Summary
Мы представляем протокол для установления модели массивного понтийного кровоизлияния у крысы с помощью двойной инъекции аутологичной крови.
Abstract
Мы предоставляем протокол для установления модели массивного понтийного кровоизлияния у крысы. Крысы весом около 250 граммов были использованы в этом исследовании. Сто микролитров аутологичной крови брали из хвостовой вены и стереотаксически вводили в понс. Процесс инъекции разделили на 2 этапа: сначала 10 мкл крови вводили в определенное место, переднезадневое положение (АП) -9,0 мм; боковой (Лат) 0 мм; вертикальная (Верт) -9,2 мм, с последующим вторым введением остаточной крови, расположенной при АП -9,0 мм; Лат 0 мм; Верт -9,0 мм с 20-минутным интервалом. Для оценки неврологической функции использовались тест на балансир, тест на размещение конечностей и модифицированный нейрооценка Voestch. Магнитно-резонансная томография (МРТ) использовалась для оценки объема кровоизлияния in vivo. Симптомы этой модели соответствовали пациентам с массивным понтийным кровоизлиянием.
Introduction
Внутримозговое кровоизлияние составляет пятую часть пациентов с инсультом. Прогноз внутримозгового кровоизлияния зависит от скорости, объема и локализации кровотечения1,2. По сравнению с кровоизлиянием в передний мозг, кровоизлияние в ствол мозга имеет более высокую смертность и заболеваемость3. Около 40% кровоизлияний в ствол мозга происходит в понс4. Этиология и патофизиология понтинного кровоизлияния совершенно различны и менее изучены, чем кровоизлияние в передний мозг5.
Существует два вида понтийных кровоизлияния на животных моделях. Одной из них является модель спонтанного кровоизлияния, индуцированная инфузией бактериальной коллагеназы в понс6,7,8. Самым большим преимуществом этой модели является то, что кровотечение является спонтанным. Однако коллагеназа может вызвать только небольшой объем понтинового кровоизлияния. Кроме того, коллагеназа может вызвать другие травмы головного мозга. Другая модель индуцируется стереотаксической инъекцией аутологичной крови в понс9. Преимущество этой модели в том, что ее легко освоить с высоким показателем успешности. Теоретически, исследователи могли бы вводить любой объем крови в любое место понсов. Однако из-за обратной утечки через игольчатый путь объем инъекций ограничен. В последнее время был предложен метод двойной инъекции для уменьшения обратной утечки9. Этот метод вводит аутологистную кровь дважды с 20-минутным интервалом между инъекциями. Метод двойной инъекции применяется для индуцирования легкого (30 мкл) и умеренного (60 мкл) понтинового кровоизлияния, но не массивного понтинового кровоизлияния. В клинике большинство пациентов с понтийным кровоизлиянием с плохим прогнозом имеют массивное кровоизлияние (более 10 мл).
В предыдущем исследовании мы предоставили протокол для установления модели ишемического инсульта понтина у крыс10. В этом исследовании мы модифицируем существующий метод двойной инъекции и предоставляем подробный протокол, чтобы вызвать массивное понтийное кровоизлияние у крысы путем двойной инъекции 100 мкл аутологичной крови в двух разных местах в понс.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Протокол был рассмотрен и одобрен Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Второй аффилированной больницы Медицинского университета Гуанчжоу. Крысы были предоставлены Центром животных Южного медицинского университета. Экспериментальная конструкция показана на рисунке 1.
1. Животные и инструменты
- Используйте 8-недельного самца крыс Sprague-Dawley весом 250 ± 10 г.
- Размещайте крыс в течение не менее 7 дней до операции в контролируемых условиях окружающей среды с температурой окружающей среды 25 ° C, относительной влажностью 65% и циклом 12/12 ч свет-темнота.
- Обеспечьте еду и воду без ограничений.
- Подготовьте приборы(рисунок 2А-Е).
2. Ввести кровь в понс
- Взвесьте крыс еще раз за 3 дня до операции, чтобы выбрать крыс с подходящей массой тела для экспериментов.
- В течение 3 дней перед моделированием научите крыс ходить на бревне 3 раза в день, чтобы нормальные крысы могли пройти балансир без паузы.
- Разогреть грелку до 37 °C перед анестезией.
- Прикрепите микродрень к держателю на стереотаксической рамке.
- Вводят крысам 50 мг/кг кетамина и 5 мг/кг ксилазина внутрибрюшинно. Подождите, пока не будет ответа на защемление.
- Транспортировать крысу в стереотаксическую рамку в положении лежа. Поставьте ушные вкладыши над ушным каналом, чтобы закрепить голову. Зафиксируйте череп в горизонтальном положении, чтобы избежать перекоса инъекции(рисунок 2F).
- Поддерживайте анестезию изофлураном (97,5% кислорода и 2,5% изофлурана) через стереотаксический носовой конус с входным и выходным портом.
- Используйте глазную мазь, чтобы сохранить роговицу влажной.
- Сбрить волосы над черепом микробритвой.
- Нарисуйте среднюю линию 3 см маркером в черепе от линии двустороннего бокового кантуса до 0,5 см позади заднего родничка, как показано на рисунке 2F.
