Summary
نقدم بروتوكولا لإنشاء نموذج نزيف بونتين ضخم في الفئران عن طريق الحقن المزدوج للدم الذاتي.
Abstract
نحن نقدم بروتوكول لإنشاء نموذج نزيف بونتين ضخمة في الفئران. استخدمت الفئران التي تزن حوالي 250 غراما في هذه الدراسة. تم أخذ مائة ميكرولتر من الدم الذاتي من الوريد الذيل وحقنها بشكل ستيريوتكاكسيكالي في المهور. تم تقسيم عملية الحقن إلى خطوتين: أولا، تم حقن 10 ميكرولتر من الدم في مكان معين، وضعية الأمامي (AP) -9.0 مم. الجانبي (لات) 0 مم؛ عمودي (فيرت) -9.2 ملم، تليها حقنة ثانية من الدم المتبقي الموجود في AP -9.0 مم؛ اللات 0 مم; Vert -9.0 مم مع فاصل زمني مدته 20 دقيقة. تم استخدام اختبار شعاع التوازن واختبار موضع الطرفين وعصب Voestch المعدل لتقييم الوظيفة العصبية. تم استخدام التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) لتقييم حجم النزيف في الجسم الحي. وكانت أعراض هذا النموذج تمشيا مع المرضى الذين يعانون من نزيف بونتين ضخمة.
Introduction
النزيف داخل المخ يمثل خمس مرضى السكتة الدماغية. يعتمد تشخيص النزيف داخل المخ على سرعة وحجم وموقع النزيف1،2. بالمقارنة مع نزيف الدماغ الأمامي ، فإن نزيف جذع الدماغ لديه معدل وفيات واعتلال أعلى3. حوالي 40٪ من نزيف جذع الدماغ يحدث في المهور4. المسببات والفيزيولوجيا المرضية لنزيف بونتين مختلفة تماما وأقل دراسة من نزيف الدماغ الأمامي5.
هناك نوعان من النماذج الحيوانية نزيف بونتين. واحد هو نموذج نزيف عفوي الناجمة عن ضخ الكولاجين البكتيري في المهور6،7،8. أكبر ميزة لهذا النموذج هو أن النزيف هو عفوي. ومع ذلك، الكولاجيناز يمكن أن تحفز سوى حجم صغير من نزيف بونتين. الى جانب ذلك، الكولاجيناز قد يسبب إصابات أخرى في الدماغ. يتم تحريض النموذج الآخر عن طريق الحقن المجسم للدم الذاتي في المهور9. ميزة هذا النموذج هو أنه من السهل لإتقان مع نسبة نجاح عالية. نظريا، يمكن للباحثين حقن أي حجم من الدم في أي مكان من المهور. ومع ذلك ، بسبب التسرب الخلفي من خلال مسار الإبرة ، فإن الحجم المحقون محدود. في الآونة الأخيرة ، تم الترويج لطريقة الحقن المزدوج للحد من التسرب الخلفي9. هذه الطريقة تحقن الدم الذاتي مرتين مع فاصل زمني لمدة 20 دقيقة بين الحقن. يتم تطبيق طريقة الحقن المزدوج للحث على نزيف بونتين خفيف (30 ميكرولتر) ومعتدل (60 ميكرولتر) ولكن ليس نزيف بونتين هائل. في العيادة، فإن غالبية المرضى الذين يعانون من نزيف بونتين يعانون من سوء التكهن لديهم نزيف هائل (أكثر من 10 مل).
في الدراسة السابقة، قدمنا بروتوكولا لإنشاء نموذج السكتة الدماغية بونتين في الفئران10. في هذه الدراسة، نقوم بتعديل طريقة الحقن المزدوج القائمة، وتوفير بروتوكول مفصل للحث على نزيف بونتين ضخمة في الفئران عن طريق الحقن المزدوج من الدم الذاتي 100 ميكرولتر في موقعين مختلفين في المهور.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد راجعت البروتوكول ووافقت عليه اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه التابعة للمستشفى الثانى التابع لجامعة قوانغتشو الطبية . تم توفير الفئران من قبل مركز الحيوانات في الجامعة الطبية الجنوبية. يظهر التصميم التجريبي في الشكل 1.
1. الحيوان والأدوات
- استخدام الفئران سبراغ دولي الذكور 8 أسابيع من العمر وزنها 250 ± 10 غرام.
- إيواء الفئران لمدة 7 أيام على الأقل قبل الجراحة في ظل ظروف بيئية خاضعة للرقابة مع درجة حرارة محيطة تبلغ 25 درجة مئوية ، ورطوبة نسبية تبلغ 65٪، ودورة ضوء داكنة 12/12 ساعة.
- توفير الغذاء والماء دون حد.
- إعداد الصكوك (الشكل 2A- ه).
2. حقن الدم في المهور
- وزن الفئران مرة أخرى قبل 3 أيام من الجراحة لاختيار الفئران مع وزن الجسم مناسبة للتجارب.
- خلال 3 أيام قبل النمذجة، وتدريب الفئران على المشي على شعاع التوازن 3 مرات في اليوم الواحد لضمان الفئران العادية يمكن أن تمر شعاع التوازن دون توقف.
- سخني وسادة التدفئة إلى 37 درجة مئوية قبل التخدير.
- إرفاق ميكرودريل إلى حامل على الإطار ستيريوتاكسيك.
- حقن الفئران مع 50 ملغ / كغ الكيتامين و 5 ملغ / كغ xylazine intraperitoneally. انتظر حتى لا يكون هناك استجابة إصبع القدم قرصة.
- نقل الفئران في إطار ستيريوتاكسيك في موقف عرضة. ضع قضبان الأذن فوق قناة الأذن لتأمين الرأس. إصلاح الجمجمة في وضع أفقي لتجنب انحراف الحقن (الشكل 2F).
- الحفاظ على التخدير بواسطة isoflurane (97.5٪ الأكسجين و 2.5٪ isoflurane) من خلال مخروط الأنف ستيريوتاكسيك مع مدخل ومنفذ الميناء.
- استخدام مرهم العين للحفاظ على القرنية رطبة.
- حلق الشعر فوق الجمجمة مع آلة حلاقة صغيرة.
