Summary
Vi presenterar ett protokoll för att upprätta en massiv pontinska blödning modell i en råtta via dubbla injektion av autolog blod.
Abstract
Vi tillhandahåller ett protokoll för att etablera en massiv pontinsk blödningsmodell hos en råtta. Råttor som väger cirka 250 gram användes i denna studie. Hundra mikroliter autologt blod togs från svans venen och stereotaxically injiceras i pons. Injektionsprocessen delades in i 2 steg: Först injicerades 10 μL blod på en specifik plats, anteroposterior position (AP) -9, 0 mm; sido (Lat) 0 mm; vertikal (Vert) -9,2 mm, följt av en andra injektion av restblodet vid AP -9,0 mm; Lat 0 mm; Vert -9,0 mm med 20 minuters intervall. Balansstråletestet, limb placering test och den modifierade Voestch neuroscore användes för att utvärdera neurologiska funktion. Magnetic Resonance Imaging (MRT) användes för att bedöma volymen av blödning in vivo. Symptomen på denna modell var i linje med patienter med massiva pontinska blödning.
Introduction
Intracerebral blödning står för en femtedel av strokepatienterna. Prognosen för intrakraniell blödning beror på blödningens hastighet, volym och placering av blödning1,2. Jämfört med förhjärnblödningen har hjärnstammen blödning högre dödlighet och sjuklighet3. Cirka 40% av hjärnstammen blödning förekommer i pons4. Etiologin och patofysiologin hos pontinblödning är helt annorlunda och mindre studerade än förhjärnblödning5.
Det finns två typer av pontinska blödningsdjurmodeller. Den ena är spontan blödningsmodell inducerad genom infusion av bakteriella kollagenaser i ponsna6,7,8. Den största fördelen med denna modell är att blödningen är spontan. Kollagenas kan dock bara inducera en liten volym pontinblödning. Dessutom kan kollagenas orsaka andra skador på hjärnan. Den andra modellen induceras genom stereotaktisk injektion av autologt blod i pons9. Fördelen med denna modell är att det är lätt att behärska med en hög framgångsgrad. Teoretiskt sett kan forskare injicera vilken mängd blod som helst på vilken plats som helst av pons. På grund av ryggläckaget genom nålvägen är dock den injicerade volymen begränsad. Nyligen har dubbelinjektionsmetoden främjats för att minska ryggläckaget9. Denna metod injicerar autologt blod två gånger med 20 minuters intervall mellan injektionerna. Dubbelinsprutningsmetoden används för att inducera mild (30 μL) och måttlig (60 μL) pontinblödning men inte massiv pontinblödning. I kliniken har majoriteten av pontinska blödningspatienter med dålig prognos massiv blödning (mer än 10 ml).
I den tidigare studien tillhandahöll vi ett protokoll för att upprätta en pontinsk ischemisk strokemodell hos råtta10. I denna studie ändrar vi den befintliga dubbla injektionsmetoden och ger ett detaljerat protokoll för att inducera massiv pontin blödning hos en råtta genom dubbel injektion av 100 μL autologt blod på två olika platser i pons.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollet granskades och godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid det andra anslutna sjukhuset i Guangzhou Medical University. Råttor tillhandahölls av Animal Center of Southern Medical University. Den experimentella designen visas i figur 1.
1. Djur och instrument
- Använd 8 veckor gamla hanråttor som väger 250 ± 10 g.
- Inhys råttorna i minst 7 dagar före operationen under kontrollerade miljöförhållanden med en omgivningstemperatur på 25 °C, relativ luftfuktighet på 65% och en 12/12-h ljus-mörk cykel.
- Ge mat och vatten utan begränsning.
- Förbered instrumenten (figur 2A-E).
2. Injicera blodet i pons
- Väg råttorna igen 3 dagar före operationen för att välja råttor med lämplig kroppsvikt för experimenten.
- Under de 3 dagarna före modellering, träna råttorna att gå på balansbalk 3 gånger per dag för att säkerställa att normala råttor kan passera balansbalken utan paus.
- Förvärm värmedynan till 37 °C före anestesi.
- Fäst en mikrodrill på hållaren på stereotaxisk ram.
- Injicera råttorna med 50 mg/kg ketamin och 5 mg/kg xyzin intraperitoneally. Vänta tills det inte finns något tå-nyp-svar.
- Transportera råttan in i stereotaxisk ram i ett utsatt läge. Sätt öronstängerna ovanför öronkanalen för att säkra huvudet. Fixera skallen i horisontellt läge för att undvika skevning av injektionen (Figur 2F).
- Behåll anestesi genom isofluran (97,5% syre och 2,5% isofluran) genom en stereotaxisk noskon med en inlopps- och utloppsport.
- Använd ögonsalva för att hålla hornhinnan fuktig.
- Raka håret ovanför skallen med en mikrorakapparat.
- Rita en 3 cm mittlinje med en markörpenna i skallen från linjen för det bilaterala laterala canthus till 0,5 cm bakom den bakre fontanelle, som visas i figur 2F.