- Наносите энтойодный хирургический скраб циркулярным способом, начиная с середины отмеченной средней линии и вращаясь наружу.
- Поместите хирургическую драпировку.
- Сделайте разрез скальпелем по обозначенной средней линии.
- Используйте ватный тампон, чтобы удалить любую потенциальную кровь.
- Поместите кусок щипцов на каждую сторону лоскута головы, чтобы обнажить череп(рисунок 2G).
- Окуните ватный тампон в 0,9% физиологического раствора и аккуратно удалите соединительные ткани из кости черепа, чтобы избежать попадания соединительных тканей в микродрил.
- Отметьте центральную точку брегмы как точку отправления маркером.
- Выполните тре черепно-тиэктомию (диаметром 1 мм) с помощью микродрила при AP-9,0 мм, Lat 0 мм(рисунок 1B и таблица 1). Действуйте осторожно, потому что эта точка находится очень близко к венозному синусу(рисунок 2G).
- Удалите микродрень из стереотаксической рамки.
- Поместите шприц Гамильтона 100 мкл в стереотаксический держатель(рисунок 2K). Включите переключатель инжекционного насоса, нажмите кнопку Быстрой ингаляции, раствор аспирата гепарина (12500 ЕД, разбавленный в 100 мл физиологического раствора) до 100 мкл, а затем полностью слить его, чтобы предотвратить слишком быстрое свертывание крови.
- Нанесите хлоргексидин и 75% спиртовой хирургический скраб на весь хвост от корня до кончика не менее 3 раз, чтобы продезинфицировать кожу, смягчить роговость и расширить хвостовую вену, чтобы увеличить частоту успеха инъекции.
- Прикрепите иглоукалывание кожи головы к шприцу 1 мл.
- Вставьте иглоукалывание кожи головы в боковую хвостовую вену на 3 см от кончика хвоста и возьмите 150 мкл крови(рисунок 2Н).
- Снимите иглоукалывание кожи головы со шприца 1 мл.
- Перенесите кровь в пробирку(рисунок 2I).
ПРИМЕЧАНИЕ: Быстро переносите, чтобы предотвратить свертывание крови. - Смените хирургические перчатки.
- Выберите режим вывода, установите громкость на 100 мкл, установите скорость на уровне 200 мкл/мин, нажмите кнопку RUN, аспирировать 100 мкл крови в шприц Гамильтона(рисунок 2J).
- Выберите режим Infuse, установите скорость на уровне 1 мкл/мин.
- Выдвигайте шприц до тех пор, пока наконечник не достигнет 9,2 мм ниже поверхности мозга(рисунок 1С и рисунок 2L).
- Нажмите кнопку Run, вводят первые 10 мкл крови со скоростью 1 мкл/мин(таблица 1).
- Остановите инъекцию и оставьте шприц в положении на 20 минут, чтобы предотвратить поступление крови в субарахноидальное пространство.
- Втягивайте шприц до тех пор, пока наконечник не прибудет на 9,0 мм ниже поверхности мозга.
- Возобновляйте инъекцию с той же скоростью 1 мкл/мин до тех пор, пока остаточная кровь не будет введена полностью.
- Оставьте шприц в положении на 10 минут, чтобы избежать обратного потока крови.
- Медленно извлеките шприц из мозга.
- Используйте костный цемент, чтобы покрыть отверстие для краниотомии.
- Когда цемент высохнет, зашивают рану 4-0 полиамидной нитью шва. После пришивания 3 или 4 швов завяжите 2-1-1 стандартных хирургических узла.
- Для профилактики инфекции крысам вводят пенициллин (0,25 мл, 80 МЕ, разведенных в 4 мл физиологического раствора) внутрибрюшинно.
- Вводят крысам подкожно тартрат буторфанола (2,5 мг/кг) и повторяют инъекцию каждые 2 часа для облегчения послеоперационной боли до 24 часов после операции.
- Наблюдайте за крысой каждые 15 минут, пока она полностью не оправится от анестезии. Верните его в исходную клетку, с грелкой под клеткой. Обеспечьте крысе свободный доступ к пище и воде до жертвоприношения.
3. Поведенческие тесты
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните поведенческие тесты на 1-й день, 3-й день, 7-й день и 14-й день после моделирования, включая тест на балансир, тест на размещение конечностей и модифицированный нейрооценку Voetsch.
- Испытание балансирового пучка11.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это тест, специально предназначенный для изучения сенсомоторной функции задней конечности.- Подготовлен аппарат для того, чтобы балка (шириной 3 см × длиной 70 см) была на 20 см выше пола.
- Поставьте темный ящик на заднем конце балки с узким входом.
- Поместите генератор белого шума и яркий источник света, которые используются для мотивации крысы пересечь луч и войти в стойку ворот, на головном конце луча.
- Остановите шум и свет, когда животное войдет в стойку ворот. Запишите задержку от головы до стойки ворот (в секундах) и производительность задней конечности во время прохождения луча.
- Запишите оценку производительности следующим образом: 0, балансы с устойчивой осанкой; 1, захваты со стороны балки; 2, прижимает балку с 1 задним сгибаем; 3, прижимает балку с 2 конечностями, отваливающимися или вращающимися вокруг балки более 60 с; 4, пытается балансировать на бревне >40 с, но падает; 5, пытается балансировать на луче >20 с, но отваливается; и 6, отваливается, без попытки сбалансировать или балансировать на луче <20 с.