- رسم خط منتصف 3 سم مع قلم علامة في الجمجمة من خط canthus الجانبية الثنائية إلى 0.5 سم وراء فونتانيل الخلفي، كما هو مبين في الشكل 2F.
- تطبيق فرك Entoiodine الجراحية بطريقة دائرية، بدءا من منتصف خط منتصف ملحوظ وتناوب إلى الخارج.
- ضع الستائر الجراحية.
- إجراء شق مع مشرط على طول خط منتصف ملحوظ.
- استخدام مسحة القطن لإزالة أي دم محتمل.
- ضع قطعة من ملقط على كل جانب من رفرف فروة الرأس لفضح الجمجمة(الشكل 2G).
- تراجع مسحة القطن في 0.9٪ المالحة وإزالة بلطف الأنسجة الضامة من عظم الجمجمة لتجنب الأنسجة الضامة الوقوع في microdrill.
- وضع علامة على النقطة المركزية لل bregma كنقطة الأصل عبر قلم علامة.
- إجراء عملية استئصال القحف (1 مم في القطر) باستخدام ميكرودريل في AP-9.0 مم، Lat 0 مم(الشكل 1B والجدول 1). المضي قدما بعناية لأن هذه النقطة قريبة جدا من الجيوب الوريدية (الشكل 2G).
- إزالة ميكرودريل من الإطار ستيريوتاكسيك.
- وضع 100 ميكرولتر هاملتون حقنة في حامل stereotaxic (الشكل 2K). بدوره على التبديل مضخة الحقن، انقر فوق زر الاستنشاق السريع، أسبيرات محلول الهيبارين (12500 U المخفف في 100 مل من المالحة) إلى 100 ميكرولتر ومن ثم استنزاف تماما لمنع تخثر الدم بسرعة كبيرة جدا.
- تطبيق الكلورهيكسيدين و 75٪ فرك الكحول الجراحية إلى الذيل كله من الجذر إلى طرف على الأقل 3 مرات لتطهير الجلد، وتليين قرنية، وتمدد الوريد الذيل لزيادة معدل نجاح الحقن.
- إرفاق الوخز بالإبر فروة الرأس إلى حقنة 1 مل.
- أدخل الوخز بالإبر فروة الرأس في الوريد ذيل الجانبي 3 سم من طرف الذيل واتخاذ 150 ميكرولتر من الدم (الشكل 2H).
- إزالة الوخز بالإبر فروة الرأس من حقنة 1 مل.
- نقل الدم إلى أنبوب (الشكل 2I).
ملاحظة: نقل بسرعة لمنع تخثر الدم. - غير القفازات الجراحية
- اختر وضع السحب، تعيين مستوى الصوت إلى 100 ميكرولتر، تعيين السرعة في 200 ميكرولتر / دقيقة، انقر فوق زر RUN، أسبر 100 ميكرولتر من الدم في حقنة هاملتون (الشكل 2J).
- اختر وضع غرس، وحدد السرعة بسرعة 1 ميكرولتر/دقيقة.
- تقدم الحقنة حتى يصل الطرف إلى 9.2 مم تحت سطح الدماغ(الشكل 1C والشكل 2L).
- انقر على زر التشغيل، وحقن أول 10 ميكرولتر من الدم بسرعة 1 ميكرولتر/دقيقة (الجدول 1).
- أوقف الحقن واترك الحقنة في موضعها لمدة 20 دقيقة لمنع تدفق الدم إلى الفضاء تحت العنكبوتية.
- اسحب الحقنة حتى يصل الطرف إلى 9.0 مم تحت سطح الدماغ.
- أعد الحقن بنفس السرعة 1 ميكرولتر/دقيقة حتى يتم حقن الدم المتبقي بالكامل.
- اترك الحقنة في موضعها لمدة 10 دقائق لتجنب تدفق الدم الخلفي.
- إزالة الحقنة من الدماغ ببطء.
- استخدم أسمنت العظام لتغطية ثقب فغر القحف.
- عندما يجف الاسمنت، خياطة الجرح مع خيوط خياطة البولي أميد 4-0. بعد الخياطة 3 أو 4 stiches، التعادل 2-1-1 عقدة الجراحية القياسية.
- لمنع العدوى، وحقن الجرذ مع البنسلين (0.25 مل، 80 وحدة IU المخففة في 4 مل المالحة) intraperitoneally.
- حقن الفئران تحت الجلد مع طرطرات بوتولفانول (2.5 ملغ / كغ) وتكرار الحقن كل 2 ساعة لتخفيف الألم بعد الجراحة حتى 24 ساعة بعد الجراحة.
- مراقبة الفئران كل 15 دقيقة حتى يتعافى تماما من التخدير. إعادته إلى القفص الأصلي، مع وسادة التدفئة تحت القفص. توفير وصول الفئران مجانا إلى الغذاء والماء حتى التضحية.
3. الاختبارات السلوكية
ملاحظة: إجراء اختبارات سلوكية في اليوم الأول واليوم الثالث واليوم السابع واليوم الرابع عشر بعد النمذجة، بما في ذلك اختبار شعاع التوازن واختبار موضع الطرفين وعصب Voetsch المعدل.
- اختبار شعاع التوازن11.
ملاحظة: هذا اختبار خصيصا لفحص وظيفة الحسية الحركية من hindlimb.- أعد الجهاز لضمان أن شعاع (3 سم × 70 سم طويلة) هو 20 سم فوق الأرض.
- وضع مربع الظلام في النهاية الخلفية للشعاع مع مدخل ضيق.
- ضع مولد ضوضاء أبيض ومصدر ضوء ساطع ، والتي تستخدم لتحفيز الفئران لاجتياز شعاع ودخول مربع الهدف ، في نهاية رأس شعاع.
- وقف الضوضاء والضوء عندما يدخل الحيوان مربع الهدف. سجل زمن الوصول من نهاية الرأس إلى مربع الهدف (بالثواني) وأداء الواجهة الخلفية أثناء عبور الشعاع.
- تسجيل درجة الأداء على النحو التالي: 0، أرصدة مع موقف ثابت. 1، يمسك الجانب من شعاع. 2، يحتضن شعاع مع 1 hindlimb السقوط؛ 3، يحتضن شعاع مع 2 أطرافه تسقط، أو الغزل حول شعاع لأكثر من 60 ثانية. 4، يحاول تحقيق التوازن على شعاع >40 ق، ولكن يسقط؛ 5، يحاول تحقيق التوازن على شعاع >20 ق، ولكن يسقط؛ و 6، يسقط، مع عدم وجود محاولة لتحقيق التوازن أو التوازن على شعاع <20 s.
