Summary
Развитие мозга млекопитающих требует надлежащего контроля экспрессии генов на уровне перевода. Здесь мы описываем систему поликомного профилирования с помощью простой в сборке градиентной градиентной и фракционной платформы для оценки трансляционного состояния мРНК в развивающемся мозге.
Abstract
Правильное развитие мозга млекопитающих опирается на тонкий баланс пролиферации нервных стволовых клеток и дифференциации на различные типы нервных клеток. Этот баланс жестко контролируется экспрессией генов, которая достроена на нескольких уровнях, включая транскрипцию, посткриптацию и перевод. В этой связи растущее количество фактических данных подчеркивает важную роль трансляционной регуляции в координации решений о судьбе нервных стволовых клеток. Полисомная фракционирование является мощным инструментом для оценки трансвеститного статуса мРНК как на глобальном, так и на индивидуальном уровне генов. Здесь мы представляем внутриутверенные полисомные профилирования трубопровода для оценки трансляционной эффективности в клетках из развивающейся коры головного мозга мыши. Мы описываем протоколы для подготовки градиента сахарозы, лиза тканей, ультрацентрифугации и дробного анализа переводного статуса мРНК.
Introduction
Во время развития мозга млекопитающих, нервные стволовые клетки размножаются и дифференцируются для генерации нейронов иглии 1,2. Возмущение этого процесса может привести к изменениям в структуре и функции мозга, как видно из многих расстройств нейроразвития3,4. Правильное поведение нервных стволовых клеток требует организованного выражения конкретных генов5. В то время как эпигенетический и транскрипционные контроль этих генов был интенсивно изучен, последние результаты показывают, что регуляции генов на других уровнях также способствует координации пролиферациинервных стволовых клеток и дифференциации6, 7,8,9,10. Таким образом, решение программ трансляционного контроля значительно повысит наше понимание механизмов, лежащих в основе решения судьбы нервных стволовых клеток и развития мозга.
Три основных метода с различными сильными сторонами были широко применены для оценки трансляционного статуса мРНК, включая рибосомное профилирование, перевод очистки рибосомной сродства (TRAP) и профилирование поликомы. Рибосомное профилирование использует секвенирование РНК для определения защищенных рибосомой фрагментов мРНК, что позволяет глобальному анализу количества и местонахождения перевода рибосом на каждой стенограмме косвенно сделать вывод о скорости перевода, сравнив его с изобилиемстенограммы 11. TRAP использует рибосомальные белки с эпитопом, помеченными эпитопом, для захвата рибосомно-связанных мРНК12. Учитывая, что помеченные рибосомные белки могут быть выражены в конкретных типах клеток с использованием генетических подходов, TRAP позволяет анализ перевода в клеточном типе конкретных образом. Для сравнения, поликомное профилирование, которое использует градиентную фракциацию плотности сахарозы для отделить свободную и плохо переведенную часть (легкие моносомы) от тех, которые активно переводятся рибосомами (более тяжелыми полисомами), обеспечивает прямое измерение плотности рибосомы на мРНК13. Одним из преимуществ этого метода является его универсальность для изучения перевода конкретных мРНК, представляющих интерес, а также генома всей перевод анализа14.
В этой статье мы описываем подробный протокол полисомного профилирования для анализа развивающейся коры головного мозга мыши. Мы используем домоборную систему для подготовки градиентов плотности сахарозы и сбора фракций для нисходящих приложений. Представленный здесь протокол можно легко адаптировать для анализа других типов тканей и организмов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все виды использования животных контролировались Комитетом по уходу за животными в Университете Калгари. Мыши CD1, используемые для эксперимента, были приобретены у коммерческого поставщика.
1. Подготовка решений
ПРИМЕЧАНИЕ Для предотвращения деградации РНК, спрей рабочая скамья и все оборудование с RNase обеззараживание раствора. Для эксперимента используются советы без RNase. Все решения готовятся в воде без RNase.