- Тест на размещение конечностей
ПРИМЕЧАНИЕ: Тест на размещение конечностей исследует 3 независимых стимула зрения, осязания и проприоцепции с 6 параметрами для оценки сенсомоторной функции крысы. Общий показатель неврологической функции варьировался от 0 до 12. Перед тестом крыса должна привыкнуть к обращению.- Держите крысу за спину и медленно ставить на стол с высоты 10 см. Обычно крыса растягивает передние конечности и ложит их на стол.
- Схватите крысу за спину и держите ее лицом к краю стола. Наблюдается реакция передних конечности. Обычная крыса размещала передние конечности на столе.
- Пусть крыса схватится за край стола. Обычная крыса будет использовать подбородок, чтобы предотвратить прикосновение волос носа и носа к краю стола.
- Положите крысу на стол, мягко надавите на крысу с легким боковым давлением за плечо к краю стола и наблюдайте за расположением передних и задних конечности. Нормальная крыса схватила бы край передними и задними конечноями.
- Положите крысу на стол мордочкой к краю и осторожно протолкнуть ее сзади к краю. Нормальная крыса схватила бы край передними конечноями.
- Положите крысу на стол спиной к краю и прижмите ее спиной к краю стола. Наблюдают за реакцией задних конечности. Нормальная крыса схватила бы край задними налимками.
- Оцените расположение передних или задних конечности к краю стола. Запишите баллы следующим образом: 0, без размещения; 1, незавершенное и/или отложенное размещение; 2, немедленное, полное размещение.
- Модифицированный нейроскор Voetsch8
ПРИМЕЧАНИЕ: Модифицированная нейрооценка Voetsch представляет собой оценку сенсомоторной способности по вертебробазилярной шкале, содержащую 14 параметров: движение головы, активность, слух, болевой рефлекс, рефлекс роговицы, проприоцепция, ощущение шеи, исследование, кружение, осевое ощущение туловища, движение 4 конечностей, движение передних конечностей, скалолазание и ходьба лучом. Оценка по каждому параметру колеблется от 0 (полный неврологический дефицит) до 3 (отсутствие неврологического дефицита). Общий балл неврологической функции колеблется от 0 до 42.- Положите крысу на стол (50 см длиной × шириной 35 см) и дайте ей пошевелиться в течение пяти минут. Наблюдайте за спонтанным движением его головы: движется во всех измерениях, 3; предпочитает одну сторону, 2; только движение в 1 сторону, 1; согнутый в одностороннюю сторону, 0.
- Положите крысу на стол (50 см длиной × шириной 35 см) и дайте ей пошевелиться в течение пяти минут. Деятельность определяется как: полностью отзывчивая, 3; умеренно отзывчивый, 2; минимально отзывчивый, 1; кома, 0.
- Наблюдают краниокаудальное кружение: поворачивается двусторонне, 3; предпочитает 1 сторону, 2; только с 1 стороны, 1; упал на 1 сторону, 0.
- Оценка движения передних конечности: равное и двустороннее движение, 3; незначительная асимметрия, 2; большая асимметрия, 1; парез, 0.
- Оцените движение 4 конечностей: равное и двустороннее движение, 3; незначительная асимметрия, 2; большая асимметрия, 1; парез, 0.
- Когда крыса неподвижна, выполните ущемление уха, чтобы стимулировать ушные раковины и проверить болевой рефлекс: быстро и симметрично удаляется от стимула, 3; медленно или асимметрично удаляется от стимула, 2; показывает некоторое движение в ответ на боль, 1; без реакции, 0.
- Когда крыса неподвижна, издавайте шум по обе стороны тела крысы, чтобы проверить слух: растирание пальцев, 3; щелчки пальцев, 2; громкие хлопки, 1 и не поразительно, 0.
- Чтобы проверить проприоцепцию, коснитесь вибрисс крысы с обеих сторон соответственно тупой палочкой и наблюдайте за ее реакцией на раздражитель: реагируйте на прикосновение, 3; снижение реакции с одной стороны, 2; уменьшено с обеих сторон, 1; отсутствует, 0.
- Чтобы оценить осевое ощущение туловища, поместите тупую палочку по обе стороны тела крысы и наблюдайте за ее реакцией на раздражитель: резкая и симметричная реакция на раздражители, 3; слегка уменьшенная или асимметричная реакция, 2; значительно уменьшенная и асимметричная реакция, 1 и отсутствие реакции, 0.
- Чтобы проверить рефлекс роговицы, удерживайте крысу и быстро коснитесь роговицы с обеих сторон ватным тампоном: оба глаза быстро закрываются, 3; снижение рефлекса с одной стороны, 2; уменьшено с обеих сторон, 1; отсутствует, 0.
- Чтобы проверить ощущение шеи, удерживайте крысу и используйте тупую палку, чтобы коснуться шеи: активно реагирует на прикосновение, 3; замедленная реакция на прикосновение, 2; значительно сниженная реакция, 1; без реакции, 0.
- Чтобы наблюдать за исследованием, используйте светлый темный ящик.