- اختبار وضع الأطراف
ملاحظة: اختبار وضع الأطراف يفحص 3 محفزات مستقلة للرؤية واللمس والبروبريوبسيبسيون مع 6 معلمات ، لتقييم وظيفة الحسية الحركية للفئران. وتراوحت درجة الوظيفة العصبية الإجمالية بين صفر و12. قبل الاختبار ، يجب أن يكون الفئران معتادا على التعامل معه.- عقد الفئران من الخلف ووضعه على الطاولة ببطء من ارتفاع 10 سم. عادة، فإن الفئران تمتد الأطراف الأمامية ووضعها على الطاولة.
- الاستيلاء على الفئران من الخلف والاحتفاظ بها تواجه حافة الجدول. ويلاحظ رد فعل الأطراف الأمامية. الجرذ العادي سيضع الأطراف الأمامية على الطاولة
- دع الجرذ يمسك حافة الطاولة يستخدم الجرذ العادي الذقن لمنع شعر الأنف والأنف من لمس حافة الطاولة.
- ضع الجرذ على الطاولة ، وادفع الجرذ بضغط الجانبي اللطيف خلف كتف الجرذ نحو حافة الطاولة ، ولاحظ وضع الأطراف الأمامية والأطراف الخلفية. الجرذ العادي سيمسك الحافة بأطرافه الأمامية وأطرافه الخلفية.
- ضع الجرذ على الطاولة مع الوجه نحو الحافة ، ودفعه بلطف من الخلف إلى الحافة. الجرذ العادي سيمسك الحافة بأطرافه الأمامية
- ضع الجرذ على الطاولة وظهره إلى الحافة وادفعه من الخلف إلى حافة الطاولة. لاحظ رد فعل الأطراف الخلفية. الجرذ العادي سيمسك الحافة بأطرافه الخلفية
- تقييم موضع الأطراف الأمامية أو hindlimbs إلى حافة الجدول. سجل الدرجات كما يلي: 0، لا تنسيب؛ 1، لم تنته و / أو تأخر التنسيب؛ 2، على الفور، والتنسيب الكامل.
- المعدلة Voetsch العصبية8
ملاحظة: المعدلة Voetsch neuroscore هو درجة مقياس vertebrobasilar من القدرة الحسية الحركية، التي تحتوي على 14 المعلمات: حركة الرأس، والنشاط، والسمع، منعكس الألم، منعكس القرنية، proprioception، الإحساس الرقبة، والاستكشاف، والدوران، والإحساس الجذع المحوري، وحركة 4 أطراف، وحركة الأطراف الأمامية، والتسلق، والمشي شعاع. وتتراوح النتيجة لكل معلمة من 0 (العجز العصبي الكامل) إلى 3 (أي عجز عصبي). مجموع درجة الوظيفة العصبية يتراوح من 0 إلى 42.- ضع الجرذ على الطاولة (50 سم × عرضه 35 سم) والسماح له بالتحرك لمدة خمس دقائق. مراقبة الحركة العفوية لرأسه: يتحرك في جميع الأبعاد، 3؛ يفضل جانب واحد، 2؛ حركة فقط إلى جانب واحد، 1؛ استعرض إلى جانب أحادي، 0.
- ضع الجرذ على الطاولة (50 سم × عرضه 35 سم) والسماح له بالتحرك لمدة خمس دقائق. ويعرف النشاط بأنه: الاستجابة الكاملة، 3؛ و 3؛ و 3؛ و 3؛ و 3؛ و 3؛ و 3؛ و استجابة معتدلة، 2؛ استجابة الحد الأدنى، 1؛ غيبوبة، 0.
- مراقبة الدوران القحفي: يتحول ثنائيا، 3؛ يفضل الجانب 1، 2؛ فقط إلى جانب واحد، 1؛ سقط إلى جانب واحد، 0.
- تقييم حركة الأطراف الأمامية: حركة متساوية وثنائية، 3؛ عدم تناسق طفيف، 2؛ عدم التماثل الكبير، 1؛ لغة ال paresis، 0.
- تقييم حركة الأطراف 4: حركة متساوية وثنائية، 3؛ عدم تناسق طفيف، 2؛ عدم التماثل الكبير، 1؛ لغة ال paresis، 0.
- عندما يكون الجرذ ثابتا ، قم بإجراء قرصة أذن لتحفيز اليوريكلز واختبار منعكس الألم: يتحرك بعيدا بسرعة وتناسقا عن التحفيز ، 3 ؛ يتحرك بعيدا ببطء أو غير متماثل من التحفيز, 2; يظهر بعض الحركة استجابة للألم، 1؛ لا رد فعل، 0.
- عندما يكون الجرذ ثابتا ، قم بعمل ضوضاء على جانبي جسم الجرذ لاختبار السمع: فرك الأصابع ، 3 ؛ المفاجئة من الأصابع، 2؛ التصفيق بصوت عال، 1 وليس مذهلا، 0.
- للتحقق من proprioception، لمس vibrissae الجرذ على كلا الجانبين على التوالي مع عصا حادة ومراقبة استجابتها للتحفيز: رد فعل على اتصال، 3؛ تقلص رد الفعل على جانب واحد، 2؛ تضاءلت على كلا الجانبين، 1؛ غائب، 0.
- لتقييم الإحساس المحوري للجذع ، ضع عصا حادة على جانبي جسم الجرذ ولاحظ استجابته للتحفيز: رد فعل سريع ومتناظر للمحفزات ، 3 ؛ رد فعل متضائل قليلا أو غير متماثل، 2؛ تقلصت إلى حد كبير وردود الفعل غير المتماثلة، 1 وليس رد فعل، 0.
- لاختبار منعكس القرنية، عقد الجرذ ولمس القرنية بسرعة على كلا الجانبين مع مسحة القطن: كلتا العينين إغلاق بسرعة، 3. منعكسة متضائلة على جانب واحد، 2؛ تضاءلت على كلا الجانبين، 1؛ غائب، 0.