- Подготовка циклохэксимида фондовый раствор (100 мг/мл) в DMSO и хранить при -20 градусов по Цельсию.
- Приготовьте раствор для запаса сахарозы 2,2 М, добавив 75,3 г сахарозы в воду без RNase и долива объема до 100 мл (для подготовки градиента No16). Раствор можно хранить при -20 градусов по Цельсию для длительного хранения.
- Приготовить 10-х соляной раствор (1 М НаКл; 200 мМ Трис-ХКл, рН 7,5; 50 мММгКл 2).
- Приготовьте 60% (w/v) раствор для погони сахарозы, содержащий 30 г сахарозы, 5 мл 10-х соленого раствора и доверху до 50 мл с безсолевой водой без RNase.
- По желанию, добавить пятнышко бромофено-голубой или примерно 5 йл 1% бромофено-голубой в RNase свободной воды в погоню решения. 1.6. Храните растворы при 4 градусах Цельсия.
2. Подготовка градиента сахарозы
ПРИМЕЧАНИЕ: Точность в подготовке градиентов сахарозы имеет решающее значение для получения последовательных и воспроизводимых результатов.
- Чтобы подготовить шесть градиентов сахарозы 10-50%, разбавьте раствор сахарозы 2,2 М, как в таблице 1.
| Раствор сахарозы | 10% | 20% | 30% | 40% | 50% |
| 2.2 M сахароза | 2 мл | 4 мл | 6 мл | 8 мл | 10 мл |
| 10X солевой раствор | 1,5 мл | 1,5 мл | 1,5 мл | 1,5 мл | 1,5 мл |
| Циклохексимид | 15 йл | 15 йл | 15 йл | 15 йл | 15 йл |
| Вода | 11,5 мл | 9,5 мл | 7,5 мл | 5,5 мл | 3,5 мл |
| Общий объем | 15 мл | 15 мл | 15 мл | 15 мл | 15 мл |
Таблица 1: Разбавления сахарозы для препаратов градиентов сахарозы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда подготовьте градиенты сахарозы в кратных по два, чтобы сбалансировать вес во время ультрацентрифугации.
- Протрите металлическую тупую иглу с помощью раствора обеззараживания RNase. Кратко промойте ультрацентрифуговые трубки, трубки и шприц, используя воду без RNase. Воздух-сухие трубки так, что не капля воды остается в трубах, как и любая оставшаяся вода изменит концентрацию сахарозы.
- Поместите металлическую иглу на держатель зажима и центрифугу на моторизованной сцене. Для последовательной подготовки градиентов использовалась система домашней сборки, которая содержит моторизованную сцену для удержания ультрацентрифугной трубки и шприц-насоса для впрыскива растворов сахарозы(рисунок 1, см. шаг 9 для деталей).
- Заполните шприц 30 мл с 16 мл 10% сахарозы (достаточно для шести градиентов), поместите его на шприц насоса и подключить его к игле. Убедитесь, что в шприце, трубке и игле нет пузырьков воздуха. Протрите кончик с иглы, чтобы удалить любой остаточный раствор.
- Перемести моторизованную сцену так, чтобы кончик иглы касался центра трубки внизу.
- Установите шприц-насос со скоростью потока 2 мл/мин при объеме 2,3 мл.
- После дозирования 2,3 мл 10% раствора сахарозы, двигаться вниз моторизованной стадии и повторить процесс для всех шести градиентов.
- Повторите шаги 2.4-2.7, чтобы добавить 20% раствор сахарозы в нижней части труб, а затем 30%, 40% и 50% сахарозы решений аналогичным образом.
- После подготовки градиента, печать ультрацентрифуг трубки с помощью парафиновой пленки.
- Оставьте трубки на ночь при 4 градусов по Цельсию, чтобы различные слои сахарозы рассеиваются вместе, чтобы дать непрерывный градиент.
