
- Inkubera vävnaderna på is i 10 minuter med kort virvel varje 2-3 min.
OBS: För att förhindra vävnadsnedbrytning, se till att alla steg av vävnadslyst utförs på is. - Centrifugera vid 2 000 x g i 5 min vid 4 °C.
- Överför supernaten till ett nytt centrifugeringsrör på is.
- Centrifugera vid ~13 000 x g i 5 min vid 4 °C.
- Överför supernaten till ett nytt centrifugeringsrör på is.
- Mät RNA-koncentrationen i vävnadslysatet med hjälp av en UV-Vis-spektrofotometer.
OBS: Om flera prover ingår i försöket, späd prover till samma koncentration med extra celllysbuffert för att minimera variationen.
5. Provbelastning och ultracentrifugation
- Förkyl ultracentrifugeringsrotorn och gunghinkarna vid 4 °C och ställ in temperaturen på ultracentrifugen på 4 °C.
- Håll 20 μL av vävnadslyset som total RNA-ingång.
- Belastningsprover (50-300 μg RNA med samma volym) på toppen av sackarosgradienterna genom att långsamt dela lysatet till väggarna i ultracentrifugerören.
- Placera försiktigt ultracentrifugerören i gungskopan. Se till att alla diametralt motsatta skopor är balanserade.
- Lasta gunghinkarna på rotorn. Ställ ultracentrifugen på 190 000 x g (~39 000 varv/min) till 4 °C i 90 min.
- Placera försiktigt lutningarna på is efter centrifugering.
6. Fraktionering och provtagning
OBS: Ett hemmonterat fraktionerings-, inspelnings- och insamlingssystem används för analys och insamling av prover från gradienterna(figur 3, se Enhetskomponenter).
- Placera ett tomt ultracentrifugerör på rör piercern och penetrera försiktigt röret med nålen från botten.
- Slå på UV-monitorn och öppna den digitala signalinspelningsprogramvaran.
- Fyll en 30 ml spruta med 25 ml 60% sackarosjaktlösning. Tryck försiktigt på sprutan så att jaktlösningen fyller det tomma röret och gå igenom 254 nm UV-monitorn för att ställa in baslinjen för detektion.
- Tryck på auto-zero på UV-monitorn för att registrera en baslinje för detektion. Tryck på spela in programvaran för att börja spela in.
- När systemet har upprättat en baslinje pausar du inspelningen av programvaran och drar tillbaka jaktlösningen. Se till att ingen kvarvarande jaktlösning finns kvar i systemet.
OBS: Skölj systemet med RNase-fritt vatten för att ta bort kvarvarande sackaroslösningar som återstår från föregående körning. - Ladda ett provrör till rör piercern. Penetrera försiktigt röret med nålen från botten.
- Börja spela in på programvaran. Starta sprutpumpen (flödeshastighet på 1 ml/min för en volym på 25 ml) och fraktionsuppsamlaren för att samla polysome fraktioner. Ställ in bråktalsinställningarna på 30 s.
OBS: Före varje körning, se till att inga luftbubblor i sprutan eller slangen genom att försiktigt trycka på sprutan för att låta jaktlösningen flöda kontinuerligt genom nålen. - Samla fraktionerna i 1,5 ml rör (500 μL vardera) med hjälp av en fraktionsuppsamlare.
- Fraktionerna kan bearbetas omedelbart eller lagras vid -80 °C.
- Efter fraktionsamling, skölj systemet med RNase-fritt vatten för att ta bort eventuella kvarleva sackaros.
7. Utvinning av RNA
- Tillsätt 10 ng luciferas mRNA-spik-in-kontroll till varje fraktion.
- Tillsätt tre volymer guanidium hydrocholride baserade kommersiella RNA isolering reagens till varje fraktion.
- Virvel kort för 15 s.
- Extrahera RNA med hjälp av ett RNA-extraktionskit som är kompatibelt med den lösning som används i 7.2.
8. Omvänd transkription och pcr i realtid
- Mät koncentrationen av RNA med UV-Vis spektrofotometer.
- Subjekt RNA att vända transkription med hjälp av en cDNA syntes kit, enligt tillverkarens protokoll.