- للتحقق من الإحساس من الرقبة، عقد الجرذ واستخدام عصا حادة للمس الرقبة: يتفاعل للمس بنشاط، 3. رد فعل بطيء للمس، 2؛ تقلصت كثيرا رد الفعل, 1; لا رد فعل، 0.
- لمراقبة الاستكشاف، استخدم صندوقا داكنا فاتحا.
ملاحظة: يجب أن يكون ثلثي المربع مفتوحا ومضاءا، بينما يتم تغطية باقي المربع ومظلم. باب 7 سم يربط بين المقصورتين. - ضع الجرذ في حجرة الضوء لمدة 5 دقائق ثم المقصورة المظلمة لمدة 5 دقائق أخرى ، والسماح لها بالتحرك وتسجيل أنشطة الجرذ. عندما يتم وضع 4 أطراف في غرفة واحدة، سجل كمدخل. تسجيل الدرجات على النحو التالي: تصل إلى مقصورات الضوء والظلام بنشاط، 3؛ تصل إلى 1 مقصورة، 2؛ يتحرك ببطء فقط بعد التحفيز، 1؛ ولا حركة، 0.
- للتحقق من قدرة التسلق، ضع الجرذ في الجزء السفلي من 20 سم، 70 سم طائرة طويلة مع زاوية 30 درجة إلى الأرض الأفقية. سجل عشرات على النحو التالي : قادرة على الصعود إلى أعلى ، 3 ؛ ضعف التسلق، 2؛ قبضة ثابتة، 1؛ ويسقط فورا، 0
- لفحص المشي شعاع، ووضع الفئران على نهاية واحدة من شعاع 3 سم واسعة، 70 سم طويلة وهو 20 سم فوق سطح الأرض، وسجل عشرات على النحو التالي: يستكشف شعاع كامل، 3؛ يستكشف جزءا من شعاع، 2؛ بعض الحركة والسقوط، 1؛ لا حركة، 0.
- حساب النقاط.
4. تأكيد نزيف عن طريق التصوير بالرنين المغناطيسي
- إجراء التصوير بالرنين المغناطيسي في 24 ساعة بعد الجراحة.
- تخدير الفئران مع ايزوفلوران (5٪ للتحريض، 1٪- 1.5٪ للصيانة).
- تأمين رأس الجرذ في لفائف صفيف الدماغ الفئران جنبا إلى جنب مع لفائف حجم الإرسال فقط.
- ضع الملف مع الجرذ في الماسح الضوئي للتصوير بالرنين المغناطيسي. تأمين الفئران داخل المهد عن طريق قضبان الأسنان والأذن.
- استخدم سترة حرارية مغلقة للحفاظ على درجة حرارة جسم الجرذ عند 37 ± 0.5 درجة مئوية أثناء التصوير بالرنين المغناطيسي.
- تنفيذ تسلسل تجريبي لضمان الهندسة الصحيحة.
- تطبيق تسلسل صدى سريع الدوران لجمع الاشعة T2 المرجحة. تعيين المعلمات كما يلي: وقت الصدى (TE)، 132 مللي ثانية؛ وقت التكرار (TR)، 2500 مللي ثانية؛ مصفوفة الاستحواذ، 148 × 148؛ مجال الرؤية، 100 مم × 100 مم؛ 12 شريحة؛ سمكها 1.5 مم.
- أعد الجرذ إلى القفص
5. تأكيد نزيف عن طريق التشريح الإجمالي
ملاحظة: التضحية الفئران في نقطة زمنية معينة، 24 ح و 14 د بعد الجراحة (الشكل 1D).
- تخدير الفئران مع 5٪ isoflurane حتى فقدان الوعي. ثم، القتل الرحيم مع ثاني أكسيد الكربون (CO2) (20-30٪ من حجم القفص في الدقيقة الواحدة).
- تأكد من الوفاة باستخدام العلامات التالية: لا ارتفاع في الصدر وهبوط ، ولا نبضات قلب واضحة ، ولا استجابة لقرصة إصبع القدم ، أو لون الغشاء المخاطي الفقير ، أو تغيير اللون ، أو التعتيم في العينين.
- إجراء خلع عنق الرحم.
- تأمين الفئران عن طريق تسجيل الكفوف على منصة معقمة. إنشاء شق خط الوسط من عنق الرحم لفضح نقص الوذم إلى الصدر والكبد. إجراء شق الجانبي من الهامش القصي العلوي على طول الترقوة إلى أقصى اليسار وقطع الجانبية آخر من xiphoid على طول الحجاب الحاجز إلى أقصى اليسار، لفضح القلب. رفع رفرف القفص الصدري وإصلاحه إلى المنصة مع دبوس.
- قم بتوصيل نهاية الإبرة (27 جم) بمضخة تغلغل تحتوي على 4 درجات مئوية ملحية. تقدم طرف الإبرة إلى القلب على طول الحافة اليسرى من البطين الأيسر لتجنب دخول الأذين. قم بتشغيل مضخة النفخ لضمان وجود الطرف في البطين الأيسر ، ثم قم بقطع الأذين الأيمن.
- إيقاف مضخة النفخ عندما السائل استنزفت من الأذين الأيمن يتحول عديم اللون والكبد يتحول الأبيض. يحتاج هذا الإجراء إلى ما يقرب من 100 مل 4 درجة مئوية من المحلول الملحي.
- قطع رأس الجرذ وحصاد الدماغ كله باستخدام مقص والمملقط. إزالة أي رطوبة من سطح الدماغ مع ورقة النشاف.
- إبقاء الدماغ كله في -80 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة.
ملاحظة: يمكن تخطي هذه الخطوة إذا كان يمكن قطع الدماغ دون تجميد. - وضع الدماغ في مصفوفة الدماغ الفئران التاجية مع الجانب الظهري حتى.
- أدخل شفرة سميكة من الفولاذ المقاوم للصدأ 0.21 ملم في مركز النزيف وفقا للثقب في سطح الدماغ.
- أدخل شفرات أخرى في الدماغ على فاصل زمني من 2 ملم.
- تزج أقسام الدماغ في 10 مل من محلول paraformaldehyde 4٪ (PFA) لمدة 24 ساعة في 4 درجة مئوية. شطف لهم مع 0.01 مليمول / لتر فوسفات المالحة المخزنة مؤقتا (PBS).