ПРИМЕЧАНИЕ: Две трети коробки должны быть открыты и освещены, в то время как остальная часть покрыта и темна. Дверь размером 7 см соединяет два отсека. - Поместите крысу в светлый отсек на 5 минут, а затем в темный отсек еще на 5 минут, дайте ей передвигаться и запишите действия крысы. Когда в одной комнате будут размещены 4 конечности, запишите ее как вход. Запись баллов выглядит следующим образом: достигает светлых и темных отсеков активно, 3; достигает 1 отсека, 2; движется медленно только после стимула, 1; и без движения, 0.
- Чтобы проверить способность к набору высоты, поместите крысу на дно плоскости шириной 20 см, длиной 70 см с углом 30 градусов к горизонтальной земле. Рекорд баллов следующий: способен подняться на вершину, 3; нарушение скалолазания, 2; стационарный захват, 1; и падает сразу, 0.
- Чтобы осмотреть балку ходьбы, положите крысу на один конец балки шириной 3 см, длиной 70 см, которая находится на 20 см над землей, запишите оценки следующим образом: исследует весь луч, 3; исследует часть балки, 2; некоторое движение и падения, 1; без движения, 0.
- Рассчитайте баллы.
4. Подтверждение кровоизлияния с помощью МРТ
- Выполните МРТ-сканирование через 24 ч после операции.
- Обезболить крыс изофлураном (5% для индукции, 1%-1,5% для поддержания).
- Закрепите голову крысы в катушке мозгового массива крысы в сочетании с объемной катушкой только для передачи.
- Поместите катушку вместе с крысой в МРТ-сканер. Закрепите крысу в колыбели с помощью зубных и ушных стержней.
- Используйте замкнутую термообложку для поддержания температуры тела крысы на уровне 37 ± 0,5 °C во время МРТ-сканирования.
- Выполните пилотную последовательность, чтобы обеспечить правильную геометрию.
- Примените быстровращаемую эхо-последовательность для сбора сканирования, взвешенного по T2. Задайте следующие параметры: время эхо (TE), 132 мс; время повторения (TR), 2 500 мс; матрица приобретения, 148 × 148; поле зрения, 100 мм × 100 мм; 12 ломтиков; Толщина 1,5 мм.
- Верните крысу в клетку.
5. Подтверждение кровоизлияния грубой анатомией
ПРИМЕЧАНИЕ: Жертвоприношение крыс в назначенную точку времени, через 24 ч и 14 d после операции(рисунок 1D).
- Обезболивают крысу 5% изофлураном до потери сознания. Затем усыпить его углекислым газом(СО2)(20-30% от объема клетки в минуту).
- Подтвердите смерть, используя следующие признаки: отсутствие подъема и опускания грудной клетки, отсутствие пальпируемого сердцебиения, отсутствие реакции на защемление пальцев ног, плохой цвет слизистой оболочки, изменение цвета или непрозрачность в глазах.
- Выполняют вывих шейки матки.
- Закрепите крысу, заклеив лапы на стерильной платформе. Создайте разрез средней линии от шейки матки, чтобы обнажить гипогастрий грудной клетке и печени. Сделайте боковой разрез от верхнего стернального края вдоль ключицы в крайнем левом углу и еще один боковой разрез от кистого вдоль диафрагмы в крайнем левом углу, чтобы обнажить сердце. Поднимите засоску грудной клетки и закрепите ее на платформе штифтом.
- Подключите конец иглы (27 г) к перфузионного насоса, содержащему физиологический раствор 4 °C. Продвините кончик иглы в сердце вдоль левого края левого желудочка, чтобы избежать попадания в предсердие. Включите перфузионный насос, чтобы убедиться, что наконечник находится в левом желудочке, затем сделайте разрез в правом предсердии.
- Выключите перфузионный насос, когда жидкость, вытекаемая из правого предсердия, становится бесцветной, а печень белеет. Для этой процедуры требуется примерно 100 мл физиологического раствора 4 °C.
- Обезглавить крысу и собрать весь мозг с помощью ножниц и щипцов. Удалите влагу с поверхности мозга с помощью промокательной бумаги.
- Держите весь мозг при -80 °C в течение 1 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может быть пропущен, если мозг можно разрезать без замораживания. - Положите мозг в корональную матрицу мозга крысы дорсальной стороной вверх.
- Вставьте лезвие из нержавеющей стали толщиной 0,21 мм в центр кровоизлияния в соответствии с отверстием на поверхности мозга.
- Вставляют другие лезвия в мозг с интервалом 2 мм.
- Погружают участки мозга в 10 мл 4% раствора параформальдегида (ПФА) в течение 24 ч при 4 °C. Промыть их 0,01 ммоль/л фосфатного буферного физиологического раствора (PBS).
- Организуйте участки от рострального до каудального и изобразите их.
6. Парафиновое сечение и окрашивание гематоксилином и эозином (HE)
- Зафиксируйте мозг 4% раствором PFA в течение не менее 24 ч при комнатной температуре. Объем ПФА должен быть в 5-10 раз больше объема мозга.
- Разрезайте мозг из центра кровоизлияния на две части с помощью лезвия и корональной матрицы мозга крысы.
- Сделайте парафиновые тканевые блоки.