3. Вскрытие тканей
ПРИМЕЧАНИЕ: Беременные мыши были усыпляются шейки матки дислокации предшествовала анестезия с 5% изофлюран.
- Соберите эмбрионы мыши CD1 в эмбриональный день 12, или другие точки времени по мере необходимости, и поместите эмбрионы в пластину 10 см, содержащую ледяной Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) на льду, чтобы сохранить жизнеспособность клеток.
- Под прицелом вскрытия перенесите один эмбрион на пластину длиной 6 см, содержащую ледяной HBSS.
- Используйте 21-23 G иглы, чтобы исправить положение головы, проникая через глаза под углом примерно 45 "и применить силу, чтобы убедиться, что иглы фиксируются на пластине(рисунок 2A).
- Используйте No 5 типсы для удаления кожи и черепа, от середины до сторон.
- Используйте типсы, чтобы сократить обонятельные луковицы и удалить осинки подвергать корковых тканей.3.6.Использование изогнутых типсов, чтобы сократить корковых тканей на 2-3 мл нервно-пластовой среды нальду (рисунок 2B). Бассейн корковых тканей из разных эмбрионов по мере необходимости. Ткани из 8-10 эмбрионов обычно дают 200 мкг общей РНК.
4. Клеточныйлиз
- В день вскрытия тканей приготовьте буфер свежего клеточного лиза, как описано в таблице 2.
| решение | Окончательная концентрация | том |
| Трис-HCl (рН 7,5) | 20 мМ | 100 йл |
| KCl | 100 мМ | 250 йл |
| MgCl2 | 5 мМ | 25 йл |
| Тритон X-100 | 1% (v/v) | 500 йл |
| Дезоксихолат натрия | 0,5% (w/v) | 500 йл |
| Дитиотрейтол (DTT) | 1 мМ | 5 йл |
| Циклохексимид | 100 мкг/мл | 5 йл |
| RNase бесплатная вода | До 5 мл | |
| итог | 5 мл | 5 мл |
Таблица 2: Подготовка полисомного лиза буфера.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнение буфера лиза с ингибиторами протеазы и фосфатазы.
- Добавьте циклохексимид в нейробазную среду с расчлененными тканями до конечной концентрации 100 мкг/мл и инкубировать при 37 градусах Цельсия в течение 10 мин. Циклохексимид блокирует удлинение перевода и, следовательно, предотвращает рибосомный 15-й запуск.
- Центрифуга при 500 х г в течение 5 мин при 4 градусов по Цельсию и отбросить супернатант.
- Вымойте ткани дважды с ледяной фосфат-буферный солевой раствор (PBS) дополняется 100 мкг / мл циклохексимида.
- Добавьте 500 МКЛ буфера клеточного лиза, дополненного 4 МКЛ ингибитора RNase. Пипетт вверх и вниз, чтобы повторно использовать ткани в буфере лиза. Используйте инсулиновую иглу, чтобы аккуратно подставить ткань.
- Инкубировать ткани на льду в течение 10 минут с кратким вихрем каждые 2-3 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для предотвращения деградации тканей, убедитесь, что все шаги лиза тканей проводятся на льду. - Центрифуга при 2000 х г в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия.
- Перенесите супернатант в новую центрифугу на льду.
- Центрифуга при 13 000 евро х г в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия.
- Перенесите супернатант в новую центрифугу на льду.
- Измерьте концентрацию РНК в лиссате ткани с помощью спектрофотометра UV-Vis.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если в эксперимент включено несколько образцов, разбавьте образцы в ту же концентрацию с дополнительным буфером лиза клеток, чтобы свести к минимуму вариации.
5. Примерная загрузка и ультрацентрифугация
- Предварительно охладить ультрацентрифугированный ротор и качели на 4 градусов по Цельсию, и установить температуру ультрацентрифуга до 4 градусов по Цельсию.
- Держите 20 йл ткани лизолировать в качестве общего ввода РНК.