- تنظيم المقاطع من rostral إلى caudal وصورة لهم.
6. قسم البارافين والهيماتوكسيلين واليوسين (HE) تلطيخ
- إصلاح الدماغ مع 4٪ PFA الحل لمدة 24 ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. حجم PFA يجب أن يكون 5-10 مرات من حجم الدماغ.
- قطع الدماغ من مركز النزيف إلى قطعتين عن طريق مصفوفة دماغ شفرة والجرذان التاجية.
- جعل كتل الأنسجة المضمنة البارافين.
- قسم الأنسجة المضمنة البارافين كتلة تاجي في الشرائح سمك 40 ميكرومتر على microtome، وقطع 4 أقسام على التوالي، بدءا من مركز النزيف، وتعويمها في حمام مائي 40 درجة مئوية.
- قم بتركيب أقسام 40 ميكرومتر (8 شرائح في المجموع لدماغ واحد) على شرائح زجاجية نظيفة والهواء الجاف بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
- خبز الشرائح في 56 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
- يغسل لمدة 3 دقائق في إكسيلين، 3 مرات.
- تراجع أقسام 30 مرة في الإيثانول 100٪، 30 مرات أخرى في الإيثانول 100٪، 30 مرة في الإيثانول 95٪، و 30 مرة أخرى في الإيثانول 95٪.
- شطف في ماء الصنبور حتى واضحة.
- تزج المقاطع في هيماتوكسيلين لمدة 10 دقائق.
- شطف في ماء الصنبور حتى واضحة.
- تزج أقسام في وصمة عار إيوزين لمدة 30 s.
- الشرائح المجففة مع 3-4 الانخفاضات 95٪ الإيثانول، 3-4 الانخفاضات في الإيثانول 100٪، 100٪ الإيثانول لمدة 1 دقيقة، و 10 الانخفاضات في الإيثانول 100٪ + xylene (1:1).
- تنظيف المقاطع مع xylene لمدة 1 دقيقة، 2 مرات.
- جبل باستخدام غير مائي تصاعد المتوسطة وأغطية.
- جفف الأقسام في الهواء بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة، ثم اغسلها.
7. الإحصاءات
- استخدم GraphPad Prism 6.0 لحساب اختبار الطالب t أو اختبار Mann Whitney U.
ملاحظة: يجب التعبير عن كافة البيانات على أنها متوسط ± SE. يتم تحديد الاختلافات بين مجموعتين باختبار t-test للطالب ذو ذيلين أو اختبار Mann Whitney U. P<0.05 يعرف بأنه أهمية إحصائية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
واستخدم ما مجموعه 25 حيوانا، منها 3 للسيطرة، و6 ل 30 ميكرولتر، و6 ل 60 ميكرولتر، و10 لحقن دم 100 ميكرولتر. توفي أحد الفئران التي تلقت حقن 100 ميكرولتر من الدم الذاتي (1/10) في غضون 24 ساعة بعد الجراحة.
أجريت اختبارات سلوكية في اليوم الأول واليوم الثالث واليوم السابع واليوم الرابع عشر بعد الجراحة. يتم عرض الدرجات لمجموعة التحكم ومجموعات حقن الدم على نقاط زمنية مختلفة بعد الجراحة في الجدول 2. تسبب نزيف بونتين العجز العصبي مثل تقلص منعكس القرنية والدوران(الشكل 3B،C). حقن الدم 100 ميكرولتر تسبب أيضا في ميوتونيا (الشكل 3A). وكشفت نتائج اختبار شعاع التوازن، واختبار وضع الأطراف، وعصبية Voetsch المعدلة أن الوظيفة العصبية انخفضت مع زيادة حجم نزيف بونتين.
تم إجراء التصوير بالرنين المغناطيسي بعد 24 ساعة من الجراحة (الشكل 4). في مجموعات حقن الدم ، على تسلسل T2 ، تم اكتشاف نزيف كحافة تحت ضغط الدم مع نواة iso - إلى hyperintense قليلا في الجزء باسيلار من المهور. لم يكن هناك نزيف الكشف عن طريق التصوير بالرنين المغناطيسي في مناطق الدماغ الأخرى (الشكل 4). تم زيادة حجم النزيف مع زيادة حجم حقن الدم الذاتي.
ثم تم التضحية الفئران في 24 ساعة واليوم 14 بعد الجراحة، على حدة، وأدلى 2 مم أقسام سميكة(الشكل 4). تم الكشف عن نزيف المحيطة موقع الحقن وتوزيعها في قاعدة المهور. كان هناك وذمة طفيفة حول النزيف في مجموعة حقن الدم 100 ميكرولتر.
تم التضحية ببعض الفئران بعد 3 أيام من الجراحة وقسم البارافين للقيام تلطيخ HE. وأظهرت النتائج أنه في مجموعات حقن الدم، والخلايا الالتهابية المخصب في منطقة ما حول النزيف(الشكل 5C و F). يبقى الهيموجلوبين داخل خلايا الدم الحمراء سليمة (الشكل 5D و G).