- Секция парафинового тканевого блока коронально толщиной 40 мкм скользит по микротому, последовательно разрезает 4 участка, начиная с центра кровоизлияния, и плавает на водяной бане с 40 °C.
- Установите секции размером 40 мкм (всего 8 слайдов на один мозг) на чистые стеклянные слайды и высушите воздухом ночью при комнатной температуре.
- Выпекайте горки при 56 °C в течение 1 ч.
- Промыть 3 мин в ксилоле, 3 раза.
- Окуните секции в 30 раз в 100% этанол, еще в 30 раз в 100% этанол, в 30 раз в 95% этанол и еще в 30 раз в 95% этанол.
- Смойте в водопроводной воде до чистого прозрачи.
- Погружайте срезы в гематоксилин примерно на 10 мин.
- Промойте в водопроводной воде до чистого прозрачи.
- Погружайте срезы в эозиновую пятно на 30 с.
- Обезвоживание слайдов с 3-4 погружениями 95% этанола, 3-4 погружения в 100% этанол, 100% этанола в течение 1 минуты и 10 погружений в 100% этанол + ксилол (1:1).
- Очищают срезы ксилолом в течение 1 мин, 2 раза.
- Монтаж с использованием невозгодного монтажного носителя и крышки.
- Высушите участки на воздухе на ночь при комнатной температуре, затем высушите их.
7. Статистика
- Используйте GraphPad Prism 6.0 для расчета t-теста Студента или теста Манна Уитни U.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все данные должны быть выражены как среднее ± SE. Различия между двумя группами определяются с помощью t-теста двуххвостого студента или теста Манна Уитни U. P<0.05 определяется как статистическая значимость.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В общей сложности было использовано 25 животных, 3 для контроля, 6 для 30 мкл, 6 для 60 мкл и 10 для инъекций в кровь по 100 мкл. Одна крыса, получившего инъекцию 100 мкл аутологиозной крови (1/10), умерла в течение 24 часов после операции.
Поведенческие тесты проводились в День 1, День 3, День 7 и День 14 после операции. Оценки для контрольной группы и групп инъекций крови в разные временные точки после операции представлены в таблице 2. Понтинное кровоизлияние вызвало неврологический дефицит, такой как снижение рефлекса роговицы и кружение(Рисунок 3B,C). Инъекция 100 мкл крови также индуцировала миотонию(рисунок 3А). Результаты теста на балансир, теста на размещение конечностей и модифицированной нейрооценки Voetsch показали, что неврологическая функция уменьшалась по мере увеличения объема понтинового кровоизлияния.
МРТ-сканирование проводилось через 24 часа после операции(рисунок 4). В группах инъекций крови по последовательности Т2 кровоизлияние было обнаружено в виде ободка hypointense с изо- или слегка гиперинтензионным ядром в базилярной части понсов. Не было обнаружено кровоизлияния с помощью МРТ в других областях мозга(рисунок 4). Объем кровоизлияния увеличивался по мере увеличения объема инъекционной аутологиозной крови.
Затем крыс приносили в жертву в 24 часа и на 14 день после операции, отдельно, и делали участки толщиной 2 мм(рисунок 4). Было обнаружено кровоизлияние, окружающее место инъекции и распространяющееся в основании понсов. Наблюдался небольшой отек вокруг кровоизлияния в группе инъекций крови 100 мкл.
Некоторые из крыс были принесены в жертву через 3 дня после операции и разделены парафином для окрашивания HE. Результаты показали, что в кроветворных инъекционных группах воспалительные клетки обогащаются в зоне пери-кровоизлияния(фиг.5С и F). Гемоглобин остается содержащимся в интактных эритроцитах(рисунок 5D и G).
Рисунок 1:Принципиальные схемы модели понтийного кровоизлияния. (А) Аутологичные заборы крови из хвостовой вен. (B) Принципиальная схема расположения буровой установки. (C) Принципиальные схемы места инъекции. D) Экспериментальное проектирование. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Инструменты и процедуры хирургии. (А) Анестезионные аппараты. B) Хирургические инструменты. (C) Микродрил. (D) Микровпрысковый насос. (E) Стереотаксические аппараты. (F) Линия, отмеченная в середине черепа. (G) Желтая стрелка указывает на место бурения. (H) Дренаж крови из хвостовой вены. (I) Перенесите кровь в трубку Эппендорфа. (J) Аспирировать кровь в шприц Гамильтона. (K) Продвинь шприц Гамильтона через отверстие черепа. (L) Процесс инъекции аутологиозной крови. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Репрезентативные результаты поведенческих тестов. (А) Миотонии крысе вводили 100 мкл аутологичной крови. (B) Снижение рефлекса роговицы с правой стороны у крысы, впрыскивающей 60 мкл аутологичного кровотока. (C) Снижение рефлекса роговицы в двусторонних сторонах у крысы, которой вводили 100 мкл аутологичных кровяных. (D) Крыса получала 60 мкл аутологичного кровообращения, обведено до контралатеральной стороны поражения. Е) Результаты испытания на бревне. (F) Результаты модифицированной нейрооценки Voetsch. G) Результаты теста на определение конечностей. Линия означает существенную разницу между двумя группами (p < 0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:Репрезентативные результаты МРТ-сканирования и грубой анатомии. МРТ-сканирование (Верхнее) проводили через 24 ч после операции понтинного кровоизлияния, затем крыс приносили в жертву и разрезали на 2 мм участки мозга (Нижние). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5:Репрезентативные результаты окрашивания ВО. Мозг был собран у крыс, введенных 100 мкл крови 3 d после операции. (А) Весь отдел мозга. Низкие поля из (B) нормальной области понтина, (C) зоны поражения и (D) ядра кровоизлияния. Высокие поля из (E) нормальной понтийной области, (F) зоны пери-поражения и (G) ядра кровоизлияния. Шкала шкалы составила 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок S1: Репрезентативные результаты грубой анатомии на 14-й день после операции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
| Легкая | умеренный | массивный | |
| Общий объем | 30 мкл | 60 мкл | 100 мкл |
| Первая инъекция | |||
| Стереотаксические координаты | ТОЧКИ доступа -9,0 мм; Лат 0; Верт -9.2 мм | ||
| том | 10 мкл | 10 мкл | 10 мкл |
| скорость | 1 мкл/мин | 1 мкл/мин | 1 мкл/мин |
| Интервальное время | 20 мин | 20 мин | 20 мин |
| Вторая инъекция | |||
| Стереотаксические координаты | ТОЧКИ доступа -9,0 мм; Лат 0; Верт -9.2 мм | ТОЧКИ доступа -9,0 мм; Лат 0; Верт -9.0 мм | |
| том | 20 мкл | 50 мкл | 90 мкл |
| скорость | 1 мкл/мин | 1 мкл/мин | 1 мкл/мин |
| Перед выводом иглы | 10 мин | 10 мин | 10 мин |
| AP: переднезадняя позиция | |||
| Лат: боковой | |||
| Верт: вертикальный | |||
Таблица 1: Инъекции в аутологисти крови.
| Крысиный номер | День 1 | День 3 | День 7 | День 14 |
| Модифицированный нейроскор Voetsch | ||||
| 30 мкл-1 | 33 | 34 | 38 | 41 |
| 30 мкл-2 | 30 | 35 | 37 | 41 |
| 30 мкл-3 | 34 | 37 | 40 | 42 |
| 60 мкл-4 | 27 | 30 | 36 | 38 |
| 60 мкл-5 | 23 | 28 | 34 | 39 |
| 60 мкл-6 | 26 | 29 | 35 | 39 |
| 100 мкл-7 | 16 | 25 | 31 | 36 |
| 100 мкл-8 | 13 | 22 | 29 | 37 |
| 100 мкл-9 | 14 | 21 | 26 | 36 |
| Шам-10 | 41 | 42 | 42 | 42 |
| Шам-11 | 42 | 42 | 42 | 42 |
| Шам-12 | 42 | 42 | 42 | 42 |
| Испытание балансирового пучка | ||||
| 30 мкл-1 | 1 | 0 | 0 | 0 |
| 30 мкл-2 | 1 | 1 | 0 | 0 |
| 30 мкл-3 | 2 | 1 | 0 | 0 |
| 60 мкл-4 | 3 | 2 | 0 | 0 |
| 60 мкл-5 | 4 | 2 | 0 | 0 |
| 60 мкл-6 | 3 | 2 | 1 | 0 |
| 100 мкл-7 | 5 | 4 | 3 | 1 |
| 100 мкл-8 | 5 | 4 | 2 | 1 |
| 100 мкл-9 | 4 | 4 | 2 | 1 |
| Шам-10 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Шам-11 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Шам-12 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Тест на размещение конечностей | ||||
| 30 мкл-1 | 11 | 12 | 12 | 12 |
| 30 мкл-2 | 10 | 11 | 12 | 12 |
| 30 мкл-3 | 10 | 11 | 12 | 12 |
| 60 мкл-4 | 9 | 11 | 12 | 12 |
| 60 мкл-5 | 8 | 9 | 9 | 11 |
| 60 мкл-6 | 8 | 9 | 10 | 11 |
| 100 мкл-7 | 4 | 5 | 9 | 11 |
| 100 мкл-8 | 3 | 4 | 8 | 10 |
| 100 мкл-9 | 2 | 4 | 7 | 8 |
| Шам-10 | 11 | 12 | 12 | 12 |
| Шам-11 | 12 | 12 | 12 | 12 |
| Шам-12 | 12 | 12 | 12 | 12 |
Таблица 2: Результаты поведенческих тестов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В настоящем исследовании мы предоставили протокол для создания модели крыс с массивным понтийным кровоизлиянием. Данная модель может быть использована для исследования патофизиологического механизма и прогноза массивного понтинового кровоизлияния.