- Använd kvantitativ PCR i realtid (qPCR) för att undersöka polysomal fördelningen av gapdh mRNA som exempel. qPCR utfördes med hjälp av ett qPCR-detektionssystem och ett qPCR mastermix-reagens, med följande cykelförhållanden: 95 °C i 10 min, sedan 40 cykler på 95 °C för 15 s, 60 °C för 30 s, 72 °C för 40 s, följt av 95 °C för 60 s.
- Få tröskelcykelvärden (Ct) från förstärkningsdiagramna och används för att beräkna vikförändring med ΔΔCt-metoden.
9. Sackarosgradienttillverkningssystemenhet
OBS: Följ stegen för att montera varje komponent (enligt beskrivningen i tabell 3)på sackarosgradienttillverkaren(figur 1).
- Montera två vertikala fästen (A2) på basbrödbrädan (A1).
- Använd två smala vinkelräta fästen (B2) för att montera det linjära scenlindonet på basbrödskivan (A1).
- Använd setcrew på Ø12,7 mm aluminiumstolpe (C2) för att fixera den på rörhållarens basbrödbräda (C1) som stativ för rörhållaren.
- Montera rätvinks Ø1/2" till Ø6 mm stolpe (C3) med stolpen (C2) och den optiska stolpen i miniserien (C4).
- Använd setcrew på den optiska stolpen (C4) för att ansluta en liten V-klämma (C5) som rörhållare.
- Sätt ett centrifugeringsrör i rörhållaren och justera vinkeln så att det blir vertikalt. Markera rörets läge och montera piedestalstolpens hållare (C6) på basbrödskivan (C1) för att stödja röret.
- På andra sidan brödbrädan (A1) använder du setcrewen på Ø12,7 mm aluminiumstolpe (D1) för att fixa den och ansluta en optisk stolpe i miniserien (D3) med en rätvink Ø1/2" till Ø6 mm postklämma (D2).
- Anslut miniatyr-V-klämman (D4) med trubbig nål (D5) till stolpen (D3). Justera klämmans vinkel för att ställa in nålen vertikalt och justera stolpens längd för att säkerställa att nålen uppfyller centrifugröret.
- Anslut ställdonet (B1) till stegmotorföraren (E1) och använd UNO R3-styrkortet och joystickmodulen från UNO-startsatsen (E2) för att styra ställdonet. En strömadapter (t.ex. 9-24 V AC/DC justerbar strömadapter) kan användas för att driva motorn separat.
- Placera sprutpumpen (F) bredvid lutningsstationen och anslut sprutan med nålen.
- Styr rörhållarens steg upp och ner med joysticken.
| komponent | sak |
| B1 (B1) | Linjärt scendon |
| E1 | Stepper motor förare |
| E2 | UNO-projektets superstartpaket |
| A1 (på 1) | skärbräda |
| A2 (på 199 | Lodrät hakparen |
| B2 (på andra) | Smalt rätvinksfäste |
| C1 (på 1) | Brödbräda i miniserie |
| C5 (på))c5 | Liten V-klämma |
| D4 (på 199 | V-klämma i miniatyr |
| C2 (på andra) | Ø12,7 mm aluminiumstolpe |
| C4, D3 | Optisk stolpe i miniserie |
| D1 (på)du kan säga | Ø12,7 mm aluminiumstolpe |
| C3, D2 | Rätvink Ø1/2" till Ø6 mm stolpe |
| C6 (på 199 | Piedestalstolpe i miniserie |
| D5 (D5) | Trubbig ändnål |
| F. | Sprutpump |
Tabell 3: Övertoning som gör systemkomponenter.
10. Fraktionering och detektion av systemenhet (figur 2).
- Använd en vanlig rund käftspare för att montera OPTIKMODULEN på UV-monitorn på rör piercern. Fäst ena änden av slangen (1 cm lång och 0,56 mm innerdiameter) på rör piercerns anslutningsspelare och den andra änden på fluiden i optikmodulens port. Anslut Fluid Out-porten till fraktioneraren.
- Anslut optikmodulen med UV-monitorns styrenhet enligt tillverkarens handbok.