الشكل 1:الرسوم التخطيطية لنموذج نزيف بونتين. (أ) جمع الدم الذاتي من الوريد الذيل. (ب) الرسم التخطيطي لموقع الحفر. (ج) المخططات التخطيطية لموقع الحقن. (د) التصميم التجريبي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: أدوات وإجراءات الجراحة. (أ) آلة التخدير. (ب) الأدوات الجراحية. (ج) ميكرودريل. (د) مضخة الحقن الدقيق. (ه) جهاز ستيريوتاكسيك. (واو) خط ملحوظ في منتصف الجمجمة. (G) نقاط السهم الأصفر إلى موقع الحفر. (ح) تصريف الدم من الوريد الذيل. (I) نقل الدم إلى أنبوب Eppendorf. (J) أسبيرات الدم في حقنة هاملتون. (ك) تقدم حقنة هاملتون من خلال ثقب الجمجمة. (L) عملية حقن الدم الذاتي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3:النتائج التمثيلية للاختبارات السلوكية. (أ) ميوتونيا في الفئران حقن 100 ميكرولتر من الدم الذاتي. (ب) تقلص رد الفعل القرنية على الجانب الأيمن في الفئران حقن 60 ميكرولتر من الدم الذاتي. (ج) تقلص رد الفعل القرنية في الجانبين الثنائية في الفئران حقن 100 ميكرولتر من الدم الذاتي. (د) تلقى فأر 60 ميكرولتر من الدم الذاتي دائرة إلى الجانب المقابل من الآفة. (ه) نتائج اختبار شعاع التوازن. (واو) نتائج النتيجة العصبية Voetsch المعدلة. (ز) نتائج اختبار تحديد موضع الأطراف. الخط يعني فرقا كبيرا بين المجموعتين (p < 0.05). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: النتائج التمثيلية للتصوير بالرنين المغناطيسي والتشريح الإجمالي. تم إجراء التصوير بالرنين المغناطيسي (العلوي) بعد 24 ساعة من جراحة نزيف بونتين ، ثم تم التضحية بالجرذان وقطعها إلى مقاطع الدماغ 2 مم (القاع). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: النتائج التمثيلية لتلطيخ HE. تم حصاد الأدمغة من الفئران حقن 100 ميكرولتر من الدم 3 د بعد الجراحة. (أ) قسم الدماغ بأكمله. حقول منخفضة من (ب) منطقة بونتين العادية، (C) منطقة شبه الآفة و (D) نزيف الأساسية. حقول عالية من (E) منطقة بونتين العادية، (F) منطقة شبه الآفة و (G) نزيف الأساسية. كان مقياس الشريط 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل S1: النتائج التمثيلية للتشريح الإجمالي في اليوم 14 بعد الجراحة. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
| متوسط | المعتدل | ضخمه | |
| إجمالي حجم الصوت | 30 ميكرولتر | 60 ميكرولتر | 100 ميكرولتر |
| الحقنة الأولى | |||
| إحداثيات مجسمة | AP -9.0 ملم; اللات 0; فيرت -9.2 ملم | ||
| حجم | 10 ميكرولتر | 10 ميكرولتر | 10 ميكرولتر |
| سرعة | 1 ميكرولتر/دقيقة | 1 ميكرولتر/دقيقة | 1 ميكرولتر/دقيقة |
| وقت الفاصل الزمني | 20 دقيقة | 20 دقيقة | 20 دقيقة |
| الحقن الثاني | |||
| إحداثيات مجسمة | AP -9.0 ملم; اللات 0; فيرت -9.2 ملم | AP -9.0 ملم; اللات 0; فيرت -9.0 ملم | |
| حجم | 20 ميكرولتر | 50 ميكرولتر | 90 ميكرولتر |
| سرعة | 1 ميكرولتر/دقيقة | 1 ميكرولتر/دقيقة | 1 ميكرولتر/دقيقة |
| قبل سحب الإبرة | 10 دقائق | 10 دقائق | 10 دقائق |
| AP: موقف روبوستريور | |||
| اللات: الجانبي | |||
| فيرت: عمودي | |||
الجدول 1: حقن الدم الذاتي.
| رقم الجرذ | اليوم الأول | اليوم الثالث | اليوم السابع | اليوم الرابع عشر |
| المعدلة Voetsch العصبية | ||||
| 30 ميكرولتر-1 | 33 | 34 | 38 | 41 |
| 30 ميكرولتر-2 | 30 | 35 | 37 | 41 |
| 30 ميكرولتر-3 | 34 | 37 | 40 | 42 |
| 60 ميكرولتر-4 | 27 | 30 | 36 | 38 |
| 60 ميكرولتر-5 | 23 | 28 | 34 | 39 |
| 60 ميكرولتر-6 | 26 | 29 | 35 | 39 |
| 100 ميكرولتر-7 | 16 | 25 | 31 | 36 |
| 100 ميكرولتر-8 | 13 | 22 | 29 | 37 |
| 100 ميكرولتر-9 | 14 | 21 | 26 | 36 |
| شام-10 | 41 | 42 | 42 | 42 |
| شام-11 | 42 | 42 | 42 | 42 |
| شام-12 | 42 | 42 | 42 | 42 |
| اختبار شعاع التوازن | ||||
| 30 ميكرولتر-1 | 1 | 0 | 0 | 0 |
| 30 ميكرولتر-2 | 1 | 1 | 0 | 0 |
| 30 ميكرولتر-3 | 2 | 1 | 0 | 0 |
| 60 ميكرولتر-4 | 3 | 2 | 0 | 0 |
| 60 ميكرولتر-5 | 4 | 2 | 0 | 0 |
| 60 ميكرولتر-6 | 3 | 2 | 1 | 0 |
| 100 ميكرولتر-7 | 5 | 4 | 3 | 1 |
| 100 ميكرولتر-8 | 5 | 4 | 2 | 1 |
| 100 ميكرولتر-9 | 4 | 4 | 2 | 1 |
| شام-10 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| شام-11 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| شام-12 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| اختبار وضع الأطراف | ||||
| 30 ميكرولتر-1 | 11 | 12 | 12 | 12 |
| 30 ميكرولتر-2 | 10 | 11 | 12 | 12 |
| 30 ميكرولتر-3 | 10 | 11 | 12 | 12 |
| 60 ميكرولتر-4 | 9 | 11 | 12 | 12 |
| 60 ميكرولتر-5 | 8 | 9 | 9 | 11 |
| 60 ميكرولتر-6 | 8 | 9 | 10 | 11 |
| 100 ميكرولتر-7 | 4 | 5 | 9 | 11 |
| 100 ميكرولتر-8 | 3 | 4 | 8 | 10 |
| 100 ميكرولتر-9 | 2 | 4 | 7 | 8 |
| شام-10 | 11 | 12 | 12 | 12 |
| شام-11 | 12 | 12 | 12 | 12 |
| شام-12 | 12 | 12 | 12 | 12 |
الجدول 2: نتائج الاختبارات السلوكية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه الدراسة، قدمنا بروتوكولا لتوليد نموذج فئران نزيف بونتين ضخمة. ويمكن استخدام هذا النموذج للبحث في آلية المرضية والتكهن بنزيف بونتين ضخمة.