На протяжении всего эксперимента использовались 25 крыс, из которых только одна умерла. Проверка МРТ, грубой анатомии и окрашивания ВО показала, что этот метод имел очень низкий уровень смертности и высокий уровень успеха. Чтобы установить модель массивного понтинового кровоизлияния, необходимо решить две проблемы: введенная аутологичная кровь имеет тенденцию просачиваться в субарахноидальное пространство и течь обратно в четвертый желудочек вдоль игольчатого тракта. Существующая модель умеренного понтинового кровоизлияния с двойной инъекцией (всего 60 мкл аутологичной крови) решила первую проблему, едва ли кровь текла в субарахноидальное пространство. Тем не менее, все еще было небольшое количество обратного потока крови. В настоящем исследовании было применено несколько стратегий для оптимизации существующего метода двойной инъекции, чтобы сделать возможным введение большего количества 100 мкл аутологиозной крови без обратного потока. Во-первых, были использованы два разных места для инъекций вместо одного. Во-вторых, гепарин использовался для промывки шприца с минимальным остатком для снижения дозировки, чтобы только защитить кровь от свораживания во время процесса инъекции, но недостаточно, чтобы способствовать утечке и обратному потоку после инъекции. В-третьих, время инъекции было длительным, а скорость впрыска медленной, 1 мкл/мин. Более того, только небольшое количество аутологиозной крови было введено в первый раз, в то время как вторая инъекция была выполнена через 20 минут. После этого иглу изымают только через 10 минут, и эта процедура проводилась крайне медленно. Используя этот метод, у крыс, вводимых 30 мкл или 60 мкл аутологизольной крови, едва ли была кровь, вливаемая в субарахноидальное пространство или четвертый желудочек, но у крыс, вводимых 100 мкл, все еще было небольшое количество обратного потока.
Поведенческие тесты проводились на 1-й день, 3-й день, 7-й день и 14-й день после моделирования, включая тест на балансир, тест на размещение конечностей и модифицированный нейрооценку Voetsch. В первый день после операции почти все крысы в группах инъекций крови демонстрировали круговое поведение (т.е. поворот влево или вправо), сопровождающееся исчезновением одностороннего или двустороннего рефлекса роговицы. Хотя аутологичная кровь вводилась в среднюю линию понтина, она была неравномерно распределена в двух сторонах мозга. Это, по-видимому, было причиной различной производительности в поведенческих тестах. Активность и реакции крыс, вводимым 30 мкл или 60 мкл аутологиозной крови, замедлялись ближе к норме. У крыс вводили 100 мкл крови, сенсомоторные функции были значительно ослаблены, а реакция была плохой. Мышечная ригидность появилась у некоторых крыс в состоянии покоя. На 1-й, 3-й и 7-й день наблюдались очевидные различия между крысами, введёнными 30 мкл, 60 мкл или 100 мкл аутологичная кровь, и крысами в контрольной группе в модифицированном нейросколе Voetsch. В тесте на балансир и тест на место конечностей не было существенных различий между крысами, введёнными 30 мкл или 60 мкл крови, и крысами в контрольной группе в любые моменты времени. Тем не менее, результаты теста на балансир и теста на размещение конечностей у крыс, введённых в 100 мкл аутологичная кровь, значительно отличались по сравнению с контрольной группой на 1-й и 3-й день. Возможная причина может заключаться в том, что в тесте на балансир и тесте на размещение конечностей меньше элементов оценки по сравнению с модифицированным нейрооцентом Voetsch, которые недостаточно чувствительны, чтобы обнаружить тонкий неврологический дефицит. Неуместно использовать эти два метода для оценки поведения в моделях кровоизлияния с легкими симптомами, но они применимы в модели массивного понтийного кровоизлияния. В целом, модифицированный нейроскор Voetsch оказался более подходящим для всесторонней и точной оценки неврологических функций в различных моделях понтинного кровоизлияния.
Есть несколько преимуществ этого метода. Основываясь на предыдущем методе двойной инъекции, место второй инъекции было изменено, а дозировка гепарина была скорректирована, чтобы избежать утечки и обратного потока в модели легкого (30 мкл) и умеренного (60 мкл) понтинового кровоизлияния. Даже в модели массивного (100 мкл) понтийного кровоизлияния обратный поток был очень ограничен и происходил только у небольшого числа крыс. Этот метод может быть легко выполнен с высоким уровнем успеха и низким уровнем смертности. Более того, экспериментальное понтийное кровоизлияние может наблюдаться в течение длительного периода, по крайней мере, через 14 дней после моделирования, что способствует исследованию всего развития заболевания и эффектов лечения. Основным достижением этой модели было то, что она имитировала симптомы пациентов с понтийным кровоизлиянием. Клинически массивное понтинное кровоизлияние приводит к тяжелому неврологическому дефициту, в то время как предыдущие модели понтинного кровоизлияния развивали только относительно небольшой геморрагический объем с легкими симптомами. Массивное понтинное кровоизлияние в этой модели распределено в двусторонних понах, что аналогично распределению кровоизлияния у пациентов с понтинным кровоизлиянием. В предыдущих экспериментальных моделях понтийного кровоизлияния кровоизлияние располагалось только в одностороннемпонсе 9.
Однако существуют и некоторые ограничения этого метода. Во-первых, понтинное кровоизлияние в этом исследовании было вызвано инъекцией крови, частично гепаринизированной во время перехода, что может повлиять на свертываемость крови или даже гомеостаз в окружающих понсах. Во-вторых, эта модель требует специального оборудования, такого как стереотаксический аппарат и тнвоковый насос. В-третьих, эта модель не может имитировать спонтанное кровоизлияние.
В заключение, это исследование предоставило метод создания экспериментальной модели острого массивного понтинового кровоизлияния у крыс, которая могла бы способствовать новым механическим и терапевтическим исследованиям в этой области.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Отсутствие конфликта интересов.