- Applicera Entoiodine kirurgisk skrubb på ett cirkulärt sätt, börja i mitten av den markerade mittlinjen och rotera utåt.
- Placera operationsdrapet.
- Gör ett snitt med en skalpell längs den markerade mittlinjen.
- Använd en bomullspinne för att ta bort eventuellt blod.
- Placera en bit tång på varje sida av hårbottenklaffen för att exponera skallen (Figur 2G).
- Doppa en bomullspinne i 0,9% saltlösning och ta försiktigt bort bindväven från skallbenet för att undvika att bindväven fastnar i mikrodrillen.
- Markera knägmans centrala punkt som ursprungspunkt via en markörpenna.
- Utför en kraniotomi (1 mm i diameter) med en mikrodrill vid AP-9,0 mm, Lat 0 mm (Figur 1B och Tabell 1). Fortsätt försiktigt eftersom denna punkt ligger mycket nära den venösa sinusen (figur 2G).
- Ta bort mikrodrillen från stereotaxiska ramen.
- Lägg en 100 μL Hamilton-spruta i stereotaxichållaren (Figur 2K). Slå på insprutningspumpbrytaren, klicka på snabb inandningsknappen, aspirera heparinlösningen (12500 U utspädd i 100 ml saltlösning) till 100 μL och dränera den sedan helt för att förhindra blodkoagulering för snabbt.
- Applicera klorhexidin och 75% alkohol kirurgisk skrubb på hela svansen från rot till spets minst 3 gånger för att desinficera huden, mjuka upp kåtan och vidga svans venen för att öka injektionshastigheten.
- Fäst en hårbottenakupunktur på en 1 ml spruta.
- För in hårbottenakupunkturen i en sidosvans ven 3 cm från svansspetsen och ta 150 μL blod (Figur 2H).
- Ta bort hårbottenakupunkturen från 1 ml-sprutan.
- Överför blodet till ett rör (figur 2I).
OBS: Överför snabbt för att förhindra blodkoagulering. - Byt operationshandskar.
- Välj uttagsläge, ställ in volymen på 100 μL, ställ in hastigheten på 200 μL/min, klicka på RUN-knappen, aspirera 100 μL blod i Hamilton-sprutan (Bild 2J).
- Välj Infuse-läge, ställ in hastigheten på 1 μL/min.
- För fram sprutan tills spetsen når 9,2 mm under hjärnans yta (figur 1C och figur 2L).
- Klicka på körknappen, injicera de första 10 μL blod med en hastighet av 1 μL/min (Tabell 1).
- Stoppa injektionen och låt sprutan vara på plats i 20 minuter för att förhindra att blod strömmar in i subarachnoidutrymmet.
- Dra tillbaka sprutan tills spetsen kommer 9,0 mm under hjärnans yta.
- Starta om injektionen med samma hastighet på 1 μL/min tills kvarvarande blod har injicerats helt.
- Låt sprutan vara på plats i 10 minuter för att undvika blodspill.
- Ta långsamt bort sprutan från hjärnan.
- Använd bencement för att täcka kraniotomihålet.
- När cementet torkar, suturera såret med 4-0 polyamid suturfilament. Efter sömnad 3 eller 4 stiches, knyt 2-1-1 standard kirurgiska knutar.
- För att förhindra infektion, injicera råttan med penicillin (0, 25 ml, 80 IE utspädd i 4 ml saltlösning) intraperitoneally.
- Injicera råttorna subkutant med Butorphanol tartrat (2,5 mg/kg) och upprepa injektionen varannan timme för att lindra postoperativ smärta fram till 24 timmar efter operationen.
- Observera råttan var 15: e minut tills den återhämtar sig helt från anestesi. Sätt tillbaka den i den ursprungliga buren, med en värmeplatta under buret. Ge råttan fri tillgång till mat och vatten tills de offras.
3. Beteendetester
OBS: Utför beteendetester dag 1, dag 3, dag 7 och dag 14 efter modellering, inklusive balansstråletestet, limbplaceringstestet och den modifierade Voetsch-neuroscoreen.
- Provning avbalansbalk 11.
OBS: Detta är ett test speciellt för att undersöka bakbenens sensorimotoriska funktion.- Förberedde apparaten för att säkerställa att balken (3 cm bred × 70 cm lång) är 20 cm över golvet.
- Sätt en mörk låda i baksidan av balken med en smal ingång.
- Placera en vit ljudgenerator och en ljus ljuskälla, som används för att motivera råttan att korsa strålen och gå in i mållådan, i strålens huvudslut.
- Stoppa bruset och ljuset när djuret kommer in i målrutan. Registrera latensen från huvudslut till målrutan (i sekunder) och bakbenens prestanda under färd med strålen.
- Registrera prestationspoängen enligt följande: 0, balanserar med stadig hållning; 1, greppsidan av balken; 2, myser balken med 1 bakben som faller av; 3, myser balken med 2 lemmar som faller av eller snurrar runt balken i mer än 60 s; 4, försök att balansera på balken >40 s, men faller av; 5, försök att balansera på balk >20 s, men faller av; och 6, faller av, utan försök att balansera eller balansera på balken <20-talet.