وطوال التجربة، استخدم 25 فأرا، توفي منها جرذ واحد فقط. وقد أشار التحقق من التصوير بالرنين المغناطيسي، والتشريح الإجمالي، وتلطيخ HE إلى أن هذه الطريقة لديها معدل وفيات منخفض جدا ومعدل نجاح مرتفع. لإنشاء نموذج نزيف بونتين ضخمة، يجب حل مشكلتين، والدم الذاتي حقن يميل إلى تسرب إلى الفضاء تحت العنكبوتية وتدفق العودة إلى البطين الرابع على طول القناة إبرة. القائمة مزدوجة الحقن معتدلة (60 ميكرولتر الدم الذاتي في المجموع) نموذج نزيف بونتين حل المشكلة الأولى, بالكاد أي دم تدفقت إلى الفضاء تحت العنكبوتية. ومع ذلك، لا تزال هناك كمية صغيرة من تدفق الدم الخلفي. في هذه الدراسة، تم تطبيق العديد من الاستراتيجيات لتحسين طريقة الحقن المزدوج القائمة لجعل من الممكن حقن كمية أكبر من الدم الذاتي 100 ميكرولتر دون تدفق خلفي. أولا، تم استخدام بقعتين مختلفتين للحقن بدلا من بقعة واحدة. ثانيا، تم استخدام الهيبارين لطرد الحقنة بأقل قدر من البقايا لتقليل الجرعة، من أجل حماية الدم فقط من التخثر أثناء عملية الحقن، ولكن ليس بما يكفي لتعزيز التسرب والتدفق الخلفي بعد الحقن. ثالثا، كان وقت الحقن طويلا وكانت سرعة الحقن بطيئة، 1 ميكرولتر/دقيقة. وعلاوة على ذلك، تم حقن كمية صغيرة فقط من الدم الذاتي في المرة الأولى، في حين تم إجراء الحقنة الثانية بعد 20 دقيقة. بعد ذلك ، تم سحب الإبرة فقط بعد 10 دقائق ، وأجري هذا الإجراء ببطء شديد. باستخدام هذه الطريقة ، كان هناك بالكاد أي دم يتدفق إلى الفضاء تحت العنكبوتية أو البطين الرابع في الفئران التي تم حقنها ب 30 ميكرولتر أو 60 ميكرولتر من الدم الذاتي ، ولكن لا يزال هناك كمية صغيرة من التدفق الخلفي في الفئران التي تم حقنها ب 100 ميكرولتر.
أجريت الاختبارات السلوكية في اليوم الأول واليوم الثالث واليوم السابع واليوم الرابع عشر بعد النمذجة، بما في ذلك اختبار شعاع التوازن واختبار موضع الأطراف وعصب Voetsch المعدل. في اليوم الأول بعد الجراحة، أظهرت جميع الفئران تقريبا في مجموعات حقن الدم سلوكا يدور حولها (أي الدوران يسارا أو يمينا)، مصحوبا باختفاء رد الفعل القرني الأحادي أو الثنائي. على الرغم من حقن الدم الذاتي في خط الوسط من بونتين، تم توزيعه بشكل غير متساو في جانبي الدماغ. ويبدو أن هذا هو السبب في الأداء المختلف في الاختبارات السلوكية. تباطأت أنشطة وردود فعل الفئران التي حقنت 30 ميكرولتر أو 60 ميكرولتر من الدم الذاتي أقرب إلى وضعها الطبيعي. في الفئران حقن 100 ميكرولتر من الدم، وضعفت وظائف الحسية الحركية بشكل كبير وكانت الاستجابة ضعيفة. ظهرت صلابة العضلات في بعض الفئران في حالة الراحة. في اليوم الأول واليوم الثالث واليوم السابع، كانت هناك اختلافات واضحة بين الفئران التي حقنت 30 ميكرولتر أو 60 ميكرولتر أو 100 ميكرولتر من الدم الذاتي والجرذان في مجموعة التحكم في النتيجة العصبية المعدلة Voetsch. في اختبار شعاع التوازن واختبار مكان الطرف، لم تكن هناك اختلافات كبيرة بين الفئران التي حقنت 30 ميكروغرام أو 60 ميكرولتر من الدم والجرذان في مجموعة التحكم في أي وقت. ومع ذلك ، كانت نتائج اختبار شعاع التوازن واختبار وضع الأطراف في الفئران حقن 100 ميكرولتر من الدم الذاتي مختلفة بشكل كبير بالمقارنة مع مجموعة التحكم في اليوم الأول واليوم الثالث. يمكن أن يكون السبب المحتمل هو أن هناك عدد أقل من عناصر التقييم في اختبار شعاع التوازن واختبار موضع الطرف مقارنة ب سكور Voetsch العصبي المعدل ، والتي ليست حساسة بما يكفي لاكتشاف العجز العصبي الدقيق. من غير المناسب استخدام هاتين الطريقتين لتقييم السلوك في نماذج النزيف ذات الأعراض الخفيفة ، ولكنها قابلة للتطبيق في نموذج نزيف بونتين الضخم. وعموما، تبين أن النتيجة العصبية Voetsch المعدلة لتكون أكثر ملاءمة لتقييم شامل ودقيق للوظائف العصبية في نماذج نزيف بونتين مختلفة.
هناك العديد من المزايا من هذا الأسلوب. استنادا إلى طريقة الحقن المزدوج السابقة، تم تغيير موقع الحقن الثاني وتم تعديل جرعة الهيبارين لتجنب التسرب والتدفق الخلفي في نموذج نزيف بونتين خفيف (30 ميكرولتر) ومعتدل (60 ميكرولتر). حتى في نموذج نزيف بونتين الضخم (100 ميكرولتر) ، كان التدفق الخلفي محدودا جدا ، وحدث فقط في عدد قليل من الفئران. ويمكن تنفيذ هذه الطريقة بسهولة مع ارتفاع معدل النجاح وانخفاض معدل الوفيات. وعلاوة على ذلك، يمكن ملاحظة نزيف بونتين التجريبية خلال فترة طويلة، على الأقل 14 يوما بعد النمذجة، مما يؤدي إلى التحقيق في تطور المرض بأكمله وآثار العلاجات. وكان التقدم الرئيسي لهذا النموذج أنه يحاكي أعراض المرضى الذين يعانون من نزيف بونتين. سريريا, نزيف بونتين ضخمة النتائج في العجز العصبي الحاد, في حين أن نماذج نزيف بونتين السابقة وضعت فقط حجم نزفي صغير نسبيا مع أعراض خفيفة. نزيف بونتين ضخمة في هذا النموذج وزعت في المهور الثنائية، وهو ما يشبه مع توزيع نزيف في المرضى نزيف بونتين. في نماذج نزيف بونتين التجريبية السابقة ، لا يقع النزيف إلا في المهور الأحادية9.