- Загрузите образцы (50-300 мкг РНК с равным объемом) в верхней части градиентов сахарозы, медленно распределяя лизат к стенкам ультрацентрифугных труб.
- Аккуратно поместите ультрацентрифуговые трубки в ведро с качелями. Убедитесь, что все диаметрально противоположные ведра сбалансированы.
- Загрузите качели ведра на ротор. Установите ультрацентрифуг до 190 000 х г (39 000 об/мин) при 4 градусах Цельсия в течение 90 мин.
- Аккуратно поместите градиенты на лед после центрифугации.
6. Фракция и сбор образцов
ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа и сбора образцов из градиентов (рисунок3, см. Компонентыустройства) используется система домашней дробиления, записи и сбора.
- Поместите пустую ультрацентрифугную трубку на трубчатый пирсинг и аккуратно проникните в трубку иглой со дна.
- Включите УФ-монитор и откройте программное обеспечение для записи цифрового сигнала.
- Заполните 30 мл шприца с 25 мл 60% раствора погони сахарозы. Аккуратно нажмите шприц так, что решение погони заполняет пустую трубку и пройти через 254 нм УФ-монитор, чтобы установить базовый уровень для обнаружения.
- Нажмите авто-ноль на УФ-монитор, чтобы зарегистрировать базовый уровень для обнаружения. Нажмите играть на программное обеспечение, чтобы начать запись.
- Как только система установит базовый уровень, приохтять запись на программное обеспечение и отказаться от решения погони. Убедитесь, что в системе не останется остаточного решения погони.
ПРИМЕЧАНИЕ: Промыть систему с RNase свободной воды для удаления остаточной сахарозы решений, оставшихся от предыдущего запуска. - Загрузите одну пробоотборчатую трубку в трубчатый пирсинг. Аккуратно проникайте в трубку иглой со дна.
- Начните запись на программное обеспечение. Запустите шприц-насос (скорость потока 1 мл/мин для объема 25 мл) и сборщик фракций для сбора полисомных фракций. Установите параметры фракциотеля до 30 с.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед каждым запуском, убедитесь, что пузырьки воздуха в шприце или трубки, мягко нажав шприц, чтобы погоня решение течет непрерывно через иглу. - Соберите фракции в 1,5 мл труб (500 йл каждая) с помощью фракционной коллектора.
- Фракции могут быть обработаны немедленно или хранятся при -80 градусов по Цельсию.
- После сбора фракций, промыть систему с RNase свободной воды, чтобы удалить остатки сахарозы.
7. Извлечение РНК
- К каждой фракции добавьте 10 нг люциферазы мРНК-контроля.
- Добавьте три тома гидрохолрида гуанидия на основе коммерческого реагента изоляции РНК к каждой фракции.
- Вихрь кратко для 15 s.
- Извлекайте РНК с помощью набора для извлечения РНК, совместимого с раствором, используемым в 7.2.
8. Обратная транскрипция и ПЦР в режиме реального времени
- Измерьте концентрацию РНК с помощью спектрофотометра UV-Vis.
- Тема РНК для обратной транскрипции с помощью комплекта синтеза cDNA, в соответствии с протоколом производителя.
- В качестве примера используйте количественный ПЦР в реальном времени (qPCR) для изучения полисомального распределения зияющей мРНК. qPCR был выполнен с помощью системы обнаружения qPCR и реагента qPCR mastermix, со следующими условиями езды на велосипеде: 95 градусов по Цельсию в течение 10 минут, затем 40 циклов по 95 градусов по Цельсию для 15 с, 60 градусов по Цельсию для 30 с, 72 кк C для 40 с, а затем 95 градусов по Цельсию для 60 с.
- Получение значений порогового цикла (Ct) на участках усиления и использование для расчета изменения складок с использованием метода «CT».
9. Сборка градиента сахарозы
ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте шагам, чтобы собрать каждый компонент (как описано в таблице 3) градиента сахарозы(рисунок 1).
- Гора две вертикальные скобки (A2) на базовой доске (A1).