- Använd en brytkabel för att ansluta signalutgångsuttaget till den digitala omvandlaren vid marken och analoga ingångsanslutningar, enligt tillverkarens manual.
- Anslut den digitala omvandlaren till en bärbar dator med en vanlig USB-kabel och spela in de konverterade digitala signalerna med hjälp av dataförvärvsprogram.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som en demonstration separerades det kortikala lysatet som innehåller 75 μg RNA (poolat från 8 embryon) av sackarosgradienten i 12 fraktioner. Toppar av UV-absorbans vid 254 nm identifierade fraktioner som innehåller 40S-underenheten, 60S-underenheten, 80S monosom och polyomer (figur 4A). Analys av fraktioner av western blot för den stora ribosomal underenheten, Rpl10 visade dess närvaro i 60S underenheten (fraktion 3), monosom (fraktion 4) och polysomes (fraktioner 5-12) (Figur 4B). Cytoplasmaproteinerna Gapdh och Csde1 var däremot inte associerade med ribosomer utan berikades i fraktioner som innehöll fritt RNA (fraktion 1) (figur 4B). I överensstämmelse med separationen av proteiner i olika fraktioner fann vi att gapdh och sox2 mRNAs var mycket berikade i fraktionerna som innehåller tunga polyomer (mer än tre ribosomer i fraktioner 7-12), vilket tyder på att gapdh och sox2 mRNAs effektivt översätts i utvecklingsbarken (Figur 4C,D). Däremot berikades rpl7 och rpl34 mRNAs i fraktionen som innehåller monosomer, vilket tyder på förträngd översättning(figur 4E,F)16. Dessa resultat validerade vårt polysome fraktionering protokoll.
Figur 1:Inställning för sackarosgradientberedning. (A) Hemmonterad sackarosgradienttillverkare bestående av ett linjärt scenstyrdon, en rörhållare på motoriserade scenen, en scenstyrenhetsuppsättning, en trubbig nål av metall monterad på en nålhållare och en automatiserad sprutpump med en spruta ansluten till nålen (se tabell 3). B)För att förbereda sackarosgradienten placeras ultracentrifugröret i rörhållaren. Sackaroslösningar doseras genom den trubbiga nålen med hjälp av en sprutpump. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Dissekering av kortikalvävnaderna från utvecklingsmusembryon. (A) Bild som visar ett E12,5 CD1-embryo fastsatt på en Ø 6 cm-platta med 21G-23G-nålar. (B) Bild som visar den dissekerade cortex efter avlägsnande av hud, skalle och hjärnhinnor (markerade med vita streckade linjer). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 3:Inställningar för fraktionering, inspelning och provinsamling. Bild som visar det hemmonterade fraktionerings-, inspelnings- och provuppsamlingssystemet bestående av en automatiserad sprutpump, en rörborrare, en fraktionssamlare och en UV-monitor med en digital omvandlare ansluten till en bärbar dator för kontinuerlig övervakning av UV-absorbans. Datainsamling hanteras av programvaran för förvärv av kommersiella data. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4:Polysome profilering analys av denutvecklande musbarken. (A) UV-absorbans som visar fraktioner som innehåller fritt RNA (fraktion 1), 40S underenhet (fraktion 2), 60S underenhet (fraktion 3), 80S monosomer (fraktion 4) och polysomer (fraktion 5-12). Totalt användes RNA som poolats från 8 embryon. B)Västerländska blots som visar fördelningen av Gapdh-, Rpl10- och Csde1-proteiner i fraktioner. qPCR-analys som visar fördelningen av gapdh (C), sox2 (D), rpl7 (E) och rpl34 (F) mRNAs i fraktioner. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Polysome profilering är en vanligt förekommande och kraftfull teknik för att bedöma translationell status på både enda gen och genom-wide nivåer14 . I den här rapporten presenterar vi ett protokoll av polysome profilering med hjälp av en hemmonterad plattform och dess tillämpning för att analysera den utvecklande musbarken. Denna kostnadseffektiva plattform är lätt att montera och generera robusta, reproducerbara sackarosgradienter och polysomeprofilering med hög känslighet.