ومع ذلك، هناك أيضا بعض القيود على هذا الأسلوب. أولا، كان سبب نزيف البونتين في هذه الدراسة عن طريق حقن الدم، والحجاج جزئيا أثناء الانتقال، والتي قد تؤثر على تخثر الدم أو حتى التوازن في المهور المحيطة بها. ثانيا، يتطلب هذا النموذج معدات خاصة، مثل جهاز ستيريوتاكسيك ومضخة الحقن. ثالثا، لا يمكن لهذا النموذج أن يحاكي النزيف العفوي.
في الختام، قدمت هذه الدراسة طريقة لإنشاء نموذج تجريبي نزيف بونتين حاد حاد في الفئران، والتي يمكن أن تعزز البحوث الميكانيكية والعلاجية الجديدة في هذا المجال.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لا تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم دعم هذه الدراسة ماليا من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم في الصين (81471181 81870933) وبرنامج المختبر الافتتاحي لجامعة قوانغتشو الطبية (0506308) إلى Y Jiang ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الصينية (81701471) والبرنامج العلمي للجنة الصحة البلدية في قوانغتشو (20191A01083) إلى Z Qiu ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الصينية (81501009) إلى L Wu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100ml Saline solution | Guangdong yixiang | 191222201 C1 | Preparing heparin diluent |
| 100μl Microinjector | Shanghai Gaoge | Injection of autologous blood | |
| 1ml Syringe | Jiangsu Zhiyu | 20191014 | Withdraw autologous blood from the tail vein |
| 75% Alcohol | Shandong Lierkang | Disinfection of rat tail | |
| Adhesive tape | Shanghai Jinzhong | Surgicl instruments | |
| Animal anesthesia system | RWD | R510-31S-6 | Inducing and maintaining anesthesia |
| Balance beam | Jiangsu Saiangsi | For neurological deficit scores | |
| Blades | Shanghai Feiying | 74-C | For gross anatomy |
| Bone cement | Shanghai Xinshiji | 20180306 | Surgicl instruments |
| Brain tank | Shenzhen LEIYEA | For gross anatomy | |
| Butorphanol tartrate | Jiangsu Hengrui | For pain management | |
| Electric cranial drill | Nanjing Darwin biotechnology | 20180090018 | Making a burr hole on the skull |
| EP tube | Nantong Surui | Transfer autologous blood | |
| Erythromycin eye cream | Yunnan pharmacy | Eyes protection | |
| HE dye liquor | Solarbio | G1120 | For HE staining |
| Heating pad | Dangerous Jungle | JR01 | Keeping warm |
| Heparin sodium injection | Chengdu Haitong Pharmacal Company | 190701 | Preparing heparin diluent |
| IndoPhors | Guoyao of China | Sterilization | |
| Isoflurane | RWD | 20080701 | Inducing and maintaining anesthesia |
| Light dark box | Jiangsu Saiangsi | For neurological deficit scores | |
| Micro-injection pump | Baoding Leifu | TFD03-01-C | Injection of autologous blood |
| MRI system | Philips | Confirmation of infarction in vivo | |
| Needle holder | Shanghai Jinzhong | J32020 | Surgicl instruments |
| Penicilin | Guoyao of China | Infection Prevention | |
| Q-tips | Jiangxi Songhe | Surgicl instruments | |
| Scalp heedle | Jiangxi Hongda | 20200313 | Withdraw autologous blood from the tail vein |
| Scalpel | Shanghai Kaiyuan | 170902 | Surgicl instruments |
| Shearing scissors | Shanghai Jinzhong | Y00040 | Surgicl instruments |
| Stereotaxic apparatus | RWD | 900-00001-00 | for surgical positioning |
| Surgical towel | Xinxiang Huakangweicai | 20070601 | Surgicl instruments |
| Suture needle | Shanghai Jinzhong | Surgicl instruments | |
| Suture scissors | Shanghai Jinzhong | J25041 | Surgicl instruments |
| Tissue holding forcepts | Shanghai Jinzhong | J31080 | Surgicl instruments |
References
- Charidimou, A., et al. Brain hemorrhage recurrence, small vessel disease type, and cerebral microbleeds: A meta-analysis. Neurology. 89 (8), 820-829 (2017).
- Tao, C., et al. A novel brainstem hemorrhage model by autologous blood infusion in Rat: White Matter Injury, Magnetic Resonance Imaging, and Neurobehavioral features. Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 25 (5), 1102-1109 (2016).
- Ichimura, S., et al. Surgical treatment for primary brainstem hemorrhage to improve postoperative functional outcomes. World Neurosurgery. 120, 1289-1294 (2018).
- Behrouz, R. Prognostic factors in pontine haemorrhage: A systematic review. European Stroke Journal. 3 (2), 101-109 (2018).
- Guo, X., et al. Brainstem iron overload and injury in a rat model of brainstem hemorrhage. Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 29 (8), 104956 (2020).
- Chung, Y., Haines, S. J. Experimental brain stem surgery. Neurosurgery Clinics of North America. 4 (3), 405-414 (1993).
- Lekic, T., Tang, J., Zhang, J. H. A rat model of pontine hemorrhage. Acta Neurochirurgica Supplement. 105, 135-137 (2008).
- Lekic, T., et al. Evaluation of the hematoma consequences, neurobehavioral profiles, and histopathology in a rat model of pontine hemorrhage. Journal of Neurosurgery. 118 (2), 465-477 (2013).
- Shrestha, B. K., et al. Rat brainstem hemorrhage model: Key points to success in modeling. World Neurosurgery. 117, 106-116 (2018).
- Luo, M., Tang, X., Zhu, J., Qiu, Z., Jiang, Y. Establishment of acute pontine infarction in rats by electrical stimulation. Journal of Visualized Experiments. (162), (2020).
- Wu, L., et al. Keep warm and get success: The role of postischemic temperature in the mouse middle cerebral artery occlusion model. Brain Research Bulletin. 101, 12-17 (2014).