- Используйте два тонких правоугольных кронштейна (B2) для установки линейного привода к базовой доске (A1).
- Используйте наборы на алюминиевом столбе 12,7 мм (C2), чтобы зафиксировать его на держатель трубки базовой доски (C1) в качестве стенда для держателя трубки.
- Соберите правый угол No 1/2" до 6 мм после зажима (C3) с постом (C2) и мини-серии оптический пост (C4).
- Используйте наборы на оптическом столбе (C4) для подключения небольшого V-зажима (C5) в качестве держателя трубки.
- Положите центрифугу трубки в держатель трубки и настроить угол, чтобы сделать его вертикальным. Отметь положение трубки и смонтировать держатель поста пьедестала (C6) на базовой доске (C1) для поддержки трубки.
- С другой стороны доски (A1) используйте наборы алюминиевого столба диаметром 12,7 мм (D1), чтобы исправить его и подключить оптический столб мини-серии (D3) с помощью правого угла No1/2" до почтового зажима диаметром 6 мм (D2).
- Соедините миниатюрный V-clamp (D4) с тупой иглой (D5) к столбу (D3). Отрегулируйте угол зажима, чтобы установить вертикаль иглы, и отрегулируйте длину столба, чтобы игла соответствовала центрифуге трубки.
- Подключите привод (B1) к шагеру(E1) и используйте доску контроллера UNO R3 и модуль джойстика из стартового комплекта UNO (E2) для управления приводом. Для отдельного привода двигателя можно использовать адаптер питания (например, 9-24 V AC/DC регулируемый адаптер питания).
- Поместите шприц-насос (F) рядом со станцией изготовления градиентов и соедините шприц с иглой.
- Управление держатель трубки этапе вверх и вниз с помощью джойстика.
| компонент | пункт |
| B1 | Линейный актуатор сцены |
| E1 | Степпер водитель |
| E2 | Супер стартовый комплект проекта UNO |
| A1 | макет |
| A2 | Вертикальная кронштейн |
| B2 | Тонкий правый угол кронштейна |
| C1 | Мини-серия доска |
| C5 | Маленький V-зажим |
| D4 | Миниатюрный V-зажим |
| C2 | Алюминиевый столб диаметром 12,7 мм |
| C4, D3 | Мини-серия оптический пост |
| D1 | Алюминиевый столб диаметром 12,7 мм |
| C3, D2 | Правый угол No1/2" до 6 мм пост зажима |
| C6 | Мини-серия пьедестал пост держатель базы |
| D5 | Блант конец иглы |
| фа | Шприц насос |
Таблица 3: Градиент делает системные компоненты.
10. Фракционо-обнаружение системной сборки(рисунок 2).
- Используйте обычный круглый зажим для зажима для зажима для установки оптики модуля УФ-монитора на трубчатом пирсинге. Прикрепите один конец трубки (1 см в длину и 0,56 мм внутреннего диаметра) к соединителю трубчатого пирсинга, а другой конец к жидкости в порту оптики модуля. Подключите порт Fluid Out к фракциотору.
- Подключите модуль оптики к блоку управления УФ-монитора в соответствии с руководством производителя.
- Используйте прорыв кабеля для подключения розетки выход сигнала к цифровому преобразователь на земле и аналоговых входных соединений, в соответствии с руководством производителя.