Det är värt att notera att beredningen av konsekventa sackarosgradienter av god kvalitet är avgörande för att erhålla reproducerbara polysome profileringsresultat17. Förändringar i volymen av 10-50% sackaroslösningar under gradientpreparat kan orsaka förskjutning av polysome toppar och inkonsekvens av resultat i nedströms analys. Dessutom kan störande av lutningen under införandet och avlägsnandet av nålen bidra till inkonsekvensen av gradientpreparat. Jämfört med andra tillvägagångssätt och kommersiella enheter använde vårt hemgjorda gradienttillverkningssystem ett motoriserat steg för att minska störningar av gradienter under beredningen och en sprutpump för att noggrant dispensera sackaroslösningar, vilket erbjuder en billig och enkel lösning för gradientberedning.
Tillämpa polysome profilering plattform och protokoll som finns här till den utvecklande musbarken, fann vi att ribosomal protein Rpl10 och cytoplasmic proteiner Gapdh och Csde1 distribuerades i rätt fraktioner. Dessutom berikades de högt översatta gapdh och sox2 mRNAs i polysomala fraktioner, medan translationellt förträngda rpl34 och rpl7 mRNAs visade mindre berikning i polysomer, vilket validerar vår plattform och protokoll. Med ett liknande tillvägagångssätt kan translationell status för andra gener i den utvecklande cortexen bestämmas individuellt av PCR i realtid. Observera att polysome profilering har använts för att analysera translationell status i den utvecklande hjärnan på genomomfattande nivå. I detta avseende kan fraktioner som innehåller polyomer kombineras och extraheras RNA kan analyseras med hjälp av djup sekvensering. Plattformen och protokollet som finns här kan anpassas och optimeras ytterligare för att passa translatomiska studier med andra celltyper och vävnader. Med tanke på tillgången på närvävnader begränsade av experimentella tillstånd (t.ex. <50 μg RNA) kan ytterligare optimering av protokollet ge ytterligare ökningar av experimentens effektivitet och reproducerbarhet.
Medan polysome profilering ger insikter om översättningsstatus för mRNAs i den utvecklande cortex, har den begränsningar att analysera specifika celltyper i senare utvecklingsstadier, när olika neurala celltyper finns. För att ta itu med denna fråga kan polysome profilering integreras med TRAP genom neddragning av epitopmärkt ribosomalprotein uttryckt under en vävnadsspecifik promotor11.
Sammanfattningsvis ger plattformen och protokollet som vi rapporterar här för sackarosgradienttillverkning och fraktionering en ekonomisk lösning på polysome profileringsexperiment i samband med hjärnutveckling samt andra biologiska sammanhang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av ett NSERC Discovery Grant (RGPIN/04246-2018 till G.Y.). G.Y. är en kanadensisk forskningsordförande. S.K. finansierades av Mitacs Globalink Graduate Fellowship och ACHRI Graduate Student Scholarship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL RNA free microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 10 cm dish | Greiner-Bio | 664160 | |
| 1M MgCl2 | Invitrogen | AM9530G | |
| 21-23G needle | BD | 305193 | |
| 2M KCl | Invitrogen | AM8640G | |
| 30 mL syringe | BD | 302832 | |
| Blunt end needle | VWR | 20068-781 | |
| Breadboard | Thorlabs | MB2530/M | |
| Bromophenol blue | Sigma | 115-39-9 | |
| CD1 mouse | Charles River Laboratory | ||
| Curved tip forceps | Sigma | #Z168785 | |
| Cycloheximide | Sigma | 66-81-9 | |
| Data acquisition software TracerDAQ | Measurement Computing | ||
| Digital converter | Measurement Computing | USB-1208LS | |
| Direct-zol RNA miniprep kit | Zymo | R2070 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-basic | 12-03-3483 | |
| DMSO | Bioshop | 67-68-5 | |
| Dumont No.5 forceps | Sigma | #F6521 | |
| Fraction collector | Bio-Rad | Model 2110 | |
| HBSS | Wisent | 311-513-CL | |
| Linear stage actuator | Rattmmotor | CBX1605-100A | |
| Luciferase control RNA | Promega | L4561 | |
| Maxima first strand cDNA synthesis kit | Themo Fisher | M1681 | |