Acknowledgments
Это исследование было финансово поддержано Национальным научным фондом Китая (81471181 и 81870933) и Программой открытия лабораторий Медицинского университета Гуанчжоу (0506308) для Y Jiang, а также Национальным научным фондом Китая (81701471) и Научной программой Муниципальной комиссии по здравоохранению Гуанчжоу (20191A011083) для Ц цз цю и Национальным научным фондом Китая (81501009) для L Wu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100ml Saline solution | Guangdong yixiang | 191222201 C1 | Preparing heparin diluent |
| 100μl Microinjector | Shanghai Gaoge | Injection of autologous blood | |
| 1ml Syringe | Jiangsu Zhiyu | 20191014 | Withdraw autologous blood from the tail vein |
| 75% Alcohol | Shandong Lierkang | Disinfection of rat tail | |
| Adhesive tape | Shanghai Jinzhong | Surgicl instruments | |
| Animal anesthesia system | RWD | R510-31S-6 | Inducing and maintaining anesthesia |
| Balance beam | Jiangsu Saiangsi | For neurological deficit scores | |
| Blades | Shanghai Feiying | 74-C | For gross anatomy |
| Bone cement | Shanghai Xinshiji | 20180306 | Surgicl instruments |
| Brain tank | Shenzhen LEIYEA | For gross anatomy | |
| Butorphanol tartrate | Jiangsu Hengrui | For pain management | |
| Electric cranial drill | Nanjing Darwin biotechnology | 20180090018 | Making a burr hole on the skull |
| EP tube | Nantong Surui | Transfer autologous blood | |
| Erythromycin eye cream | Yunnan pharmacy | Eyes protection | |
| HE dye liquor | Solarbio | G1120 | For HE staining |
| Heating pad | Dangerous Jungle | JR01 | Keeping warm |
| Heparin sodium injection | Chengdu Haitong Pharmacal Company | 190701 | Preparing heparin diluent |
| IndoPhors | Guoyao of China | Sterilization | |
| Isoflurane | RWD | 20080701 | Inducing and maintaining anesthesia |
| Light dark box | Jiangsu Saiangsi | For neurological deficit scores | |
| Micro-injection pump | Baoding Leifu | TFD03-01-C | Injection of autologous blood |
| MRI system | Philips | Confirmation of infarction in vivo | |
| Needle holder | Shanghai Jinzhong | J32020 | Surgicl instruments |
| Penicilin | Guoyao of China | Infection Prevention | |
| Q-tips | Jiangxi Songhe | Surgicl instruments | |
| Scalp heedle | Jiangxi Hongda | 20200313 | Withdraw autologous blood from the tail vein |
| Scalpel | Shanghai Kaiyuan | 170902 | Surgicl instruments |
| Shearing scissors | Shanghai Jinzhong | Y00040 | Surgicl instruments |
| Stereotaxic apparatus | RWD | 900-00001-00 | for surgical positioning |
| Surgical towel | Xinxiang Huakangweicai | 20070601 | Surgicl instruments |
| Suture needle | Shanghai Jinzhong | Surgicl instruments | |
| Suture scissors | Shanghai Jinzhong | J25041 | Surgicl instruments |
| Tissue holding forcepts | Shanghai Jinzhong | J31080 | Surgicl instruments |
References
- Charidimou, A., et al. Brain hemorrhage recurrence, small vessel disease type, and cerebral microbleeds: A meta-analysis. Neurology. 89 (8), 820-829 (2017).
- Tao, C., et al. A novel brainstem hemorrhage model by autologous blood infusion in Rat: White Matter Injury, Magnetic Resonance Imaging, and Neurobehavioral features. Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 25 (5), 1102-1109 (2016).
- Ichimura, S., et al. Surgical treatment for primary brainstem hemorrhage to improve postoperative functional outcomes. World Neurosurgery. 120, 1289-1294 (2018).
- Behrouz, R. Prognostic factors in pontine haemorrhage: A systematic review. European Stroke Journal. 3 (2), 101-109 (2018).
- Guo, X., et al. Brainstem iron overload and injury in a rat model of brainstem hemorrhage. Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 29 (8), 104956 (2020).
- Chung, Y., Haines, S. J. Experimental brain stem surgery. Neurosurgery Clinics of North America. 4 (3), 405-414 (1993).
- Lekic, T., Tang, J., Zhang, J. H. A rat model of pontine hemorrhage. Acta Neurochirurgica Supplement. 105, 135-137 (2008).
- Lekic, T., et al. Evaluation of the hematoma consequences, neurobehavioral profiles, and histopathology in a rat model of pontine hemorrhage. Journal of Neurosurgery. 118 (2), 465-477 (2013).
- Shrestha, B. K., et al. Rat brainstem hemorrhage model: Key points to success in modeling. World Neurosurgery. 117, 106-116 (2018).
- Luo, M., Tang, X., Zhu, J., Qiu, Z., Jiang, Y. Establishment of acute pontine infarction in rats by electrical stimulation. Journal of Visualized Experiments. (162), (2020).
- Wu, L., et al. Keep warm and get success: The role of postischemic temperature in the mouse middle cerebral artery occlusion model. Brain Research Bulletin. 101, 12-17 (2014).