- Подключите цифровой преобразователь к ноутбуку с помощью обычного USB-кабеля и заместите преобразованные цифровые сигналы с помощью программного обеспечения для сбора данных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В качестве демонстрации корковой лизат, содержащий РНК 75 мкг (с объединением из 8 эмбрионов), был разделен градиентом сахарозы на 12 фракций. Пики поглощения УФ-излучения на 254 нм определили фракции, содержащие 40S подразделение, 60S подразделение, 80S моносомы и полисомы(рисунок 4A). Анализ фракций западной помаркой для большого рибосомного подразделения, Rpl10 показал свое присутствие в 60S субъединицы (фракция 3), моносомы (фракция 4) и поликомы (фракции 5-12) (Рисунок 4B). В отличие от этого, цитоплазмические белки Gapdh и Csde1 не были связаны с рибосомами, но были обогащены фракциями, содержащими свободную РНК (фракция 1) (рисунок 4B). В соответствии с разделением белков на различные фракции, мы обнаружили, что gapdh и sox2 mRNAs были сильно обогащены фракциями, содержащими тяжелые полисомы (более трех рибосом в фракциях 7-12), предполагая, что gapdh и sox2 mRNAs эффективно переведены в развивающейся коре(рисунок 4C,D). В отличие от этого, rpl7 и rpl34 mRNAs были обогащены фракцией, содержащей моносомы, что предполагает репрессированный перевод(рисунок 4E,F)16. Эти результаты подтвердили наш протокол полисомной фракциоции.
Рисунок 1: Настройка для подготовки градиента сахарозы. ( A ) Домашний градиент сахарозы производитель, состоящий из линейной сцены привода, держатель трубки на моторизованной сцене, набор контроллера сцены, металлическая тупая игла, установленная на держателе иглы, и автоматизированный шприц насос со шприцем, подключенным к игле (см. таблицу 3). (B) Для подготовки градиента сахарозы, ультрацентрифугная трубка помещается в держатель трубки. Растворы сахарозы распределяются через тупую иглу с помощью шприц-насоса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Вскрытие корковых тканей из эмбриона мыши развития.(A)Изображение, показывающее эмбрион E12.5 CD1, закрепленный на пластине 6 см с помощью игл 21G-23G. (B)Изображение, показывающее расчлененную кору после удаления кожи, черепа и опоясывания (отмечено белыми пунктирной линией). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Настройка для фракционования, записи и сбора образцов. Изображение, изображающее домашнее дробирование, систему записи и сбора образцов, состоящую из автоматизированного шприц-насоса, трубчатого пирсинга, коллектора фракций и УФ-монитора с цифровым преобразователем, подключенным к ноутбуку для непрерывного мониторинга поглощения УФ. Сбором данных занимается коммерческое программное обеспечение для сбора данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Полисомный анализ профилирования развивающейся коры мыши. (A) УФ-поглощение, показывающее фракции, содержащие свободную РНК (фракция 1), 40S подразделение (фракция 2), 60S подразделение (фракция 3), 80S моносомы (фракция 4) и полисомы (фракция 5-12). Было использовано 75 мкг общей РНК, слились из 8 эмбрионов. (B)Западные пятна, показывающие распределение белков Gapdh, Rpl10 и Csde1 в фракциях. анализ qPCR, показывающий распределение gapdh (C), sox2 (D), rpl7 (E) и rpl34 (F) mRNAs в фракциях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Поликом-профилирование является широко используемым и мощным методом оценки трансляционного статуса как на одном гене, так и на уровнегенома 14. В этом отчете мы представляем протокол полисомного профилирования с помощью домашней платформы и ее применения для анализа развивающейся коры мыши. Эта экономически эффективная платформа проста в сборке и генерации надежных, воспроизводимых градиентов сахарозы и полисомного профилирования с высокой чувствительностью.
Стоит отметить, что подготовка последовательного и хорошего качества градиентов сахарозы имеет решающее значение для получения воспроизводимых результатов профилированияполисомы 17. Изменения в объеме 10-50% растворов сахарозы во время подготовки градиента могут привести к сдвигу полисомных пиков и несоответствию результатов в анализе ниже по течению. Кроме того, нарушение градиента во время вставки и удаления иглы может способствовать несоответствию градиентной подготовки. По сравнению с другими подходами и коммерческими устройствами, наша система изготовления самодельных градиентов использовала моторизованную стадию для уменьшения нарушения градиентов во время подготовки и шприц-насос для точного распределения растворов сахарозы, который предлагает дешевое и простое решение для подготовки градиента.