- Test av lemplacering
OBS: Limb placeringstestet undersöker 3 oberoende stimuli av syn, beröring och proprioception med 6 parametrar, för att utvärdera den sensorimotoriska funktionen hos råtta. Den totala neurologiska funktionspoängen varierade från 0 till 12. Före testet bör råtta vara van vid hantering.- Håll råttan bak och placera den långsamt på bordet från en höjd av 10 cm. Normalt skulle råttan sträcka framben och placera dem på bordet.
- Ta tag i råttan bak och håll den vänd mot bordets kant. Reaktionen av framben observeras. En normal råtta skulle lägga frambenen på bordet.
- Låt råttan greppa kanten av bordet. En normal råtta skulle använda hakan för att förhindra att näs- och näshåret vidrör bordskanten.
- Lägg råttan på bordet, tryck råttan med ett mjukt sidotryck bakom råttans axel mot bordets kant och observera placeringen av framben och bakben. En normal råtta skulle greppa kanten med sina framben och bakben.
- Placera råttan på bordet med ansiktet mot kanten och tryck försiktigt den från baksidan till kanten. En normal råtta skulle greppa kanten med sina framben.
- Placera råttan på bordet med ryggen mot kanten och tryck den bak till bordets kant. Observera bakbenens reaktion. En normal råtta skulle greppa kanten med bakbenen.
- Utvärdera placeringen av frambenen eller bakbenen till bordskanten. Spela in poängen enligt följande: 0, ingen placering; 1, oavslutad och/eller försenad placering; 2, omedelbar, fullständig placering.
- Den modifierade Voetsch neuroscore8
OBS: Den modifierade Voetsch neuroscore är en vertebrobasilar skala poäng av sensorimotorisk förmåga, som innehåller 14 parametrar: huvudrörelse, aktivitet, hörsel, smärta reflex, hornhinnans reflex, proprioception, hals sensation, utforskning, circling, axiell torso sensation, 4-limb rörelse, förbensrörelse, klättring och balk promenad. Poängen för varje parameter varierar från 0 (fullständigt neurologiskt underskott) till 3 (inget neurologiskt underskott). Den totala neurologiska funktionspoängen varierar från 0 till 42.- Placera råttan på bordet (50 cm lång × 35 cm bred) och låt den röra sig i fem minuter. Observera huvudets spontana rörelse: rör sig i alla dimensioner, 3; föredrar en sida, 2; Endast rörelse till 1 sida, 1; böjd till ensidig sida, 0.
- Placera råttan på bordet (50 cm lång × 35 cm bred) och låt den röra sig i fem minuter. Aktiviteten definieras som: fullt responsiv, 3; måttligt lyhörd, 2; minimalt lyhörd, 1; koma, 0.
- Observera craniocaudal cirking: vänder bilateralt, 3; föredrar 1 sida, 2; endast till 1 sida, 1; fallit till 1 sida, 0.
- Utvärdera förbensrörelsen: lika och bilateral rörelse, 3; Lätt asymmetri, 2; stor asymmetri, 1; paresis, 0.
- Utvärdera 4-lemmens rörelse: lika och bilateral rörelse, 3; Lätt asymmetri, 2; stor asymmetri, 1; paresis, 0.
- När råttan är stillastående, utför en öronnypa för att stimulera öronen och testa smärtreflexen: flyttar sig snabbt och symmetriskt från stimulans, 3; rör sig långsamt eller asymmetriskt från stimulans, 2; visar viss rörelse som svar på smärta, 1; ingen reaktion, 0.
- När råttan står stilla, gör ett ljud på vardera sidan av råttans kropp för att testa hörseln: fingrar gnuggar, 3; snäpp av fingrar, 2; högt klappande, 1 och inget häpnadsväckande, 0.
- För att kontrollera proprioceptionen, rör råttans vibrissae på båda sidor respektive med en trubbig pinne och observera dess svar på stimulansen: reagera vid beröring, 3; minskad reaktion på ena sidan, 2; minskat på båda sidor, 1; frånvarande, 0.
- För att utvärdera bålens axiella känsla, placera en trubbig pinne på vardera sidan av råttans kropp och observera dess svar på stimulansen: rask och symmetrisk reaktion på stimuli, 3; något minskad eller asymmetrisk reaktion, 2; kraftigt minskad och asymmetrisk reaktion, 1 och ingen reaktion, 0.
- För att testa hornhinnans reflex, håll råttan och rör snabbt hornhinnan på båda sidor med en bomullspinne: båda ögonen stängs snabbt, 3; minskad reflex på ena sidan, 2; minskat på båda sidor, 1; frånvarande, 0.
- För att kontrollera känslan av nacken, håll råttan och använd en trubbig pinne för att röra nacken: reagerar på beröring aktivt, 3; långsam reaktion vid beröring, 2; kraftigt minskad reaktion, 1; ingen reaktion, 0.
- För att observera utforskning, använd en ljus mörk låda.