| Miniature V-clamp | Thorlabs | VH1/M | |
| Mini-series breadboard | Thorlabs | MSB7515/M | |
| Mini-series optical post | Thorlabs | MS2R/M | |
| Mini-series pedestal post holder base | Thorlabs | MBA1 | |
| NaCl | Bio-basic | 7647-14-5 | |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| Ø12.7 mm aluminum post | Thorlabs | TRA150/M | |
| Parafilm | Bemis | PM992 | |
| PerfeCTa SYBR green fastmix | Quanta Bio | CA101414-274 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Wisent | 311-010-CL | |
| Puromycin | Bioshop | 58-58-2 | |
| Right-angle clamp | Thorlabs | RA90/M | |
| Right-angle Ø1/2" to Ø6 mm post clamp | Thorlabs | RA90TR/M | |
| Rnase AWAY | Molecular BioProducts | 7002 | |
| RNase free tips | Frogga Bio | FT10, FT200, FT1000 | |
| RNase free water | Wisent | 809-115-CL | |
| RNasin | Promega | N2111 | |
| Slim right-angle bracket | Thorlabs | AB90B/M | |
| Small V-clamp | Thorlabs | VC1/M | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 302-95-4 | |
| Stepper motor driver | SongHe | TB6600 | |
| Sucrose | Bioshop | 57501 | |
| SW 41 Ti rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| Triton-X-100 | Bio-basic | 9002-93-1 | |
| Trizol | Thermofisher Scientific | 15596018 | |
| Tube piercer | Brandel | BR-184 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | L8-70M | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
| UNO project super starter kit | Elegoo | EL-KIT-003 | |
| UV monitor | Bio-Rad | EM-1 Econo | |
| Vertical bracket | Thorlabs | VB01A/M |
References
- Götz, M., Huttner, W. B.
- Guillemot, F. Spatial and temporal specification of neural fates by transcription factor codes. Development. 134, 3771-3780 (2007).
- Fiddes, I. T., et al. Human-Specific NOTCH2NL Genes Affect Notch Signaling and Cortical Neurogenesis. Cell. 173, 1356-1369 (2018).
- Lennox, A. L., et al. Pathogenic DDX3X mutations impair RNA metabolism and neurogenesis during fetal cortical development. Neuron. 106, 404-420 (2020).
- Martynoga, B., Drechsel, D., Guillemot, F. Molecular control of neurogenesis: A view from the mammalian cerebral cortex. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 4 (10), 008359 (2012).
- Amadei, G., et al. A Smaug2-based translational repression complex determines the balance between precursor maintenance versus differentiation during mammalian neurogenesis. Journal of Neurosci. 35, 15666-15681 (2015).
- Yang, G., Smibert, C. A., Kaplan, D. R., Miller, F. D. An eIF4E1/4E-T complex determines the genesis of neurons from precursors by translationally repressing a proneurogenic transcription program. Neuron. 84, 723-739 (2014).
- Yang, G., et al. A Glo1-Methylglyoxal pathway that is perturbed in maternal diabetes regulates embryonic and adult neural stem cell pools in murine offspring. Cell Reports. 17, 1022-1036 (2016).
- Kraushar, M. L., et al. Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the RNA-binding protein Hu antigen R. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 111, 3815-3824 (2014).
- Rodrigues, D. C., et al. Methylglyoxal couples metabolic and translational control of Notch signalling in mammalian neural stem cells. Nature Communications. 11, 2018 (2020).
- Iwasaki, S., Ingolia, N. T. The growing toolbox for protein synthesis studies. Trends in Biochemical Sciences. 42, 612-624 (2017).
- Chekulaeva, M., Landthaler, M.
- Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling. Journal of Visualized Experiments. (92), e52295 (2014).
- Chassé, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45, 15 (2017).
- Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nature Chemical Biology. 6, 209-217 (2010).
- Kraushar, M. L., et al. Thalamic WNT3 secretion spatiotemporally regulates the neocortical ribosome signature and mRNA translation to specify neocortical cell subtypes. Journal of Neuroscience: Official Journal of Society of Neuroscience. 35, 10911-10926 (2015).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. Journal of Visualized Experiments. (7), e51455 (2014).