Применяя поликомную платформу профилирования и протокол, присутствующие здесь, к развивающейся коре мыши, мы обнаружили, что рибосомный белок Rpl10 и цитоплазмические белки Gapdh и Csde1 были распределены в правильных фракциях. Кроме того, высоко переведенные gapdh и sox2 mRNAs были обогащены полисомальными фракциями, в то время как переводно репрессированные rpl34 и rpl7 mRNAs показали меньше обогащения в полисомах, которые подтверждают нашу платформу и протокол. При аналогичном подходе, переводное состояние других генов в развивающейся коре может быть определено индивидуально ПЦР в режиме реального времени. Следует отметить, что поликомное профилирование используется для анализа трансституального состояния развивающегося мозга на уровне генома. В этой связи фракции, содержащие полисомы, могут быть объединены и извлечены РНК могут быть проанализированы с помощью глубокого секвенирования. Платформа и протокол, присутствующие здесь, могут быть адаптированы и дополнительно оптимизированы в соответствии с переводомными исследованиями с использованием других типов клеток и тканей. Учитывая наличие корковых тканей, ограниченных экспериментальными условиями (например, РНК <50 мкг), дополнительная оптимизация протокола может обеспечить дальнейшее повышение эффективности и воспроизводимости экспериментов.
В то время как полизомное профилирование дает представление о переводном состоянии мРНК в развивающейся коре головного мозга, оно имеет ограничения для анализа конкретных типов клеток на более поздних стадиях развития, когда присутствуют различные типы нейронных клеток. Для решения этого вопроса, полисомное профилирование может быть интегрировано с TRAP путем стягивания эпитопа помечены рибосомный белок, выраженный под ткани конкретныхпромоутер 11.
В заключение, платформа и протокол, которые мы сообщаем здесь для сахарозы градиента решений и фракциотации обеспечивают экономичное решение для полисом профилирования экспериментов в контексте развития мозга, а также других биологических контекстах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствие конкурирующих интересов.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась грантом NSERC Discovery Grant (RGPIN/04246-2018). Г.Я. является канадским научным кафедрой. S.K. финансировалась стипендией Mitacs Globalink Graduate Fellowship и стипендией аспиранта ACHRI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL RNA free microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 10 cm dish | Greiner-Bio | 664160 | |
| 1M MgCl2 | Invitrogen | AM9530G | |
| 21-23G needle | BD | 305193 | |
| 2M KCl | Invitrogen | AM8640G | |
| 30 mL syringe | BD | 302832 | |
| Blunt end needle | VWR | 20068-781 | |
| Breadboard | Thorlabs | MB2530/M | |
| Bromophenol blue | Sigma | 115-39-9 | |
| CD1 mouse | Charles River Laboratory | ||
| Curved tip forceps | Sigma | #Z168785 | |
| Cycloheximide | Sigma | 66-81-9 | |
| Data acquisition software TracerDAQ | Measurement Computing | ||
| Digital converter | Measurement Computing | USB-1208LS | |
| Direct-zol RNA miniprep kit | Zymo | R2070 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-basic | 12-03-3483 | |
| DMSO | Bioshop | 67-68-5 | |
| Dumont No.5 forceps | Sigma | #F6521 | |
| Fraction collector | Bio-Rad | Model 2110 | |
| HBSS | Wisent | 311-513-CL | |
| Linear stage actuator | Rattmmotor | CBX1605-100A | |
| Luciferase control RNA | Promega | L4561 | |
| Maxima first strand cDNA synthesis kit | Themo Fisher | M1681 | |
| Miniature V-clamp | Thorlabs | VH1/M | |
| Mini-series breadboard | Thorlabs | MSB7515/M | |
| Mini-series optical post | Thorlabs | MS2R/M | |
| Mini-series pedestal post holder base | Thorlabs | MBA1 | |
| NaCl | Bio-basic | 7647-14-5 | |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| Ø12.7 mm aluminum post | Thorlabs | TRA150/M | |