OBS: Två tredjedelar av lådan ska vara öppen och tänd, medan resten är täckt och mörkt. En 7 cm dörr förbinder de två facken. - Placera råttan i ljusfacket i 5 min och sedan det mörka facket i ytterligare 5 minuter, låt den röra sig och spela in råttans aktiviteter. När 4 lemmar placeras i ett rum, spela in det som en ingång. Spela in poäng enligt följande: når de ljusa och mörka facken aktivt, 3; når 1 fack, 2; rör sig långsamt först efter stimulans, 1; och ingen rörelse, 0.
- För att kontrollera klättringsförmågan, placera råttan längst ner på ett 20 cm brett, 70 cm långt plan med 30 graders vinkel mot den horisontella marken. Rekordpoäng enligt följande: kan klättra till toppen, 3; nedsatt klättring, 2; Stillastående grepp, 1. och faller omedelbart, 0.
- För att undersöka balkvandringen, sätt råttan på ena änden av en 3 cm bred, 70 cm lång balk som är 20 cm över marken, rekordpoäng enligt följande: utforskar hela balken, 3; utforskar en del av strålen, 2; viss rörelse och fall, 1; ingen rörelse, 0.
- Beräkna poängen.
4. Hemorrag bekräftelse av MRI
- Utför MR-skanningen vid 24 timmar efter operationen.
- Söv råttan med isofluran (5% för induktion, 1%- 1,5% för underhåll).
- Säkra råttans huvud i råtta hjärnans matrisspole i kombination med en överföringsspole endast volymspole.
- Placera spolen tillsammans med råttan i MR-skannern. Fäst råttan i vaggan via tand- och öronstängerna.
- Använd en termisk jacka med sluten krets för att bibehålla råttans kroppstemperatur vid 37 ± 0,5 °C under MR-skanning.
- Utför en pilotsekvens för att säkerställa korrekt geometri.
- Applicera en snabbspinn ekosekvens för att samla T2-viktade skanningar. Ange parametrarna på följande sätt: ekotid (TE), 132 ms; repetitionstid (TR), 2 500 ms; förvärvsmatris, 148 × 148; Synfält, 100 mm × 100 mm. 12 skivor; 1,5 mm tjock.
- Sätt tillbaka råttan i buren.
5. Blödning bekräftelse av grov anatomi
OBS: Offra råttorna vid den angivna tidpunkten, 24 timmar och 14 d efter operationen (figur 1D).
- Söv råttan med 5% isofluran tills medvetandet går förlorat. Avliva den sedan med koldioxid (CO2) (20-30% av burets volym per minut).
- Bekräfta döden med följande tecken: inget bröst som stiger och faller, inga påtagliga hjärtslag, inget svar på tå nypa, dålig slemhinna färg, färgförändring eller opacitet i ögonen.
- Utför livmoderhalsförskjutning.
- Fäst råttan genom att tejpa tassarna på en steril plattform. Skapa ett mittlinjesnitt från livmoderhalsen för att utsätta hypogastriumet för bröstkorg och lever. Gör ett sidosnitt från den övre sternala marginalen längs nyckelbenet längst till vänster och ett annat sidosnitt från xiphoid längs membranet längst till vänster, för att exponera hjärtat. Lyft ribcageklaffen och fäst den på plattformen med en stift.
- Anslut änden av en nål (27 G) till en perfusionspump som innehåller 4 °C saltlösning. För in nålspetsen i hjärtat längs vänster kammares vänstra kant för att undvika att komma in i atriumet. Slå på perfusionspumpen för att säkerställa att spetsen är i vänster ventrikel och skär sedan i höger atrium.
- Stäng av perfusionspumpen när vätskan som töms ur höger atrium blir färglös och levern blir vit. Denna procedur behöver cirka 100 ml saltlösning på 4 °C.
- Halshugg råttan och skörda hela hjärnan med sax och tång. Ta bort eventuell fukt från hjärnytan med blottingpapper.
- Håll hela hjärnan på -80 °C i 1 min.
OBS: Detta steg kan hoppas över om hjärnan kan skäras utan frysning. - Lägg hjärnan i koronal råtta hjärnmatris med den dorsala sidan upp.
- Sätt in ett 0,21 mm tjockt blad i rostfritt stål i blödningscentret enligt hålet i hjärnans yta.
- Sätt in andra blad i hjärnan med ett intervall av 2 mm.
- Sänk ned hjärnsektionerna i 10 ml 4% paraformaldehydlösning (PFA) i 24 timmar vid 4 °C. Skölj dem med 0,01 mmol/L fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Organisera sektionerna från rostral till caudal och avbilda dem.
6. Paraffinsektion och hematoxylin och eosin (HE) färgning
- Fixa hjärnan med 4% PFA-lösning i minst 24 timmar vid rumstemperatur. Volymen av PFA bör vara 5-10 gånger hjärnvolymen.
- Skär hjärnan från blödningscentret i två delar via blad och koronal råtta hjärnmatris.
- Gör paraffin-inbäddade vävnadsblock.
- Dela upp det paraffinininbäddade vävnadsblocket koronalt i 40 μm tjockleksrutschbanor på en mikrotom, skär 4 sektioner i följd, från blödningscenter och flyta dem i ett 40 °C vattenbad.
- Montera 40 μm-sektionerna (totalt 8 diabilder för en hjärna) på rena glasrutschbanor och lufttorka över natten vid rumstemperatur.
- Grädda rutschkanorna vid 56 °C i 1 timme.
- Tvätta i 3 min i xylen, 3 gånger.
- Doppa sektioner 30 gånger i 100% etanol, 30 gånger till i 100% etanol, 30 gånger i 95% etanol och 30 fler gånger i 95% etanol.
- Skölj i kranvatten tills det är klart.
- Sänk ner sektionerna i Hematoxylin i ca 10 min.
- Skölj i kranvattnet tills det är klart.
- Sänk ner sektionerna i eosinfläcken i 30 s.
- Dehydrera diabilder med 3-4 dopp 95% etanol, 3-4 dopp i 100% etanol, 100% etanol i 1 minut och 10 dopp i 100% etanol + xylen (1:1).
- Rengör sektioner med xylen i 1 min, 2 gånger.
- Montera med icke-vattenhaltigt monteringsmedium och ett täckglas.
- Torka sektionerna i luften över natten vid rumstemperatur och san dem sedan.
7. Statistik
- Använd GraphPad Prism 6.0 för att beräkna studentens t-test eller Mann Whitney U-test.
OBS: Alla data ska uttryckas som ± SE. Skillnader mellan två grupper bestäms med ett tvåstjärtat students t-test eller Mann Whitney U-test. P<0.05 definieras som statistisk signifikans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Totalt användes 25 djur, 3 för kontroll, 6 för 30 μL, 6 för 60 μL och 10 för 100 μL blodinjektioner. En råtta som fick en 100 μL injektion av autologt blod (1/10) dog inom 24 timmar efter kirurgi.
Beteendetester utfördes dag 1, dag 3, dag 7 och dag 14 efter operationen. Poängen för kontrollgruppen och blodinjektionsgrupperna på olika tidpunkter efter operationen presenteras i tabell 2. Pontin blödning orsakade neurologiska underskott som minskad hornhinnans reflex och cirkla(Figur 3B,C). Injektion av 100 μL blod inducerade också myotonia (Figur 3A). Resultaten av balans beam test, lem placering test och den modifierade Voetsch neuroscore visade att den neurologiska funktionen minskade när volymen av pontin blödning ökade.
MR-skanning utfördes 24 timmar efter operationen (figur 4). I blodinjektionsgrupperna, på T2-sekvensen, upptäcktes blödning som en hypointense fälg med en iso- till något hyperintense kärna i basilar delen av pons. Ingen blödning upptäcktes av MRT i andra hjärnområden ( figur4). Volymen blödning ökade i och med att injektionsvolymen av autologt blod ökade.
Sedan offrades råttor på 24 timmar och dag 14 efter operation, separat, och 2 mm tjocka sektioner gjordes (Figur 4). Blödning upptäcktes runt injektionsstället och distribution i basen av pons. Det fanns lätt ödem runt blödningen i 100 μL blodinjektionsgruppen.
Några av råttorna offrades 3 dagar efter kirurgi och paraffin-sektion för att göra HE färgning. Resultaten visade att i blodinjektionsgrupperna berikades inflammatoriska celler i peri-blödningszonen (figur 5C och F). Hemoglobin förblir inneslutet i intakta röda blodkroppar (Figur 5D och G).
Bild 1: Schematiska diagram över pontinsk blödningsmodell. (A) Autolog blodsamling från svansven. B) Schematiskt diagram över borrplatsen. C) Schematiska diagram över injektionsstället. D) Experimentell utformning. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Instrument och ingrepp i kirurgi. (A) Anestesimaskin. B) Kirurgiska instrument. C) Mikrodrill. D) Mikroinsprutningspump. E) Stereotaxisk apparatur. F) En linje markerad i mitten av skallen. (G) Gul pil pekar på borrplatsen. (H) Dränering av blod från svans venen. (I) Överför blodet till Eppendorfröret. (J) Aspirera blodet i Hamilton spruta. (K) För fram Hamiltonsprutan genom skallhålet. L) Injektionsprocess av autologt blod. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Representativa resultat avbeteendetester. (A) Myotonia hos en råtta injicerad 100 μL autologt blod. B) Minskad hornhinnans reflex på höger sida i en råtta injicerad 60 μL autologt blod. c) Minskad hornhinnans reflex på de bilaterala sidorna hos en råtta injicerad 100 μL autologt blod. D) En råtta fick 60 μL autologt blod inringat på lesionens kontralaterala sida. e) Resultat av balansbalkens provning. F) Resultat av den modifierade Voetsch neuroscore. g) Resultat av placeringen av extremiteterna. Linje innebär betydande skillnad mellan de två grupperna (p < 0,05). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Representativa resultat av MR-skanning och grov anatomi. MRI skanning (övre) utfördes 24 h efter pontinska blödning kirurgi, sedan råttor offrades och skärs i 2 mm hjärnsektioner (botten). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5: Representativa resultat av HE-färgning. Hjärnor skördades från råttor injicerade 100 μL blod 3 d efter operationen. A) Hela hjärndelen. Låga fält från (B) det normala pontinområdet, (C) peri-lesion zon och (D) blödning kärnan. Höga fält från (E) normala pontin område, (F) peri-lesion zon och (G) blödning kärnan. Skalbaren var 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur S1: Representativa resultat av bruttoanatomi dag 14 efter operationen. Klicka här för att ladda ner den här filen.