| Parafilm | Bemis | PM992 | |
| PerfeCTa SYBR green fastmix | Quanta Bio | CA101414-274 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Wisent | 311-010-CL | |
| Puromycin | Bioshop | 58-58-2 | |
| Right-angle clamp | Thorlabs | RA90/M | |
| Right-angle Ø1/2" to Ø6 mm post clamp | Thorlabs | RA90TR/M | |
| Rnase AWAY | Molecular BioProducts | 7002 | |
| RNase free tips | Frogga Bio | FT10, FT200, FT1000 | |
| RNase free water | Wisent | 809-115-CL | |
| RNasin | Promega | N2111 | |
| Slim right-angle bracket | Thorlabs | AB90B/M | |
| Small V-clamp | Thorlabs | VC1/M | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 302-95-4 | |
| Stepper motor driver | SongHe | TB6600 | |
| Sucrose | Bioshop | 57501 | |
| SW 41 Ti rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4500 | |
| Triton-X-100 | Bio-basic | 9002-93-1 | |
| Trizol | Thermofisher Scientific | 15596018 | |
| Tube piercer | Brandel | BR-184 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | L8-70M | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
| UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
| UNO project super starter kit | Elegoo | EL-KIT-003 | |
| UV monitor | Bio-Rad | EM-1 Econo | |
| Vertical bracket | Thorlabs | VB01A/M |
References
- Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 777-788 (2005).
- Guillemot, F. Spatial and temporal specification of neural fates by transcription factor codes. Development. 134, 3771-3780 (2007).
- Fiddes, I. T., et al. Human-Specific NOTCH2NL Genes Affect Notch Signaling and Cortical Neurogenesis. Cell. 173, 1356-1369 (2018).
- Lennox, A. L., et al. Pathogenic DDX3X mutations impair RNA metabolism and neurogenesis during fetal cortical development. Neuron. 106, 404-420 (2020).
- Martynoga, B., Drechsel, D., Guillemot, F. Molecular control of neurogenesis: A view from the mammalian cerebral cortex. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 4 (10), 008359 (2012).
- Amadei, G., et al. A Smaug2-based translational repression complex determines the balance between precursor maintenance versus differentiation during mammalian neurogenesis. Journal of Neurosci. 35, 15666-15681 (2015).
- Yang, G., Smibert, C. A., Kaplan, D. R., Miller, F. D. An eIF4E1/4E-T complex determines the genesis of neurons from precursors by translationally repressing a proneurogenic transcription program. Neuron. 84, 723-739 (2014).
- Yang, G., et al. A Glo1-Methylglyoxal pathway that is perturbed in maternal diabetes regulates embryonic and adult neural stem cell pools in murine offspring. Cell Reports. 17, 1022-1036 (2016).
- Kraushar, M. L., et al. Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the RNA-binding protein Hu antigen R. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 111, 3815-3824 (2014).
- Rodrigues, D. C., et al. Methylglyoxal couples metabolic and translational control of Notch signalling in mammalian neural stem cells. Nature Communications. 11, 2018 (2020).
- Iwasaki, S., Ingolia, N. T. The growing toolbox for protein synthesis studies. Trends in Biochemical Sciences. 42, 612-624 (2017).
- Chekulaeva, M., Landthaler, M. Eyes on translation. Molecular Cell. 63, 918-925 (2016).
- Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling. Journal of Visualized Experiments. (92), e52295 (2014).
- Chassé, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45, 15 (2017).
- Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nature Chemical Biology. 6, 209-217 (2010).
- Kraushar, M. L., et al. Thalamic WNT3 secretion spatiotemporally regulates the neocortical ribosome signature and mRNA translation to specify neocortical cell subtypes. Journal of Neuroscience: Official Journal of Society of Neuroscience. 35, 10911-10926 (2015).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. Journal of Visualized Experiments. (7), e51455 (2014).