| Mild | moderat | massiv | |
| Total volym | 30 μL | 60 μL | 100 μL |
| Första injektionen | |||
| Stereotaktiska koordinater | AP -9,0 mm; Lat 0; Vert -9,2 mm | ||
| volym | 10 μL | 10 μL | 10 μL |
| hastighet | 1 μL/min | 1 μL/min | 1 μL/min |
| Intervalltid | 20 min | 20 min | 20 min |
| Andra injektionen | |||
| Stereotaktiska koordinater | AP -9,0 mm; Lat 0; Vert -9,2 mm | AP -9,0 mm; Lat 0; Vert -9,0 mm | |
| volym | 20 μL | 50 μL | 90 μL |
| hastighet | 1 μL/min | 1 μL/min | 1 μL/min |
| Innan nålen drar sig tillbaka | 10 min | 10 min | 10 min |
| AP: anteroposterior position | |||
| Lat: lateral | |||
| Vert: vertikal | |||
Tabell 1: Injektion av autologt blod.
| Råttnummer | Dag 1 | Dag 3 | Dag 7 | Dag 14 |
| Den modifierade Voetsch neuroscore | ||||
| 30 μL-1 | 33 | 34 | 38 | 41 |
| 30 μL-2 | 30 | 35 | 37 | 41 |
| 30 μL-3 | 34 | 37 | 40 | 42 |
| 60 μL-4 | 27 | 30 | 36 | 38 |
| 60 μL-5 | 23 | 28 | 34 | 39 |
| 60 μL-6 | 26 | 29 | 35 | 39 |
| 100 μL-7 | 16 | 25 | 31 | 36 |
| 100 μL-8 | 13 | 22 | 29 | 37 |
| 100 μL-9 | 14 | 21 | 26 | 36 |
| Bluff-10 | 41 | 42 | 42 | 42 |
| Bluff-11 | 42 | 42 | 42 | 42 |
| Bluff-12 | 42 | 42 | 42 | 42 |
| Provning av balansbalk | ||||
| 30 μL-1 | 1 | 0 | 0 | 0 |
| 30 μL-2 | 1 | 1 | 0 | 0 |
| 30 μL-3 | 2 | 1 | 0 | 0 |
| 60 μL-4 | 3 | 2 | 0 | 0 |
| 60 μL-5 | 4 | 2 | 0 | 0 |
| 60 μL-6 | 3 | 2 | 1 | 0 |
| 100 μL-7 | 5 | 4 | 3 | 1 |
| 100 μL-8 | 5 | 4 | 2 | 1 |
| 100 μL-9 | 4 | 4 | 2 | 1 |
| Bluff-10 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Bluff-11 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Bluff-12 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Test av lemplacering | ||||
| 30 μL-1 | 11 | 12 | 12 | 12 |
| 30 μL-2 | 10 | 11 | 12 | 12 |
| 30 μL-3 | 10 | 11 | 12 | 12 |
| 60 μL-4 | 9 | 11 | 12 | 12 |
| 60 μL-5 | 8 | 9 | 9 | 11 |
| 60 μL-6 | 8 | 9 | 10 | 11 |
| 100 μL-7 | 4 | 5 | 9 | 11 |
| 100 μL-8 | 3 | 4 | 8 | 10 |
| 100 μL-9 | 2 | 4 | 7 | 8 |
| Bluff-10 | 11 | 12 | 12 | 12 |
| Bluff-11 | 12 | 12 | 12 | 12 |
| Bluff-12 | 12 | 12 | 12 | 12 |
Tabell 2: Resultat av beteendetester.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I den nuvarande studien tillhandahöll vi ett protokoll för att generera en massiv pontinsk blödning råtta modell. Denna modell kan användas för forskning om patofysiologisk mekanism och prognos av massiva pontin blödning.
Under hela experimentet användes 25 råttor, varav endast en dog. Verifieringen av MRI, brutto anatomi och HE färgning anges att denna metod hade en mycket låg dödlighet och en hög framgång. För att fastställa massiv pontinblödningsmodell måste två problem lösas, det injicerade autologa blodet tenderar att läcka in i det subarachnoid utrymmet och flöda tillbaka till den fjärde ventrikeln längs nålsystemet. Den befintliga måttliga dubbelinjektionen (totalt 60 μL autologt blod) pontinsk blödningsmodell löste det första problemet, knappt något blod flödade in i subarachnoidutrymmet. Det fanns dock fortfarande en liten mängd blod tillbakaflöde. I den aktuella studien tillämpades flera strategier för att optimera den befintliga dubbelinjektionsmetoden för att göra det möjligt att injicera en större mängd 100 μL autologt blod utan återflöde. För det första användes två olika injektionsfläckar i stället för en. För det andra användes heparin för att spola sprutan med minimal rest för att minska dosen, för att endast skydda blodet från koagulerande under injektionsprocessen, men inte tillräckligt för att främja läckage och återflöde efter injektionen. För det tredje var injektionstiden lång och injektionshastigheten långsam, 1 μL/min. Dessutom injicerades endast en liten mängd autologt blod första gången, medan den andra injektionen utfördes 20 minuter senare. Efteråt drogs nålen tillbaka först efter 10 minuter, och denna procedur genomfördes extremt långsamt. Med denna metod flödade knappt något blod in i det subarachnoida utrymmet eller fjärde ventrikeln hos råttorna injicerade med 30 μL eller 60 μL autologt blod, men det fanns fortfarande en liten mängd återflöde hos råttorna injicerade med 100 μL. Förläng tiden innan nålen togs bort kunde lösa detta problem.
Beteendetester utfördes på dag 1, dag 3, dag 7 och dag 14 efter modellering, inklusive balansstråletest, lemplaceringstest och den modifierade Voetsch-neuroscoreen. Den första dagen efter operationen visade nästan alla råttor i blodinjektionsgrupperna cirkrypande beteende (dvs. sväng vänster eller höger), åtföljd av försvinnande av ensidiga eller bilaterala hornhinnans reflex. Även om autologt blod injicerades i pontinens mittlinje, var det ojämnt fördelat i hjärnans två sidor. Detta verkade vara orsaken till de olika prestandan i beteendetester. Råttornas aktiviteter och reaktioner injicerade 30 μL eller 60 μL autologt blod saktade närmare det normala. Hos råttorna injicerade 100 μL blod försvagades sensorimotorfunktionerna avsevärt och svaret var dåligt. Muskelstelhet uppträdde hos vissa råttor i vilotillståndet. Dag 1, dag 3 och dag 7 fanns det uppenbara skillnader mellan råttor injicerade 30 μL, 60 μL eller 100 μL autologt blod och råttorna i kontrollgruppen i den modifierade Voetsch-neuroscoreen. I balansstråletestet och testet av extremitetsstället fanns det inga signifikanta skillnader mellan råttorna som injicerade 30 μL eller 60 μL blod och råttorna i kontrollgruppen vid några tidpunkter. Resultaten av balansstråletestet och placeringen av extremiteterna hos råttor som injicerades 100 μL autologt blod var dock signifikant annorlunda jämfört med kontrollgruppen dag 1 och dag 3. Den möjliga orsaken kan vara att det finns färre utvärderingsobjekt i balansstråletestet och lemplaceringstestet jämfört med den modifierade Voetsch neuroscore, som inte är tillräckligt känsliga för att upptäcka subtila neurologiska underskott. Det är olämpligt att använda dessa två metoder för att utvärdera beteendet i blödningsmodeller med milda symtom, men de är tillämpliga i den massiva pontinska blödningsmodellen. Sammantaget visade sig den modifierade Voetsch neuroscore vara mer lämplig för omfattande och noggrant bedöma de neurologiska funktionerna i olika pontinska blödningsmodeller.
Det finns flera fördelar med denna metod. Baserat på den tidigare dubbelinjektionsmetoden ändrades den andra injektionsplatsen och doseringen av heparin justerades för att undvika läckage och återflöde i den milda (30 μL) och måttliga (60 μL) pontinblödningsmodellen. Även i den massiva (100 μL) pontinska blödningsmodellen var återflödet mycket begränsat och inträffade endast hos ett litet antal råttor. Denna metod kan enkelt utföras med en hög framgångsgrad och en låg dödstal. Dessutom kan den experimentella pontinblödningen observeras under en lång period, minst 14 dagar efter modellering, vilket bidrar till att undersöka hela sjukdomsutvecklingen och effekterna av behandlingar. Det stora framsteget med denna modell var att det efterliknade symtomen hos patienter med pontin blödning. Kliniskt, massiva pontin blödning resulterar i allvarliga neurologiska underskott, medan tidigare pontin blödning modeller endast utvecklat relativt liten hemorragisk volym med milda symtom. Den massiva pontin blödning i denna modell distribueras i bilaterala pons, som liknar blödning distribution i pontin blödning patienter. I tidigare experimentella pontinska blödningsmodeller ligger blödningen endast i de ensidiga ponsna9.
Men det finns också vissa begränsningar i denna metod. För det första orsakades pontin blödning i denna studie av injektion av blod, delvis heparinized under övergången, vilket kan påverka blodkoagulering eller till och med homeostas i de omgivande pons. För det andra kräver denna modell speciell utrustning, såsom stereotaxisk apparat och insprutningspump. För det tredje kan denna modell inte efterlikna spontan blödning.
Sammanfattningsvis gav denna studie en metod för att skapa en experimentell akut massiv pontinsk blödningsmodell hos råttan, vilket skulle kunna främja ny mekanisk och terapeutisk forskning inom detta område.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Denna studie stöddes ekonomiskt av National Science Foundation of China (81471181 och 81870933) och Opening Lab Program of Guangzhou Medical University (0506308) till Y Jiang, och av National Science Foundation of China (81701471) och det vetenskapliga programmet för Guangzhou Municipal Health Commission (20191A011083) till Z Qiu och av National Science Foundation of China (81501009) till L Wu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100ml Saline solution | Guangdong yixiang | 191222201 C1 | Preparing heparin diluent |
| 100μl Microinjector | Shanghai Gaoge | Injection of autologous blood | |
| 1ml Syringe | Jiangsu Zhiyu | 20191014 | Withdraw autologous blood from the tail vein |
| 75% Alcohol | Shandong Lierkang | Disinfection of rat tail | |
| Adhesive tape | Shanghai Jinzhong | Surgicl instruments | |
| Animal anesthesia system | RWD | R510-31S-6 | Inducing and maintaining anesthesia |
| Balance beam | Jiangsu Saiangsi | For neurological deficit scores | |
| Blades | Shanghai Feiying | 74-C | For gross anatomy |
| Bone cement | Shanghai Xinshiji | 20180306 | Surgicl instruments |
| Brain tank | Shenzhen LEIYEA | For gross anatomy | |
| Butorphanol tartrate | Jiangsu Hengrui | For pain management | |
| Electric cranial drill | Nanjing Darwin biotechnology | 20180090018 | Making a burr hole on the skull |
| EP tube | Nantong Surui | Transfer autologous blood | |
| Erythromycin eye cream | Yunnan pharmacy | Eyes protection | |
| HE dye liquor | Solarbio | G1120 | For HE staining |
| Heating pad | Dangerous Jungle | JR01 | Keeping warm |
| Heparin sodium injection | Chengdu Haitong Pharmacal Company | 190701 | Preparing heparin diluent |
| IndoPhors | Guoyao of China | Sterilization | |
| Isoflurane | RWD | 20080701 | Inducing and maintaining anesthesia |
| Light dark box | Jiangsu Saiangsi | For neurological deficit scores | |
| Micro-injection pump | Baoding Leifu | TFD03-01-C | Injection of autologous blood |
| MRI system | Philips | Confirmation of infarction in vivo | |
| Needle holder | Shanghai Jinzhong | J32020 | Surgicl instruments |
| Penicilin | Guoyao of China | Infection Prevention | |
| Q-tips | Jiangxi Songhe | Surgicl instruments | |
| Scalp heedle | Jiangxi Hongda | 20200313 | Withdraw autologous blood from the tail vein |
| Scalpel | Shanghai Kaiyuan | 170902 | Surgicl instruments |
| Shearing scissors | Shanghai Jinzhong | Y00040 | Surgicl instruments |
| Stereotaxic apparatus | RWD | 900-00001-00 | for surgical positioning |
| Surgical towel | Xinxiang Huakangweicai | 20070601 | Surgicl instruments |
| Suture needle | Shanghai Jinzhong | Surgicl instruments | |
| Suture scissors | Shanghai Jinzhong | J25041 | Surgicl instruments |
| Tissue holding forcepts | Shanghai Jinzhong | J31080 | Surgicl instruments |
References
- Charidimou, A., et al. Brain hemorrhage recurrence, small vessel disease type, and cerebral microbleeds: A meta-analysis. Neurology. 89 (8), 820-829 (2017).
- Tao, C., et al. A novel brainstem hemorrhage model by autologous blood infusion in Rat: White Matter Injury, Magnetic Resonance Imaging, and Neurobehavioral features. Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 25 (5), 1102-1109 (2016).
- Ichimura, S., et al. Surgical treatment for primary brainstem hemorrhage to improve postoperative functional outcomes. World Neurosurgery. 120, 1289-1294 (2018).
- Behrouz, R. Prognostic factors in pontine haemorrhage: A systematic review. European Stroke Journal. 3 (2), 101-109 (2018).
- Guo, X., et al. Brainstem iron overload and injury in a rat model of brainstem hemorrhage. Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 29 (8), 104956 (2020).
- Chung, Y., Haines, S. J. Experimental brain stem surgery. Neurosurgery Clinics of North America. 4 (3), 405-414 (1993).
- Lekic, T., Tang, J., Zhang, J. H. A rat model of pontine hemorrhage. Acta Neurochirurgica Supplement. 105, 135-137 (2008).
- Lekic, T., et al. Evaluation of the hematoma consequences, neurobehavioral profiles, and histopathology in a rat model of pontine hemorrhage. Journal of Neurosurgery. 118 (2), 465-477 (2013).
- Shrestha, B. K., et al. Rat brainstem hemorrhage model: Key points to success in modeling. World Neurosurgery. 117, 106-116 (2018).
- Luo, M., Tang, X., Zhu, J., Qiu, Z., Jiang, Y. Establishment of acute pontine infarction in rats by electrical stimulation. Journal of Visualized Experiments. (162), (2020).
- Wu, L., et al. Keep warm and get success: The role of postischemic temperature in the mouse middle cerebral artery occlusion model. Brain Research Bulletin. 101, 12-17 (2014).
